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Programme d’immunisation de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux
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3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.
Procédures
Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Analyse des effets de monocytes modifiés sur la croissance de tumeurs chez la souris
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5 496 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales et de monocytes génétiquement modifiés, des séances d'imagerie sous anesthésie deux fois par semaine et développent des tumeurs sous-cutanées mesurées régulièrement. Le porteur indique qu'une partie des protocoles provoque une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et perte de poils, et que tous les animaux sont tués pour analyse des organes. Il revendique des résultats in vitro "très encourageants" en coculture 3D mais conclut au "besoin" de passer par la souris, et renvoie les retombées cliniques au conditionnel.
Objectifs
Le développement constant des immunothérapies contribue fortement à l’amélioration et au progrès liés au traitement des cancers. Nous développons des approches cherchant à mobiliser les cellules myéloïdes (la lignée des cellules myéloïdes est produite dans la moelle osseuse et donne naissance à plusieurs types de cellules sanguines dont les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques) pour stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale et ainsi contrôler le développement de la tumeur. Nous souhaitons modifier génétiquement les monocytes pour augmenter leur capacité à stimuler la réponse immunitaire et évaluer leur efficacité antitumorale dans des modèles de souris portant des tumeurs. Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous avons pour but 1) d’optimiser ce type de traitement en cherchant à déterminer quel est le devenir des monocytes modifiés in vivo (localisation, survie, état), 2) déterminer leur mode d’action contre les tumeurs et 3) leur capacité à modifier le microenvironnement tumoral qui est par nature inhibiteur du système immunitaire. Par la mise en place de différents modèles d’injection des cellules tumorales et des CAR monocytes, nous étudierons à la fois la capacité des CAR monocytes à contrôler directement la croissance tumorale en favorisant l’interaction entre les deux types de cellules mais aussi le recrutement des CAR monocytes au sein de la tumeur et leur action sur la progression tumorale en injectant les CAR monocytes de manière systémique. Nous pourrons distinguer donc si les CAR myéloides sont capables de passer d’un compartiment/organe à la tumeur via le système sanguin. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous voulons avant tout acquérir des connaissances importantes qui pourront ensuite être utilisées en clinique pour le traitement du cancer. Les possibilités de traitement d'une tumeur solide sont jusqu'à présent plutôt limitées et parfois moins efficaces. L'approche thérapeutique avec les CAR monocytes et autres monocytes génétiquement modifiés promet d'être plus efficace tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires et surtout de permettre le traitement de cancers qui étaient jusqu'à présent difficiles ou impossibles à traiter. En effet, nos approches pourraient permettre de réduire certaines toxicités liées à l’utilisation d’autres approches de l’immunothérapie comme des cellules CAR T (lymphocytes T modifiés génétiquement), telles que l’apparition d’une suractivation du système immunitaire appelée orage cytokinique. L'avantage des CAR monocytes est avant tout qu'ils seront recrutés plus facilement au sein de la tumeur et qu'ils peuvent ainsi interagir directement avec les cellules tumorales mais aussi avec les cellules immunitaires alentour. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer « du système immunitaire. Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.
Procédures
Pour évaluer la capacité des CAR myeloides à contrôler la croissance tumorale et en se basant sur des recherches publiées (Klichinsky et al, 2020), nous injecterons les cellules tumorales et les CAR monocytes directement dans l’abdomen des souris (voie intrapéritonéale) permettant de suivre via un système d’imagerie le contrôle de la croissance tumorale. Les cellules tumorales injectées exprimant la luciferase, de la luciferin sera injectée par voie intra-péritonéale (1,5mg par souris de 20g). Les souris seront anesthésiées avec de l’Isofluorane (entre 2,5 et 3%) puis imagées via IVIS. L’anesthésie aura une durée de 10 minutes. Les souris seront imagées 2 fois par semaine. Pour évaluer la localisation, la persistance et le recrutement des cellules utilisées comme traitement, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale, intraperitoneale ou intraveineuse. (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec). Pour évaluer l’effet du traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie intraveineuse aux animaux vigiles (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis les animaux seront traités 1 fois avec des CAR myeloides injectées par voie intraveineuse. Pour évaluer le traitement dans d’autres modèles de tumeurs, les cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inf à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale ou intraveineuse. Dans certaines expériences, nous utiliserons une chirurgie courte (20min) sous anesthésie (1h) pour implanter de manière orthotopique des cellules tumorales pancréatiques afin de mettre en place un modèle plus fidèle afin de valider notre thérapie cellulaire. Nous administrerons le traitement cellulaire par voie intraveineuse (durée du geste inf à 10 sec). Pour comprendre comment fonctionne notre traitement, les animaux seront injectés 1 fois avec les cellules tumorales par voie sous cutanée. Le traitement sera injectée 1 fois par voie intratumorale ou intraveineuse et les cellules effectrices 1 fois par voie intraveineuse (durée de chaque geste inf à 10 sec).
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires transplantées attaquent le corps du receveur, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Comme nous avons déjà réalisé ce type d’expérience dans notre laboratoire, nous pouvons bien nous préparer et nous connaissons les signes pour éviter la douleur et la souffrance. Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules par voie intraveineuse ou sous cutanée seront celles liées à l’injection.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo
Remplacement
Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet avec des monocytes modifiés ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroides qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet car il est important de considérer l'interaction des monocytes CAR avec les cellules tumorales dans un organisme entier et d’évaluer les éventuelles toxicités.
Réduction
En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les tumeurs sous-cutanées seront mesurées minimum 2 fois par semaine afin de s’assurer qu’elles ne dépassent pas la taille maximale entrainant le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. L'intervention chirurgicale est réalisée dans des conditions aussi stériles que possible et par un personnel spécialement formé à cet effet. Un traitement anti-douleur standardisé et un contrôle régulier des animaux après l'intervention sont effectués. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score définie pour le projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques ou des compléments alimentaires.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 6 semaines afin que les souris aient atteint la maturité sexuelle, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Développement d’un traitement innovant de la drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une drépanocytose, elles reçoivent des injections sous anesthésie et, pour une partie, sont placées trois heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène afin de déclencher des crises d'occlusion des vaisseaux, avant une mise à mort sans réveil. Le porteur reconnaît que ces crises provoquent douleur, perte de poids et baisse de mobilité, atténuées par un antidouleur puissant. Il affirme que la complexité des crises vaso-occlusives ne peut être reproduite in vitro et que seule cette souris génétiquement modifiée reproduit fidèlement la maladie.
Objectifs
L’un des projets de recherche de notre unité de recherche consiste à développer un nouveau traitement contre la drépanocytose, une maladie génétique du sang qui touche les globules rouges et qui est associée à des complications récurrentes, graves et parfois mortelles. De plus, l’espérance de vie des patients drépanocytaires est réduite. Actuellement, cette maladie ne peut pas être guérie et elle se traite très difficilement. Ceci souligne le besoin pour les patients de pouvoir bénéficier de nouveaux traitements plus efficaces, ou qui pourraient être utilisés en combinaison avec les médicaments déjà existants, pour augmenter leur efficacité. Dans ce projet, nous nous proposons de démontrer l’efficacité de plusieurs médicaments que nous avons avons développés au laboratoire. Nous souhaitons également déterminer comment, et à quelle dose, devront être pris ces potentiels médicaments, lors de futures études cliniques chez les patients drépanocytaires. La drépanocytose étant une maladie particulièrement complexe, nous devrons tester nos molécules chez des souris drépanocytaires, qui sont les seuls animaux disponibles qui reproduisent fidèlement la maladie chez l'Homme. Si les résultats obtenus chez la souris sont convaincants, nous poursuivrons ensuite les tests de ce médicament potentiel, chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Si nos résultats sont positifs, ce projet pourrait clairement avoir un bénéfice pour la qualité de vie et l'espérance des patients drépanocytaires. Nous avons, d'ailleurs, obtenu un financement par une entreprise pharmaceutique qui est intéressée pour développer nos médicaments et les tester chez les patients.
