Autres troubles humains

24 porcs adultes vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans des protocoles de prélèvement d'organes. Chaque animal reçoit un cathéter jugulaire, quatre plaies par excision chirurgicale ou par brûlure thermique, des biopsies répétées et cinq prélèvements sanguins, pour tester un pansement destiné aux grands brûlés humains. Le porteur affirme que la peau du porc est "le meilleur modèle" de la cicatrisation humaine et présente l'étude comme le dernier passage avant l'essai chez l'homme. Sur le remplacement, il indique que ces tests de tolérance et d'efficacité doivent réglementairement passer par un modèle animal après les étapes in vitro et ex vivo.

Objectifs

Les brûlures constituent un important problème de santé publique, avec près de 11 millions de personnes dans le monde subissant annuellement des brûlures suffisamment graves pour nécessiter des soins médicaux. Le besoin de la prise en charge des brûlures est de restaurer le plus rapidement possible et complètement la fonction de la barrière cutanée, évitant ainsi la survenue de cicatrices, d’infections et de diminuer la douleur. Il n'existe actuellement aucun traitement des brûlures qui soit en mesure de relever ce défi majeur. Ce problème de santé publique est particulièrement important chez les enfants, qui représentent près de 50 % des brûlés, et pour lesquels le chirurgien décide le plus souvent d'effectuer une autogreffe de peau. L’objectif de ce projet est de montrer la tolérance et l’efficacité du pansement sur la durée et la qualité de la cicatrisation chez un modèle porcin. En effet, les nombreuses similarités entre l’homme et le porc au niveau dermatologique font que le porc est un excellent modèle animal pour la cicatrisation. Dans une revue bibliographique, sur 25 thérapies de plaies, 78 % de concordances ont été établies entre les études sur modèles porcin et l’homme. Cette étude est le premier élément avant de pouvoir passer à une étude chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les attendus sur cette étude doivent nous permettent : - De démontrer la sécurité du pansement (absence de nécrose, d’irritation, d’allergies), - De démontrer la protection contre la contamination (absence de surinfection), - De démontrer la protection contre les facteurs physiques extérieurs (maintien en place avec le pansement secondaire, intégrité du pansement), - D’évaluer l’efficacité de l’absorption (absence d’exsudat non absorbés) - D’évaluer la protection du pansement (absence de contamination du pansement) - De mesurer l’impact sur la vitesse de cicatrisation (accélération de la cicatrisation d’un point de vue macroscopique et histologique), - D’évaluer la qualité de la cicatrice (accélération de la cicatrisation d’un point de vue macroscopique), - D’analyser des marqueurs histologiques de proliférations, de migration et de différenciation tissulaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales de type pose de cathéter en veine jugulaire (n = 24), induction de plaie par excision chirurgicale (4 plaies par animal, n= 12) ou par brûlure thermique (4 plaies par animal, n= 12). Au cours des 14 jours de suivi prévus, des biopsies seront réalisées (4 fois par plaie) ainsi que des prélèvements de sang via un cathéter (5 fois par animal).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus seraient ceux liés à la douleur due aux plaies par excision chirurgicale ou par brûlure thermique. La douleur sera prise en charge, comme en médecine humaine, la seule restriction médicamenteuse portant sur l’utilisation d’AINS qui peuvent interférer sur la cicatrisation. Après l’intervention chirurgicale, l’apparition de signes d’infection sera particulièrement surveillée : chaleur, rougeur au niveau des plaies chirurgicales, fièvre. Les animaux seront en hébergement collectif jusqu'aux chirurgies, dans des conditions d'élevages classiques. L'hébergement individuel sera utilisé uniquement durant la phase expérimentale pour protéger les pansements et plaies chirurgicales et en faisant en sorte de maximiser les contacts entre les animaux. Les cages seront disposées dans la salle pour que les animaux se voient et puissent avoir des contacts groin-groin. Un autre risque identifié est celui lié à l'anesthésie générale (anesthésie gazeuse avec un mélange d'oxygène / isoflurane) mais que le protocole de monitoring des animaux permet d'appréhender (spo2, rythme cardiaque). Le dernier risque relevé est celui lié au prélèvement sanguin (5 ml par prélèvement à raison de 5 prélèvements par animal). Ces volumes et fréquences sont inférieurs aux recommandations en vigueur et sont réalisés via un cathéter posés en veine jugulaire.

Devenir

Les biopsies ou prises de sang seront faites sur animaux vivants. A l'issu de la phase expérimentale, les animaux seront destinés à être réutilisés notamment dans des protocoles de prélèvements d'organes et de tissus dans un objectif de développement de modèle in vitro.

Remplacement

Les études de biocompatibilité, de tolérance et d’efficacité sur un tissu aussi complexe que la peau doivent réglementairement être réalisées sur des modèles animaux avant tout essai clinique chez l’homme. Ce nouveau pansement a été testé in vitro et ex vivo avant d’envisager le modèle animal.

Réduction

Les protocoles d’excisions (chirurgicale et thermique) ont été validés par une pré-étude méthodologique pour obtenir une méthode fiable et répétable et ainsi limiter le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Les excisions chirurgicales ou brûlures thermiques seront faites sur des animaux anesthésiés. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à cicatrisation totale des plaies (la grille de score pour l'évaluation de la douleur, de la détresse et de l'inconfort du mini-porc sera remplie pour chaque animal) et des traitements antalgiques par voie générale leur seront administrés.

Choix des espèces

Anatomiquement et physiologiquement la peau de porc est très similaire à celle de l’homme. Sur une revue de 180 articles sur la cicatrisation montre le haut taux de concordance entre les études sur le modèle humain et porcin faisant du modèle porcin le meilleur modèle pour la cicatrisation humaine. Les animaux sont adultes. La croissance d’un animal jeune pourrait interférer, améliorer la cicatrisation et donc biaiser le mécanisme

70 chevaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 d'entre eux replacés en fin de projet et les autres tués. Ils sont immunisés à répétition avec un adjuvant qui peut provoquer des inflammations locales, puis soumis à des plasmaphérèses avec réinjection des globules rouges, pour produire du plasma servant de base à des anticorps polyclonaux. Le porteur, une société de biodéfense, indique viser 95 000 à 150 000 traitements contre des menaces NRBC et des maladies infectieuses. Il affirme que le cheval est l'animal producteur de référence et qu'aucune méthode alternative n'est connue pour ces anticorps.

