Autres troubles humains

1 032 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une parodontite par ligature ou injections répétées dans la gencive, certains subissant une chirurgie stéréotaxique avec injections intracérébrales, un hébergement isolé en cage métabolique et des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, pour tester le lien entre infection buccale et maladies neurodégénératives. Le porteur indique n'attendre qu'un inconfort léger et des saignements gingivaux, sans effet secondaire notable. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux vivants revêt un caractère de "stricte nécessité" et que ces évaluations ne peuvent se faire sans modèle animal.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives regroupent un ensemble de pathologies affectant le système nerveux, dont la plus prévalente est la maladie d’Alzheimer (MA) faisant partie des tauopathies. Dans les tauopathies, la protéine Tau est hyperphosphorylée et présente un repliement anormal, provoquant une perte de sa fonction physiologique et un gain de fonction toxique. La protéine Tau anormale est délocalisée vers le soma puis les dendrites où elle s’accumule, générant une dysfonction synaptique. Ces dernières années, est apparue l’hypothèse qu’une inflammation, progressive et auto-entretenue, du système nerveux central (SNC), peut constituer un terrain favorable à une neurodégénérescence. Les infections périphériques, en agissant sur les processus neuro-inflammatoires, contribueraient au déclenchement et/ou à l’évolution péjorative de ces pathologies. Les parodontites, pathologies buccales infectieuses figurant parmi les affections humaines les plus fréquentes, sont caractérisées par des lésions inflammatoires chroniques des tissus de soutien des dents. Elles sont reconnues comme associées à la progression négatives de diverses pathologies systémiques dont les pathologies neurodégénératives. Cependant le schéma spatio-temporel pouvant lier tauopathies et pathologie infectieuse/inflammatoire périphérique comme la parodontite est encore mal connu. Dans ce contexte général, notre projet vise a investiguer de manière large le schéma spatio-temporel liant infections et inflammation périphériques, neuroinflammation et tauopathie pour mieux définir dans quelle mesure l’immunité innée/adaptative dans le système nerveux central (SNC) mais également les processus immunitaires périphériques sont impliqués dans le développement de la tauopathie. Notre hypothèse est que les infections et/ou inflammations périphériques aggravent voire induisent les signes biologiques et cliniques des tauopathies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l’obtention de données satisfaisantes permettant : - D’identifier les conséquences d’une infection périphérique buccale ou d’une inflammation systémique sur l’initiation ou la progression des tauopathies. - D’élucider des voies mécanistiques liant les tauopathies et les parodontites afin de mettre en évidence des cibles thérapeutiques ou des marqueurs diagnostiques. En effet, l’induction d’une parodontite expérimentale sur un terrain avéré de prédisposition à une pathologie neurodégénérative permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’exacerbation, l’entretien voire le déclenchement de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence chez un individu susceptible. Si la parodontite est un facteur aggravant les tauopathies, alors cliniquement les patients atteints de tauopathies devraient bénéficier d’un examen parodontal et d’une prise en charge parodontale en cas de pathologie détectée. Les données que nous obtiendrons avec ce projet sont importantes pour améliorer à moyen terme la prise en charge globale des patients atteints de tauopathies dont la maladie d’Alzheimer et à long terme la santé orale de ces patients. D’autre part, l’induction d’une parodontite expérimentale chez un animal sans prédisposition permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’induction de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence. Si ce rôle est vérifié, alors cliniquement les patients atteints de parodontite pourrait faire l’objet de dépistage de troubles cognitifs de manière préventive. Il serait alors interessant de pousser la recherche vers des études cliniques en fonction des stades et grades de la parodontite pour déterminer si une catégorie de patient atteint de parodontite serait plus à risque (parodontite sévère de stade III ou IV, à progression rapide grade C par exemple). Compte tenu de la charge mondiale des troubles du déclin cognitif due aux changements démographiques, la recherche et l’identification de facteurs de risque potentiellement modifiables de tauopathies comme proposé dans notre projet fait partie intégrante des efforts de recherche multidisciplinaires. De plus, l’emploi de différents modèles dans notre projet, devrait permettre d’identifier le modèle le plus optimal pour l’analyse des mécanismes et du schéma spatio-temporel des liens entre pathologies neurodégénératives et parodontite et donc raffiner la modélisation pour les études futures.