Procédures
Une partie des souris utilisées (drépanocytaires ou non) seront injectées (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis au maximum 2 prélèvements de sang (durée de 30 s chacun) seront réalisés sous anesthésie générale. Les souris seront immédiatement mises à mort, sans retour à la conscience, après le dernier prélèvement de sang. Pour une des interventions cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 2 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis seront placées, ou non, dans des conditions dans lesquelles l'oxygène de l'air sera diminué (de 21 à 8%), pendant 3 h, et enfin replacées à l'air ambiant pendant 1 h. Toutes les souris seront ensuite immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), le sang sera prélevé (durée d’1 minute), et les souris euthanasiées. Finalement, les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés. Pour l’autre intervention cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 3 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, et 3 h après la dernière injection, toutes les souris seront immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), et le sang sera prélevé (durée d’1 minute). Les souris seront finalement euthanasiées et les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les souris drépanocytaires développent une maladie similaire à la drépanocytose humaine, avec en particulier une anémie chronique, mais sans effet majeur chez des souris jeunes (< 10 semaines), qui ont été choisies pour notre projet. Au cours de leur 10 semaines de vie, les souris drépanocytaires pourront développer des "crises vaso-occlusives" (comme les patients), engendrant pendant quelques jours une douleur, une perte de poids, une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Ces crises sont transitoires, mais seront soulagées avec l'administration d'un anti-douleurs puissant. De même, quand nous induirons les crises vaso-occlusives chez les souris drépanocytaires, ceci engendrera une douleur d'une durée au maximum égale à la durée de l'intervention (3-4 h), ainsi qu'une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Cette douleur sera prise en charge par administration préventive d'un anti-douleur puissant, avant le déclenchement de la crise. Dans ce projet, d'autres nuisances sont attendues pour les souris drépanocytaires ou non drépanocytaires, et sont liées à la préhension/contention des animaux, aux injections (introduction d'une aiguille sous anesthésie), ainsi qu’au prélèvement final de sang, à la perfusion intracardiaque, au prélèvement d’organes, et au sacrifice (tous sous anesthésie).
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront systématiquement euthanasiées en fin d'expériences. En effet, des analyses post-mortem sur des organes seront nécessaires pour certaines expériences. Pour le reste des expériences, les souris drépanocytaires (génétiquement modifiées), ou non drépanocytaires, ne pourront être ré-utilisées ou replacées car elles auront été injectées avec des molécules expérimentales dont les effets à long terme ne sont pas connus.
Remplacement
Les crises vaso-occlusives (CVOs) chez les patients drépanocytaires sont très complexes. Les cellules constituant les vaisseaux sanguins, mais également de nombreux types de cellules sanguines différentes, sont impliquées dans les mécanismes qui déclenchent ces crises. Ce système complexe ne peut à l'heure actuelle être remplacé par des systèmes in vitro, étant données les interactions multiples qui existent entre toutes ces cellules. L'évaluation de l'efficacité de nouveaux traitements dans la drépanocytose nécessite donc le recours à un modèle animal de cette maladie, et la souris est le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible.
Réduction
Le but de notre projet est de déterminer si nos molécules pourraient être utilisées chez les patients drépanocytaires, avec des injections les moins fréquentes possibles, et si oui, à quelle dose. Dans un premier temps, nous partirons d'un dose classiquement utilisée en thérapeutique pour d'autres maladies, et nous évaluerons quelles molécules restent détectables dans le sang 96 h après l'injection, à cette dose. Seules les molécules respectant ce critère seront étudiées plus en détail dans ce projet, ce qui permettra de limiter le nombre de molécules testées, et donc le nombre de souris utilisées. Ces molécules seront ensuite testées pour savoir si elles sont efficaces pour limiter l’ampleur des crises vaso-occlusives chez des souris drépanocytaires. Pour répondre à cette question, le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé en nous basant sur des expériences similaires qui nous ont ensuite permis d’utiliser des logiciels de statistiques spécifiques pour estimer ce nombre. Au total, 360 souris devront ainsi être utilisées, mais uniquement si toutes les molécules répondent à nos critères initiaux. De plus, le maximum d’organes seront prélevés pour ne pas avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris. Il est aussi prévu, en fin de nos expériences, de prélever une quantité de sang suffisante pour pouvoir répéter les analyses sur le sang, sans avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, un enrichissement est prévu dans les cages. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, avec un nombre d’individus par cage compris entre 3 et 5 (pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une population trop importante). Toute injection ou tout prélèvement sera effectué sous anesthésie générale. Lors des modèles d'induction des crises vaso-occlusives (CVOs) chez les souris drépanocytaires, qui sont douloureuses, les animaux resteront sous la surveillance continuelle de l'expérimentateur, et tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, seront recherchés. Si ces changements et ces signes sont trop importants, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Surtout, un médicament anti-douleur très puissant sera administré aux souris, en prévention, avant de déclencher la CVO. Il est également possible que les souris drépanocytaires élevées dans notre animalerie développent spontanément une CVO douloureuse, en raison de leur maladie. C’est pourquoi ces souris drépanocytaires seront quotidiennement surveillées, y compris pendant leur hérbergement, et elles seront traitées par un anti-douleur très puissant quand des signes évoquant des COVs seront constatés.
Choix des espèces
Seule cette espèce possède un modèle génétiquement modifié mimant la drépanocytose, et qui reproduit de façon fidèle les manifestations cliniques de la maladie. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines maximum seront utilisées, car les souris drépanocytaires développent ensuite des atteintes d’organes sévères au cours du vieillissement.
Caractérisations dosimétriques et radiopathologiques des brûlures radiologiques induites par des rayonnements X chez la souris : impact du volume irradié, de la localisation, de l’énergie et de la répétition des expositions
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
2 466 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Elles reçoivent une irradiation aux rayons X sur la patte arrière qui provoque des brûlures radiologiques, décrites comme un "protocole sévère" par le porteur, avec un suivi journalier au pic lésionnel. Le porteur indique un point limite de mise à mort à 20 % de perte de poids et classe 1 794 animaux en souffrance sévère. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus, l'étude étant justifiée par les surexpositions accidentelles dans les domaines médical, industriel et militaire et le modèle in vivo décrit comme "indispensable".
Objectifs
Bien que l’utilisation des rayonnements ionisants dans le domaine médical, industriel ou militaire soit majoritairement maitrisée, des surexpositions accidentelles peuvent se produire. Lorsque ces surexpositions dépassent un certain seuil de dose à la peau, elles peuvent entrainer un syndrome cutané radio-induit se traduisant par l’apparition d’érythème, de desquamation ou de nécrose tissulaire, musculaire voir osseuse dans les cas les plus sévères. Lorsque ces accidents de surexpositions impliquent des sources de rayonnements X de basses énergies (
Bénéfices attendus
Au-delà de l’acquisition de nouvelles connaissances scientifiques, ce projet contribuera améliorer la prédiction du risque de complications lié aux surexpositions accidentelles impliquant des rayonnements X de basses énergies ainsi qu’à enrichir l’expertise de l’institut dans ce domaine. En particulier, il permettra, à partir d’un modèle expérimental pré-clinique, d’avoir une analyse dosimétrique in vivo et de caractériser les spécificités radiopathologiques des brûlures radiologiques pour les rayonnements X de basses énergies. Ce projet permettra également d’améliorer la compréhension des effets « volume de tissu exposé » et « énergie des rayons X utilisés».
Procédures
Pour les animaux que nous garderons 6 mois, une imagerie doppler (non invasif) une fois par semaine sous anesthésie gazeuse (durée de 10 minutes maximum ; maximum 24 sessions d'imagerie par animal). Sur ces mêmes groupes, des prélèvements à l’œil seront réalisées avec un capillaire sous anesthésie gazeuse afin de réaliser une analyse longitudinale de la formulation sanguine. Ces prélèvements seront réalisés au temps suivant : 0 (avant l’irradiation), 7jours, 14 jours, 21 jours, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois et 6 mois post-irradiation : soit 7 prélèvements maximum. Tous les autres prélèvements seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet les animaux vont développer des brûlures radiologiques au niveau de la patte arrière. Ce protocole sévère, nécessite une vigilance particulière en particulier au pic de la lésion. Sur la base de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle, un suivi journalier sera effectué entre 7 jours et 30 jours après l’exposition (pic lésionnel). Les animaux seront également pesés deux à trois fois par semaine. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial ou une perte de poids supérieure à 15% entre deux pesées entrainent la mise à mort de l'animal afin de limiter ses souffrances. Des signes de souffrance manifestes, en plus de la lésion localisée, comme la piloérection, une perte de mobilité ou la prostration de l’animal sont également des points limites adaptés. De plus, nous considérons qu’une souris isolée du reste du groupe est un signe de souffrance et un point limite suffisamment précoce.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les analyses.
Remplacement
Dans le but de caractériser de nouveaux modèles d’exposition chez la souris d’un point de dosimétrique et radiopathologique, l’utilisation d’un modèle « in vivo » demeure indispensable au bon déroulement des projets scientifiques mais le nombre de souris utilisé sera réduit autant que possible. Les utilisations d’animaux dans le cadre de ce projet seront tracées (date, projet concerné, informations sur les animaux, devenir des animaux, type d’irradiation).