Objectifs

Le nombre croissant de maladies infectieuses émergentes et ré-émergentes, la mondialisation et la propagation rapide des épidémies, l'absence de traitements et/ou de vaccination satisfaisants, le développement des menaces liées au bioterrorisme et l'augmentation de la résistance aux antimicrobiens ont conduit à une augmentation significative des risques de menaces biologiques. Le développement, l'accès et le déploiement rapides de contre-mesures médicales adéquates sont essentiels pour anticiper de telles urgences de santé publique, et constituent des enjeux nationaux et internationaux critiques comme a pu le confirmer l’émergence récente du virus Sars-Cov-2 et la pandémie mondiale de Covid-19 qui en a résulté. La société est spécialisée dans les traitements contre les maladies infectieuses émergentes et sévères, et les intoxications. Elle développe actuellement un produit dans le domaine de la bio-défense / menaces NRBC (Nucléaire Radiologique Biologique et Chimique). L’entreprise est également impliquée dans le traitement des maladies infectieuses émergentes comprenant la COVID-19, mais également la grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF). En effet elle a notamment développé un produit contre la grippe aviaire H5N1 et un produit anti-Ebola sous l’égide de l’OMS et avec le soutien de l’Agence Européenne du Médicament (EMA). Elle capitalise sur une plateforme technologique de développement et de production à base d’anticorps polyclonaux. Cette plateforme robuste et reproductible s’appuie sur une technologie éprouvée, avec des produits enregistrés et administrés dans le monde entier depuis des décennies, témoignant d'un excellent profil de sécurité. Elle permet à partir d’un antigène d’immuniser des chevaux et de produire du plasma. Ce plasma est ensuite hautement purifié en anticorps dans un laboratoire pilote en grade R&D. Et ces derniers sont évalués dans des études précliniques in vitro et in vivo. Après la démonstration d’efficacité, des lots sont purifiés dans des conditions BPF (Bonnes Pratiques de Fabrication) pour les besoins des études précliniques réglementaires et cliniques. L’objectif de ce projet est d’immuniser des chevaux dans le but de produire des plasmas servant de base à la purification d’anticorps polyclonaux dirigés contre des cibles virales et / ou toxiniques (y compris toxines bactériennes).

Bénéfices attendus

Des fragments d’anticorps hautement purifiés apportent une solution thérapeutique à des problématiques majeures de santé publique. En effet, la société développe actuellement un produit dans le domaine de la bio-défense / menace NRBC. L’entreprise est également impliquée dans le traitement des maladies infectieuses émergentes comprenant la COVID-19, mais également la grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF). Ce projet nécessitera l’utilisation de 70 chevaux sur 5 ans. Ces chevaux permettront de : 1- Production de plasma servant de base à l'obtention de 95000 à 150000 traitements ciblant les risques bio défense et les maladies infectieuses. 2- Production de plasmas servant de base au développement de nouvelles thérapies (Développement pré-clinique et clinique avec essais chez l'Homme.)

Procédures

Deux procédures différentes sont prévues dans ce projet. Dans les deux procédures les animaux seront soumis à deux types d’interventions : → Des immunisations par voie sintra-dermique, sous-cutané ou intra-musculaire. → Des prélèvements de sang. Il s’agit là de prélèvement de sang, avec séparation des globules rouges (plasmaphérèse), puis réinjection des globules rouges selon le résultat de l'analyse sanguine.

Impact sur les animaux

Deux éléments peuvent induire des nuisances : - L’adjuvant : Les antigènes seront administrés avec ou sans adjuvant. Cet adjuvant peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, seront suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Si un animal nécessite un traitement par voie parentérale, et que ce traitement n’améliore pas son état général après la fin du délai d’attente, les immunisations pourront être suspendues sur cet animal après décision concertée entre les responsables du projet et le vétérinaire. - Baisse de l’hématocrite : Par ailleurs, les prélèvements de sang, peuvent entrainer une baisse de l’hématocrite des animaux. Ainsi, un test d’hématocrite est réalisé après chaque prélèvement et des réinjections de globules rouges (issus de l’animal), et d’agents d’hématopoïèses sont réalisées lorsque l’hématocrite est trop faible.

Devenir

Les animaux ayant terminée une procédure ne peuvent pas intégrer une autre procédure Ainsi, en fin de procédure, si les animaux sont en bonne santé, ils pourront être replacés après concertation des responsables du projet et en accord avec le vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être replacés ou réutilisés en interne, ils seront mis à mort après anesthésie. Les animaux ne pourront pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

L’immunothérapie passive utilisant des immunoglobulines polyclonales spécifiques a déjà démontré son efficacité dans le domaine des maladies infectieuses, intoxications et envenimations. Le cheval est l’animal producteur de référence dans le cadre de ces produits. La production de ces anticorps polyclonaux n’est possible que par des moyens in vivo. Aucune méthode alternative n’est aujourd’hui connue.

Réduction

Le nombre de chevaux nécessaire pour un projet augmente au cours du temps. Néanmoins, le nombre de chevaux entrant dans le projet est calculé au plus juste selon l’avancée du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. - Pour les nouvelles indications/nouveaux antigènes : 2 à 4 animaux seront immunisés afin de tester et déterminer l’efficacité de l’immunisation. - Après la démonstration de l’efficacité de l’immunisation, dans le cadre du développement du produit et selon les études précliniques et cliniques programmées, le volume de plasma nécessaire sera calculé précisément. Ce volume permettra de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble du développement du produit. Les résultats obtenus permettront de déterminer de manière fiable le nombre maximal de chevaux nécessaires pour la production des traitements à base d’anticorps. A minima, une revue annuelle sera faite pour optimiser le nombre de chevaux au plus juste des besoins.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leur espèce, logés sur une aire paillée en groupes sociaux de maximum 12 chevaux, fixes dans le temps. Un suivi quotidien leur est apporté par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire. Les animaux ont accès à la nourriture via un distributeur automatique de concentrés en plusieurs fois, au foin et à l’eau à volonté dans une ambiance musicale. Par ailleurs, le projet met en œuvre des procédures maîtrisées et qui ont déjà fait la preuve de leur efficacité pour la production d’immunoglobulines polyclonales équines. Par ailleurs, depuis 2017 ces procédures sont mises en œuvre dans le cadre de l’autorisation précédente, et ont permis de mettre en place et préciser les procédures pour entrainer les animaux, réduire les douleurs et définir les points limites.

Choix des espèces

Le cheval est un animal corpulent permettant de récolter une importante quantité de plasma. Il présente peu de zoonoses, ce qui limite les risques de présence de contaminants nocifs pour l'Homme dans les plasmas. Les chevaux sont des adultes de plus de 3 ans car à partir de cet âge la production d’immunoglobulines est optimale.

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe osmotique est implantée sous la peau par chirurgie, puis les rats subissent pendant cinq jours des prélèvements sanguins quotidiens représentant 3,5 à 7 % de leur volume sanguin et des injections sous-cutanées, pour tester de nouvelles molécules contre l'hyponatrémie. Le porteur affirme avoir déjà prouvé l'efficacité de sa molécule brevetée et renvoie au conditionnel l'intérêt pour les patients, avec moins d'effets indésirables que le Tolvaptan. Sur le remplacement, il indique qu'il serait "nécessaire" de démontrer l'efficacité chez l'animal avant l'Homme et retient le rat comme modèle reconnu par la communauté internationale.

Objectifs

L’hyponatrémie, c’est-à-dire la diminution de la concentration de sodium du sang, est une pathologie fréquente, en particulier en hospitalisation. C’est un problème de santé publique puisqu’elle augmente la mortalité quelle que soit la pathologie responsable. Le Tolvaptan est un médicament, utilisé en clinique chez l’Homme dans cette pathologie. Toutefois, son utilisation est limitée, notamment du fait d’un risque de correction trop rapide de l’hyponatrémie et d’une toxicité au niveau du foie. Il paraît donc nécessaire de rechercher de nouvelles options thérapeutiques. Une nouvelle molécule a été développée dans notre laboratoire. Cette molécule est plus sélective et plus puissante que le Tolvaptan. De plus, cette molécule est moins toxique pour le foie. Nous avons déjà prouvé l’efficacité de notre molécule chez l’animal contre cette pathologie par de premières expériences. Nous voudrions maintenant valider chez le rongeur des versions de cette molécule optimisées en laboratoire et brevetées en 2021.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’effet, chez le rat, de nouvelles molécules pour traiter l’hyponatrémie qui devraient présenter moins d’effets indésirables que les traitements actuels, afin d’envisager une utilisation de ces produits chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale courte (d’une durée d’environ 10 minutes) pour mettre en place une pompe osmotique sous-cutanée. Les animaux vont être placés en cage individuelle permettant de recueillir les urines et les fèces pendant 5 jours. Pendant ces 5 jours, les animaux vont être soumis à des prélèvements sanguins (d’une durée d’environ 3 minutes) quotidiens d’un volume de sang correspondant à environ 3.5-7% de leur volume sanguin total chaque jour. Pendant les 3 derniers jours, les animaux vont être injectés quotidiennement par voie sous-cutanée (d’une durée inférieure à une minute).

Impact sur les animaux

La mise en place du modèle d’hyponatrémie nécessitera l’administration continue sous-cutanée par pompe osmotique d’une molécule, l’apport d’une nourriture semi-liquide et l’hébergement dans des cages spéciales permettant de récupérer les urines. Les effets indésirables relatifs à l’implantation de la pompe osmotique sous-cutanée sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie et dureront au maximum 2 jours. Les effets indésirables relatifs à l’apport d’une nourriture semi-liquide et à l’hébergement dans des cages spéciales sont potentiellement un stress pour les animaux. Ces effets dureront au maximum 5 jours. Le traitement par les molécules candidates nécessitera des injections sous-cutanées quotidiennes. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets dureront au maximum 5 jours. Les dosages de la natrémie nécessiteront des prélèvement sanguins quotidiens. Les effets indésirables relatifs à ces prélèvements quotidiens sont potentiellement une douleur et une hypovolémie. Ces effets dureront au maximum 5 jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au CO2 à la fin de la procédure afin de réaliser une autopsie.

Remplacement

L’objet de ce travail est d’étudier l’efficacité de nouveaux composés, jamais administrés chez l’Homme. Il existe donc un objectif clinique à court terme. Les expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de valider l’affinité et la sélectivité des molécules pour leur cible. Avant d’évaluer l’effet de ces produits chez l’Homme, il est nécessaire de démontrer leur efficacité chez l’animal. Le modèle expérimental que nous avons choisi constitue un modèle pathologique fiable qui a déjà été utilisé pour développer des traitements chez l’Homme dans l’hyponatrémie.

Réduction

Nous allons réaliser notre étude sur un modèle déjà publié et bien décrit dans la littérature, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point du modèle. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous avons calculé le nombre d’animaux nécessaire par groupe via l’utilisation d’un test statistique. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures. De plus, les résultats des expériences seront analysés au fur et à mesure afin de modifier si besoin les doses de produit utilisées et donc ne pas utiliser inutilement des animaux. Au total, 240 animaux au maximum seront utilisés pour ce projet.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes dans un milieu enrichi pendant au minimum 8 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, des analgésiques injectables par voie sous-cutanée seront délivrés. Pendant toute chirurgie, les animaux seront maintenus à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre dans un milieu enrichi et étroitement surveillés pendant au moins 48h. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux prélèvements et administrations sous-cutanées quotidiens, une pommade analgésique sera appliquée sur le site d’injection, 10 minutes avant la piqûre. La localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Les animaux devront être placés dans des cages spéciales permettant le recueil de leurs urines au cours du temps. Le temps passé dans ces cages sera réduit au minimum (5 jours) et une observation quotidienne de tous les animaux sera réalisée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux prélèvements quotidiens, les animaux seront anesthésiés.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce préalablement utilisée pour des expérimentations in vitro, ex vivo et in vivo dans le laboratoire pour tester l’effet des antagonistes des récepteurs à la vasopressine sur différents paramètres rénaux et cardiovasculaires. Conserver la même espèce animale permet d’éviter de renouveler certaines expériences et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. De plus, le modèle utilisé correspond à ceux préalablement décrits dans la littérature pour évaluer l’effet des traitements dans l’hyponatrémie. Il s’agit du modèle reconnu par la communauté internationale comme le plus adapté aux pathologies humaines. Les rats utilisés dans ce projet seront à un stade de développement similaire à celui utilisé dans les protocoles de la littérature, c’est-à-dire des rats âgés de plus de 6 semaines. Cela permettra la comparaison des résultats expérimentaux obtenus aux données de la littérature.

24 porcs adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze subissent une perfusion isolée du rein de six heures pour tester un vecteur de thérapie génique, avec cathétérisme, prélèvements sanguins répétés et mise à mort au bout de deux semaines, les douze autres, jugés non éligibles, étant cédés à un autre établissement pour une formation chirurgicale sans réveil. Le porteur indique des douleurs possibles aux points de cathétérisme, gérées par antalgiques. Il affirme qu'un "organisme entier" au système vasculaire intact est requis et qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité du rein.

Objectifs

Les maladies rénales rares se répartissent en trois groupes principaux : • les anomalies congénitales du développement rénal, • les maladies rénales monogénétiques identifiées, • les syndromes néphrotiques. Ces maladies ont en commun un phénotype variable selon l’âge, pouvant progresser jusqu'au stade final qui est incurable et exige un traitement soit de substitution avec la dialyse, soit une transplantation rénale. Les maladies rénales monogénétiques, comme les tubulopathies, maladies kystiques, tubulo-interstitielles ou glomérulaires, peuvent toucher n’importe quelle structure du néphron et nécessitent une prise en charge spécifique précoce. A ce jour il n’existe aucun traitement curatif. L’objectif final de ce projet est de traiter ces maladies rénales chez l’homme, et plus particulièrement celles d’origine génétique. L’approche par thérapie génique qui a pour but de suppléer le gène défectueux dans les maladies monogéniques, c’est à dire liée au dysfonctionnement d’un seul gène, est très prometteuse. Elle doit pouvoir permettre l’administration en toute sécurité de vecteurs thérapeutiques (« moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles) dans le rein, et d’en cibler l’action au rein en limitant l'exposition à d'autres organes. Les vecteurs de thérapie génique de choix aujourd’hui sont les vecteurs de type AAV (virus adéno-associé), car ils permettent un transfert de gène efficace dans beaucoup de tissus. Une Perfusion LocoRégionale (PLR) du rein, dans laquelle le rein est isolé de la circulation générale de façon transitoire tout en étant oxygéné, pourrait assurer un ciblage spécifique de ce tissu d’intérêt.

Bénéfices attendus

Les maladies rénales ciblées, ont en commun une présentation phénotypique variable selon l’âge, un risque d’évolution vers l’insuffisance rénale, d’une hypertension artérielle, et des répercussions possibles sur la croissance chez l’enfant. Toutes ces maladies rares nécessitent donc une prise en charge adaptée et précoce, gage d’une évolution ralentie ainsi qu’un suivi prolongé et pour un grand nombre d’entre elles tout au long de la vie adulte. Par rapport aux thérapies classiques, la thérapie génique permet de cibler directement le gène défectueux responsable des maladies rénales géniques. L’identification d’un vecteur de thérapie génique avec un fort tropisme pour le rein, couplée à la technique de PRL optimisée en terme de durée de perfusion et de quantité de vecteur injectée pourra permettre une transduction maximale du vecteur au niveau du rein, avec donc une correction du gène défectueux, et sans avoir à subir les effets secondaires liés à une transduction du vecteur dans les autres organes.

Procédures

Le projet se déroulera selon les étapes suivantes (cf annexe 1) : 1- CT-Scan Chacune des 4 Phases du projet devra être constituée de 3 porcs (2 minimum). 6 porcs seront soumis au CT-Scan, afin de vérifier la compatibilité avec une PLR. L’examen sera réalisé sous anesthésie générale avec monitoring et sera d’une durée d’environ 2h. Cette étape sera répétée pour chacune des Phases du projet, pour un total maximum de 24 porcs. 2- PLR du rein Cette intervention concerne les animaux éligibles à une PLR du rein suite au résultat du CT-Scan. La PLR sera réalisée en établissant une perfusion localisée et isolée du système vasculaire rénal. La mise en place de la PLR se fera par une méthode peu invasive : cathétérisme de la veine jugulaire et de l’artère fémorale pour accéder respectivement à la veine rénale et à l’artère rénale. Cette mise en place se fait en percutanée sous angiographie. La PLR sera réalisé sous anesthésie générale et analgésie adaptée ainsi qu’un monitoring constant. Le vecteur testé sera injecté au niveau du système PLR à une dose donnée et pendant le temps déterminé L’intervention est estimée à 6h. Cette étape sera répétée pour chacune des Phases du projet, pour un total maximum de 12 porcs (3 animaux maximum /Phase, 4 Phases maximum) 3- Prélèvements Sanguins Des prélèvements sanguins seront réalisés pendant la PLR à D0 sous anesthésie générale, sur sang périphérique et au niveau de la PLR (détermination de l’infectiosité et dissémination du vecteur) : - sang périphérique à D0 avant le début de la PLR (baseline) pour toutes les analyses citées ci-après. - au niveau du système de la PLR à D0 puis +5min, +10min , +15min , +20min, +25min , +30min , +45min, +60min, +75min, +90min, +105min et +120min après le démarrage de la PLR Des prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de la veine jugulaire sous anesthésie générale à D3, D5, D10+/-1, D14+/-2 pour sérologie anti-AAV, dosages des paramètres biochimiques, numération sanguine et hémostase, marqueurs rénaux, évaluation immunologiques et biodistribution. Tous les animaux inclus dans chacune des Phases du projet : 12 porcs max (3 animaux max/Phase, 4 Phases max.). 4- Mise à mort Suite à un suivi de 14±2 jours, les animaux inclus seront euthanasiés sous anesthésie générale et analgésie, pour prélèvements post-mortem. Avant l'euthanasie, des prélèvements sanguins ante-mortem sont effectués. Tous les animaux inclus dans chacune des Phases du projet : 12 porcs max (3 animaux max / Phase, 4 Phases)

Impact sur les animaux

La mise en place de la PLR se fera par méthode peu invasive. L’accès veineux du système vasculaire rénal sera réalisé à partir du cathétérisme de la veine jugulaire ou fémorale et l’accès artériel à partir de l’artère fémorale. La PLR sera réalisée dans un premier temps sur l’un des 2 reins, isolé de la circulation générale par une approche hémodynamique basée sur l’oxygénation d’une membrane extra-corporelle (ExtraCorporeal Membrane Oxygenation, ou ECMO). Lors d’une précédente étude identique menée sur le cœur, « Etude de tolérance, toxicité et biodistribution d’un vecteur thérapeutique à 2 semaines après perfusion locorégionale (PLR) du coeur battant chez le porc domestique », APAFIS#26250-2020062915381908, quelques animaux ont montré de douleurs post-LRP au niveau des points de cathétérisme avec difficulté de mobilité durant 3 jours maximum. Des traitements antalgiques et antibiotiques supplémentaires ont été mis en place et ont permis de résoudre ces effets indésirables. Lors du présent projet, les mêmes observations peuvent être attendues et anticipées, et le traitement suivant sera mis en place en fin de PLR du rein : un traitement antibiotique sera réalisé par injection IV de 20 mg/kg de Céfazoline (Rilexine®, Cefovet®). En fin de procédure de PLR, une antibiothérapie sera mise en place, 1g d’ampicilline/ulbactam (Unacim®) et 0.4mg/kg de meloxicam (Metacam®)) par voie IV. Pour anticiper toute douleur, 0.2mg/kg de Morphine sera administré en intramusculaire. Si besoin, avec accord du vétérinaire de l’UE, un traitement analgésique (ex : Buprénorphine ou Perfalgan si douleur) pourra être mis en place dans les jours suivant la procédure.

Devenir

Au cours de ce projet, les animaux subiront différents actes expérimentaux du début à la fin de la procédure dans laquelle ils seront inclus. Avant chaque Phase du projet, une imagerie CT-Scan sera réalisée sur un maximum de 6 porcs (nombre maximal compte tenu des statistiques de compatibilité avec une PLR afin d’obtenir 3 animaux (2 minimum) /Phase) afin de déterminer les animaux éligibles à une PLR de rein. Un total maximum de 24 porcs sera donc soumis à une imagerie (6 porcs/Phase, 4 Phases maximum). Sur ces 24 animaux, 12 maximum seront retenus pour la réalisation de la PLR du rein, et seront suivis durant 14±2 jours durant lesquels différents prélèvements sanguins seront effectués, avant euthanasie pour prélèvements post-mortem afin de déterminer la tolérance, la toxicité et la biodistribution du vecteur testé. Les 12 autres animaux non éligibles seront réutilisés par un autre établissement utilisateur pour des formations de procédures chirurgicales, procédure sans réveil.

Remplacement

Différents modèles cellulaires in vitro comme des lignées de cellules épithéliales rénales, ou plus récemment d’organoïdes rénaux différenciés à partir notamment de cellules souches pluripotentes induites sont disponibles et permettent l’étude des maladies rénales. Il est cependant très difficile d’obtenir dans ces modèles une structure vascularisée. L’expérimentation animale proposée vise à établir la PLR du rein, un organisme intact avec un système vasculaire est requis pour sa mise en oeuvre. En effet, compte tenu de la complexité du rein, tant structurelle (vascularisation, structure cortico-médullaire) que fonctionnelle (contrôle de la pression rénale), les paramètres issus de processus complexes qui doivent être contrôlés lors de la PLR ne peuvent pas être simulés par des modèles in vitro. D’autre part, l’étude de la transduction du rein par les AAVs en comparaison avec la transduction d’autres organes non-ciblés (biodistribution) permettant d’évaluer l’efficacité et la sécurité du futur produit thérapeutique ne peut être réalisée que sur un organisme entier, et donc sur animal vivant.

Réduction

Un total maximum de 24 porcs sera nécessaire, afin d’obtenir 3 animaux (2 minimum) éligibles à la procédure PLR pour chacune des 4 Phases. Ce nombre requis s’explique par le fait que l’un des critères d’inclusion est que la structure vasculaire rénale de chaque animal inclus ne doit pas présenter d’anomalies. Cette structure vasculaire rénale sera analysée par imagerie médicale, CT-scan Computed Tomography Scan, ou tomodensitométrie). Selon les données préliminaires du Sponsor, seul 1 animal sur 2 présentera une structure vasculaire rénale adaptée à le PLR et pourra donc être finalement inclus pour l’approche PLR du rein. D’autre part, les reins sont des organes très vascularisés et une quantité importante de sang y afflue. Aussi, toute intervention chirurgicale, même peu invasive, reste délicate et entraine un risque accru pour l’animal. Il en résulte la possibilité d’une interruption prématurée de l’expérience en cas par exemple d’une hémorragie ou encore une altérations des structures cellulaires en cas de pression et d’oxygénation non contrôlées. Le nombre d’animaux inclus dans chaque phase (3 porc) a été défini en tenant compte de ces 2 points de façon à obtenir le nombre minimal requis d’animaux ayant été soumis à la procédure PLR complète, à savoir 2 porcs + 1 animal « backup ». L’enchainement des 4 Phases est lié à des « GO/NO GO », cf. Annexe 1, c’est à dire avec un enchaînement dépendant des résultats obtenus à une dose d’AAV donnée et un temps de perfusion donné. Un « GO » sera donné lorsque une transduction maximale et spécifique du rein sera obtenue à une dose donnée. La Phase suivante consistera alors à réduire le temps de perfusion, afin de vérifier si une efficacité similaire est obtenue avec un protocole PLR plus réduit. Au contraire, en cas de « NO GO » (transduction insuffisante et/ou non spécifique du rein), la phase suivante consistera à tester une dose de vecteur plus haute. Un tel enchaînement permet de minimiser le nombre total d’animaux inclus. Et dès lors que l’objectif de transduction maximale du rein sera atteint durant une des Phases, le projet sera stoppé, minimisant là aussi le nombre total d’animaux inclus. Des analyses statistiques de type non paramétriques seront utilisés pour comparer les données obtenues entre les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

- De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur : Deux à 3 porcs par hébergement permettant des interactions sociales entre les animaux. L’hébergement est organisé sur 2 box attenants dont un seul avec copeaux de façon à garantir une propreté maximale. Un enrichissement du milieu et mise à disposition d’objets (Box équipés de planche anti-démangeaisons, balles, Kong dental…). Interactions sociales, en dehors des gestes inhérents au protocole, avec des soignants par le biais d'échanges quotidiens avec un technicien animalier. - Intervention de personnels formés spécifiquement à l’espèce - Suivi observationnel et clinique régulier des animaux - Toutes les interventions seront réalisées sur animal anesthésié. Les procédures d’anesthésie légère (prélèvements sanguins) ou profonde (chirurgie), sont détaillées dans les procédures expérimentales. - Un traitement peri-opératoire avec analgésiques sera mis en place pour limiter la douleur. - Un suivi post-chirurgie par un vétérinaire et technicien animalier sera réalisé - Une grille de scoring de la douleur sera mise en place afin de détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates.

Choix des espèces

En raison de la configuration expérimentale avec une membrane extracorporelle (ECMO), seul le modèle grand animal peut être utilisé pour les expériences prévues. Puisqu'un rein suffisamment grand est important pour réaliser l'expérience de perfusion avec son propre circuit de perfusion extracorporelle, les petits modèles animaux ne sont en effet pas compatibles avec cette étude. Le porc est un modèle animal répandu dans la recherche médicale de par certaines caractéristiques physiologiques, anatomiques et génétiques proches de celles de l’être humain. C’est notamment le cas de ses fonctions cardiaques, pulmonaires et rénales. Le choix du porc est donc optimal pour le développement d'une méthode de PLR, qui est transférable à l'homme du fait de son anatomie, de sa taille et de la possibilité d’utiliser un matériel identique à celui utilisé chez l’homme et donc permettant de favoriser rapidement son utilisation thérapeutique potentielle chez le patient. Le porc domestique à l’âge adulte a été choisi pour cette étude en raison de son poids et des similitudes avec le rein humain. En effet un poids de 80-90kg lors de la procédure PLR est nécessaire pour se rapprocher d’une future évaluation chez l’humain adulte. Les animaux seront donc injectés à l’âge adulte, puis seront suivis durant 14±2 jours post-injection maximum.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour du D-galactose par voie intrapéritonéale pendant huit semaines pour induire un vieillissement accéléré, avec prélèvements sanguins, traitements et mesures cutanées, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur indique des effets indésirables possibles des molécules testées, perte de poids et irritations cutanées. Sur le remplacement, il affirme que le modèle animal est "incontournable" et qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du vieillissement de l'"organisme entier".

Objectifs

À l’échelle mondiale, la proportion de personnes âgées de 60 ans et plus est en constante augmentation depuis plusieurs années. En France, d’après les projections de l’Institut national de la statistique et des études économiques (Insee), un individu sur trois aura 60 ans et plus en 2050 (ils étaient un sur cinq en 2005). Accompagner ce vieillissement de la population est donc devenu un enjeu de santé publique mais aussi socio-économique. Ces dernières décennies, de nombreux modèles animaux de vieillissement ont été développés. Dans ce projet, on utilisera un modèle murin de vieillissement accéléré induit par le D-galactose avec pour objectif d'évaluer l'efficacité de nouvelles approches à visée thérapeutique. Le D-galactose est un nutriment physiologique, il s'agit d'un sucre réducteur qui, lorsqu'il est administré en excès chez la souris, contribue à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), à un dysfonctionnement mitochondrial, à la formation excessive de produits glyqués et est associé à de l'inflammation et à un déclin progressif des capacités cognitives. Ces changements miment le processus de vieillissement dans différents tissus et organes incluant le cerveau, le coeur, les poumons,le foie, les reins, le système reproducteur, la peau, les os, les muscles squelettiques, la réponse immunitaire et dans le sérum. Ainsi, ce modèle présente des caractéristiques mimant la senescence du vieillisement naturel et est adapté à l'évaluation d'efficacité de nouvelles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le vieillissement est un processus physiologique qui intervient chez tous les êtres vivants. Il correspond à un déclin qui altère, à l’échelle moléculaire et cellulaire, les capacités fonctionnelles de l’individu et ses possibilités d’adaptation face à un évènement aigu auquel il est confronté (une maladie, un stress). Dans le contexte biologique, le vieillissement se caractérise par l’accumulation d’évènements qui détériorent les fonctions des organes, et par une augmentation, avec le temps, des risques de décès ou de développer des maladies (cancer, diabète, troubles cardiovasculaires ou cérébraux, etc.). La recherche biologique sur le vieillissement s’intéresse, par définition, à l’étude de cette accumulation d’innombrables évènements inévitables qui apparaissent au cours de la période comprise entre la conception et le décès de l’individu. Il est donc important d'avoir un modèle préclinique prédictif du vieillissement afin d'évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le but d'appréhender le vieillissement de manière à "vieillir mieux".

Procédures

Les animaux seront administrés quotidiennement par voie intrapéritonéale (durée d'intervention

Impact sur les animaux

Dans la littérature, il n'y a pas d'effet indésirable décrit pour ce modèle de vieillissement accéléré. Des effets indésirables peuvent être observés lors de l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance pouvant entraîner une perte de poids, irritation en cas d'application topique...

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de prévlever les tissus et réaliser des analyses ex vivo (histologie, dosages de cytokines, dosages enzymatiques...) pour l'évaluation d'efficacité des traitements testés.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est incontournable afin d’étudier les mécanismes du vieillissement, mais aussi afin d’améliorer la compréhension des processus impliqués dans la survenue des syndromes de vieillissement accéléré. Il est indispensable d'améliorer les connaissances sur le vieillissement et les pathologies qui y sont associées. La complexité du vieillissement physiologique repose en fait sur la globalité de son impact : il intéresse l’ensemble des organes ; il est modulé par des facteurs qui peuvent être internes (c’est-à-dire physiologiques) mais aussi externes (environnementaux). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du vieillissement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décrits pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine.

Réduction

La stratégie d'expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale). Cette approche expérimentale permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA) et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d'initier les phases de traitement. Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester ou la molécule à tester). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15%, une puissance de 70% et une différence à souligner de 20% entre groupes témoins et tests comparativement à l'approche classique. Cette approche permet donc de réduire le nombre d'animaux de 50% au moins. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par l’expérimentateur afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson, comportement...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, igloo, cotons,bâtonnets de bois) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué au 2 fois par semaine, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. De la nourriture humidifiée ou du gel diététique pourra être ajouté dans leur cage. Au moindre signe de déshydratation, les animaux recevront une injection intra-péritonéale de sérum physiologique (20mL/kg). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Etre Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et /ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation; - Perte de poids >20% du poids normal maintenue sur 72h; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication au site d'injection (présence de plaie, douleur...) Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs se sont rapidement imposés au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. L’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique (faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales) ; l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes de plus de 8 semaines d'ages seront utilisés dans ce projet (cf Parameshwaran K et al, Rejuventation Research, 2010).

80 souris et 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés jusqu'à 168 heures dans des cages à métabolisme, sur grille et exposés à la lumière, ce que le porteur décrit lui-même comme un inconfort, après administration de candidats médicaments par diverses voies. Ces études d'excrétion s'inscrivent dans le cadre réglementaire obligatoire pour la mise sur le marché d'un médicament, et les animaux sont tués pour doser ce qui reste dans leur corps. Le porteur indique qu'il n'existe "aucun modèle in vitro" applicable à l'excrétion dans un organisme vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées dans le cadre des études de pharmacocinétique réalisées chez les rat ou les souris. Chaque étude permet d’évaluer le devenir de molécules contenues dans un candidat médicament dans l'organisme. L’objectif est de récolter des données concernant la quantité des molécules excrétées par rapport aux quantités administrés ainsi que de déterminer la durée d’excrétion. Après l'administration, des recueils d’urines, fèces ou de bile pour mesure de la concentration de la molécule seront réalisés. L’objectif de ces tests n’est pas de démontrer une efficacité de la molécule ou de mettre en relief les effets secondaires possibles, mais de démontrer que le produit est bien excrété du corps après une période définie.

Bénéfices attendus

Ce type d'étude permet de comprendre comment et pendant combien de temps des molécules sont excrétées de l'organisme après leur administration et sont nécessaires pour évaluer la sécurité d'un médicament.

Procédures

Les animaux sont placés individuellement dans les cages pendant une certaine durée : Pour les études d’excrétion biliaire (procédure 1), 3 à 4 jours d’acclimatation des rats sur litière + 24h maximum dans les cages à métabolisme. Pour les animaux utilisés pour les études d’excrétion urine et fèces (procédure 2), la durée, seul dans les cages à métabolisme, est au maximum de 168h. Les administrations iv, vaginale, rectale, oculaire, intranasale, intra-auriculaire, topique sont réalisées une seule fois sous anesthésie en moins d'une minute Les administration PO sont réalisées une seule fois sur animaux vigile en moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans le cas des études pour récupérer l'urine et fèces, les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme. Les animaux sont seuls dans la cage, sur grille et plus exposé à la lumière que dans les cages classiques, ce qui provoque un inconfort chez l’animal et ne correspond pas à son environnement habituel.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’étudier l’excrétion d’une molécule dans un organisme vivant. Un autre modèle n’est pas applicable dans la mesure où ces études rentrent dans un cadre réglementaire obligatoire pour la sécurité d'un médicament.

Réduction

Pour les études réglementaires le nombre minimum utilisé est défini par les guidances. Pour les études précoces dans le développement d’un médicament, un nombre d’animaux inférieur ou égal à celui recommandé par les guidances est utilisé. Dans la mesure du possible un maximum de données est collecté sur un même animal afin de ne pas avoir à reproduire l’expérimentation.

Raffinement

Une procédure de point limite est en place au laboratoire. Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, les cages sont regroupées sur le même portoir afin que les animaux soient proches l’un de l’autre pour favoriser le lien et la communication entre animaux (instinct grégaire). Une plaque métallique finement perforée est ajoutée dans les cages afin de permettre à l’animal de se reposer. Des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites (voir annexe) basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort.

Choix des espèces

Les espèces rat ou souris seront utilisées conformément aux guidances techniques. Le choix de l’espèce pour chaque étude sera en cohérence avec les espèces utilisées pour toutes les études nécessaires pour le dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) de la molécule. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 6 à 12 semaines conformément aux recommandations de la règlementation.

220 rats femelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, seize gardés en vie pour des formations internes et le reste tué pour des prélèvements terminaux de peau, muscle et os. Les animaux sont épilés puis exposés à des rayonnements ionisants sur la patte arrière sous anesthésie, ce qui provoque une radiodermite douloureuse et une possible perte de poids. Le porteur décrit un modèle destiné à tester des vasoconstricteurs contre les brûlures des radiothérapies. Il affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" pour évaluer la réponse à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de mettre en place un modèle d’irradiation localisée de la patte chez le rat afin de mimer les brulures pouvant survenir des radiothérapies ou des actes de radiologie interventionnelle. Une fois le modèle mis en place, les objectifs seront de tester différents produits et d’évaluer leurs efficacités sur la prévention et/ou la limitation du développement des lésions.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’efficacité de vasoconstricteurs (substance permettant de rétrécir le diamètre des vaisseaux sanguins) en application cutanée préventive pour prévenir et/ou limiter l’apparition de lésions cutanées suite à une exposition aux rayonnements ionisants (radiothérapie et radiologie interventionnelle).

Procédures

Les animaux seront épilés (crème dépilatoire) et exposés aux rayonnements ionisants sous anesthésie gazeuse. Des pesées et un scoring des lésions seront réalisés sur animaux vigiles. Une fois par semaine le flux sanguin au niveau des pattes sera mesuré au laser doppler sous anesthésie gazeuse. Des prélèvements terminaux (prélèvement de sang, de la peau, des muscles et des os) seront réalisés sur tous les animaux.

Impact sur les animaux

L’objectif de ce projet étant de développer un nouveau modèle de radio dermite radio-induite chez le rat, les animaux exposés aux rayonnements ionisants vont développer des dermatites radiques localisées au niveau de la patte arrière gauche plus au moins sévères en fonction de la dose d’exposition. Cette dermatite radique va conduire à une douleur locale au niveau de la patte. Une perte de poids n’est pas à exclure lorsque le pic de la lésion sera atteint ainsi qu’une utilisation réduite de cette patte. La durée et la sévérité de ces effets va dépendre de la dose d’exposition.

Devenir

Les animaux devront être euthanasiés à la fin de l’expérience afin de réaliser les différents prélèvements prévus. Une partie des rats sera gardée en vie et pourront être utilisés dans des sessions de formation interne.

Remplacement

Dans le but de caractériser un nouveau modèle de radiodermite chez le rat et d’évaluer l’efficacité thérapeutique de vasoconstricteurs pour le traitement ou la prévention des radiodermites radio-induites il est nécessaire d’avoir recours à un modèle « in vivo ». Ce modèle nous permettra d’évaluer l’impact de l’irradiation à différentes énergies et la réponse thérapeutique à différents vasoconstricteurs sur le développement d’une pathologie à l’échelle de l’organisme.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation de 220 rats sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisé correspond au minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifique robuste et statistique.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux seront adaptées aux procédures réalisées afin de limiter le plus possible le stress et la souffrance de l’animal. Les rats seront hébergés en groupe et dans un environnement enrichi. Lors des irradiations, des anesthésiques seront utilisés et une surveillance des animaux sera mise en place après les irradiations. Le bienêtre animal sera également évalué en réalisant des pesées, des photos des lésions et un scoring lésionnel ainsi que la mise en place de points limites adaptés.

Choix des espèces

Pour les besoins de ce projet nous avons choisi d’utiliser l’espèce animale rat car des équipes ont déjà travaillé sur la même thématique avec ce modèle. Nous pourrons ainsi comparer l’efficacité du traitement appliqué à ces études. Nous utiliserons des animaux adultes (10 – 12 semaines) afin d’éviter une potentielle hétérogénéité liée à l’âge. Pour ce projet nous utiliserons uniquement des rats femelles. L’objectif n’étant pas d’étudier le dimorphisme sexuel, les femelles, moins agressives, ont été choisies, ce qui permettra de garder les animaux en groupes sociaux stables.

20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit une injection de la bactérie de la syphilis directement dans les testicules sous anesthésie générale, puis des prises de sang à l'oreille deux fois par semaine pendant six semaines, jusqu'au développement d'une orchite. Les animaux sont ensuite tués pour prélever les tréponèmes présents dans le tissu testiculaire. Le porteur présente le lapin comme le seul modèle connu et affirme qu'une fois la culture en milieu axénique maîtrisée, il s'abstiendra du recours à l'expérimentation animale.

Objectifs

Notre projet a pour but l'obtention de suffisamment de matière infectieuse prélevée sur des lésions de syphilis primaire induites chez le lapin au niveau des testicules inoculé à partir de souche établit ou de prélèvements cliniques. Ce broyat testiculaire de lapin sera mis en culture dans les différents milieux mis au point par notre équipe. L’infectiosité sera suivie au cours du temps par PCR mais aussi par inoculation à d’autres lapins. Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable. Ainsi nous nous abstiendrons du recourt à l’expérimentation animale quand cette technique sera maîtrisée.

Bénéfices attendus

Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable pour l'isolement de nouvelles souches cliniques ainsi que pour leur production. L'étape d'injection des testicules de lapin est primordiale pour la mise au point de milieu de culture optimum afin de s'abstenir à terme de l'utlisation d'animaux ou d'en réduire au maximum son utilisation.

Procédures

Inoculation par injection intra testiculaire sous anesthésie générale pour une durée prévue entre 15 à 20 minutes maximum. Le prélèvement sanguin auriculaire sera effectué sur des animaux vigiles après application de crème anesthésiante locale de type EMLA 5%. Les animaux sont placés dans des boites de contention le temps du prélèvement pour une durée prévue entre 10 à 15 minutes, 2 fois par semaine pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le suivi des lapins se fera pendant les six semaines qui suivront l’inoculation. Le développement d’une orchite est attendu. D’après la littérature, les lapins sont sacrifiés dès l'apparition de l'orchite afin de prélever les treponema présents dans le tissus testiculaire. Des prises de sang auront lieu 1 fois par semaine (suivi PCR et sérologie). A l’issu, ils seront euthanasiés et prélevés.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure. En effet, les individus infectés ne peuvent pas être utilisés dans une nouvelle procédure ni proposé à l'adoption.

Remplacement

La syphilis est due à Treponema pallidium, bactérie spirochète, observée au microscope au début du siècle dernier, mais qui n’a jamais été mise en culture axénique. Depuis un an, notre équipe tente la culture ultrapure de l’agent de la syphilis (T. pallidium) dans un milieu axénique (en absence de tout autre organisme, dans un milieu stérile, exempt de tout autre agent biologique). Les résultats obtenus, s’ils montrent que des cultures restent positives au test moléculaire (détection de l’ADN) de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), ne peuvent pas objectiver la viabilité des éventuelles bactéries cultivées. Le passage à l’essai in vivo chez le lapin (seul connu pour être un bon modèle) devient une étape obligatoire d’une recherche scientifique, qui une fois que la culture axénique de T. pallidum sera maîtrisée, s’abstiendra d’avoir recours à l’expérimentation animale. Des animaux destinés à la recherche seront donc utilisés, de manière ponctuelle, dans ce projet.

Réduction

Afin d'estimer au mieux le nombre d'animaux pour l’isolement de souche clinique et leur production, nous avons utilisé le concept de l'effet de taille (effect size). On s'attend à ce que plus l'effet soit fort (donc la différence est grande), plus la taille de l’échantillon nécessaire sera petite. Pour se faire, deux moyennes ont été comparées, une moyenne théorique (mt) de 25% a été choisie en se référant aux données bibliographiques, et la comparaison a été faite pour un effet fort (80%), qui représente ici le taux d’infections réussies avec une puissance de 0,9 et un risque (alpha) de 0,05. Le nombre de lapins nécessaires pour la production est fixé à 2 lapins pour chaque inoculum bactérien, si 10 souches par an, nous aurons besoin de 20 lapins par an, soit 100 lapins sur 5 ans. En ce qui concerne l’isolement d’une souche clinique, la faible quantité et concentration de départ nous oblige à ne prévoir qu’un seul lapin par souche, ce qui correspond à 10 lapins par souche clinique par an, soit sur 5 ans: 50 lapins. Au total, sur 5 ans, nous pensons avoir recours à 150 lapins.

Raffinement

Par ailleurs, les animaux bénéficient d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin de leur assurer un bien-être optimal tout au long des études. Ce suivie est réalisé par du personnel habilité. Des éléments à ronger, de la paille à ronger et d'autres enrichissement seront fournis aux lapins afin qu’ils puissent se divertir. Les lapins seront hébergés dans des cages individuelles munies d’une plateforme non métallique répondant aux normes. Les manifestations de la douleur seront suivies rigoureusement grâce à une grille d’évaluation (voir annexe) (adaptée de celle de Morton et Griffiths 1985) et tout signe de douleur sera tout de même soulagé par une pommade anti-inflammatoire (Betneval® 0,1 %). De plus, une anesthésie profonde est préconisée avant l’euthanasie des lapins de laboratoire afin de réduire le plus possible la douleur et la détresse de l’animal. Cela est préconisé dans la directive du Parlement Européen et du Conseil relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques : (https://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=COM:2008:0135:FIN:FR:PDF ). La voie IM est la voie préconisée pour l’administration de la combinaison kétamine/xylazine chez le lapin, car elle est non douloureuse. Cela a été décrit par Lipman et al. (Lab Anim Sci. 1990, 40(4):395-8).

Choix des espèces

Le choix du lapin est basé sur les informations bibliographiques dans le domaine de laproduction et isolement d'agent de la syphilis. Le modèle lapin a déjà été prouvé et validé pour l'infection par Treponema pallidum. Nous allons utiliser des sujets adultes dont le volume des organes cibles de cette infection (testicule de lapin) est suffisant et capable de contenir l’infection sans induire de choc infectieux(septicémie) fatal.

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.

Pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique, 4 050 rongeurs, 3 600 souris et 450 rats, vont être utilisés afin de fournir des échantillons de sang où mesurer la concentration de candidats médicaments, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rongeurs reçoivent les composés par gavage, par injection, par voie nasale ou intratrachéale, une fois ou pendant plusieurs semaines, puis subissent jusqu'à huit prises de sang en 24 heures, parfois sous anesthésie répétée. Certains sont opérés pour l'implantation d'un cathéter ou d'une pompe sous la peau et peuvent être isolés dans leur cage, et les plus gros volumes de sang sont prélevés dans le cœur, avec ouverture du thorax chez la souris. Le prestataire indique fixer ses effectifs en tenant compte des "besoins de nos clients" et ne réaliser "pas de tests statistiques" sur les données.

Objectifs

Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration unique ou répétée.

Bénéfices attendus

Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations de composés soit par voie PO, IP, SC (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine de la queue (durée inférieure à 5 minutes) ; soit par voie IN, IT, topique (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse (durée inférieure à 5 minutes). Dans la majorité des cas il s’agira d’une administration unique, mais elles pourront également être répétées sur plusieurs jours ou semaines. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via un cathéter vasculaire, à la veine de la queue ou submandibulaire (souris uniquement), soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire (durée: quleques minutes). Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24 à 72h suivant l’administration avec un maximum de 8 prélèvements sur 24h, mais ils pourront également être étalés sur plusieurs semaines (2 prélèvements par semaine maximum). Certains animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires (durée de la chirurgie : environ 40 minutes) et/ou de pompes osmotiques en SC (durée de la chirurgie : environ 20 minutes) . Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être effectué en intra-cardiaque de façon terminale (durée inférieure à 1 minutes) sous anesthésie chez le rat, sous anesthésie et analgésie morphinique chez la souris.

Impact sur les animaux

Pour les administrations de composés, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Un ou plusieurs gavages pourront être réalisés, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille. Certaines modalités d’administration nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux. Certains animaux subiront également une chirurgie d’implantation de pompe osmotique et/ou de cathéters qui pourra nécessiter de les isoler dans leur cage d’hébergement. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés toutes les 24h sur 24 à 72h, ou encore 2 prélèvements maximum par semaine pendant plusieurs semaines. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale : dans ce cas les animaux seront anesthésiés et une thoracotomie sera réalisée pour les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter différents organes.

Remplacement

Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Nous ne réalisons pas de tests statistiques sur les données obtenues. Le nombre d'animaux par groupe (N=3 par dose ou par temps de prélèvement) a été déterminé sur la base de nos études précédentes où il est apparu qu'un nombre de 3 animaux est le nombre minimum permettant de conclure sur le profil pharmacocinétique d'un composé en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques à chaque procédure sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie et les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de pompe osmotique ou de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.

Choix des espèces

Ces études de pharmacocinétique vont permettre de déterminer les doses qui seront ensuite utilisées pour les études d’efficacité et de pharmacologie de sécurité chez le rongeur, ce qui justifie le choix des espèces retenues pour ce projet. Le choix entre souris et rat sera ensuite conditionné notamment par l’historique des études déjà réalisées par nos clients, le choix du modèle de pathologie envisagé par la suite, et les volumes de sang requis pour les bioanalyses. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : - Des rats de tous âges soit environ 150 à 600g - Des souris de tous âges soit environ 20 à 40g L’âge des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester