Autres troubles humains

2 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par ponction intracardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour, pendant seize jours au maximum, des composés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, pour déterminer la dose maximale tolérée d'inhibiteurs de kinases. Le porteur annonce comme seul effet indésirable attendu une perte de poids, et prévoit la mise à mort de tout animal atteignant un point limite. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" parce que les tests in vitro ne prédisent pas la toxicité d'un organisme vivant.

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine : maladies inflammatoires, pathologies affectant le système nerveux périphérique et central, et cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à cribler des molécules organiques de masse moléculaire très faible (fragments) qui n’ont la plupart du temps qu’une faible affinité pour la cible compte tenu de leur taille. Le criblage va se faire contre une cible thérapeutique choisie dans le cadre d’une pathologie particulière. Il va s’agir ensuite de combiner différents fragments identifiés et/ou de les faire évoluer en se basant sur la structure tridimensionnelle de la protéine cible considérée pour obtenir un candidat médicament de forte affinité et spécificité pour la cible étudiée. Ce projet se situera dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Les études sur les modèles de cellules en culture et la pharmacocinétique in vivo des composés à tester auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations sur la toxicité du composé test. Après avoir selectionné les molécules in vitro à travers des cribles biologiques pertinents, il est nécessaire d'évaluer la dose maximale tolérée in vivo. En effet, le développement de tout nouveau composé thérapeutique nécessite l'évaluation du rapport bénéfice/risque entre les doses thérapeutiques efficaces, et les effets secondaires et les niveaux de toxicité potentiels, suceptibles de diminuer ou annuler les effets curatifs de nouvelles molécules. L'importance d'évaluer les propriétés toxiques des molécules candidates ne peut donc pas être sous évaluée. L'objectif du projet est de déterminer la gamme optimale de doses de la molécule ne générant pas d'effets indésirables chez la souris, ainsi que ses paramètres posologiques (dose et fréquence d’administration).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'identifier la plage de dose utilisable d'une nouvelle molécule thérapeutique ciblée, c’est à dire ne générant aucun effet indésirable chez la souris. Ceci permettra d’optimiser sa posologie pour l’évaluation de son activité biologique sur des modèles murins de pathologies humaines, mais également d'ajuster la dose initiale utilisée lors des essais cliniques. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dûs au traitement, pour le traitement de maladies à forts besoins médicaux non satisfaits (maladies neurodégénératives, inflammatoires et cancer) et ainsi améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux se verront administrer des composés test quotidiennement ou biquotidiennement pendant 16 jours maximum. Les administrations seront faites par injection du produit par voie orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous-cutanée. A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale et une ponction intracardiaque sera réalisée. Les animaux seront pesés quotidiennement.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu suite à l'administration d'une nouvelle molécule est une perte de poids.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Si ces tests sont nécessaires et permettent d'identifier les meilleures molécules candidates, ils ne permettent malheureusement pas de prédire la toxicité in vivo. Ces approches expérimentales ne constituent donc pas des méthodes alternatives ou substitutives à la complexité d’un organisme vivant. L'effet de l’administration du composé test in vivo résulte de l'interaction entre de nombreux mécanismes physiologiques qui ne peuvent être reproduits in vitro. Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été determiné de manière statistique afin d'obtenir des résultats analysables avec un test statistique. La réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet passe également par l'optimisation de l'utilisation des groupes contrôles : dans la mesure du possible des études pourront être définies pour tester plusieurs molécules en parallèles afin de limiter l’utilisation d’animaux dans les groupes contrôles.