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation de 2466 souris sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisé correspond au minimum nécessaire pour effectuer des tests paramétriques statistiques, avoir une bonne évaluation et quantification de la dose à l’os, une bonne caractérisation radiopathologique de l’effet des rayonnements et prendre en compte la variabilité inter-individuelle. Pour cela, il est nécessaire d’avoir un minimum de 6 à 8 animaux par groupe en fonction des expérimentations.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux seront adaptées aux procédures réalisées afin de limiter le plus possible le stress et la souffrance de l’animal. Les souris seront hébergées en groupe et dans un environnement enrichi. Lors des irradiations, des anesthésiques et analgésiques seront utilisés et une surveillance des animaux sera mise en place après les irradiations. Le bien-être animal sera également évalué en réalisant des pesées, des photos des lésions et un scoring lésionnel ainsi que la mise en place de points limites adaptés. Ce protocole sévère, où des brûlures radiologiques vont être développées au niveau du membre inférieur nécessite une vigilance particulière. Sur la base de notre expérience, de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle, un suivi journalier sera effectué entre 7 jours et 30 jours après l’exposition correspondant au pic de la lésion. Des croquettes pourront également être déposées au fond de la cage avec de l’eau gélifiée afin de faciliter l’alimentation des animaux si des souris perdaient beaucoup de poids durant le pic lésionnel.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé pour les études physiologiques. De plus, le modèle de lésions musculo-cutanée radio-induites a été précédemment caractérisé sur une autre installation de l’institut utilisant des rayonnements X de haute énergie et basse énergie (cf. résultats précédents). C’est également un modèle utilisé en routine à l’IRSN. Pour les besoins de ce projet, des animaux adultes seront utilisés (8-10 semaines). Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge. De plus, en vieillissant, les souris C57BL/6J ont tendance à développer des comportements agressifs.
MTD: Evaluation chez le rongeur, de la dose maximale tolérée de composés biologiques ou chimiques d’intérêt.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 500
1 500 rongeurs, 1 000 souris et 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et soixante-quinze réutilisés en formation. Ils reçoivent des agents à tester par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse afin d'établir la dose maximale tolérée, avec pesées et prélèvements sanguins quotidiens. Le porteur décrit les effets attendus de la première administration, perte de poids, posture courbée, expressions faciales de douleur, hypothermie ou diarrhée, et fixe un point limite à 20 % de perte de poids. Il affirme que les méthodes alternatives ne permettent pas de prévoir la toxicité in vivo et que la tolérance doit être "vérifiée chez le rongeur".
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance des animaux pour un agent thérapeutique pouvant être d’origine biologique, chimique, cellulaire, viral ou bactérien après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Ce projet permettra d’identifier la dose maximale après une ou plusieurs administrations qui n’engendre pas d’effet toxique chez les animaux (tolérance, Maximum Tolerated Dose, MTD) afin d’utiliser ces composés aux doses non toxiques pour d’autres expériences.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité d’évaluer la tolérabilité d’un traitement par un agent thérapeutique pouvant être d’origine biologique, chimique, cellulaire, viral ou bactérien après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite envisager des études d’efficacité sur des modèles expérimentaux complexes (animaux porteurs de tumeurs) permettant de démontrer des preuves concepts avant d’envisager des investigations plus poussées en clinique.
Procédures
Les animaux seront identifiés par la mise en place d’un système d’identification sous anesthésie générale (moins d’1 min, une seule fois) pouvant entrainer un stress léger. Les animaux seront randomisés pour former des groupes homogènes en poids pouvant entrainer un stress de 1-2j lié au changement de congénères (une seul fois). Les traitements peuvent être administrés aux animaux par voies : • Orale sur animaux vigiles (moins d’1 min) (max de 40 mL/kg/jour repartie en plusieurs prises / 4 prises maximum intervalle de 6h) • Sous-cutanée sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) au niveau des flanc ou du dos (jusqu’à 10 mg/kg (rat) ou 40 mL/kg (souris) réparti sur 2-3 sites avec un maximum de 3 sites par jour) • Intrapéritonéale sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) (jusqu’à 20 mL/kg (rat) ou 80 mL/kg (souris)), • Intraveineuse sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) ( jusqu’à 25 mL/kg en injection lente avec, pour des volumes supérieur à 20 mL/kg, des produits chauffé à 37°C), Les animaux seront pesés et observés (moins de 5 min, tous les jours) pour détecter d’éventuelle effets secondaires. Les prélèvements sanguins, lorsqu’ils sont requis, seront effectués sous anesthésie par les méthodes recommandées les moins traumatisantes et en prélevant le volume minimum requis. Les méthodes de prélèvements sont validées par le vétérinaire : • Jugulaire (3 prélèvements par jugulaire/jours) (moins d’1 min) • Saphène (3 prélèvements par coté sur 24h) (moins d’3 min) • Queue, soit au niveau de la veine mandibulaire (2 prélèvements / 24h), (moins d’1 min) • Via un cathéter (fémorale ou jugulaire) (moins d’1 min après la pose du cathéter, moins de 5 min) Tous les prélèvements sanguins seront faits par des personnes compétentes. La fréquence des prélèvements et les volumes collectés respecteront les recommandations du comité d’éthique. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. Pour les prélèvements, unique ou répété, individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). Les prélèvements de tissus et/ou d’organes seront réalisés sur animaux euthanasiés. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une 15 minutes avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Lors de l’injection pour la première fois d’un agent thérapeutique, les effets sur l’animal peuvent être : une perte de poids, un aspect corporel détérioré, une distension abdominale, une posture courbée, la texture de la fourrure altérée, une couleur des oreilles et des pattes plus pâles ou cyanosées, des expressions faciales de douleur, une respiration et des habitudes naturelles détériorées ; critères d’observation avancés : comportement provoqué anormal, déshydratation, diarrhée, hypothermie…
Devenir
Les animaux ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée. Tous les animaux inclus dans les groupes de traitement seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux ayant reçu une administration unique et étant rester moins d’une semaine en procédure pourront être utiliser en formation.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir la toxicité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Les données in vitro sont souvent insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules sur les organes. La tolérabilité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur.
Réduction
Au cours des trois prochaines années, nous prévoyons l’utilisation de 500 animaux (rats et souris) par an, soit 1500 animaux sur 3 ans répartis sur 40 études. Dans la mesure du possible, afin de limiter le nombre d’animaux inclus dans une étude, le même animal pourra recevoir des administrations uniques à doses croissantes du même composé (au minimum 72h d’élimination entre deux doses) plutôt que d’avoir recours à des animaux différents pour chaque dose. Dans le cas de recherche de toxicité aigue ou à moyen terme avec différents groupes pour différentes doses, le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au moins 24 heures, avec un lancement initialement du groupe recevant la plus faible dose. Ainsi l’administration n’aura pas lieu pour les groupes suivants devant recevoir une dose supérieure dans le cas ou des effets secondaires immédiats ou à moyen terme ont été observés. En pratique, si 20% ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite (perte de poids de 20% ou plus, score de 3 sur un critère, score de 2 persistant plus de 3h sur un critère, score de 2 sur au moins 3 catégories) dans les 24h suivant l’administration, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Sur la base des expériences passées, le nombre minimum permettant d’obtenir Une réponse satisfaisante de tolérabilité se situe entre 3 à 5 animaux par groupe. L’exploration de la dose maximale tolérée se fera toujours sur un nombre entre 3 à 5 animaux par groupe. Une fois la dose déterminée le même produit pourra être utilisé dans le cadre de ce projet sur un nombre plus important d’animaux (10 au maximum) pour obtenir une puissance statistique plus grande compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité.
Raffinement
Les injections/prélèvements seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique en termes de volume, de fréquence, d’antalgie et d’anesthésie. Tous les gestes techniques seront réalisés par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. Chaque animal sera observé et pesé quotidiennement et un scoring clinique sera réalisé pour détecter d’éventuels effets secondaires des traitements. La fréquence de pesée et de l’observation des animaux pourra être augmenter suivant leur état général. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Dans le contexte de la première administration d’un traitement thérapeutique non testé in vivo, elles seront réalisées le matin, et les animaux sont observés en continue durant les 30 premières minutes qui suivent la première administration puis toutes les 2h pendant les 6 premières heures post-administration. Afin d’évaluer la toxicité aigüe immédiate ainsi que la toxicité à moyen terme suite à une administration unique ou répétée, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. Les observations des signes cliniques feront l’objet de la mise en place d’un scoring clinique individuel. Les scores cliniques les plus élevés constitueront des points limites, ainsi que l’accumulation de scores intermédiaires. Les pertes de poids supérieures ou égales à 20% constitueront un point limite. Si 20% ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 6 semaines afin que leur morphologie supporte mieux les effets secondaires des composés testés.
