Autres troubles humains

Une dent arrachée sous anesthésie générale, l'implant dentaire posé dans la foulée, trente minutes à une heure d'intervention, puis des semaines d'observation ponctuées de prises de sang et d'examens du site d'implantation sous anesthésie. 120 rats vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur liste les suites possibles, douleur, perte d'appétit, gêne à la mastication, infections bactériennes et saignements du site opératoire, puis conclut qu'il n'est pas possible de maintenir les animaux en vie, les tissus autour de l'implant devant être prélevés pour histologie. Il rappelle que le rat ne remplit pas tous les critères recommandés pour ce type de test, hygiène orale et maturité squelettique, et que l'essai est commandé par un donneur d'ordre en vue d'une mise sur le marché.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé d’implantologie et de chirurgie dentaire (exemple : implant, vis, ciment, ...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir des données de performance et/ou de tolérance des produits de santé en chirurgie dentaire. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l'offre et améliorant ainsi les chances de guérison et/ou le confort des patients.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour l’extraction dentaire, puis l’implantation du dispositif à tester dans la foulée . Ces interventions peuvent durer de 30 minutes à 1h environ et ont lieu sous anesthésie générale et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non (

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont les suivants : -douleur et stress liés à la chirurgie. -perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours. -gêne à la mastication et la prise alimentaire pouvant entrainer une perte de poids à plus long terme -les infections bactériennes liées à la chirurgie. -les saignements au niveau du site opératoire.

Devenir

Pour répondre aux objectifs du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les tissus et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé dentaire. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "controle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou design d’étude le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : -Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et Aavant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (produit de nidification : coton), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (analgésie post-opératoire, désinfection des sites chirurgicaux à une fréquence adaptée si nécessaire en cas de signes cliniques…). Les prises de sang peuvent être réalisées si nécessaire sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou sous anesthésie locale, ou encore sous sédation légère (voir paragraphe sur la liste des médications) avec au besoin une analgésie préalable, afin de maitriser le stress et la douleur potentielle.

Choix des espèces

Il n’existe pas de modèle animal validé pour tester les dispositifs médicaux dentaires, mais les textes de référence recommandent l’utilisation d’animaux dont : -les mâchoires sont de taille adéquate pour permettre l’accès chirurgical et l’implantation du dispositif, -il existe la présence de dents opposées, -la maturité squelettique est atteinte, -l’hygiène orale peut être contrôlée, -l’alimentation est omnivore et qui présentent des mouvements de mastication. La littérature scientifique reporte l’utilisation du rat comme un modèle de choix dans l’évaluation préliminaire des dispositifs médicaux à visée dentaire. Cependant cette espèce ne remplit pas tous les critères citées plus haut tel que la maturité squelettique difficilement objectivable (pas de fermeture des plaques de croissance osseuse + non nécessaire selon la littérature) et hygiène orale difficile à contrôler. Néanmoins, l’espèce rat constitue un modèle de choix car certaines similarités physiologiques sont observées entre l’implantation chez l’humain et chez le rat (structure osseuse, mécanismes de cicatrisation…). Ainsi ce modèle permet d’ obtenir des données préliminaires et contribuer au développement d'interventions sûres et efficaces pour l'implantation dentaire chez l'Hommeutiles pour les étapes de développement du produit.

Une incision à la queue, puis le chronomètre jusqu'à l'arrêt du saignement, c'est la prestation vendue aux commanditaires de candidats médicaments. 240 souris et 260 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à l'issue du test ou plus tôt si le produit testé provoque des effets indésirables. Le test se déroule sous anesthésie et dure de quatre à soixante minutes, parfois précédé d'une chirurgie de pose de cathéter de vingt à quarante-cinq minutes, et les prises de sang peuvent atteindre cinq par jour chez la souris et huit chez le rat. Une partie des rongeurs est génétiquement modifiée pour reproduire l'hémophilie A, l'hémophilie B ou la maladie de Willebrand, le porteur ajoutant que les effets des produits ne sont pas prévisibles à l'ouverture du projet.