Raffinement

Un soin particulier sera apporté au raffinement et à l'anticipation des points limites au cours du projet. Le suivi quotidien individuel des animaux par le biais de leur observation et pesées quotidiennes permettra de minimiser au mieux les nuisances induites par l’étude. Dans le cas de l’atteinte de l’un des points limites définis dans le projet l’animal sera euthanasié. En cas d'approche de ces critères des croquettes mouillées seront mises à disposition des animaux pour éviter d'atteindre les points limites.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques : oncologie, maladies inflammatoires et pathologie du système nerveux. La majorité des modèles animaux développés pour ces pathologies sont des modèles de souris génétiquement modifiées, souris transgéniques pour les pathologies inflammatoires et système nerveux, souris immunodéficientes pour les modèles en oncologie. Afin de tester l'activité biologique in vivo des molécules développées il est donc nécessaire d'avoir recours à ces modèles murins. Dans ce projet il n'y aura pas d'induction de pathologie, cependant ces études de détermination de la dose maximale tolérée serviront pour la suite de l’évaluation préclinique du médicament (notamment pour les études d’efficacité). Il est donc prévu d’utiliser la même souche pour ce projet et pour les études d’évaluation de l’efficacité afin d’éviter l’apparition d’une toxicité innatendue liée à la différence de souche lors de l’étude d’efficacité. Les animaux seront adultes, soit 8 à 10 semaines lors du début de l’étude, afin d’avoir un système immunitaire, hormonal et métabolique mature dans le but d’obtenir la réponse recherchée sans biais.

2 miniporcs vont être utilisés, tous deux tués à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Ils reçoivent une molécule par voie orale pendant cinq jours, subissent cinq prises de sang, un prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie et un séjour isolé en cage à métabolisme, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de mesurer la diffusion d'une nouvelle molécule. Le porteur justifie l'étude par des données de pharmacocinétique jugées utiles pour de futurs projets. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal entier, et présente le porc comme "espèce de choix" sans autre argument.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de la formulation test, de déterminer le passage de la barrière hémato encéphalique de l'élément test et enfin de faire des analyses macroscopiques et dosage de l'élément test aux niveau de certains tissus et organes comme le cerveau, le foie, les reins, le muscle, les poumons , le coeur et la rate.

Bénéfices attendus

Il est necessaire de conduire ce projet pour déterminer les paramètres PK et avoir également des données sur la distribution de cette nouvelle molécule test qui sera bénéfique pour de futur projets.

Procédures

Administration topique orale: Dépôt de la formulation directement sur les muqueuses de la gueule de l'animal, sur animal vigile, volume inférieur à 1 mL durée de l'ordre de la minute. Administrations répétées sur 5 jours 1 fois par jour. Recueil d'urine et de fécès: miction directe. Animal en cage à métabolisme sur 24h maximum. Contact visuel et auditif entre les animaux. Pas de geste particulier fait à l'animal. Prélèvement sanguins: 5 prélèvements maximum sur 5 jours (Pre-dose, 2h, 4h, 26h, 120h ), volume maximal 2 mL, sur animal vigile. Durée par prélèvement: inférieur à la minute Prélèvement de LCR (liquide céphalo rachidien): un seul prélèvement à 5 jours aprés la première administration. Animal anesthésié. Volume prélevé environ 1 mL. Durée du prélèvement: de l'ordre de la minute Euthanasie de l'animal pour prélèvement de tissus: sur animal anesthésié, temps inférieur à la minute. Toutes interventions sur l'animal sera faite avec un personnel expérimenté et conformément aux bonnes pratiques vétérinaire et à la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, il est prévu : - Des administrations topiques par voie orales. Une attention particulière sera portée à la manipulation de l'animal plus particulièrement à la contention. Un entrainement par rapport à la manipulation de l'animal est prévu pendant la période d'acclimatation pour éviter au maximum le stress de l'animal. - Des prélèvements sanguins seront réalisés. 5 prélèvements de sang au maximum sur 120h ( pre-dose, 2h, 4h, 26h, 120h ) d'environ 2 mL. Une attention particulière sera portée au niveau des sites de prélèvements. Attention à ce qu'il n'y ait pas de douleur, gonflement au niveau des sites de prélèvement. Pour éviter cela, de la glace et un point de compression suffisament long sera fait aprés chaque prélèvement. - un recueil d'urine et de fécès sur 24h est également prévu. Pour cela les animaux seront placés en cage à métabolisme. Ils seront donc durant cet intervalle de temps (maximum 24h) dans des conditions individuelles et dans un espace restreint. Les animaux auront cependant un contact visuel et auditif entre eux. Toutes manipulations sur les animaux seront faites avec un personnel expérimenté, cela minimisera le stress des animaux lors des diverses manipulations.