Reprise de la production des cellules sanguines après irradiation chez le porc miniature – 2/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
36 cochons miniatures femelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, puis gardés en vie et transférés vers un second établissement pour la suite de l'étude. Chaque animal subit une irradiation destinée à détruire sa moelle osseuse, reproduisant un syndrome aigu d'irradiation, avant l'injection de cellules souches sanguines d'origine humaine. Le porteur présente ce modèle comme une étape vers des essais cliniques, pour traiter des militaires ou des populations victimes d'un accident nucléaire. Il justifie le choix du miniporc par une physiopathologie proche de l'humain et par la quantité limitée de cellules disponibles.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de proposer un nouveau traitement (cellule souche hématopoïétique humaine) en cas de syndrome aigu d’irradiation (SAI), pour le militaire en opération ou la population victime lors d’une urgence radiologique, d’un accident nucléaire ou un acte de malveillance. Il est basé sur une technologie de rupture permettant de produire des cellules souches hématopoïétiques (CSH) obtenue à partir de cellules souches reprogrammées issues de cellules humaines. Ces cellules d’origine humaine sont nommées hiPSC (human induced Pluripotent Stem Cells) et ont commencé à révolutionner les pratiques médicales. Le traitement en urgence de population nécessite de disposer de produits cellulaires pouvant être congelés, décongelés et injectés rapidement et permettant de traiter un groupe important d’individu. Ces banques de cellules souches dites « médicament » permettront de produire des cellules souches de différents types pour traiter les victimes. Des hiPSC issues de donneurs « universels » sont déjà disponibles. Le projet a pour ambition de démontrer que cette stratégie d’utilisation des hiPSC est la réponse thérapeutique au traitement en masse du syndrome aigu d’irradiation. Ce projet est en synergie avec les nouvelles stratégies internationales en termes de santé et de médecine régénérative, à savoir la constitution de banques d’hiPSC de grade clinique (à savoir excellente viabilité et absence d’anomalie chromosomique) et la dérivation de produits cellulaires de qualité. L’objectif est la validation après la destruction des cellules de la moelle osseuse par l’irradiation de la reprise de l’hématopoïèse chez le cochon par une injection de cellules souches humaines hématopoïétiques issues d’hiPSC. Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant iPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique.
Bénéfices attendus
La preuve de concept de la possibilité de générer un tissu hématopoïétique fonctionnel (l’ensemble des cellules du sang) à long terme à partir d’un tout nouveau type cellulaire appelé ; « hiPSC » (human induced Pluripotent Stem Cells) a été établie chez le petit animal. Cette nouvelle technologie permet de produire les cellules à l’origine de la production du sang. L’objectif de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reconstitution hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique. Pour le passage en clinique, nous sommes dans l’obligation d’utiliser des modèles in vivo, plus particulièrement des animaux de grande taille et dont la physio-pathologie du SAI est proche de l’homme. La validation de la reprise d’hématopoïèse humaine xénogénique chez le cochon par une greffe de cellules souches hématopoïétique issues hiPSC et également de la sous population de cellules triée à partir de ces hiPSC (la sous population à capacité de reconstituer l’hématopoïèse) permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant hiPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique. Le bénéfice de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reprise hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique chez l’homme.
Procédures
Les procédures d’irradiation sont réalisées en une seule fois pour une durée de 5 min sous masque et isoflurane après une anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Suite à l’irradiation, les taux de cellules sanguines varient avec une diminution puis une reprise aux niveaux de base à des temps différents selon les cellules. La survenu transitoire de quelques pétéchies est observée chez quelques animaux. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique à chaque intervention sur l'animal (à l'occasion de prises de sang notamment).
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie et retournent dans le second établissement pour l’hébergement et la poursuite de l’étude (prélèvements et administrations).
Remplacement
Le passage à la clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome hématopoïétique sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules hiPSC en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’injection de cellules en concentration compatible avec leur production.
Réduction
Pour obtenir des valeurs statistiques, les groupes des miniporcs irradiés et traités par les cellules souches sont classiquement constitués de 8 individus pour pallier les variabilités inter-individus des animaux et également du greffon injecté et pour éviter ainsi d’avoir à renouveler plusieurs fois l’expérimentation. Le nombre d’animaux choisi pour ce protocole est nécessaire et suffisant pour exploiter d’un point de vue statistique les résultats obtenus.
Raffinement
Le transport des animaux au site d’irradiation sera effectué par le véhicule climatisé dédié à ce transport. Pour la procédure d’irradiation les animaux sont anesthésiés et surveillés pendant la durée de l’irradiation, ainsi que pendant la phase de réveil. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et une mise à mort compassionnelle sera effectuée selon les méthodes approuvées en limitant le plus possible la douleur, la souffrance et l'angoisse des cochons, par une personne compétente de l'établissement hébergeur.
Choix des espèces
Le passage à l’étape clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome hématopoïétique sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules hiPSC en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’administration de cellules en concentration compatible avec leur production limitée à l’heure actuelle. Les animaux seront des animaux âgés de 2 mois minimum). Etant donné que le nombre de cellules à administrer est fonction du poids de l’animal, il faut donc des animaux le plus jeune possible avec un poids le plus proche de 5 kg environ. D’autre part, la prise de greffe est plus efficace plus l’animal est jeune. Les porcs seront des femelles afin d’éviter des conflits et donc risques de blessure, qui sont plus fréquents chez les mâles. Le risque de blessure doit être absolument évité chez ces animaux qui auront un système immunitaire et de coagulation affaibli après irradiation et par conséquent un risque de mortalité augmenté.
Test de l’efficacité de molécules d’intérêt en tant qu’agent protecteur pour le syndrome d’irradiation hématopoïétique aigu
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
864 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules humaines, des prélèvements de moelle osseuse et de sang sous anesthésie, des injections répétées et un gavage, puis une irradiation qui provoque une anémie d'une dizaine de jours, pour tester une molécule censée limiter les dommages sanguins des rayonnements. Les retombées annoncées, augmenter la survie de patients exposés à des doses aiguës d'irradiation, restent au conditionnel et à long terme. Le porteur affirme que le projet n'a "pas d'alternative non animale" et qualifie l'étape in vivo d'"indispensable", ces souris immunodéficientes étant présentées comme les "outils de référence" du développement sanguin humain.
Objectifs
Les chimiothérapies et radiothérapies peuvent altérer la production des cellules sanguines et immunitaires par la moelle osseuse (appelé myelosuppression). Les recherches menées depuis 2013, par une partenaire, portent sur le développement d'une molécule X1 pour l'indication de la myélosuppression induite par la chimiothérapie et par irradiation. Notre projet se base sur des données préliminaires, qui démontrent un effet positif de X1, en combinaison avec des facteurs stimulant la formation de cellules impliquées dans l'immunité anti-bactérienne et virale et dans la formation de plaquettes sanguines, améliorant ainsi la survie des animaux traités après une myélosuppression induite par irradiation. Le présent projet vise à valider si le traitement par X1 peut améliorer la récupération fonctionnelle des cellules sanguines humaines après irradiation. Cette étude nécessite d’explorer les effets de l’irradiation par des études d’efficacité sur des rongeurs dits "humanisés" (souris ayant reçu une greffe des cellules humaines) traités ou non avec X1. Ces modèles murins sont les seuls à l'heure actuelle à récapituler le développement sanguin normal humain. Notre projet a plusieurs objectifs: L'Objectif 1 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans laquelle nous allons mesurer l’effet de X1, seul ou combiné aux facteurs décrits plus haut, sur l’atténuation de la toxicité des radiations sur les cellules sanguines humaines lorsque X1 est donné à partir de 2 heures après irradiation aux souris humanisées. L'Objectif 2 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans une moelle osseuse humaine. Dans cet objectif, nous testerons l’efficacité de X1 comme dans l'objectif 1, mais cette fois dans des souris portant une niche de moelle osseuse humanisée contenant une production sanguine humaine active. L'Objectif 3 consiste en l'étude prophylaxique de X1 dans laquelle nous étudierons si X1 peut aussi être utilisé pour atténuer la toxicité des radiations sur les cellules hématopoïétiques humaines dans les modèles de souris humanisées en apportant X1 avant l'irradiation. Cette étude permettra de prédire au mieux la réponse sanguine humaine à ce nouvel agent thérapeutique.
Bénéfices attendus
1-Atténuation de la myélosuppression et des séquelles associées (infections, hémorragies) chez les patients à des doses myélosuppressives de irradiation aiguë. Par conséquent, augmenter la survie des patients exposés de manière aiguë à des doses de irradiation (syndrome aiguë de rayonnement). 2-Augmenter la survie des patients exposés de manière aigüe à des doses myélosuppressives d’irradiation. Les cytokines aident à la récupération des lignées granulocytaire et macrophagique, mais sont sources d’effets indésirables graves. De plus, elles sont très couteuses à produire. Il y a donc un besoin de développement de nouvelles contre-mesures médicales. Celles-ci devront se caractériser par leur efficacité à améliorer les séquelles post-myelosuppression induite par une irradiation, par une atténuation complémentaire ou plus large de la myélosuppression associée. Ces nouvelles contre mesures devront également avoir un profil d'innocuité et de tolérabilité, un stockage facile et pouvoir être administrées rapidement dans un scénario de pertes massives. X1 est une bio-molécule administrée par voie orale. Elle a été initialement développée pour le traitement des infections virales respiratoires et de la neutropénie induite par la chimiothérapie. Son utilisation est justifiée en tant qu'agent de radioatténuation pour le syndrome hématopoïétique d’irradiation. En effet, les lésions induites par la chimiothérapie et la radiothérapie ont des voies communes qui entraînent une myélosuppression aigüe et des lésions résiduelles de la moelle osseuse. La gravité des lésions des organes dépend de la dose de rayonnement et de la durée d'exposition. Les lésions par rayonnement sensibilisent les organes et les cellules cibles entraînant le syndrome d'irradiation aigüe (ARS). Ces dommages multiples nécessiteront probablement plus d'une seule thérapie pour atténuer et améliorer la récupération. Par conséquent, une approche polypharmaceutique est justifiée, en particulier lorsque les sujets sont exposés à des doses plus élevées d’irradiations aiguës.
