Autres troubles humains

246 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie créant un défaut osseux dans le crâne, avec deux défauts par animal, pour y implanter un biomatériau. Ils sont ensuite tués pour prélever la voûte crânienne et évaluer la repousse osseuse. Le projet teste un hydrogel destiné à traiter la péri-implantite dentaire, le porteur affirmant qu'il n'existe pas de solution de remplacement pour l'étude du tissu osseux.

Objectifs

La pose d’implants dentaires est un traitement courant en dentisterie et se répand de plus en plus parmi les praticiens au fil des années. Cependant, en raison de l’exposition permanente aux agents infectieux, la péri-implantite touche aujourd’hui 20% des patients implantés. Si elle n’est pas traitée, elle peut conduire à la perte totale de l’implant et des complications systémiques. La péri-implantite se définit par la formation d’un biofilm bactérien à la surface de l’implant qui entraine une forte inflammation des tissus environnants conduisant à une perte osseuse massive. Les traitements utilisés aujourd’hui par les praticiens (antibiotiques à larges spectres, désinfection de l’implant) ne montrent pas d’efficacité à long terme et peuvent engendrer une résistance bactérienne. Pour pallier à l’utilisation des antibiotiques, un intérêt grandissant est porté aux agents antibactériens inorganiques tels que les nanoparticules, ions métalliques ou polyphénols. Ainsi, l’objectif de notre projet est de développer un matériau innovant en combinant deux hydrogels aux propriétés distinctes. Dans un premier temps, un mélange d’hydrogel, de granules de céramique biphasées (BCP) et de nanoparticules d’hydroxyapatite dopées avec un cation pourra adhérer à l’implant et présentera des propriétés antibactériennes, ostéoconductrices et pro-régénératives. Dans un second temps, une membrane composée d’un mélange d’hydrogel et de chitosan présentant une dégradation lente, sera positionnée afin d’empêcher la croissance des tissus épithéliaux autour de l’implant. L’hydrogel et la membrane ont déjà été étudiés au laboratoire. L’hydrogel a été montré comme cytocompatible in vitro et biocompatible in vivo dans un modèle d’injection en sous-cutané chez la souris. La membrane a quant à elle été montrée comme biocompatible et agissant comme une barrière à l’invasion des cellules du tissu gingival dans un modèle ex-vivo d’explants de cellules gingivales humaines dans le cadre de la parodontite. Cette étude in vivo sera menée chez le rat en deux contextes : une procédure en site orthotopique (implantation des composites dans des défauts osseux de calvaria) afin de juger l’effet du composite sur la repousse osseuse et une seconde procédure en site orthotopique (implantation des membranes dans des défauts osseux de calvaria) afin de juger l’effet de la membrane sur la croissance des tissus épithéliaux autour de l’implant.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider in vivo l’effet ostéogénique d’un composite d’HA-Si + BCP + cation dans le cadre de la péri-implantite. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement de la péri-implantite qui serait utilisable en une seule fois, pratique pour les cliniciens et efficace au long court, en terme de régénération osseuse et effet antibactérien. Ce traitement permettrait donc aux patients de retrouver une bonne qualité de vie d’éviter l’apparition de complications systémiques de la péri-implantite.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé en cation au niveau d’un défaut osseux critique de calvaria de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.

Impact sur les animaux

Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (5mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie (stress, perte de poids, comportement anormal), l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation.

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés grâce au dispositif d’euthanasie qui respecte respecter une phase d’endormissement suivie de l’euthanasie (durée totale 8 minutes), permettant ainsi une phase progressive d’endormissement sans douleur pour les animaux. Les calvarias seront ensuite prélevés et préparées pour réaliser des analyses au laboratoire qui permettront l’évaluation la repousse osseuse.