Procédures

Ce projet comporte 2 procédures chirurgicales (induction de la parodontite, injection par stéréotaxie). L’induction de la parodontite se fera par 2 techniques différentes, l’une nécessitant une seule intervention et un suivi pendant 4 semaines, l’autre nécessitant des injections répétées trois fois par semaine pendant 24 jours. L’emploi de ces deux techniques permet de reproduire des aspects différents de la parodontite (évolution lente ou évolution rapide) pour des groupes d’animaux différents. Pendant cette période, 540 rongeurs bénéficieront d’un suivi à l’aide de cages métaboliques où les animaux seront hébergés seuls afin de déterminer leur balance énergétique. Pour ces deux techniques il sera attendu 10 jours avant de placer les animaux dans les cages métaboliques et une période d’acclimatation d’au moins 48 heures avec de la litière identique à leur cage d’hébergement et dans un espace suffisant au regard de leur poids. La stéréotaxie sera effectuée une seule fois avec pose de canule permettant des injections intracérébrales une fois par jour pendant 6 jours. L’intégralité des animaux seront suivis d’un point de vue comportemental ayant pour objectif de tester les capacités cognitives des animaux. Au cours des deux procédures, des prélèvements sanguins seront effectués une fois par semaine et juste avant la mise à mort sur animaux vigiles pour lesquels la douleur sera prévenue par application d’un anesthésique local. Au cours de la procédure faisant appel à la stéréotaxie, du liquide céphalo-rachidien sera prélevé une fois sur les animaux anesthésiés, avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les procédures chirugicales (induction de parodontite, perfusion ou stéréotaxie) seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Le suivi post-opératoire sera réalisé par du personnel formé au bien-être animal. Les procédures comme la stéréotaxie ou la pose de perfusion sont des procédures courantes dans le laboratoire. Les conséquences attendues sont minimes sur le bien-être animal. Aucun effet secondaire n'est attendu sur les animaux du fait de l’induction de la parodontite. Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger (pose d'une ligature à la base d'une dent, et injections dans la gencive). Une absence de perte de poids consécutive à la pose de ligature est attendue comme dans une étude précédente. Les injections au niveau gingival peuvent entrainer des saignements au point d’injection sans nuisance sur le comportement de l’animal. Les injections seront effectuées de manière lente pour éviter l’apparition de grosseurs/nodules au niveau de la gencive. Dans le cas où certains animaux rencontreraient tout de même des difficultés à l’alimentation, de la nourriture en gel sera mise en place.

Devenir

A l'issue des procédures (P1) et (P2), tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre des analyses des tissus parodontaux et cérébraux.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie des tauopathies en lien avec les performances cognitives et des pathologies induites au niveau périphérique. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité. En effet, nos travaux visent à mettre en lien les atteintes périphériques infectieuses et inflammatoires avec des altérations comportementales, histologiques, biochimiques et moléculaires neuronaux et d’en étudier les facteurs modulateurs au cours du vieillissement. Cela nécessite donc le développement d’approches neurobiologiques intégrées. De plus les modèles expérimentaux sont largement utilisés pour vérifier les hypothèses biologiques de la relation entre la parodontite et d’autres maladies systémiques pour permettre le contrôle de facteurs étiologiques supposés. Ces évaluations particulières ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de notre protocole sur les 5 ans à venir est donc estimé à 1632 (1032 souris et 600 rats). Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera effectuée pour la mise au point des modèles de parodontite. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R. De plus les animaux seront utilisés pour plusieurs interventions au sein des procédures expérimentales afin de réduire leur nombre. Pour l’étude statistique, une comparaison des groupes d’animaux deux à deux entre les animaux contrôles et les animaux tests sera effectuée.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au moins 1 fois par semaine, par du personnel spécialement formé. Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition: blocs à ronger pour les rats, coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées, après une prémédication analgésique, sous anesthésie générale par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique complémentaire sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront sacrifiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.