Procédures
Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation de cellules souches et de progéniteurs humains du sang. Ces deux actes, d’une durée inférieure à 2 minutes chacun seront réalisés sous anesthésie générale sur un tapis chauffant. Nous utiliserons du gel ophtalmique pour prévenir le déssèchement des yeux. Pour l’injection des molécules, via 2 actes en sous-cutané et un acte en intrapéritonéale, ils se feront sur animal vigile, une fois et pendant 4 semaines pour l’hormone parathyroïdienne. Cet acte prendra 1 minute. Il y aura un acte de gavage durant 4 jours sur animal vigile prenant une minute. Suite à ces prélèvements et injections/gavages, il sera ajouté de l’hydrogel et des cupules de nourritures enrichies dans les cages afin d’aider les animaux à récupérer. Les souris seront irradiées en 1 fois pendant une période d'environ 2 minutes.
Impact sur les animaux
Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation des cellules souches/progénitrices humaines du sang, pour vérifier que nos souris sont bien humanisées ce qui induira une douleur pour les souris. L’irradiation utilisée dans ce projet est subléthale mais provoque une anémie qui dure une dizaine de jours. Les souris recevront la molécule X1 par voie orale pendant 30 jours, dans le protocole thérapeutique. Le traitement en lui-même n’induit pas d’effet secondaire notable selon les expériences préliminaires réalisées par la compagnie qui produit X1. Les souris recevront transitoirement plusieurs injections de facteurs de croissance/hormonaux ce qui induit un risque d'inflammation locale temporaire ou des douleurs osseuses à courte durée.
Devenir
Afin de mesurer la récupération en cellules sanguines humaines après traitement, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire et à des tests fonctionnels in vitro. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou pas du traitement effectué après ou avant l'irradiation.
Remplacement
Ce projet n'a pas d'alternative non animale. Nous allons réaliser des expériences in vitro en parallèle, mais ces tests ne récapituleront jamais l'hétérogénéité organique des réponses in vivo, étape indispensable pour l’évaluation des effets potentiels de radio-atténuation de X1 (seul ou combiné) pour le syndrome hématopoïétique aigue lié aux radiations. En effet, notre projet nécessite une étape indispensable in vivo afin d'étudier les effets de X1 en suivant la récupération et la production hématopoïétique humaine dans un modèle préclinique capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’homme. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique. Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine.
Réduction
Nous avons à coeur de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Pour celà, lorsque les effets de différents traitements seront testés en utilisant la même procédure expérimentale, les expériences seront combinées et réalisées en même temps afin de comparer les différents groupes testés à un seul et unique groupe contrôle (qu'il est inévitable de faire pour que le résultat soit validé). Aussi, nous avons choisi de réaliser des expériences préliminaires (objectif 1) de choisir une dose d'irradiation et une seule souche de souris, pour réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux impliqués dans la réalisation des différents objectifs du projet seront surveillés régulièrement par l'expérimentateur et les animaliers afin de détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses inutiles. Afin d’améliorer le bien-être des souris, vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement sur la litière en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de moelle osseuse réalisé pour mesurer le niveau de reconstitution du système sanguin humain avant irradiation et traitement avec X1. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale
Choix des espèces
La souris domestique Mus Musculus est un mammifère de petite taille à l'âge adulte qui peut être facilement élevé et reproduit en captivité. De plus, la génétique et le comportement de cette souris étant parfaitement connus, cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux élevés en captivité et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Enfin, la souris reproduit de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l'homme ; les résultats des expériences réalisées chez la souris pourraient à terme améliorer l'étude des pathologies humaines ainsi que leurs thérapeutiques. Nous utilisons plus particulièrement un modèle de souris dépourvu de système immunitaire fonctionnel permettant les études sur le développement des cellules sanguines humaines normales et pathologiques.
Evaluation des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur la latence de réveil post-anesthésie chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1320
2 520 souris et 1 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée à l'issue et les témoins réutilisés dans d'autres projets. Chaque animal est anesthésié, à l'isoflurane ou par injection, puis reçoit des composés censés raccourcir le réveil, avant que ce réveil soit chronométré. Le porteur situe l'enjeu du côté du confort des patients et de l'occupation des salles de réveil, bénéfices renvoyés au long terme. Il conclut qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit et qu'il est "nécessaire" de passer par des modèles animaux avant l'humain.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments pour tenter de réduire la latence de réveil suite à une anesthésie chez la souris ou le rat. Ce projet nous permettra ainsi d’obtenir des données précliniques afin de conduire ensuite des études cliniques chez l’humain. La réduction du temps de réveil post-anesthésie présente en effet des enjeux cliniques importants, que ce soit pour vérifier la bonne récupération des fonctions vitales après une chirurgie et pouvoir intervenir rapidement dans le cas contraire, ou bien pour optimiser le temps passé par les patients dans les salles de surveillance post-opératoire aux ressources limitées et critiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de fournir des données précliniques sur l’efficacité potentielle de nouveaux candidats médicaments pour réduire la latence de réveil post-anesthésie. A long terme, ce projet pourrait donc conduire à un bénéfice en clinique dans les services de réveil post-anesthésie, afin de pouvoir d’une part vérifier plus rapidement la récupération des fonctions vitales après une chirurgie (et donc de pouvoir intervenir rapidement le cas contraire), et d’autre part diminuer le temps passé par les patients dans les salles de surveillance post-opératoire aux ressources limitées.
Procédures
A l’issue d’une période d’acclimatation de 5-7 jours en animalerie, les animaux entreront dans une phase d’expérimentation inférieure à 3h. Deux modes d’anesthésie seront testés. Pour l’anesthésie gazeuse, les rongeurs seront soumis à une période d’anesthésie gazeuse à l’isoflurane pendant une période de 5 min à 1h, qui sera déterminée à l’issue de la phase de mise au point. A l’issue de cette anesthésie, le temps de réveil des animaux sera chronométré et ne devrait pas excéder 15 min. Pour le second mode d’anesthésie, des produits anesthésiants seront injectés aux rongeurs et induiront une anesthésie qui ne devrait pas excéder 2h (les tests de mise au point permettront de déterminer plus précisément cette durée). Durant toute la durée de l’anesthésie (pour les deux modes envisagés), les animaux seront placés sur plaque chauffante pour éviter l’hypothermie induite par l’anesthésie. Des composés pharmacologiques seront administrés aux rongeurs soit avant l’anesthésie, soit à la fin de celle-ci.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, l’anesthésie et le réveil de cette anesthésie peuvent également être source de stress chez les rongeurs.
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Cependant, les animaux contrôles pourront être réutilisés dans d’autre projets selon les objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (ou par une personne compétente désignée par lui) ou par le vétérinaire.
Remplacement
Ce projet ayant pour but de tester l’action pharmacologique de nouveaux composés sur la latence de réveil post-anesthésie, il est nécessaire de passer par des modèles animaux avant toute administration à l’homme. En effet, il n’existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
Un effectif minimum de 12 souris ou rats par groupe expérimental est prévu pour la robustesse des tests statistiques. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques. En fin de procédure les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.
Raffinement
Les animaux (rats, souris) sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant expérimentation. Les animaux y sont hébergés dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, igloo, appareil de nidification…), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi de bien-être par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. L’utilisation de la plaque chauffante pendant l’anesthésie et le test de réveil permet d’éviter l’hypothermie associée à l’anesthésie.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont très classiquement utilisés dans la littérature pour des tests de réveil post-anesthésie, et les protocoles sont bien établis pour ces deux espèces. De plus, un parallèle peut être fait avec l’anesthésie chez l’humain, puisque l’isoflurane fait également partie des agents anesthésiants utilisés en clinique. D’autre part, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour lesquelles les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. En effet les tests de réveil post-anesthésie sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, et il n’est pas dans les objectifs de ce projet d’étudier l’effet des composés pharmaceutiques à d’autres stades de développement.
Pré-conditionnement rénal par un inhibiteur de la protéine SerRS, impliqué dans la résistance à l’ischémie dans un modèle porcin de donneur en mort encéphalique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour tester une molécule censée protéger le rein greffé des lésions d'ischémie-reperfusion, 57 porcelets de deux à trois mois, issus d'une même fratrie, vont être utilisés. 22 sont classés sans réveil, dont 18 donneurs de rein opérés pendant deux heures et demie puis tués avant tout réveil, et 35 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Les 30 porcelets des groupes d'étude subissent une greffe ou une ablation de rein, puis, logés en case individuelle, neuf prises de sang par un cathéter laissé en place, dix séjours d'une à deux heures en cage métabolique et trois biopsies sous anesthésie générale. Tous sont tués à l'issue, le porteur jugeant le retour à l'élevage impossible "pour des raisons sanitaires".