Devenir

Dans cette procédure le prélèvement de tissus est nécessaire. Cela sera fait sur tous les animaux post mortem selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation.

Remplacement

Il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques et les paramètres de distribution de l'élément test.

Réduction

Deux animaux sont prévus dans ce projet. Un seul animal par formulation ( 1 contrôle et 1 formulation test). C'est le nombre minimal possible pour avoir un résultat.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 et une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu (apport de jouet: balles, cordes). Les animaux seront également hébergés en cage à métabolisme pour des recueils d'urine et de fécès sur une durée maximale de 24h. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Les animaux seront observés à minima une fois par jour, voir plusieurs fois par jour si besoin.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type d'étude Jeune adulte . A ce stade les animaux sont plus facile à manipuler.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

2 592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès un à deux jours après la naissance, elles reçoivent une injection de virus dans le cerveau ou dans une veine, puis, adultes, subissent des tests de mémoire reposant sur des chocs électriques aux pattes et des tests d'anxiété, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Wolfram. Le porteur met à mort tous les animaux pour prélever le cerveau et divers organes. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" car il serait le seul mammifère non humain à reproduire les signes neurologiques de la maladie dans un délai court.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de la maladie n’existe et seul le traitement des symptômes (diabète principalement) permet d’améliorer l’espérance de vie des patients. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique d'une thérapie génique via l'injection de particules virales. Cette injection devrait restorer les déficits de mémoire et d'anxiété chez un modèle souris du syndrome de Wolfram. Cette étude permettra la validation de notre stratégie de thérapie génique chez le modèle murin de la maladie.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Touchant plusieurs organes, le syndrome de Wolfram est une maladie complexe qui nécessite des approches combinées. En développant une thérapie génique unique, qui sera délivrée de manière intra-cérébrale ou via la circulation sanguine, nous espérons arrêter la progression de la maladie. L'efficacité de notre thérapie génique dans notre modèle souris du syndrome de Wolfram permettra, à terme, le développement clinique de la thérapie génique chez les patients.

Procédures

Les nouveaux nés, 1 à 2 jours après la naissance, seront exposés à différentes procédures: anesthésie, administration cérébrale ou intraveineuse de vecteurs viraux. Cette injection sera unique, et n'excèdera pas 15 secondes. Suite à ce traitement, des analyses comportementales de la mémoire et de l'anxiété de ces animaux seront testées (6 à 8 tests de 30min maximum).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront soit "légers" soit "modérés" suivant les actes. Les animaux auront, 1 à 2 jours après la naissance, une chirurgie, associée à une anesthésie, permettant l'injection de virus dans le cerveau ou dans une veine de la tête. Cette intervention pourra engendrer un léger stress chez l'animal. Afin de tester leur mémoire, les souris, à 3 mois, recevront un choc éléctrique de faible intensité et de courte durée au niveau des pattes pouvant engendrer un léger stress.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter les structures du cerveau ainsi que divers organes. Cela permettra des analyses approfondies pour comprendre l'efficacité de notre traitement.

Remplacement

L'utilisation de modèles souris du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes neurologiques du syndrome de Wolfram dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet, les animaux utilisés en comportement seront ensuite euthanasiés et leurs organes périphériques et centraux collectés, complétant ainsi les groupes de souris pour les analyses tissulaires. Les croisements entre males et femelles seront optimisés afin de limiter le nombre d'animaux générés.

Raffinement

Au quotidien, nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Lors des tests comportementaux, les animaux ne seront pas séparés de leurs congénères et placés 20min avant le début du test dans la pièce d'expérimentation afin de leur permettre une habituation au nouvel environnement. Après les tests comportementaux, les animaux seront directement remis dans la cage d'origine à l'écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Durant les périodes de tests comportementaux, les animaux seront pesés avant chaque test afin de permettre un suivi du poids, toute perte de poids supérieure à 15% entrainant la sortie de l'animal de la procédure. Une grille de scorage définissant les points limites sera mise en place suite à l'injection des particules virales sur nouveau né. Un antalgique sera administré avant toute procédure afin de limiter la douleur des animaux.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie touchant de nombreux organes, pour laquelle les altérations auditives et visuelles s'accompagnent de signes neurologiques et cognitifs. Seul un modèle robuste qui mime la pathologie humaine permet de tester et caractériser, au niveau fonctionnel et biologique, l'efficacité de notre traitement par thérapie génique. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement. Les procédures d'injection de particules virales seront effectuées 1 à 2 jous après la naissance afin de garantir une dissémination efficace. Les tests comportementaux ainsi que l'euthanasie des animaux se feront à 1mois, 3 mois et 6 mois pour permettre une vision de l'évolution du traitement dans le temps.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

3 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants et remis en stock. Chaque animal subit un unique prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie d'environ quarante minutes, avec un risque de désordre physique ou neurologique si le geste est mal réalisé. Le porteur met au point cette technique de prélèvement en vue de futures études sur le passage de la barrière hémato-encéphalique. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'organisme entier et retient trois porcs comme minimum pour maîtriser le geste.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de mettre en place une technique de prélèvement de liquide céphalo rachidien chez le mini porc. Cela sera necessaire dans le cadre de futures études pour vérifier le passage de la barrière hémato encéphalique des produits qui seront testés.

Bénéfices attendus

Il est nécessaire de conduire ce projet pour mettre au point la technique de prélèvement de liquide céphalo rachidien qui sera utile dans de prochaines études. L'objectif étant de savoir si le produit testé passe la barrière hémato encéphalique.

Procédures

Le prélèvement de liquide céphalo rachidien se fera sur animal anesthésié. La durée de l'anesthésie est estimée à 40 minutes. Il y aura qu'un seul prélèvement par animal. La durée d'un prélèvement est de l'ordre de la minute. Tout geste technique fait à l'animal sera réalisé par un personnel formé avec la présence d'un vétérinaire conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Suite à ce prélèvement, pour le reveil des animaux, il y aura la possibilité d'héberger les animaux en individuel si besoin. Si c'est le cas la durée de l'hébergement individuel sera de courte durée, estimée à une heure environ.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de liquide céphalo rachidien est un prélèvement bien spécifique. Il faut éviter que ce prélèvement soit contaminé par du sang. Ce prélèvement sera effectué par un personnel formé et de manière conforme à la réglementation en vigueur, selon les bonnes pratiques vétérinaires. Ce prélèvement se fera sous anesthésie générale de l'animal. Le risque dans ce projet est que le prélèvement de LCR soit mal fait et que cela entraine un désordre physique ou neurologique chez l'animal. Pour cela les animaux seront observés au minimum une fois par jour, et plusieurs fois par jour aprés le prélèvement de LCR ( minimum 2 fois). Le recours à des analgésiques est possible si nécessaire. Toutes décisions sur l'animal sera prise en accord avec le vétérinaire désigné.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie et retourneront dans le stock.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre au point la technique de prélèvement de liquide céphalo rachidien chez le miniporc. Il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble pour ce type de projet.

Réduction

Dans ce projet le nombre d'animaux requis est 3. C'est le nombre d'animaux minimum pour pouvoir maitriser le geste technique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 3. Dans les hébergements, une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Présence de jouets type, balles, cordes seront présent au sol. Les animaux seront observés quotidiennement, et au minimum deux fois par jours aprés le prélèvement de LCR. Si besoin les animaux seront placés en hébergement individuel si c'est nécessire pour la phase de réveil.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type d'étude Jeune adulte . A ce stade les animaux sont plus facile à manipuler.