Remplacement

L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux fonctionnalisés en termes de biocompatibilité et d’ostéoconduction. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux. Des études in vitro de cytocompatibilité des composites et d’étude de leur effet ostéogénique ont été réalisées et ont permis le choix de deux formulations, qu’il est maintenant nécessaire de tester in vivo sur le petit animal.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, le biomatériau utilisé a été sélectionné en amont et déjà testé pour sa biocompatibilité et sa capacité d’ostéoconduction in vitro. et in vivo. Pour les deux procédures réalisées en site orthotopique, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs l’étude de la bibliographie nous a permis de déterminer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude. Pour la phase d’analyse, les tests statistiques utilisés dépendront de la distribution des données.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. - Pour la chirurgie, une anesthésie générale et l’admission d’analgésiques sont prévus. -Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Une grille de score, des points critiques et un arbre décisionnel adaptés sont mis en place et les animaux seront observés tous les jours par les opérateurs et équipe d’animaliers. En cas d’apparition de symptômes, et si persistance malgré le traitement antalgique adapté, l’animal sera sorti de l’expérimentation et mis à mort dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgées de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont placées jusqu'à quinze jours dans une centrifugeuse reproduisant une hypergravité de 2G, ce qui les plaque au sol et augmente leur stress, puis passent le test de la croix surélevée et le test du labyrinthe en Y avant d'être tuées pour l'étude de leur hippocampe. Le projet vise à comprendre l'effet de la gravité sur la mémoire, en vue d'aider les astronautes lors des vols spatiaux. Le porteur affirme que l'effet de l'hypergravité sur un "organisme entier" ne peut pas être modélisé in vitro.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer les effets de l’hypergravité (à court ou à long terme) sur la potentialisation à long terme (LTP) dans l’hippocampe des animaux, l’un des mécanismes essentiels de la mémoire. Nous allons aussi déterminer si l’exposition à l’hypergravité (2G) va mener à des difficultés dans des tests comportementaux évaluant la mémoire, la cognition et le stress des animaux. Après une période d’habituation, en groupe sociaux, dans des cages de l’animalerie, la totalité des animaux, soit 80 animaux, seront soumis soit à l’hypergravité (2G) pendant 24h (n=20), 48h (n=20) ou 15 jours (n=20) dans une centrifugeuse in vivo, prévue à cet effet soit à 1G (condition normogravitaire, n=20). Pour reproduire un champ gravitaire de 2G, et donc placer les animaux en hypergravité, nous utilisons une centrifugeuse in vivo (programme spatial du CNES). A la fin de ces différentes périodes, la première moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort pour une étude electrophysiologique approfondie sur tranches d’hippocampe. L’autre moitié des animaux effectura des tests comportementaux pour étudier si des modifications sont concommittantes au niveau comportemental (mémoire) et au niveau cérébral (propriétés électrophysiologiques de l’hippocampe). Après 15 jours d’adaptation, durant lesquels ces tests seront effectués à nouveau 4 fois (2 fois par semaine), les souris seront mises à mort pour effectuer des enregistrements electrophysiologiques et voir si les propriétés électrophysiologiques sont modifées.

Bénéfices attendus

Les données qui seront recueillies grâce à ce projet apporteront des informations essentielles sur le rôle de la gravité dans le fonctionnement de l’hippocampe. En effet on sait que le système vestibulaire, qui est l’organe sensoriel sensible à la gravité est directement connecté à l’hippocampe et participe ainsi non seulment à l’orientation dans l’espace mais aussi à la mémoire spatiale et aux autres fonctions contrôlées par l’hippocampe. Comprendre comment la gravité modifie le fonctionnement et la plasticité de l’hippocampe, et indirectement comment elle affecte les fonctions cognitives servira de base pour trouver des contre-mesures pour aider les astronautes à éviter la désorientation et l’altération de leurs fonctions cognitives lors de changement de gravité telles qu’ils subissent lors des vols spatiaux.

Procédures

Après une période d’habituation, en groupe sociaux, dans des cages de l’animalerie, la totalité des animaux, soit 80 animaux, seront soumis soit à l’hypergravité pendant 24h (n=20), 48h (n=20) ou 15 jours (n=20) dans une centrifugeuse in vivo, prévue à cet effet soit à 1G (condition normogravitaire, n=20). A la fin de ces différentes périodes, la première moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort pour une étude electrophysiologique approfondie sur tranches d’hippocampe. L’autre moitié des animaux sera soumise à des tests comportementaux non invasifs. Ces tests seront réalisés sur animaux vigiles et sans anesthésie. Concernant les 20 animaux témoins, ils seront placés, en groupe sociaux, dans une nacelle de centrifugeuse qui sera déposée dans la meme pièce que la centrifugeuse mais qui ne sera pas en rotation. Alors que 10 de ces animaux effecturont le protocole « électrophysiologie », les 10 autres effecturont le protocole « comportement + electrophysiologie ». Les nuisances prévues sont au nombre de 3. Tout d’abord l‘exposition à l’hypergravité (pour 60 souris), puis les tests comportementaux (pour 40 souris) puis l’électrophysiologie post-mortem (pour 80 souris). L’exposition à l’hypergravité va consister en une augmentation progressive de l’accélération générée par la mise en rotation de l’appareil. Nous prévoyons une augmentation lente permettant d’atteindre un vecteur d’intensité gravitaire perpendiculaire au sol des cages de 2G en 5 minutes. Lors de cette augmentation les animaux vont ressentir une augmentation de leur poids qui va les plaquer au sol et réduire leurs mouvements puis les animaux vont s’adapter et on observe qu’après quelques heures ils commencent à retrouver un certain niveau d’activité. On observe pendant cette phase d’adaptation une augmentation du niveau de stress, puis une habituation à ce nouvel environnement et une réapparition des comportements normaux. Les tests comportementaux que nous effectuerons dès la sortie de la centrifugeuse puis à deux autres délais pour les souris exposées durant 2 semaines sont le test de la croix surélevée et le test du labyrinthe en Y (alternance spontanée). Ce ne sont pas des tests qui génèrent une nuisance particulière, les animaux sont libres de leurs mouvements et on recueille seulement des paramètres liés à leur exploration.

Impact sur les animaux

La mise en hypergravité des animaux induit une sensation d’alourdissement qui peut potentiellement induire une augmentation du niveau du stress, en perturbant leur perception de la gravité et de leurs déplacements dans l’espace. Par conséquent, et comme cela a été montré dans la littérature, les animaux vont s’immobiliser pendant une periode de quelques heures avant de s’habituer au nouveau référentiel gravitationnel et reprendre une activité normale.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure. En effet la première moitié des animaux est utilisée pour des études electrophysiologiques ex-vivo de tranches d’hippocampe, par conscéquent ils seront mis à mort dès la sortie de la centrifugeuse. L’autre moitié des animaux sera soumise à des tests comportementaux non-invasifs à la sortie de la centrifugeuse, ils seront ensuite réutilisés quelques jours plus tard, pour des mesures électrophysiologiques, pour évaluer des phénomènes de réadaptation plusieurs jours apres la centrifugation. Par conséquent, à la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Des études in vitro ou in sillico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de l’hypergravité sur un organisme entier. En effet, la gravité exerce des effets sur l’intégralité de l’organisme (systèmes sensoriels, système musculo-squelettique, viscères etc.), et les effets de ses modifications et de leurs interactions ne peuvent, à l’heure actuelle, pas être modélisés autrement que sur un organisme dans son intégralité. Par ailleurs, étant donné que nous effectuons des tests comportementaux, nous avons besoin des animaux vivants. Pour les enregistrements életrophysiologiques nous avons besoin de tranches de cerveau qui ne sont pas encore modélisables in vitro ou in sillico. Nous avons choisi le modèle souris afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur ce même modèle, car il est de petite taille et peut etre maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse. De plus, le modèle souris est un mammifère suffisament proche de l’homme pour pouvoir transférer les données obtenues entre ces deux espèces.

Réduction

Nous avons défini le nombre d’animaux dans chaque groupe à n=10 en nous basant sur la littérature disponible sur le sujet et sur les travaux du laboratoire utilisant les mêmes méthodes. De plus, le fait d’utiliser les mêmes animaux pour les études comportementales et pour le suivi de la récupération des animaux après l’exposition à l’hypergravité permet de réduire considérablement leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables dans des cages standard, répondant aux normes d’éthique. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, c’est-à-dire dans un environnement stabilisé en température à 21°, hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h). L’eau et la nourriture seront ad libitum, de la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition. Leur milieu est enrichi par des frisures de carton et un igloo en papier mâché. Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, à chaque arrêt de la centrifugeuse un responsable des animaux vérifiera quotidiennement l’état des animaux et particulièrement des éventuelles variations de poids, leur apparence physique externe des animaux (poils hérissés, blessures…), des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et mis à mort.

Choix des espèces

Les données bibliographiques les plus récentes sur ce sujet ont portés sur le modèle souris, il parait donc judicieux de poursuivre avec cette espèce pour pouvoir confronter nos résultats et apporter de nouvelles données. Nous avons également choisi le modèle souris car il est de petite taille et supporte très bien une modification de la gravité jusqu’à 2g. De plus, son génome est connu et suffisament proche de celui de l’homme pour obtenir des premiers résultats concluants. Nous utilisons des souris adultes de 8 semaines car pour étudier la plasticité synaptique hippocampique, nous souhaitons que la croissance et le développement cérébral soit atteint.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation cérébrale sous anesthésie, des administrations intra-nasales, une perfusion intracardiaque et des prélèvements sanguins, puis passent des tests comportementaux répétés (labyrinthe en Y, labyrinthe en croix surélevé, rotarod) avant d'être euthanasiées pour prélever leurs structures cérébrales. Le projet teste des vésicules extracellulaires censées limiter les troubles cognitifs provoqués par la radiothérapie chez les patients, retombées renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne permettent d'évaluer ni le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs et conclut que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules constituant les vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, chez 50-90% des patients suite au traitement de tumeurs du cerveau par radiothérapie il est observé dans les 6 mois des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. Il est donc indispensable de proposer de nouveaux traitements afin d’améliorer la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les CSM sont un type de cellules souches adultes très utilisées en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue des CSM (prélèvement et administration chez la même personne). Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture. On note surtout une efficacité des cellules diminuées en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des CSM serait majoritairement lié à la sécrétion de vésicules extracellulaires (VE). Elles sont produites en grand nombre par les CSM suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de VE in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des CSM via le patient. Les VE sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les VE permettent de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et donc pourraient permettre de limiter le développement des troubles cognitifs. Dans le cadre de ce projet, la mesure du flux sanguin cérébral sera réalisée dans un autre établissement possédant expertise et équipement pour le réaliser de façon non invasive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices que ce projet apportera sont multiples tel que - une nouvelle thérapie non-invasive - une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) - une amélioration de la qualité de vie

Procédures

Prélèvement sanguin (80 microL) 1 fois sous anesthésie gazeuse isoflurane avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes Perfusion intracardiaque sous anesthésique, durée 15 minutes Irradiation cérébrale sous anesthésie gazeuse : 10 min sous anesthésie gazeuse isoflurane Administration intra-nasale sous anesthésie gazeuse : environ 5 min par administration Les animaux subiront plusieurs fois les procédures qui suivent à différents temps. Tests comportementaux réalisés 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois): - Labyrinthe en Y : 10 min, - Labyrinthe en croix surélevé : 5 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Rotarod : 3 fois 3 min par séance (1h entre chacun des 3 passages) Analyse échodoppler sous anesthésie gazeuse : 10 min sous légère anesthésie gazeuse Ils seront transportés dans un autre établissement, anesthésiés et rasés entre la base de la nuque et les oreilles avec une tondeuse afin de pouvoir appliquer un gel et la sonde échographique pour évaluer la vasoréactivité cérébrale : mesure de la demande en sang du cerveau. Une diminution de ce flux sanguin nous renseigne sur une diminution du nombre de vaisseau et donc la mise en place des complications aux rayonnements ionisants et le développement des troubles cognitifs.

Impact sur les animaux

Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après administration nasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellule en boîte de pétri) ne permettent d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation animal présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticien déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux comptabilisés dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes (Anova, Ttest) afin de valider notre nouvelle thérapie.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, administrations intra-nasales et imageries, hébergement en groupe avec enrichissement).

Choix des espèces

Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement.

1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent des prises de sang sur animal vigile et des injections, 880 sont placées en cage métabolique jusqu'à 18 heures dont une période sans eau, et d'autres portent un modèle de drépanocytose provoquant des crises douloureuses. Le porteur indique anesthésier les gestes les plus invasifs et surveiller la douleur par une grille de score. Il affirme que la souris est "le seul modèle" permettant d'étudier à la fois les atteintes rénales et musculaires de la maladie.

Objectifs

La drépanocytose est la maladie génétique du sang la plus fréquente au monde. Cette maladie se manifeste par une déformation et une rigidification des globules rouges. Ces globules rouges déformés sont plus fragiles et sont la source de l’anémie hémolytique décrite chez les patients drépanocytaires. La forme en faucille de ces globules rouges favorise leur agglomération, l’interruption du flux sanguin et par conséquent, des crises vaso-occlusives, très douloureuses, au niveau de tous les organes du corps. La répétition de ces ischémies (un arrêt ou insuffisance de la circulation sanguine dans une partie du corps ou un organe, qui prive les cellules d'apport d'oxygène) induit des lésions sévères, notamment des organes les plus vascularisés et donc une réduction de la qualité et de l’espérance de vie des patients.Notre projet se concentre sur deux complications chroniques majeures de la drépanocytose : la maladie rénale et la fonte musculaire en s'intéressant aussi le point sur d’autres atteintes tel que la cardiomyopathie et la rétinopathie associée a la drépanocytose. Ainsi, les objectifs de notre projet sont de comprendre : 1- comment telles altérations multi-organes se produisent 2- si le muscle altéré peut avoir des effets déletèrent sur le rein ou vice-versa 3- comment pourrait on les prévenir ou les traiter

Bénéfices attendus

Cette étude pourra révéler une voie commune jusqu'alors non reconnue affectant à la fois le rein et les muscles dans la drépanocytose et éventuellement d'autres maladies hématologiques hypoxémiques. Elle pourra apporter une stratégie thérapeutique puissante pour la progression de la maladie rénale chronique et la fonte musculaire chez les patients atteints de cette maladie. En outre, l'exploration d'une interférence potentielle entre le néphropathie et la sarcopénie associées à la drépanocytose ouvre un nouveau domaine de recherche.

Procédures

Tous les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang de 20 microlitres a sur souris vigile maintenue en contention manuelle. 160 souris subiront une injection deux fois par semaine pour six semaines sur souris vigile. 160 souris subiront une injection pour 5 jours consécutifs sur souris vigile. 160 souris subiront une injections de la patte postérieure aprés anésthésie gazeuse. 160 souris subiront deux injections séparées de 56 jours, de la patte, postérieure aprés anésthésie à l'isoflurane. 80 souris subiront une injection aprés anésthésie gazeuse. Tout les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang aprés anésthésie à l'isoflurane et avant mis à mort. 880 souris seront mises en cages metaboliques, pour deux fois, séparées de 24 heures. La premier confinement en cages metaboliques sera pour 18 heures, le second sera pour 6 heures. 880 souris subiront deux mesures de pressions de 20 minutes non ivasives sur souris vigiles sur deux jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Les souris subiront le stress d'être isolées pendant 20 minutes pour les mesures de pressions. Elles subiront aussi le stress d'être isolées pendant 6 heures allant jusqu'à 18 heures en cages metaboliques. Elles resteront sans eau pour 18 heures lors du confinement en cage metabolique. Elles subiront une douleur minime lors de certains prélèvements et injections. Cependant, lors des procédures plus invasives les souris seront anésthésiées à l'isoflurane et analgésiées.

Devenir

Etant donné que les organes de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.

Remplacement

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concernent l'étude des maladies glomérulaires et musculaire car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés à la taille de nos échantillons. Pour chaque animal, un maximum d'organes et de prélèvement biologique sera fait afin de ne pas avoir à refaire des experiences sur de nouveaux animaux.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises : 1) Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bihebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie. 3)Les procédures invasives tel que certaines injections seront réalisées aussi sous anesthésie et les souris recevront un traitement analgésique qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère et d'utiliser la recombinaison homologue ou l'excision allélique dirigée afin de connaitre la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. A partir de 4 semaines, une fois que le sevrage physiologique est effectif et jusqu'à 6 mois pour ne pas observer une potentielle fibrose rénale liée au vieillissement. En effet, l'âge est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop âgées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

448 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit l'implantation chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis des sessions répétées d'auto-administration intraveineuse de nouvelles drogues de synthèse ou de cocaïne, pour évaluer le pouvoir addictif de ces substances. Le porteur indique que la prise chronique peut induire un état émotionnel négatif, avec poil hérissé, irritabilité et agressivité envers l'expérimentateur. Il affirme que ce type de recherche ne peut être mené que sur un animal vivant, l'étude du comportement exigeant des "réseaux neuronaux intacts et fonctionnels".

Objectifs

Ce projet a pour but principal de dépister et caractériser les effets récompensants de nouvelles substances psychostimulantes de synthèse. En effet, depuis vingt ans, l’usage de ces produits n’a pas cessé d’augmenter ainsi que le nombre de cas d’accidents liés à leur usage. Par exemple, à la fin de 2019, le « Observatoire Français des Drogues et des Tendances addictives pour l’Europe » (OFDT) avait recensé plus de 700 nouvelles substances psychostimulantes. Le problème majeur avec ces nouvelles substances est qu’elles miment l’effet des drogues psychostimulantes traditionnelles (ex. amphetamines) mais qu’elles ont des nouvelles structures chimiques qui ne sont pas connues et classifiées par la législation française et européenne et donc, qu’elles peuvent être librement achetées et utilisées. Ainsi, il existe un important décalage temporel entre l’apparition des intoxications et les fatalités liées à leur usage, et le moment où elles sont déclarées illégales et que leur vente et leur usage sont interdits. Le but principal de ce projet est d’identifier et caractériser précocement les nouvelles substances psychostimulantes de synthèse qui présentent un risque d’abus important afin d’informer le législateur sur les mesures à mettre en place le plus rapidement possible pour limiter les risques associés à leur usage. Ce projet fait partie d’un projet international financé par l’Union Européenne qui prévoit l’interaction étroite entre des spécialistes de différents domaines allant de la chimie en passant par les modèles d’addiction in vivo. Notre rôle dans le projet est de tester chez le rat le pouvoir addictogène de nouvelles substances psychostimulantes en utilisant l’auto-administration intraveineuse. Pour cela, nous allons tester les effets récompensants de 8 nouvelles substances psychostimulantes de synthèse sélectionnées par le consortium européen en fonction de leur risque d’abus prédit sur la base « théorique » d’une comparaison de la structure chimique des nouvelles substances psychostimulantes de synthèse avec celle des molécules connues.

Bénéfices attendus

Les nouvelles substances psychostimulantes de synthèse constituent un risque majeur pour la santé humaine. Ce projet permettra d'être en capacité d'anticiper les risques d'abus de ces nouvelles substances psychostimulantes de synthèse ce qui permettra aux autorités judiciaire et policière de mettre en place des contre-mesures pour limiter les dégâts induits par ces molécules. Ce projet, financé par l’Union Européenne, devrait permettre de coordonner les efforts de lutte contre ces nouvelles drogues.

Procédures

Tous les rats (448) seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir suivre les sessions d’auto-administration de drogue. 224 rats suivront 21 sessions d’auto-administration de nouvelle substance psychostimulante de synthèse (20 sessions de 2h et 1 session de 5h à raison d’1 session par jour). 224 rats suivront 20 sessions d’auto-administration de cocaïne (1 session de 2h par jour) et 15 sessions d’auto-administration de nouvelle substance psychostimulante de synthèse (12 sessions de 2h et 3 sessions de 5h à raison d’1 session par jour). Tous les rats (448) seront pesés 16 fois (2 fois par semaine, 10 secondes par pesée, pendant 8 semaines).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - cathéter : gène légère - auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « dépendant » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur, mais pas d’agressivité vis-à-vis des congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques semaines. - stress léger lié à l’isolement temporaire (2jours) des animaux au cours du projet

Devenir

Tous les animaux, à l’issue de tous les tests d’auto-administration, seront mis à mort pour le prélèvement de leur cerveau pour pouvoir étudier les mécanismes cérébraux des nouvelles substances psychostimulantes de synthèse.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les effets comportementaux des drogues d’abus, peut-être uniquement menée sur un animal vivant. En effet, l’étude du comportement nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques . Ainsi 14 animaux par lot seront nécessaires à notre étude, avec 32 lots, soit 448 animaux au maximum. Les cerveaux seront prélevés après la mise à mort à la fin des procédures afin de constituer une banque de tissus utilisable si besoin.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal. En cas d’apparition de signes de mal-être, et suivants des points limites établis, une prise en charge adaptée et sans délai sera appliquée et un traitement antalgique sera mis en place si nécessaire. Le bien-être animal est également assuré pendant la chirurgie par le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques. De plus, pendant la chirurgie l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger ou tunnel) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs expérimentés et compétents.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux car les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Les rats Sprague-Dawley sont les plus utilisés dans le domaine biomédical. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet (qui durera environ 3 mois) afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

1 862 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de paclitaxel, un agent de chimiothérapie, puis subissent des tests comportementaux de douleur mécanique ou thermique sur trente-cinq jours, pour mettre au point un modèle de neuropathie chimio-induite. Le porteur indique s'attendre à une perte de poids, de la constipation, de l'alopécie et une piloérection, et rester vigilant aux signes d'anémie et de déshydratation. Il présente ce modèle comme une offre commerciale destinée à ses clients pour développer des candidats médicaments, et affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la douleur.

Objectifs

Ce projet porte sur le développement d’un modèle de neuropathie chimioinduite, causé par des administrations répétées de paclitaxel chez la souris. Cet agent chimio-thérapeutiques est utilisé dans le traitement des cancers colo-rectaux, pulmonaires, ovarien, ainsi que dans le traitement du cancer du sein. Toutefois, il induit des douleurs neuropathiques chez 40 à 92% des patients conduisant à la limitation ou l’arrêt du traitement. Le nombre de procédures, ainsi que le nombre d’études au sein de ces procédures et le nombre d’animaux sont basés sur l’expérience du laboratoire dans le développement de modèles de douleur chez le rongeur et sur l’expérience acquise dans le même modèle chez le rat . Le laboratoire souhaite mettre en place des modèles au plus proche de la clinique afin de permettre le screening de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre au laboratoire de mettre au point un nouveau modèle au plus près des conditions cliniques. Le laboratoire peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causées par l’administration de paclitaxel, actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ceci va ainsi permettre une meilleure prise en charge de neuropathie due à l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer.

Procédures

Les animaux auront 4 ou 5 injections intrapéritonéale de paclitaxel (tous les jours pendant cinq jours ou tous les deux jours pendant 7jours) et auront un test comportementale de douleur (mécanique ou thermique) Les procédures feront des cinétiques de test sur du long terme pour voir l'induction (tous les 3 à 4 jours pendant 35jours un seul point de mesure) ou un seul jour de test (selon résultats des premières procédures) sera testé mais avec une cinétique de cinq points de mesures le même jour.

Impact sur les animaux

Suite à nos recherches bibliographiques, peu d’informations sont données sur des effets secondaires de ce modèle. Malgré tout, un article nous permet de nous attendre à une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie et de la piloérection. Ces observations seront incluses dans nos points limites. Nous serons aussi vigilants aux signes d’anémies et de déshydratation, signes que nous avons pu observer dans ce modèle chez le rat. Le cadre de ce projet est de travailler sur un modèle de neuropathie, les animaux subissent donc des tests de douleur aiguë (thermique ou mécanique). Les animaux peuvent être isolés pendant la durée des tests. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets secondaires tel que la constipation, la baisse de tonus… Ces effets secondaires disparaissent quelques heures après administrations. Les injections répétées de paclitaxel peuvent créer un hématome dans la zone d’injection. Les animaux sont injectés en alternance de chaque côté de l’abdomen.

Devenir

Le modèle de neuropathie chimioinduite par administration de paclitaxel semble être un modèle stable dans le temps. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De plus, les processus biologiques causés par l’administration de paclitaxel pourraient interférer avec d’autres modèles. L’âge de ces animaux à la fin des procédures sera bien plus important que pour l’ensemble de nos modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement d’un modèle permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=12 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat

Raffinement

Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Les tests comportent pour la majorité des valeurs maximales (cut-off, ou temps d’application maximale, intensité lumineuse maximale, température la plus basse possible) à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance supplémentaire. Ces mises au point ont pour objectif de raffiner au maximum les conditions expérimentales.permettant de montrer une allodynie/hyperalgésie. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement (tunnel et matériel pour nidifier) et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein ddu laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de leur capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore dévelopés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) les médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente chez la souris (ex. : duloxetine) ce qui permet la validation des modèles et suggère l’existence de mécanismes biologiques communs. Les sujets jeunes sont à favoriser pour le développement d’une neuropathie périphérique après administration répétée de paclitaxel. Cet article met en évidence des marqueurs physiologiques et des tests comportementaux (similaire à ce que nous réaliserons ici)

360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après pose d'un cathéter dans la veine jugulaire et deux chirurgies cérébrales, ils s'auto-administrent cocaïne ou nicotine sur vingt-cinq sessions, isolés en cage individuelle, pour étudier le rôle du cholestérol cérébral dans la rechute. Le porteur décrit un état de dépendance avec poil hérissé, irritabilité et agressivité, et reconnaît que l'isolement prolongé est source de stress. Les rats sont ensuite tués pour des analyses du cerveau, et le porteur renvoie d'éventuelles thérapies à moyen terme.

Objectifs

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la recherche de drogues chez des individus addicts restent mal connus ce qui limite le développement de thérapies efficaces. Quelques études antérieures ont suggéré que le métabolisme du cholestérol jouerait un rôle dans la recherche de drogue et dans la rechute. Ce projet a pour but d’étudier le rôle de ce métabolisme dans l’activité cérébrale déclenchée dans le striatum dorsal, une structure impliquée dans l’addiction, lors de la recherche de drogues. Dans ce projet, nous chercherons à démontrer un lien entre la manipulation du cholestérol dans le striatum dorsal et l’activité neuronale dans cette région lors de la recherche de drogue après une période d'abstinence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant le rôle du cholestérol cérébral dans la vulnérabilité à la rechute à l'addiction. Ces expériences pourraient conduire à moyen terme au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire voire empêcher la rechute.

Procédures

Les rats des groupes cocaïne et nicotine seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir s’auto-administrer les drogues. Tous les rats seront placés dans les cages d’auto-administration pour suivre des sessions d’entrainement d’auto-administration (25 sessions, 1 session par jour ; durée d’une session : pour cocaïne=6h, nicotine=1h, sucre=4h). Tous les rats subiront un total de deux chirurgies cérébrales (1h30 par chirurgie) : - la première pour placer un senseur de l'activité des neurones avec (groupes cocaïne et nicotine) ou sans (groupe sucre) implantation d’un cathéter intraveineux - la seconde pour injecter une enzyme dégradant le cholestérol et pour implanter à demeure un système d’imagerie qui permettra de mesurer l’activité des neurones pour tous les animaux. Tous les rats auront deux sessions d'’adaptations et de test (30 min et 1h, respectivement) aux dispositifs permettant de mesurer simultanément l'activité de recherche de récompenses et l'activité des neurones du striatum dorsal.

Impact sur les animaux

- Cathéter et Fibre optique : gène, risque d'infection ou de démangeaisons - Auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains rats, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques semaines. - Isolement : Les animaux sont hébergés individuellement pendant toute la durée de l’auto-administration et jusqu’à la fin de la procédure ce qui peut causer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires et histologiques sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'un processus psychobiologique, peut-être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques impliquées dans le phénomène de rechute. L’étude de ce processus nécessite d’enregistrer l’activité des neurones in vivo, chez l’animal lors du comportement, ce qui implique d’utiliser des modèles d’animaux vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques préalables ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe sera de 18. Deux animaux par lot sont ajoutés en anticipation de possibles pertes liées à la complexité du geste des procédures chirurgicales (la veine peut céder lors de l’insertion du cathéter), à l’expression des virus et/ou à un mauvais placement de la fibre optique. Ainsi 20 animaux par lot, seront nécessaires à notre étude. 18 lots seront nécessaires pour le projet, soit 360 animaux maximum.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire et de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal, et pendant la chirurgie le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick de papier ou pièce de bois à ronger ou tunnel) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Avant le début des sessions d’entrainement à l’auto-administration, les animaux auront une période d’habituation aux cages et seront placés dans les cages d’auto-administration pendant 2 jours, 1 heure par jour. Les animaux seront également habitués à être connectés par leur système de fibre optique avant le test de rechute et d’enregistrement. En cas d’atteinte de points limites, des actions correctives sont prises sans délai. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs formés et compétents à l’expérimentation animale et à la chirurgie.

Choix des espèces

Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de la motivation dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus afin de modéliser au mieux la variabilité inter-individuelle humaine dans le développement d’une addiction. Pour notre étude, le rat est le modèle le plus approprié car il peut s’auto-administrer toutes les drogues, comme l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).