Objectifs
Ce projet vise à concevoir une nouvelle génération d'inhibiteurs pharmacologiques capables de contrecarrer les conséquences d'un épisode ischémique. Ils ciblent une protéine que nous avons récemment identifiée et qui est impliquée dans la résistance des organes à l'ischémie. L'application clinique visée est la transplantation rénale. La transplantation rénale est le traitement optimal de l’insuffisance rénale terminale. Au cours de la transplantation, les phénomènes liés à l’ischémie-reperfusion (séquence intrinsèque du processus de la transplantation d’organes solides) sont à l’origine de lésions qui induisent une dysfonction du greffon à la phase précoce et peuvent faciliter le rejet de ce dernier. L’ischémie correspond à la phase où l’organe est privé de la circulation sanguine. La reperfusion de l'organe se traduit par la reprise de la circulation sanguine et donc des apports en nutriments et oxygène. L’ischémie-reperfusion est impliquée également dans les mécanismes de lésions chroniques à plus long termes. Il est donc nécessaire de développer des moyens de protéger les organes afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion, afin améliorer la qualité du greffon et sa survie à court et long terme. Des travaux récents ont permis d’identifier une cible d’intérêt, une protéine régulée durant l’ischémie-reperfusion rénale. Notre objectif est d’évaluer un produit thérapeutique ciblant cette protéine, afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion rénales et ainsi améliorer la qualité du greffon, dans un modèle de transplantation de rein chez le porc. A terme, ces travaux permettront d’optimiser les protocoles de transplantation d’organe chez l’homme et de fournir des organes de meilleure qualité garant d’une survie plus longue.
Bénéfices attendus
Actuellement la transplantation rénale est la meilleure solution pour le traitement de l’insuffisance rénale terminale, moins coûteuse pour la société et moins contraignante pour le patient que la dyalyse chronique. Malheureusement, la durée de vie d’un greffon rénal est limitée et les lésions précoces, dues à l’inévitable succession d’ischémie (arrêt de l’irrigation sanguine oxygénée) et reperfusion (reprise de l’irrigation sanguine oxygénée), sont en grande partie responsables de la reduction de cette durée de vie. L’utilisation des machines de perfusion des greffons a permis d’élargir les critères d’acceptabilité d’un greffon mais n’a pas permis d’améliorer la durée de vie des greffons. Pour l’instant la meilleure façon de réduire les lésions d’ischémie – reperfusion est de réduire au maximum la durée d’ischémie et réaliser la greffe le plus rapidement possible. L’inhibiteur de la protéine étudiée a montré in vitro et sur organe de petit animal une activité intéressante qui permet de réduire les lésions d’ischémie reperfusion. Il est donc indispensable de passer par l’étape de modèle pré-clinique chez le gros animal avant de pouvoir le proposer chez l’homme.
Procédures
Pour les 18 animaux donneurs : procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 2h30) , avec 2 prises de sang au cours de la chirurgie, puis mise à mort en fin de procédure. Pour les animaux de groupes d’étude (n=30) : procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec analgésie postopératoire et surveillance, d'une durée de 1h30 à 2h30. 2 prises de sang sous anesthésie générale en début et fin de chirurgie. 9 prélèvements sanguins sur animal vigile, à l’aide d’un cathéter laissé lors de la procédure initiale (durée 5 minutes). 10 prélèvements d’urine en cage métabolique (mise en cage métabolique 1 à 2 heures). 3 prélèvements de tissus par biopsie sous anesthésie générale (durée 20 minutes chacun).
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont prévisibles : - stress lors de la réalisation des prises de sang et des transferts - douleur postopératoire - limitation de la possibilité de déplacement car la surveillance sera effectuée en cage métabolique. Les injections intraveineuses peuvent provoquer un hématome. Comme pour toute intervention chirurgicale, une infection, un hématome au site d'intervention pourraient survenir. Néanmoins dans notre expérience c'est rare (moins de 5% des cas).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures. En effet, pour des raisons sanitaires, le retour à l'élevage est impossible en fin d'expérimentation.
Remplacement
La transplantation et l’appreciation de l’évolution post-greffe d’un organe ne peut être faite autrement que sur un animal vivant. Nous avons naturellement commencé par des études en vitro (cultures cellulaires) puis des études sur des organes chez le petit animal. Le projet est arrivée à l’étape pré-clinique, de mise en situation complète chez le gros animal.
Réduction
Nous avons effectué des études pour calculer la dose à tester afin de ne pas utiliser plusieurs dosages de la molécule testée. Le nombre d’animaux a été déterminé en s’appuyant sur un score de lésions histologiques très sensible et en prenant en compte le taux de reduction des lésions observées in vitro. Le calcul des effectifs a été fait pour réduire le plus possible le nombre d’animaux utilisés, en s’appuyant sur les methodes statistiques définies pour les petits effectifs qui utilisent les tests non-paramétriques. Nous avons estimé le nombre d’animaux (porcs de race commune) utilisés dans ce projet à 57. Il y a 30 animaux dans les 5 groupes précisés plus haut, dont la taille a été calculée en se basant sur des tests statistiques non paramétriques (très petits échantillons). En plus des animaux étudiés, il nous faut des donneurs SLA (Swine Leukocyte Antigen (comme le HLA chez l’homme)) compatibles de la même fratrie. Le fait de vérifier la compatibilité SLA permet de ne pas utiliser d’immunosuppression et d’éviter le phénomène de rejet. Il y a 4 groupes d’animaux qui reçoivent une transplantation rénale, donc en théorie il faudrait 24 donneurs. Nous avons calculé l’effectif total avec seulement 18 donneurs, car dans le groupe contrôle, on effectue l’ablation d’un rein, rein qui peut être conditionné et tranplanté ensuite à un receveur. Cela nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. En plus des groupes d’étude nous avons prévu 4 animaux test pour la mise en place chirurgicale du projet, qui seront mis à mort immédiatment à la fin de la procédure et 5 animaux en réserve, en cas d’échec de la procédure chirurgicale.
Raffinement
Les animaux seront sous anesthésie générale lors des chirurgies. Un suivi quotidien sera mis en place pour évaluer et réduire la douleur animale. Des analgésiques et des antibiotiques seront administrés systématiquement au moment des procédures et occasionellement pendant la période du suivi si l’état de l’animal l’impose. Les animaux seront logés en case individuelle avec des cloisons ajourées pour qu’ils puissent interagir avec les congénères. L’enrichissement du milieu sera réalisé à l’aide de paille, de bidon ou autres jouets. Une surveillance vidéo des animaux sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle porcin de transplantation rénale est un modèle largement utilisé, reconnu et proche de la tranplantation rénale chez l’homme. C’est de loin le modèle de gros animal le plus utilisé en transplantation rénale ce qui nous permettra d’identifier toute anomalie d’évolution post-opératoire et d’obtenir des résultats robustes. Les animaux utilisés seront des porcelets de 2-3 mois d’âge (25-40kg), issus de la même fratrie et compatibles SLA (Swine Leukocyte Antigen). Cette tranche d’âge est utilisée à cause de la possibilité chirurgicale (greffe plus ou moins proche de celle chez l’homme) tout en laissant la possibilité de manipuler facilement l’animal 3 mois après la transplantation.
Production d’anticorps chez le lama immunisé (lama glama)
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Immobilisés dans un couloir de contention par un licol et des sangles passées sous le ventre, les lamas subissent une prise de sang finale de 250 à 400 ml, après six injections d'antigènes et d'adjuvant en général, huit au plus, le tout sans anesthésie. 375 lamas, classés parmi les autres mammifères, vont être utilisés dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger, puis 200 restent à l'élevage et 175, mâles et autres femelles, sont placés chez des détenteurs. Le porteur décrit une "prestation de services" : produire des anticorps "à la demande de clients", qui mènent leurs propres recherches thérapeutiques. Il indique que les injections peuvent provoquer des "douleurs aiguës transitoires", et que l'impact léger des procédures "ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux à usage thérapeutique. Les anticorps polyclonaux ont plusieurs cibles sur l'antigène, tandis que les anticorps monoclonaux n'en ciblent qu'une seule. Après plusieurs étapes de sélection, un anticorps monoclonal sera sélectionné parmi la masse d’anticorps polyclonaux sur la base de son potentiel thérapeutique, par example le traitement de maladies inflammatoires comme la myasthénie grave. Les anticorps polyclonaux sont obtenus par immunisations de lamas, car les anticorps du lama ont une structure très proches des anticorps humains, ce qui pourrait de fait limiter les risques de rejet thérapeutique chez l’homme et accélérer le développement pré-clinique. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors d’une stimulation spécifique. Le lama ne sera pas utilisé pour la production en masse du produit thérapeutique, mais celle-ci se fera en laboratoire. L’objectif de ce projet est donc de produire des anticorps à la demande de clients (prestation de services) à but thérapeutique dans le cadre des recherches translationnelles ou appliquées réalisées par ceux-ci. La recherche translationnelle (ou recherche de transfert) se situe entre la recherche fondamentale, dont le travail consiste à comprendre les mécanismes à l’origine du développement d’un cancer par example, et la recherche clinique (ou appliquée) qui vise à évaluer l’efficacité et thérapeutique dans des champs d’application aussi variés que: La prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé ou d’autres anomalies, ou de leurs effets chez l’homme, les animaux ou les plantes. L’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez l’homme, les animaux ou les plantes. Le bien-être des animaux et l’amélioration des conditions de production des animaux élevés à des fins agronomiques. La protection de l’environnement naturel dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal.
Bénéfices attendus
Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez des patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques. Ils sont particulièrement petits, ce qui leur permet de pénétrer des tissus autrement impénétrables (barrière sang/cerveau) et de plus elles résistent à des environnements hautement acides ou des températures élevées. Leurs qualités se sont avérées très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre de nombreuses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Chaque immunisation a pour but d’augmenter la réponse immunitaire et d’accroitre l’affinité des anticorps générés par le lama pour obtenir une grande variété de candidats anticorps à portée thérapeutique. Plus le nombre de candidats est élevé, plus la chance d’avoir un anticorps efficace en clinique dans une maladie donnée est élevée.
Procédures
Au jour 0, un prélèvement de sang non-encore immunisé est prélevé du lama (durée du geste 1 à 2 minutes), après quoi l'animal reçoit immédiatement la ou les injections d’immunisation qui prennent quelques secondes. La quantité totale injectée ne dépassera pas les 4ml. L'injection du cocktail d'antigènes et de l'adjuvant est effectuée 1x/semaine ou à des intervalles de temps plus longs (2 semaines, ou jusqu’à 4 semaines dans de rares projets pour lesquels le nombre d’injections sera alors réduit à 3), répétée généralement 6 fois, rarement jusqu’à un maximum de 8 épisodes d’injections. Un prélèvement sanguin unique (1 à 2 minutes) ou à intervalles réguliers (2-4 semaines) pendant les séquences de « vaccination » pourra permettre d’évaluer la réponse immunitaire avant la fin de la procédure. Dans un délai de 4 à 14 jours après la dernière injection d'antigène, un prélèvement de sang sera réalisé en bas du cou. La prise de sang finale dure 5 à 10 minutes pendant lesquelles l'animal sera immobilisé dans un couloir de contention à l'aide d'un licol et de sangles sous-ventrières. Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile.
Impact sur les animaux
L’utilisation d'un adjuvant lors des immunisations peut provoquer une réponse inflammatoire locale classique, accompagnée d'un gonflement. Comme pour toute vaccination, un épisode de fièvre peut survenir accompagnant cette inflammation. Les injections peuvent provoquer des douleurs aiguës transitoires (selon le produit injecté), ainsi qu’un inconfort dû à la contention légère nécessaire à la réalisation des gestes, un bras autour du cou pour quelques secondes. Même s’il peut y avoir un risque théorique de choc anaphylactique par l’utilisation d’un cocktail antigénique, il est finalement quasi nul, car les antigènes utilisés (protéines ou séquences ADN humaines) n'ont rien en commun avec le lama. Les prises de sang finales nécessitent une immobilisation plus longue, source d’un inconfort, voire d’un stress de 10 à 15 minutes, d’intensité et de durée variable selon les individus.
Devenir
Les femelles resteront en grande partie à l'élevage en tant que reproductrices, les mâles et les autres femelles seront placés chez des détenteurs qualifiés. Ceci après inspection par notre vétérinaire sanitaire en vue de leur état de santé et de leur socialisation.
Remplacement
Il est indispensable, du moins pour le moment, d’obtenir les anticorps polyclonaux en utilisant le système immunitaire d’animaux (in vivo). En effet, les techniques pour produire des anticorps à partir de librairies d’anticorps synthétisées (in vitro) ne sont pas encore au point et leur utilité est limitée à un nombre de domaines restreint (certains experts estiment qu’il faudrait au moins encore une dizaine d’années de recherches pour améliorer leurs capacités même dans ceux-ci). Elles génèrent des anticorps de moins bonne qualité car nous sommes encore loin de la complexité et de l’efficacité des anticorps obtenus via le système immunitaire des mammifères (ou même des humains dans le cas du covid), qui a évolué sur des millions d’années. De produire des anticorps à l’aide d’animaux fait usage d’une série de processus naturels améliorant, entre autres, leur capacité de se lier aux molécules de la maladie. Ceci car l’organisme animal est capable de sélectionner l’anticorps le mieux à même de se lier à une cible spécifique parmi mille milliards d’anticorps à l’aide un processus hautement complex, impossible à réaliser in vitro. Ce processus est déclenché par le démarrage de la réponse immunitaire de l’animal. La plus efficace des techniques in vitro arrive à gérer dix milliards. Étant donné que les anticorps des camélidés sont structurellement très proches des anticorps humains, il n'y aura que des modifications minimes qui seront nécessaires pour convertir les anticorps de lamas en anticorps pleinement tolérés par le système immunitaire humain. Ces qualités rendent les petits camélidés uniques. Les anticorps polyclonaux obtenus par immunisations de lamas sont la base pour les anticorps thérapeutiques sélectionnés (monoclonaux) qui seront séquencés et produits en masse en laboratoire (in vitro) sans utilisation d'animaux. Les anticorps prennent une place de plus en plus importante dans la recherche et les thérapeutiques humaines et vétérinaires, voir même agricoles. Nous avons donc besoin d’anticorps de la plus haute qualité. Naturellement les conditions dans lesquelles ces immunisations sont réalisés doivent obligatoirement se faire sous les meilleures conditions, afin d’éviter toutes souffrances inutiles aux animaux.
Réduction
En utilisant des cocktails de différents antigènes cibles, sous forme de protéine purifiée par exemple, le nombre d'animaux dans les essais est fortement réduit, tout en préservant le rendement expérimental. Nous visons une compatibilité suffisante des différentes protéines pour maximiser le nombre de cibles dans le cocktail. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors de chaque stimulation spécifique. Pour chaque expérience d’immunisation ciblée, 2 à 4 animaux maximum seront utilisés, car un individu seul pourrait produire des réactions atypiques ou non-concluantes. Le nombre d'animaux est basé sur les résultats des expériences précédentes. Des lamas non consanguins sont utilisés; donc des lamas qui sont génétiquement éloignés les uns des autres, ce qui rend leurs systèmes immunitaires plus efficaces.
Raffinement
Toutes nos installations sont conçues pour permettre aux lamas de vivre de sorte que soient respectés le mieux possible leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux sont logés en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Nous élevons des animaux de pâturage et les hébergeons sur nos 30 hectares de prairies permanentes et de bois. Dans le cours des soins de routine, nos lamas sont régulièrement manipulés. Traitements vermifuges par injections sous-cutanées et par solutions administrées oralement, tous les trois mois (Moxidectine, Praziquantel, Fenbendazol). Prises de sang pour les analyses de santé, tonte, coupe des ongles etc. La tonte annuelle étant l’intervention la plus stressante dans ce cadre, mais entièrement réalisée pour le confort des lamas, nous ne commercialisons pas la laine. Ces interventions ont comme effet collatéral d’habituer les animaux aux interventions humaines, ce qui nous permet de limiter le stress ou l’inconfort liés aux gestes d’injection ou de prélèvements sanguins répétés. Comme nos lamas sont destinés à une utilisation en tant qu’animaux de loisirs et de bât, voir de médiation animale, ils suivent également un entrainement à la longe. Nous sélectionnons nos lignées depuis plus de 30 ans selon des critères d’anatomie, de laine, de couleur, mais avant tout de caractère. Même dans ces conditions il y a toujours des individus plus sensibles que d’autres, qui auront droit à des séances d’éducation complémentaires. Nos interventions durant les procédures expérimentales prévues ne dépassent pas le cadre de ce qu’ils sont habitués à subir pour leurs soins courants et sont réalisés sur des animaux vigiles. L’impact léger de ces procédures ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques. Naturellement les animaux peuvent avoir un problème de santé sans relation avec la procédure durant celle-ci, en quel cas la vétérinaire les traitera selon leurs symptômes et décidera, en consultation avec le donneur d’ordre, s’ils doivent être retirés de la procédure. Les gestes réalisés sont de nature à ne provoquer qu’un inconfort voire du stress sur les animaux les plus sensibles au contact, malgré les séances d’habituation lors des soins quotidiens.
Choix des espèces
Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez les patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques telles que leur taille et leur stabilité. Leur spécificité et leur sélectivité se sont avérés très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre diverses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin, c’est à dire 250ml pour les lamas de moins de 100kg et entre 250 et 400ml pour les individus plus lourds. Nos clients potentiels nous indiquent que 250ml pourraient désormais être la norme et que le maximum de 400ml sera normalement abandonné, ce qui constituerait un raffinement de la procédure.