Objectifs

Le but de ce projet est de déterminer les capacités pro- ou anticoagulantes d'un candidat médicament par le test du temps de saignement à la queue chez le rongeur. Ce test constitue un outil pour évaluer la fonction plaquettaire et l’efficacité de la coagulation après administration d'un candidat médicament chez le rongeur sain ou présentant un trouble de la coagulation sanguine. Avant ou après l’administration du candidat-médicament et éventuellement du véhicule qui a servi à préparer la formulation de la molécule testée, l'animal est anesthésié et analgésié et une incision est réalisée au niveau de la queue. L’écoulement du sang est observé jusqu’à son arrêt. Un cathéter intraveineux ou carotidien peut être placé sous anesthésie, pour administrer le produit ou prélever du sang avant et pendant le test du temps de saignement. Un ou des prélèvements sanguins pourront être réalisés avant ou après le test pour déterminer la concentration plasmatique du produit et/ou ses métabolites.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les pathologies de la coagulation, un éventail de pathologies humaines touchant près de 1 125 000 personnes dans le monde. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques

Procédures

Les animaux de ce projet subiront : une administration de produit par différentes voies, avec moins de 3 minutes par administration. Des prélèvements de sang pourront être réalisés sur l'animal vigile ou anesthésié (environ 2 minutes par prélèvements). Ces expériences (administration et prélèvements de sang) pourront être réalisées sur animal vigile ou anesthésié, à raison de 5 prélèvements maximums par jour chez la souris et 8 chez le rat, en respectant un volume maximal de prélèvement dans la limite des volumes autorisés. Chirurgie d'implantation de cathéters (pour prélèvements et/ou administration) sous anesthésie et analgésie générale. Cette chirurgie durera environ 20-45min. Le test du temps de saignement à la queue sera réalisé sous anesthésie et analgésie générale (durée entre 4 et 60 min maximum) suivant les bonnes pratiques vétérinaires. Un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie pourra être éventuellement réalisé (durée entre 4 et 6 minutes).

Impact sur les animaux

Au cours de cette expérience, l'animal vigile sera contraint : pour d'éventuels prélèvements de sang, pour l'administration du composé à tester, et à chaque fois pour induire l'anesthésie avant la pose de cathéters et/ou le test du temps de saignement à la queue. Ces contentions peuvent donc engendrer un stress mineur à l'animal. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations et lors des prélèvements sanguins. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Les effets potentiellement indésirables font l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue du test de temps de saignement de la queue et/ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets pro ou anti-coagulants d’une nouvelle molécule sur l'homme. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou des effets secondaires d'un candidat médicament. A ce jour, le rongeur est l'espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d'étude (temps de saignement).

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 10 / par groupe. Sur la période du projet ( 5 ans), il est prévu de réaliser entre 10 à 12 études avec les rongeurs.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole anesthésique adapté pour le test de saignement de la queue, • La mise en groupe des animaux

Choix des espèces

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le rongeur est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets pro ou anti coagulante d'un candidat médicament, notamment par sa facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Les rongeurs génétiquement modifiés susceptibles d’être utilisés dans le test de temps de saignement reproduisent les caractéristiques des pathologies de la coagulation humaine (Hémophilie A, Hémophilie B, maladie de Willebrand) par inhibition ou mutation des gènes responsables de la production des facteurs de coagulation. Ces modèles sont utilisés pour tester l'efficacité de nouveaux traitements, comme l'administration de facteurs de coagulation recombinants ou les thérapies géniques visant à corriger le défaut génétique. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Des dispositifs médicaux injectables, solutions aqueuses plus ou moins visqueuses, sont implantés sous la peau ou dans le derme de rats, de lapins et de porcs pour en évaluer la tolérance locale et la résorption, en vue de leur marquage CE. 300 animaux non-humains, 200 rats, 50 lapins et 50 cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des injections sous anesthésie générale, des prises de sang possibles jusqu'à une par semaine pendant un mois puis plus espacées, et jusqu'à 20 biopsies de peau sous anesthésie générale chez les porcs. La plupart sont tués pour prélever les sites d'injection, une partie des porcs biopsiés peut être gardée en vue d'une réutilisation, et 10 des 300 animaux non-humains sont déclarés réutilisés. Le porteur écrit que l'emploi de ces espèces est "rendu obligatoire par le règlement Européen", et prévoit aussi des "études non réglementaires".

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'obtenir des informations relatives à la tolérance locale de dispositifs médicaux injectables, ainsi qu'au comportement de ces derniers au sein des tissus, notamment en ce qui concerne leur résorption et leur intégration.

Bénéfices attendus

Les projet permettra d'obtenir des données fiables concernant la tolérance, l'intégration et la dégradation des dispositifs médicaux injectables. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché. Ceci afin d'assurer la sécurité des patients recevant ces produits.ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux auront des injections sous anesthésie génér le à J0, pour une durée totale de 5 à 15 minutes/animal. D'autres actes sont envisagés mais non systématiques: Prises de sang: rats sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 1/mois maxi, 30 seconde par acte. Lapins vigiles avec anesthésie locale: 1 fois par semaine maximum pendant 1 mois, puis 1 fois par mois maximum, 1 minute maximum par acte. Porcs: sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 2 fois par mois maximum. Biopsies cutanées chez le Porc: sous anesthésie générale (injection intramusculaire, 30 secondes), maximum 20 biopsies réparties sur la durée de l'étude, durée 15 minutes environ par biopsie.

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatiblesen solution aqueuse plus ou moins visqueuse. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu in vitro: les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. Dans de rares cas, les implantations intradermiques chez le Lapin peuvent générer des réaction un peu plus fortes, mais restant localisées au niveau du site d'injection.

Devenir

Dans la majorité des cas, les animaux devront être euthanasiés, afin de prélever les sites d'injection à des fins d'analyse. Cependant, chez les porcs, lors d'injections intradermiques, il sera parfois possible de réaliser les prélèvements par biopsie avec un biopsy punch (sous anesthésie générale) et de conserver les animaux en fin d'étude en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Les produits étudiés sont d'abord évalués de façon approfondie grâce à des expériences in vitro: culture cellulaire, modèles de peau artificielle, organe isolé. Les essais de tolérance/biocompatibilité in vivo sont indispensables en complément des tests in vitro, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permettra d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires ainsi que l'intégration des produits dans les tissus environnants. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement Européen (UE) 2017/745 tout en suivant la norme ISO 10993, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux) et également demandé pour les dossiers équivalents dans les pays tiers.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans les études réglementaires est imposé par la norme ISO 10993, les préconisations sont donc suivies, sans augmenter inutilement le nombre d'animaux et sans répéter les protocoles. Dans le cas d'études non réglementaires, on veille à n'utiliser que les animaux strictement nécessaires pour l'obtention des résultats voulus, généralement un nombre très inférieur aux exigences réglementaires. La possibilité d'injecter plusieurs produits en différents sites chez un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une période d'acclimatation systématique est respectée (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Les animaux sont hébergés en groupe et ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce (matériel de nidification pour les rats, blocs/objets à mâcher pour tous les animaux, jouets…). Des points limites, suffisamment prédictifs, permettent de sortir un animal de l’étude en cas d'effet secondaire sévère, ou de mettre en place des traitements pour des réactions locales (application de cicatrisant, administration d'antidouleur) afin que l'animal soit impacté le moins possible. Toues les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les actes trop stressants ou douloureux sont effectués sous anesthésie générale: injections à J0, prises de sang chez le Rat, chez le Porc, et biopsies cutanées chez le Porc. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine). Quelles que soient les procédures, toute éventuelle douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).

Choix des espèces

Les 3 espèces font parties des espèces préconisées par la norme 10993-6. Le rat et le lapin sont des modèles d'implantation utilisés et maitrisés dans l'établissement utilisateur depuis 2006. Leur taille est suffisante pour permettre l'implantation de plusieurs produits chez un seul animal, l'utilisation de techniques d'imagerie et d'appareils de mesures de paramètres cutanés. Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme ; notamment dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude l’effet attendu en clinique. Sa taille, plus importante, permet également l'implantation de plus de produits chez un seul animal, permettant alors de réduire le nombre d'animaux utilisé. Ces modèles sont des modèles de choix (nombreuses données dans la littérature). Leurs comportements sont bien connus, ce qui permet de détecter facilement tout signe de douleur et/ou de mal-être. Les rats utilisés seront de jeunes adultes, environ 300g (=en fin de croissance, paramètres physiologiques stables). Les lapins seront âgés d'environ 14 semaines, soit environ 3.5kg (= présence d'un derme suffisamment épais pour que l'implantation intradermique des produits ne génère pas une contrainte mécanique trop importante). Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 70kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.

16 800 souris et 1 650 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir la formation d'une bulle d'air sous la peau par deux injections sous anesthésie, des administrations de composés jusqu'à deux fois par jour pendant deux semaines par voie orale, sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intra-articulaire, intramusculaire, intranasale ou topique, jusqu'à six administrations d'un inducteur de maladie et trois prélèvements sanguins. Le porteur annonce un maximum de 48 souris ou 40 rats par étude, et 350 études sur souris et 35 sur rats en cinq ans, un compte qui laisse les 1 650 rats déclarés sans justification. Il présente ces travaux de pharmacocinétique comme un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés en pharmacologie.

Objectifs

Les études pharmacocinétique/pharmacodynamie offrent plusieurs avantages dans le développement des médicaments dans les maladies inflammatoires, notamment elles permettent: 1) d’aider à élucider la relation entre la cinétique d’un composé (temps, concentration) et l’effet biologique sur un biomarqueur relié à la cible ou directement sur la cible (temps, effet) 2) de comprendre le mécanisme d’action d’un composé et aider à identifier les propriétés PK pour une amélioration ultérieure et une conception optimale du composé. La modélisation de la relation pharmacocinétique/pharmacodynamie peut aider à mieux relier la puissance des composés in vitro à la prédiction de l’efficacité in vivo et ainsi réduire le nombre d’études in vivo et à améliorer la translation des résultats des espèces précliniques dans le cadre clinique.

Bénéfices attendus

La connaissance de l’effet biologique sur un biomarqueur d’un produit en fonction de sa concentration chez l’animal permet d’utiliser le meilleur traitement (composé, dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. A terme, les résultats précliniques de ce projet permettront également de mieux comprendre la relation pharmacocinétique/pharmacodynamie des composés afin de développer en clinique des composés prometteurs ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

1) Formation de bulle d’air sous la peau qui persiste maximum 8 jours, avec deux injections d’air par étude sous anesthésie. 2) Administration des composés à tester ou de leur véhicule, par voie orale ou sous-cutanée ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou intra-articulaire ou intra-musculaire ou intra-nasale ou en topique. Au maximum 2 fois par jour pour les voies orale, sous cutané et topique pendant un maximum de 2 semaines mais, exceptionnellement un composé pourra être administré 3 fois dans la même journée mais une seule fois dans l'étude. Pour les administrations intraveineuse, intrapéritonéale, intra-articulaire ou intra-musculaire, les injections pourront être effectuées maximum 1 fois par semaines soit 2 fois maximum dans l’étude. La durée de chaque traitement prend quelques secondes 3) Administration de l’inducteur, au maximum 6 fois dans l’étude ; durée de chaque induction : quelques secondes 4) Prélèvement sanguin après anesthésie gazeuse ou non (dépendant de la localisation du prélèvement), au maximum 3 fois dans l’étude, durée d’une minute

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez la souris ou le rat peuvent être dus à l’injection des inducteurs ou au traitement avec les composés. Ces effets indésirables pourraient induire une perte de poids, une diminution de l’activité ou une prostration. La manipulation des animaux plusieurs fois dans l’études ainsi que l’administration des composés ou des inducteurs peuvent également générer du stress et de l’inconfort.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’étude car le ou les tissus cibles sont prélevés pour analyser l’effet des composés sur la cible ainsi que la concentration des composés dans les tissus

Remplacement

Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme et aussi de le relier à un effet biologique. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé et pour observer la conséquence sur un ou plusieurs biomarqueurs. L’ensemble des molécules ont préalablement été testées, validées et sélectionnées in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été initialement basé sur la littérature puis a été réduit suite aux résultats obtenus dans des projets précédents. Pour de nouvelles cibles, une analyse statistique rétrospective sera effectuée après 3 à 5 études selon une formule mathématique communément décrite, comme le d de Cohen, afin de vérifier que le nombre d’animaux par groupe est suffisant pour obtenir, pour chaque paramètre étudié, une puissance de 80% et alpha=0.05. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés par notre recherche sont éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo. Pour ce projet, nous utiliserons un maximum de 48 souris ou 40 rats par étude. Sur 5 ans, nous pensons réaliser un maximum de 350 études utilisant des souris et 35 études utilisant des rats.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière. Enfin, si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera euthanasié de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l’entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée, en adéquation avec les contraintes des différentes procédures, et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton adaptées, carrés de coton et feuilles de cellulose, entre autres).

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces les plus utilisées et les plus décrites dans la littérature pour les études pharmacologiques sur les maladies inflammatoires. Les études PK/PD étant des études préludes aux études pharmacologiques d’efficacité, les espèces utilisées dans les modèles de PK/PD seront les mêmes que celles utilisées dans le modèle pharmacologique afin d’éviter toute différence due à l’espèce. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes et un système immunitaire parfaitement développés.

Pour tester des traitements contre la maladie de Berger, une atteinte rénale auto-immune, 372 souris porteuses de gènes humains qui la déclenchent vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang dans la veine de la joue et des prélèvements d'urine deux fois par mois, des injections dans la veine de la queue chaque semaine pendant un mois puis chaque mois pendant six mois, un gavage par sonde gastrique, et pour une partie d'entre elles une biopsie du rein. Le porteur écrit que la maladie de Berger n'entraîne aucune nuisance, alors qu'il décrit des souris accumulant des anticorps dans les reins, avec du sang et des protéines dans les urines dès douze semaines. Toutes sont tuées pour analyser l'inflammation rénale, et il précise que l'industrie pharmaceutique a sollicité son laboratoire pour ces études.

Objectifs

Nous disposons d'un modèle unique dans le monde, le modèle de souris avec des gènes humains exprimant des anticorps spécifiques et un récepteur pour les anticorps spécifiques. Ces souris développent une maladie auto-immune rénale (c'est à dire qui résulte d'un dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s'attaquer à l'organisme) et ainsi cause l'accumulation anormale des anticorps dans les reins avec de la protéinurie (présence de protéines dans les urines) et d'hématurie (présence de sang dans les urines) à partir de 12 semaines. Comme il n'existe pas de traitement curatif pour cette maladie, notre laboratoire cherche à développer des nouveaux traitements. Nous avons généré cinq anticorps anti-inflammatoires et l'industrie pharmaceutique nous a sollicité pour des études sur l'animal basées sur nos recherches précèdentes . En effet, nous avons démontré une belle efficacité d'une enzyme, une protéine capable de couper les anticorps et ainsi réduire l'inflammation liée à la maladie. Le problème était que comme il s'agit d'une protéine d'origine bactérienne, il y a une réponse immunitaire contre cette enzyme , des anticorps anti-enzymes bloquant son activité. L'objectif de notre étude est de traiter les souris exprimant la maladie avec les anticorps anti-inflammatoires, des ARN messagers (molécule capable d'induire la production d'une protéase qui est une enzyme (=protéine) capable de cliver les anticorps responsable de la maladie) ou avec des nanoparticules (particules de petite taille) permettant d'induire une tolérance au traitement avec la protéase recombinante d'origine bactérienne. Ces traitements sont bien tolérés sans aucun dommage chez la souris (résultats obtenus au laboratoire). L'objectif est d'évaluer l'action de ces traitements sur les anticorps circulants, sur les dépôts rénauxd'anticorps, l'inflammation tissulaire rénale et sur la protéinurie.

Bénéfices attendus

La néphropathie (ou maladie de Berger) est l'une des premières causes d'insuffisance rénale en France et dans le monde. Cette maladie est causée par une accumulation anormale d'anticorps dans les reins. Il n'existe actuellement pas de traitement spécifique de cette maladie, les patients n'ont que des traitements de suppléance (dialyse, greffe). Le développement d'un traitement pourrait éliminer la cause de la maladie et ainsi pouvoir proposer un traitement curatif. Les traitements proposés chez les souris qui développent la maladie seront une étape pré-clinique cruciale avant le passage à l'homme pour des essais cliniques.

Procédures

Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les anticorps anti-inflammatoires : les souris seront soumises à des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (deux fois par mois). Des prélèvements d'urines (2 fois par mois) les prélèvements seront faits sur animaux non anesthésiés, lors de la contention de la souris, la miction est en général spontanée . Des injections d'anticorps par voie intraveineuse (une fois par semaine pendant 1 mois) seront faites principalement par la veine caudale qui est située sur la queue de l'animal. Le gavage par une sonde gastrique (1 fois par mois pendant 1 mois). Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les ARNmessagers (ARNm) : les souris seront soumises à des injections d'ARNm (une molécule retrouvée dans toutes les cellules qui sera traduite en protéine) principalement par la veine caudale (veine sur la queue) une fois par semaine pendant un mois puis une fois par mois pendant 6 mois. Les prélèvements de sang (au niveau de la veine de la joue) se feront à J0 puis une fois par mois pendant 6 mois, en même temps que les urines. Afin d'évaluer la traitement de la maladie par les nanoparticules : les souris seront soumises à des injections par voie intraveineuse (veine de la queue) 3 fois pendant 1 mois puis à des prélèvements sanguins et d'urines à J0, J1 et J7. De plus, une fois la dose et la voie optimale de traitement déterminée pour les anticorps et l'ARNm, une biopsie rénale sera faite avant traitement sur un petit groupe de souris afin de confirmer définitivement l'efficacité du traitement à la dose optimale.

Impact sur les animaux

Les traitements donnés sont très bien tolérés et bénéfiques pour cette maladie de Berger. Les seules nuisances attendues sont celles liées à la biopsie rénale, aux injections intraveineuse des produits, au gavage et aux prélèvements de sanguins et d'urines. Ceux-ci pourraient occasionner un stress et un inconfort pour la souris de courte durée lors de la contention et de l'injection et de quelques jours pour la biopsie. Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger.

Devenir

A l'issue de chaque traitement, les animaux seront euthanasiés et des analyses complementaires seront réalisées au niveau des reins afin d'évaluer l'inflammation rénale.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un organe en entier dans le cas du developpement de la nephropathie. Le travail à l'échelle de l'organisme en entier est nécessaire, compte tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire et de la fonction rénale. Il est indispensable de travailler sur l'organisme entier, vivant et proche de l'homme pour pouvoir ensuite envisager un traitement curatif chez l'homme.

Réduction

Nous avons estimé qu'il faudra 6 animaux par groupe afin obtenir des résultats statistiquement exploitables et mener à bien notre projet. En effet, nos expériences précèdentes nous ont permis de préciser ce nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Dans le but de répondre à la loi des 3R (Raffiner) et dans un souci de bien-être animal de l'enrichissement (coton, Kraft, tunnels) sera mis en place pour les animaux tout au long de l'expérience pour que les animaux puissent faire des nids. Les souris sont placées sur des portoirs ventilés par groupe de 5 individus. La température, l'hygrométrie , la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours par le personnel technique. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour anticiper toute douleur ou angoisse infligée aux animaux. Les gestes experimentaux seront effectués par une personne compétente. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés 1 fois par semaine par l'expérimentateur ( état général, comportement et pesées). Un analgésique sera administré si l'état de l'animal le nécessite et toutes les 12heures et de façon systématique pendant 3 jours après chirurgie. Si l'animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour développer la maladie de Berger car elle n'exprime pas la maladie, ce qui permet après transgénese c'est à dire la fait d'incorporer des gènes humains dans son génome d'induire et d'exprimer cette maladie en question chez ces souris transgéniques. De plus, son comportement et sa génétique sont largement connus ce qui nous permet une meilleure évaluation et prise en charge de son bien-être tout au long du projet. Il est donc indispensable pour nous d'utiliser ce modèle de souris transgéniques exprimant la maladie pour évaluer l'action et l'efficacité des traitements que nous proposons. A 12 semaines d'âge car c'est à cet âge là que les souris développent la maladie rénale.

Un mois de gavage quotidien pour les souris traitées, une échographie cardiaque et une IRM du cerveau sous anesthésie, des tests moteurs sur tapis roulant et sur cylindre rotatif : 2 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'équipe a créé deux lignées porteuses d'une mutation retrouvée chez des patients atteints d'une maladie mitochondriale, pour décrire leur pathologie et tester des médicaments candidats, dont certains ont déjà été essayés sur des cellules de peau de patients. Les souris mutantes pèsent moins dès le sevrage et deviennent apathiques vers 3 ou 4 mois. Entre 4 et 7 mois, certaines maigrissent brutalement ou s'isolent, signes qui ont déjà conduit l'équipe à les mettre à mort. Dans la grille de suivi, l'isolement vaut à lui seul 3 points, le seuil où la souris est mise à mort.

Objectifs

Les mitochondries jouent le rôle essentiel de centrale énergétique dans nos cellules. Les maladies mitochondriales regroupent de nombreuses pathologies héréditaires qui résultent d'un dysfonctionnement du métabolisme énergétique mitochondrial. Ces pathologies ont été associées à de nombreux symptômes incluant désordres du mouvement, cécité, surdité, épilepsie, accidents vasculaires, atteintes cardiaques ou encore neurodégénérescence. Les maladies mitochondriales peuvent débuter à tout âge, de la naissance, dans l'enfance et chez l’adulte jeune. A ce jour il n’existe pas de traitement curatif pour ces maladies. De ce fait, la recherche dans ce domaine des thérapies pour ces maladies mitochondriales est capitale. Nous avons identifié des médicaments candidats pouvant améliorer le fonctionnement des mitochondries. Certaines de ces molécules prometteuses ont été ensuite testées sur des cellules de peau de patients de maladies mitochondriales. Afin de tester les effets bénéfiques de ces médicaments sur un modèle in vivo, nous avons généré des souris présentant une mutation retrouvée chez des patients humains. Notre objectif principal pour ce projet est donc de caractériser en profondeur la pathologie de ces souris et valider l'efficacité des médicaments candidats identifiés, qui pourront ensuite être testés chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet est justifié d'un point de vue scientifique, car il propose d'étudier les effets de médicaments candidats dans les maladies mitochondriales, maladies qui ne bénéficient pas actuellement de traitements curatifs. Le développement d’une médecine mitochondriale est fortement compromis par l’absence de thérapies efficaces avec un nombre limité d'essais cliniques à ce jour. Raison pour laquelle la recherche sur les pathologies mitochondriales humaines s’oriente aujourd'hui résolument vers la thérapeutique. La présence de mutations pathogènes mitochondriales est responsable de maladies mitochondriales sévères et souvent fatales. Ainsi, déterminer l’impact de plusieurs médicaments pourrait permettre de restaurer le fonctionnement mitochondrial, apparaissant comme un objectif important, qui pourrait déboucher sur des essais cliniques pour les patients souffrant de maladies mitochondriales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (30 minutes, 1 fois); Test de la fonction motrice sur tapis roulant et cylindre rotatif (durée variable en fonction des performances des animaux); Imagerie par Résonance Magnétique du cerveau (sous anesthésie, durée 30 à 60 minutes, 1 fois); Administration des médicaments par gavage à l'aide d'une sonde adaptée (1 fois par jour pendant 1 mois).

Impact sur les animaux

Les souris des deux modèles présentant une mutation que nous allons utiliser sont de nouveaux modèles murins pour lesquels nous décrivons un phénotype pour la première fois. Nos observations montrent que les animaux des deux modèles ont un poids plus faible dès le sevrage, et un comportement apathique qui apparait entre 3 et 4 mois et devient plus marqué au fur et à mesure. Les jeunes souris présentent parfois une dépilation transitoire. Nous avons observé qu'entre l'âge de 4 mois et 7 mois, certains animaux présentent une perte de poids brutale, ou une forte apathie et un isolement qui nous ont conduits à les mettre à mort. Le traitement médicamenteux par gavage pourrait entraîner une irritation de l'oesophage, et nous avons donc prévu de donner au animaux traités accès à de l'eau contenant un antalgique pour prendre en charge la douleur éventuelle.

Devenir

Les reproducteurs seront utilisés pendant leur phase reproductive (2 à 6 mois) puis mis à mort. Pour toutes les autres expériences prévues, tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires humains tels que les fibroblastes de peau pour répondre à certaines questions scientifiques. Cependant ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans les maladies mitochondriales, puisqu'elles ne tiennent pas compte l’ensemble des interactions biologiques existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour la suite du programme de recherche et pouvoir valider et passer aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Aucune expérience inutile ne sera menée. Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, nos expériences solides des méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental par sexe pour la métabolomique. Pour la biologie moléculaire et l'histologie, des groupes de 8 animaux/génotype sont prévus, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux sans compromettre l'obtention de résultats statistiquement valides.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure de Bien-Etre Animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent, et seront pris en charge selon la grille de points limites suivante: Perte de poids 20% = 3 points Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points Isolement: 3 points. A partir de 1 point, un signalement sur la cage avec le numéro de l’animal concerné sera apposé, de telle sorte à ce qu’il y ait une attention particulière lors du contrôle quotidien pour déceler rapidement toute évolution négative, 2 points, surveillance bi-quotidienne de l'animal concerné, 3 points, l’animal est mis à mort en point limite.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le présent projet, la souris que nous utilisons est un modèle de maladie mitochondriale unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des médicaments candidats sur les fonctions mitochondriales dans les tissus habituellement affectés dans ces pathologies, que sont le cerveau, les muscles squelettiques et les coeur. Les animaux utilisés pour la mise en place de l'élevage le seront dans leur phase reproductive (2 mois à 6 mois). Pour la caractérisation de la maladie, les animaux seront utilisés entre les âges de 2 mois et 12 mois. De plus, nous traiterons les souris avec des médicaments candidats de l'âge de 3 mois à 4 mois dans la phase d'expérimentation de traitements potentiels.