Choix des espèces

Ces espèces sont utilisées parce que rats et souris peuvent être évalués par des méthodes comportementales et être génétiquement modifiés par injections de vecteurs viraux ou transgénèse. Les souris transgéniques utilisées dans notre protocole reproduisent un certain nombre d’altérations retrouvées dans la Maladie d’Alzheimer et les tauopathies (lésions amyloïdes : APP/PS1dE9, APPP KI, hyperphosphorylation/troncation, agrégation/altération d’épissage/perte de fonction de la protéine Tau : THY-Tau22, THY-Tau30, TauKO, Tau-KI, MiniTau. Le parodonte des rongeurs et notamment du rat est assez similaire à celui de l'homme notamment d’un point de vue anatomique dans la région molaire. L’avantage de ce modèle animal est aussi de pouvoir mener une étude sur des groupes homogènes et alors minimiser les effets de la variabilité biologique. Dans la plupart des expérimentations, les souris et les rats seront utilisées à l’âge adulte : entre 2 mois à 12 mois.

102 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous la peau du dos des racines de dents humaines remplies d'un hydrogel ou de sang, pour quatre à douze semaines, avant de les tuer et de prélever les échantillons pour analyse. Le porteur décrit une douleur post-chirurgicale, un stress lié aux points de suture et une anxiété qu'il présente comme "attendue dans toute expérimentation animale". L'objectif est de valider un gel de revitalisation des dents nécrosées comme alternative à la dévitalisation chez de jeunes patients.

Objectifs

L’acte de dévitaliser les dents sur de jeunes patients peut-être éviter en préférant une thérapie régénérative (Traitement Endodontique Régénératif (TER) ou revitalisation pulpaire). Ce traitement se base sur l’obtention d’un tissu vascularisé à partir d’un caillot sanguin formé à l’intérieur de la racine de la dent nécrosée. Pour favoriser le développement d’un tissu de type pulpe dentaire à partir d’un caillot sanguin, au sein de notre laboratoire , a été développé un gel injectable dans la racine de la dent. Les études in vitro ont démontré la capacité de ces matrices sous forme de gel à former un tissu similaire à la pulpe dentaire, vascularisé et organisé. L’étape suivante vise à évaluer et à étudier le tissu formé dans des conditions in vivo chez le rat. Le modèle in vivo consiste en l’implantation sous-cutanée dans le dos du rat, de racines des dents humaines remplies avec les matériaux de revitalisation pulpaire. Pour notre étude, 10 racines remplies avec du gel (groupe test) et 10 racines remplies avec du sang (groupe contrôle) seront implantés sur 10 animaux par groupe. Chaque animal sera implanté avec 2 échantillons selon un modèle en split mouth : un échantillon « contrôle » et un échantillon « test ». Après la fin de la période d’implantation une étude histologique des tissus néoformés dans les racines sera réalisée. L’ensemble de ces résultats seront comparés avec les résultats des études in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans la continuité de l’étude des effets des biomatériaux pour la revitalisation pulpaire. Les bénéfices attendus de ce projet sont l’obtention d’un tissu en condition proche de la clinique dont les caractéristiques en termes de cellules, de fibres et de formation de vaisseaux sanguins et nerveux seraient proches de celles de la pulpe dentaire. L’étude de la formation du tissu par l’hydrogel en condition in vivo nous permettrait de valider la capacité de l’hydrogel à recréer un tissu proche de la pulpe qui pourrait ensuite être appliqué en condition réelle à l’intérieur de la dent d’un patient, afin de remplacer le processus de dévitalisation.

Procédures

Implantation sous cutanée des échanitillons dans la loge dorsale de l'animal pour une période de 4 et 12 semaines. Dans chaque animal nous allons implanter 2 échantillons - un échantillon "test" et un échantillon "contrôle". Après les deux périodes d'implantation les animaux seront autanasiés et les échantillons prélévés pour une étude histologique et immunohistochimique.

Impact sur les animaux

- Douleur post chirurgicale au niveau du site opératoire (gonflement, inflammation) due à la cicatrisation - Stress physique provoqué par les points de suture au niveau des incisions (excitation, comportement anormal des animaux qui peuvent essayer de se retirer les points) - L’anxiété est un effet indésirable attendu comme dans toute expérimentation animale.-

Devenir

A la fin des deux périodes d'implantation, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération et analyse des échantillons

Remplacement

Ce projet de recherche s’inscrit dans la suite d’études expérimentales in vitro concluantes qui peuvent donner lieu à l’application chez l’homme des biomatériaux proposés. C’est pourquoi, des études sur le petit animal doivent être entreprises pour confirmer le bénéfice in vivo et informer d’éventuels biais non révélés in vitro. Il n’existe pas d’alternatives non animales pour réaliser ce test in vivo. L’implantation de l’hydrogel à base de fibrinogène et du sang dans la racine dentaire humaine permettra de réaliser le test in vivo directement sur l’environnement du produit dans lequel il sera appliqué. En effet, cliniquement, l’hydrogel sera en contact avec le sang de l’hôte pour permettre la formation d’un tissu similaire à la pulpe dentaire humaine. L’implantation de nos échantillons dans le dos du rat offre un environnement avec des conditions de vascularisation similaire à la réalité clinique, ce qui augmente la significativité des résultats.

Réduction

La taille d’échantillon utilisé (racine dentaire humaine 10mm) nous permet d’implanter maximum 2 échantillons dans la loge sous-cutanée thoracique dorsale de deux côtés de la colonne vertébrale par animal. Ansi dans un animal nous allons implanter un échantillon "test" et un échantillon "controle". Cela va diviser par deux le nombre d' animaux necessaires pour tous les tests. Le résultat du nombre de sujets nécessaires est de 10 par groupe (soit 20 échantillons implantés) et par la période d’implantation pour l’étude principale et de deux animaux pour l’étude préliminaire au total 102 animaux. Cela détermine un nombre d' animaux implantés pour l’étude principale égal à 100. Les résultats seront groupés dans des fiches individuelles pour chaque animal.

Raffinement

les animaux seront isolés en post-opératoire afin d'éviter tout risque de blessure.Les rats disposeront dans leurs cages individuelles de modules de cœur de bois de peuplier qui permettent de développer l’activité d’exploration de l’animal et de participer à son bien être. L'environnement du rongeur est également enrichi avec frisottis de papier qui stimule les instincts de nidification et d'exploration de jeu. Le rythme circadien des rongeurs sera respecté. Les procédures ne débuteront que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement.Visites quotidiennes par le personnel qualifié de l’animalerie. Utilisation d'un anesthésique local en début de toute chirurgie .Mise en place d’un protocole antalgique adapté . En cas de signes clinique d'infection du site opératoire, nous lui administrerons un antibiotique.Mise en place d’une grille de score ,utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance .

Choix des espèces

Le rat est un animal dont la taille et les proportions permettent la mise en place d’un protocole chirurgical pour l’implantation des racines dentaires humaines avec ces dimensions déterminées dans le dos du rat. L’implantation des biomateriaux pour la revitalisation de la pulpe dentaire et du sang dans la racine dentaire humaine permettra de réaliser le test in vivo directement sur l’environnement du produit dans lequel il sera appliqué. De plus le rat est un animal connu pour la rapidité de cicatrisation, sa résistance à la douleur et aux infections ainsi que sa bonne tolérance à l’anesthésie. Le rat dispose d'une qualité tissulaire proche de celle de l’homme ce qui nous permettra d’obtenir des conditions expérimentales proches des situations cliniques, augmentant ainsi la significativité des résultats. Animaux adultes : la taille suffisante pour l’implantation de deux échantillons par animal.

150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.

Procédures

1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

72 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de l'oreille interne d'une à deux heures sous anesthésie, une injection de vecteur viral, des prises de sang et des prélèvements de liquide cérébrospinal, pour tester une thérapie génique de la surdité avant un passage chez l'Homme. Le porteur indique des effets possibles comme une perte d'équilibre et un nystagmus transitoires, et décrit ce projet comme "indispensable" au dossier réglementaire de première administration humaine. Il affirme que la souris ne permet pas cette translation et conclut à la "nécessité" du primate.

Objectifs

Le projet est réalisé pour vérifier et optimiser la transduction du vecteur viral (soit le composé d’intérêt de la thérapie génique développée), d’en évaluer l’impact sur la fonction auditive ainsi que sa sécurité chez le PNH afin de préparer, chez l’Homme, la restauration de la fonction auditive, en cas de surdité profonde héréditaire, à l’aide du vecteur précédemment sélectionné. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme et fait partie des dossiers présentés aux autorités.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet, le traitement pourra être testé en clinique, avec l’objectif ultime de palier la surdité tout en préservant la structure de l’oreille interne, laissant ainsi la possibilité pour le patient d’avoir ultérieurement un autre traitement tel que la pose d’un impant cochléaire par exemple.

Procédures

Chirurgie : sur animaux sous anesthésie générale, tous les animaux de l’étude, selon les protocoles d’usage vétérinaire. Considérant que la procédure chirurgicale commence avec l’anesthésie de l’animal et se termine au réveil de l’animal, la durée de chirurgie est estimée entre 1 heure (traitement unilatéral) et 2 heures (traitement bi-latéral). Prises de sang : sur animal vigile, tous les animaux de l’étude, contention manuelle, nombre de prélèvements selon les études mais toujours 1) dans le respect du volume maximal prélevable et 2) avec un temps de récupération des animaux entre 2 prises de sang. Les prises de sang, incluant la durée de contention de l’animal, sont de courte durée (environ 1 à 2 minutes) Liquide de l’oreille, liquide cerebrospinal : sur animal sous anesthésie générale ou à la nécropsie, tous les animaux de l’étude, 1 prélèvement par occasion, au maximum 2 occasions par animal (à la chirurgie et à la nécropsie)

Impact sur les animaux

Les nuisances correspondent essentiellement à la chirurgie et aux conséquences de la chirurgie. Suite à la chirurgie, et selon sa durée (si traitement uni- ou bi-latéral, durée entre 1h et 2h), les animaux peuvent présenter une phase de réveil plus ou moins longue (variabilité inter individuelle), toujours sous surveillance étroite des techniciens et l’appui des vétérinaires. Il est possible qu’après la chirurgie, les animaux présentent une baisse légère et ponctuelle de leur prise alimentaire et de leur poids. Les effets indésirables potentiels sont une perte d’équilibre et/ou un nystagmus (mouvement d'oscillation involontaire et saccadé du globe oculaire) transitoire(s). Dans tous les cas, une analgésie et une surveillance péri-opératoire sont mis en place (ex : les animaux sont suivis quotidiennement avec plusieurs examens quotidiens sur au moins 10 jours post-chirurgie avec contrôle vétérinaire).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la collecte de tissus, fluides pour évaluer la toxicité du test item, la biodistribution du test item.

Remplacement

Il n'existe pas de système in vitro à l'heure actuelle pour la validation de l’efficacité et de la sécurité de la transduction des différents sérotypes de vecteurs viraux présélectionnés dans le modèle murin. Nécessité d’optimiser la chirurgie, la dose et le sérotype viral chez le PNH afin de pouvoir ensuite transférer cette stratégie à l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux est estimé en fonction de la variation attendue concernant les différents paramètres explorés : transduction du vecteur dans les cellules ciliées, modification des seuils en PEA. Cette estimation du nombre a été déterminée pour permettre la détection d'une différence de 10% minimum de transduction virale entre les cellules ciliées des cochlées et pouvoir détecter une éventuelle variation de 10 dB à deux fréquences sur les PEA des oreilles injectées et non injectées afin de vérifier l'absence d'effets indésirables de la technique et/ou du virus pouvant causer une perte de l'audition. Les tests statistiques seront choisis en fonction des paramètres comparés. Cette procédure permet d'optimiser le nombre d'animaux utilisés dans chaque série, soit en utilisant les deux oreilles avec une condition différente pour chacune, soit en utilisant à chaque fois l'oreille controlatérale comme témoin expérimental.

Raffinement

Pendant la phase pré-opératoire et de réveil et ensuite pendant au moins 10 jours après la chirurgie, sont surveillés étroitement : l’activité et la mobilité dans les volières des animaux, les interactions sociales et les expressions faciales, l’apparence physique (aspect de la fourrure traduisant les phases de toilettage entre congénères, poils drus), les éventuels écoulements nasaux et/ou oculaires, les postures inhabituelles, la réponse aux stimuli, la consommation alimentaire, le poids, le clignement des yeux/mobilité des paupières (signes cliniques de paralysie faciale, en raison de la chirurgie intracochléaire), par les techniciens avec l’appui des vétérinaires. A chaque paramètre évalué est associé un score de sévérité. La somme permet de définir un score total. Selon le résultat, le vétérinaire est consulté pour mise en place des soins pour soulager l’animal (ex. traitement anti-inflammatoire). Par exemple, en cas de dessèchement de l’oeil, une pommade (Ocrygel ou équivalent) sera utilisée. Egalement, suite à la chirurgie, des rations additionnelles de fruits et de légumes peuvent être proposées aux animaux pour favoriser la prise alimentaire dès 24 heures après la chirurgie afin d’éviter la perte de poids, et les animaux peuvent être regroupés dès leur réveil complet après chirurgie pour permettre les interactions physiques entre congénères et favoriser le retour au comportement physiologique, dont la consommation de fruits/légumes. S’ajoute également le suivi quotidien de la fréquence cardiaque et de la température corporelle sur ces 10 jours (et plus si l’état de l’animal l’exige). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se feront sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. Leur état de santé sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.Les animaux seront hébergés au minimum par deux et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Les études préalables menées chez la souris ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’Homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’oreille comparable à celle de l’Homme. Le choix de macaca fascicularis est justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système auditif, une dimension et une structure de l’oreille moyenne et interne comparable à celles de l’Homme. Des études préalables ont également mis en évidence une différence morphologique critique entre l’oreille moyenne de souris et celle de macaque. Seuls ces derniers présentent une structure de la fenêtre ovale similaire à ce que l’on retrouve chez l’Homme (absence d’artère stapédienne qui existe chez la souris) et permet de rendre possible la translation de la technique d’injection locale dans l’oreille interne à l'Homme. Animaux (2 à 6 ans). La nécessité de travailler avec des animaux de cet âge est de pouvoir avoir un système auditif bien développé au moment de l’étude.

200 chiens, cochons et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins et des chirurgies d'implantation de dispositifs urologiques pouvant durer plusieurs heures sous anesthésie, avant une mise à mort suivie de nécropsie et d'examen des tissus. Le porteur décrit des suites post-opératoires douloureuses pouvant durer plusieurs jours selon l'invasivité. Il affirme que l'expérimentation sur "organisme entier" est "incontournable" et relève d'une "obligation règlementaire" pour valider ces dispositifs implantables.

Objectifs

La chirurgie uro-néphrologique s’est développée rapidement dans la deuxième moitié du XXème siècle avec par exemple l’avènement de la transplantation rénale (années 60-70), ou encore de l’hémodialyse (années 50-60) permettant de sauver des millions de personnes par an, le développement de nouvelles technologies comme les circuits extracorporels avec filtre de dialyse permettant la déviation du sang vers un filtre externe et ainsi sa purification artificielle. Il est possible dès lors de pallier des dysfonctions importantes du rein par exemple. De même, le traitement des affections prostatiques, tumorales par exemple a fait des progrès immense grâce par exemple à l’avènement de techniques chirurgicales peu invasives. Les progrès diagnostiques et thérapeutiques se développent rapidement pour l’ensemble des organes de l’appareil urinaire et ses annexes. L’évaluation et le développement de nouvelles méthodes, molécules, dispositifs et techniques pour les affections de l’appareil urinaire et ses annexes par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessitent une phase de recherche pré-clinique et développement qui permet de mettre au point ces méthodes et d’en vérifier leur sécurité. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. Les différentes versions de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites postopératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients humains représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être de tous les stades de développement : juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

12 chiennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendues à leurs propriétaires. Amenées dans un centre hospitalier vétérinaire pour une ovariectomie de convenance, elles reçoivent par voie intraveineuse un analgésique en développement à la place de la méthadone habituelle, avec jusqu'à trois prises de sang. Le porteur décrit la chienne comme un bon modèle de douleur post-opératoire et attend de l'essai la dose efficace du produit, chez l'humain à moyen terme. Il écarte le remplacement en affirmant que l'évaluation repose sur des observations comportementales impossibles sans animal vivant.

Objectifs

Notre laboratoire est en cours de développement d’un analgésique non opioïde, pour le traitement des douleurs aiguës et chroniques de forte intensité et/ou réfractaire aux autres analgésiques. Le développement clinique initial se concentre sur le traitement des douleurs post-chirurgicales pour lesquelles une prise en charge adaptée est nécessaire. Dans ce cadre, il est couramment noté que la réduction de la douleur post-opératoire diminue l’anxiété et l’inconfort des patients et contribue à une meilleure récupération post-opératoire aussi bien chez les animaux que chez l’homme. Actuellement, les molécules utilisées en routine pour traiter les douleurs postchirurgicales chez le chien comme chez l’homme comprennent l’utilisation de médicaments de type opioïdes/morphiniques associés à des anti-inflammatoires et des analgésiques non opioïdes comme les anti-inflammatoires non stéroïdiens, médicaments inhibiteurs de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline, paracétamol, prégabaline. Concernant les anti-inflammatoires, leurs effets indésirables incluent des troubles gastro-intestinaux (les plus fréquents) et plus rarement des troubles rénaux ou hépatiques. Bien que les protocoles analgésiques varient selon les cliniques vétérinaires, les opioïdes sont souvent la pierre angulaire de la thérapie analgésique post-opératoire. Malgré leurs avantages, les effets indésirables des opioïdes chez le chien incluent la bradycardie, l’hypoventilation, le reflux gastro-oesophagien et la dysphorie. En situation postopératoire, les effets indésirables de type dysphorie, nausées, vomissements, iléus comptent parmi les plus fréquents. De plus, la fréquence élevée de l’addiction aux opioïdes chez l’homme et la « crise des opioïdes » aux Etats-Unis pourraient contribuer à une limitation des opioïdes en médecine vétérinaire. La molécule innovante que nous développons a déjà montré des effets analgésiques chez les Rongeurs de laboratoire. Les essais de toxicité et de pharmacologie de sécurité sont en cours et donnent des résultats encourageants. Les doses toxiques chez le chien sont connues. Nous devons déterminer la dose efficace chez le chien pour développer des essais d’effet/dose et en vue d’une application chez le chien voire chez l’homme à moyen terme.

Bénéfices attendus

De cet essai nous attendons de connaître la dose efficace pour traiter la douleur post-opératoire chez la chienne, qui est un bon modèle de douleur post-opératoire.

Procédures

Les sujets d'études sont des chiennes que leur proprétaires conduisent dans un centre hospitalier vétérinaire pour une ovariectomie, dans le but de les stériliser. Notre protocole conduit à essayer un produit analgésique innovant à la place de la méthadone qui est généralement administrée par voie intra veineuse chez les chiennes. Notre produit sera administré par voie intra-veineuse au même moment, à la place de la méthadone. L'ovariectomie sera réalisée exactement de la même façon que pour toute chienne prise en charge dans un centre hospitalier vétérinaire. Une telle intervention chirurgical dure 30 minutes en moyenne. Elle se déroule sous anesthésie générale. La totalité de la prise en charge de la chienne dure 24h entre le moment où elle arrive dans l'établissement, jusqu'au moment où elle ressort. Entre temps, elle reçoit les injections de la préanesthésie 15 minutes avant l'intervention, puis elle est opérée. Elle reçoit ensuite les injections post-opératoires, et 3 prises de sang sont réalisées au maximum, ce qui représente une contrainte d'une à deux minutes à chaquef fois.

Impact sur les animaux

Notre essai est réalisé en tant qu'essai préclinique de terrain, dans un contexte d'une chirurgie demandée par le propriétaire de l'animal pour sa stérilisation. Les nuisances ou effets indésirables liés au caractère expérimental de notre essai sont les suivants : - effets indésirables éventuels liés à la molécule administrée, puisqu'il est en cours de développement : il pourrait provoquer un inconfort transitoire mais jusqu’ici aucun effet indésirable n’a été observé - maintien de la chienne en hospitalisation quelques heures de plus que la durée d'hospitalisation normale pour une chienne venue pour la stérilisation. Nous pouvons être amenés à garder la chienne pour observations pendant la nuit qui suit l'intervention et la rendre le lendemain en fin matinée. Des critères d'intervention très précoces sont déterminés pour éviter toute souffrance inutile des chiennes si le produit n'est pas efficace. Dans ce cas, un antalgique de référence est administré rapidement. D'autre part, en cas d'incident, qu'il soit dû au produit testé ou non, la chienne est confiée à un service de soins intensifs dans un centre hospitalier vétérinaire performant.

Devenir

Le projet ne se déroule pas dans un laboratoire, mais sur le terrain, parmi la clientèle d'un centre hospitalier vétérinaire, sur la base d'un consentement libre et éclairé des propriétaires. Les animaux ne sont donc jamais dans aucun laboratoire, ils arrivent au centre hospitalier vétérinaire le jour de leur opération et retournent dans leur foyer le lendemain de l'opération.

Remplacement

Nous réalisons un essai clinique très précoce (qui s'assimile aux essais de phase I ou II chez l'Homme) pour connaître une dose efficace d'un analgésique. L'évaluation de l'efficacité se fait par des observations comportementales qui ne sont possibles que chez un animal vivant.

Réduction

Le calcul de la taille de l'échantillon a été effectué afin de déterminer le nombre minimum de cohortes incluses qui conduira à une recommandation de traitement avec la véritable dose efficace. Les simulations se base sur l'hypothèse que les scores de douleur suivent une distribution normale.

Raffinement

Les chiennes sont accueillies et prises en charge exactement comme toutes les chiennes qui viennent dans le centre hospitalier vétérinaire. Notre essai ne modifie rien dans tous les éléments techniques. Pour les 3 cohortes de 4 chiennes, nous substituons notre produit à l'analgésique couramment utilisé. Les chiennes sont donc hébergées dans un chenil hospitalier où elles arrivent à jeun. Elles sont opérées et le réveil, ainsi que toute la phase postopératoire sont suivis très attentivement. Au bout de 2 à 3h, si la chienne est bien réveillée, elle peut boire et manger. Ensuite, elle est gardée dans une cage confortable. Les propriétaires sont invités à lui apporter des objets familiers et peuvent lui rendre visite. La chienne est promenée en dehors de la cage pour lui permettre de faire ses besoins à l'extérieur. Elle est rendue à ses propriétaires dès le lendemain matin. Des critères d'intervention très précoces sont déterminés pour éviter toute souffrance inutile des chiennes si le produit n'est pas efficace. Dans ce cas, un antalgique de référence est administré rapidement. D'autre part, en cas d'incident, qu'il soit dû au produit testé ou non, la chienne est confiée à un service de soins intensifs dans un centre hospitalier vétérinaire performant. L'étude s'arrête là pour l'animal, qui est ainsi soigné. C'est le point limite de l'étude.

Choix des espèces

Cet essai est réalisé chez le chien qui est une espèce cible de ce produit. C'est donc sur ce modèle que sera déterminée la dose efficace. Nous incluons des chiennes adultes qui auront au moins 6 mois âge auquel elles ont eut les premières chaleurs et auquel les propriétaires viennent généralement pour une stérilisation.