Développement d’un modèle de migraine chronique à l’aide d’injections répétées d’une préparation inflammatoire chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1836 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'un cathéter crânien, puis des injections répétées d'une préparation inflammatoire sur la dure-mère pour induire une migraine chronique, avec des tests de sensibilité douloureuse de la face et des pattes. Le porteur indique que les rats restent douloureux et les tue en fin d'expérience pour cette raison. Il annonce que le modèle mis au point "pourra être proposé à la commercialisation" pour tester des candidats médicaments.
Objectifs
La migraine est un trouble de la douleur neurologique. Elle a un impact sur la santé mais aussi socio-économique. Selon des rapports épidémiologiques, la migraine touche 1 personne sur 10 dans le monde et son incidence continue d'augmenter (2017). Dans le Global Burden of Diseases 2016, la migraine était la sixième maladie la plus courante parmi 328 maladies et méfaits. En plus des céphalées, les migraineux présentent d’autres symptômes comme des nausées, de la fatigue, une photo et/ou phonophobie et des allodynies mécaniques et thermiques. L’allodynie est un stimulus normalement non douloureux ressentie comme douloureux. Il est particulièrement ressenti au niveau de la face des patients. Les traitements médicamenteux actuelles sont des triptans, des corticoïdes et plus récemment des anti-CGRP (CGRP est un peptide impliqué dans la migraine). Malheureusement ces traitements ne sont pas sans effets secondaires. De plus, certains patients répondent mal à ces traitements. Il est donc important de développer de nouveaux traitements. Pour cela, nous souhaitons mettre au point un modèle de douleur migraineuse induit par injection répétée d’une préparation inflammatoire au niveau de la dure mère. Ce modèle, décrit largement dans la littérature, permet de montrer les mêmes symptômes qu’une personne migraineuse (baisse de l’activité, douleur spontanée, allodynie thermique et mécanique). De plus, la physiologie de l’animal est impactée de la même manière que chez l’homme. Ce modèle semble être le plus proche de l’homme et donc permettre des translations rapides. Dans le cadre de ce travail, nous souhaitons donc mettre au point ce modèle et tester la détection d’allodynie mécanique et thermique. Dans un second temps, nous testerons la réversion de l’allodynie par une molécule de référence (Triptan/antagoniste CGRP).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la mise au point d’un modèle fiable et reproductible. Ce modèle pourra être proposer à la commercialisation. Ainsi, de nouveaux candidats médicaments pour l’homme pourront être testé. La caractérisation de ce modèle par de nombreux tests pourra donner lieu à un poster dans le cadre d’un congrès.
Procédures
Les animaux subissent une chirurgie implantatoire d’un cathéter au niveau du crâne (une chirurgie d’environ 20-40min). Selon les procédures ils peuvent être soumis à des mesures de sensibilité douloureuse tactile (face, patte), de mesure de sensibilité thermique (patte). Ces tests durent moins d’une minute chacun et sont répétés durant une cinétique de 5 points de mesures (15 min minimum de repos entre chaque). Ces animaux pourront recevoir une molécule de références selon une voie d’administration courantes afin de tester la réversion de la sensibilité à la douleur (moins d'une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables que vont subir les animaux sont les chirurgies pour réaliser l’implantation de la canule au niveau de la duremère. Ceci peut entrainer une douleur. Ce modèle est un modèle de migraine les animaux peuvent développer des mgraines spontannées. Les animaux auront des tests de douleur mécanique ou thermique. Cette opération est réalisée tous les jours de D2-D16 sauf les week-ends dans une procédure. Ensuite, les tests ne seront réalisés que à D2, et le jour où les animaux seront considérés comme migraineux. Une cinétique de test pourra être réalisée allant jusqu’à 5 points de mesures espacés de 15min minimum.
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort. Le développement du modèle agit sur les mécanismes inflammatoires. Il est donc difficile de connaitre l’impact neurophysiologique sur d’autres modèles utilisés au sein du laboratoire. De plus, les animaux ont un modèle de migraine chronique. Ils restent donc douloureux. Pour l’ensemble de ces raisons, ils sont mis à mort dès la fin de l’expérience.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP (International Association for the study of pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. Cet effectif par groupe sera confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié. A la fin de la procédure 1, le nombre d’animaux pourra être réajusté en fonction des résultats.
Raffinement
De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour. Pour les tests, des cut-off ont été fixé afin de limiter la douleur. De l’habituation aux tests/contention est faite afin de limiter le stress. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie isoflurane et un traitement antibiotique sera réalisé afin d’éviter les risques d’infections.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the study of pain) Ass est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés seront des rats pré-adolescent. Nous garderons les animaux environ un mois. Nous ne souhaitons pas avoir des animaux trop gros afin de pouvoir réaliser les tests sereinement. De plus, les crises de migraines chez l’homme sont souvent intensifiées à la période de l’adolescence avec les changements hormonaux.
Evaluer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau traitement contre les complications des radiothérapies cérébrales sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation cérébrale sous anesthésie puis des administrations intranasales et des tests de mémoire et de locomotion sur six mois, pour évaluer des vésicules issues de cellules souches contre les troubles cognitifs de la radiothérapie. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer des difficultés à se déplacer et un amaigrissement, et l'administration nasale un écoulement et une tête penchée. Il présente ce modèle comme le plus utilisé en préclinique et renvoie les bénéfices pour les patients à une thérapie future.
Objectifs
La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules des vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, 50% à 90% des patients traités par radiothérapie pour des tumeurs du cerveau présentent dans les 6 mois après traitement des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. De nouveaux traitements permettraient d’améliorer leur qualité de vie. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les cellules souches mésenchymateuses sont un type de cellules souches très utilisé en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’Homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue (prélèvement et administration chez la même personne) des cellules souches mésenchymateuses. Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture des cellules souches mésenchymateuses. On note surtout une efficacité diminuée en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses serait majoritairement lié à des vésicules extracellulaires qu’elles sécrètent. Elles sont produites en grand nombre par les cellules souches mésenchymateuses suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de vésicules extracellulaires in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des cellules souches mésenchymateuses via le patient. Les vésicules extracellulaires sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les vésicules extracellulaires seront injectés par voie non-invasive intra-nasale et permettront de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et pourraient donc limiter le développement des troubles cognitifs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices que ce projet pourrait apporter sont multiples tels que : - une nouvelle thérapie non-invasive (administration intranasale) - une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) - une amélioration de la qualité de vie des patients vis-à-vis des troubles cognitifs
Procédures
- Irradiation cérébrale sous anesthésie générale : 10 min - Administration intranasale sous anesthésie générale : environ 5 min par administration - Tests comportementaux sur animal vigile (un test par jour pour une durée de 10 et 5 min pr évaluer la mémoire, 3 min pour évaluer la locomotion) réalisés 4 fois sur une période de 6 mois - Analyse échodoppler sous anesthésie générale : 10 min. - Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie générale avant la mise à mort : 15 secondes. - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale : 15 minutes
Impact sur les animaux
Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques telles que l’hypothermie, l’hypotension, l’hypoxie. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après injection intranasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement Le transport des animaux peut également conduire à du stress et de l’angoisse conduisant à un amaigrissement
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.
Remplacement
Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles précliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent pas d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.
Réduction
Les modèles d’expérimentation animale présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticiens déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés minium 7 jours avant le début des manips. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 animaux par cage, des maisons, du coton et du carton seront présents dans chaque cage. Les cages de transports seront autoclavées et des lingettes de produit désinfectant seront utilisées pour éviter la contamination des animaux. Le modèle murin d’irradiation cérébrale (15Gy, dose unique, collimateur variable, sarrp) étant un nouveau modèle développé et utilisé, nous n’avons pas de retour précis concernant les nuisances attendues. Cependant, les animaux seront observés quotidiennement sur leur comportement, leur aspect extérieur et pesés de façon hebdomadaire pendant toute la durée des expérimentations. Après irradiation, si un animal présente des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri (pesée hebdomadaire) : des croquettes humidifiées ou du gel de transport seront déposés dans la cage. Transport: des frisottis et du gel de transport sont ajoutés dans les cages de transport des animaux si un animal montre des signes de souffrances (locomotion, isolement, apparence) lié au stress du transport, il sera euthanasié par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le modèle murin (15Gy, dose unique, collimateur variable, sarrp) sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, il a déjà été démontré après irradiation localisée du membre inférieur gauche que l’injection d’EV-CSM au niveau musculaire améliorait le processus de néovascularisation et la cicatrisation cutanée. Enfin, nous maîtrisons, chez la souris, les techniques et les équipements afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires (anticorps) et cognitifs indispensable pour démontrer l’efficacité de notre traitement. Le modèle murin permet de diminuer la quantité de CSM ou VE-CSM injectés en intranasal et réduire les couts expérimentaux. Les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés.