Autres troubles humains

Pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique, 4 050 rongeurs, 3 600 souris et 450 rats, vont être utilisés afin de fournir des échantillons de sang où mesurer la concentration de candidats médicaments, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rongeurs reçoivent les composés par gavage, par injection, par voie nasale ou intratrachéale, une fois ou pendant plusieurs semaines, puis subissent jusqu'à huit prises de sang en 24 heures, parfois sous anesthésie répétée. Certains sont opérés pour l'implantation d'un cathéter ou d'une pompe sous la peau et peuvent être isolés dans leur cage, et les plus gros volumes de sang sont prélevés dans le cœur, avec ouverture du thorax chez la souris. Le prestataire indique fixer ses effectifs en tenant compte des "besoins de nos clients" et ne réaliser "pas de tests statistiques" sur les données.

Objectifs

Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration unique ou répétée.

Bénéfices attendus

Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations de composés soit par voie PO, IP, SC (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine de la queue (durée inférieure à 5 minutes) ; soit par voie IN, IT, topique (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse (durée inférieure à 5 minutes). Dans la majorité des cas il s’agira d’une administration unique, mais elles pourront également être répétées sur plusieurs jours ou semaines. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via un cathéter vasculaire, à la veine de la queue ou submandibulaire (souris uniquement), soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire (durée: quleques minutes). Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24 à 72h suivant l’administration avec un maximum de 8 prélèvements sur 24h, mais ils pourront également être étalés sur plusieurs semaines (2 prélèvements par semaine maximum). Certains animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires (durée de la chirurgie : environ 40 minutes) et/ou de pompes osmotiques en SC (durée de la chirurgie : environ 20 minutes) . Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être effectué en intra-cardiaque de façon terminale (durée inférieure à 1 minutes) sous anesthésie chez le rat, sous anesthésie et analgésie morphinique chez la souris.

Impact sur les animaux

Pour les administrations de composés, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Un ou plusieurs gavages pourront être réalisés, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille. Certaines modalités d’administration nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux. Certains animaux subiront également une chirurgie d’implantation de pompe osmotique et/ou de cathéters qui pourra nécessiter de les isoler dans leur cage d’hébergement. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés toutes les 24h sur 24 à 72h, ou encore 2 prélèvements maximum par semaine pendant plusieurs semaines. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale : dans ce cas les animaux seront anesthésiés et une thoracotomie sera réalisée pour les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter différents organes.

Remplacement

Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Nous ne réalisons pas de tests statistiques sur les données obtenues. Le nombre d'animaux par groupe (N=3 par dose ou par temps de prélèvement) a été déterminé sur la base de nos études précédentes où il est apparu qu'un nombre de 3 animaux est le nombre minimum permettant de conclure sur le profil pharmacocinétique d'un composé en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques à chaque procédure sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie et les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de pompe osmotique ou de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.

Choix des espèces

Ces études de pharmacocinétique vont permettre de déterminer les doses qui seront ensuite utilisées pour les études d’efficacité et de pharmacologie de sécurité chez le rongeur, ce qui justifie le choix des espèces retenues pour ce projet. Le choix entre souris et rat sera ensuite conditionné notamment par l’historique des études déjà réalisées par nos clients, le choix du modèle de pathologie envisagé par la suite, et les volumes de sang requis pour les bioanalyses. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : - Des rats de tous âges soit environ 150 à 600g - Des souris de tous âges soit environ 20 à 40g L’âge des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester

250 lamas vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des anticorps par immunisations suivies de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la plupart sont gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, une minorité étant tuée pour prélever la quasi-totalité du sang. Les effets décrits se limitent au stress de la contention, des injections et des prélèvements, répartis sur environ vingt-cinq études par an pendant cinq ans. Il affirme qu'il n'existe "aucune méthode substitutive" et que cette production animale est "indispensable" à la recherche.

Objectifs

Les lamas sont aujourd'hui des animaux très utilisés dans la recherche basée sur les anticorps, les biotechnologies... En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, le plus faible coût de production, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de lamas. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic…

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements.

Devenir

Dans certains cas (très rares chez le lama), les animaux inclus pourront être mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité de volume sanguin circulant. Dans le cas où le prélèvement terminal de la quasi-totalité du volume sanguin circulant n'est pas nécessaire (très souvent le cas), les animaux inclus pourront être gardés en vie et maintenus sur le site avec leurs congénères. Ils pourront ensuite être réutilisés dans d'autres études après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux nécessite une immunisation de l'animal et donc son utlisation. Il n'existe aucune méthode substitutive pour cette production qui est indispensable à l'avancement de la recherche, de la médecine, du développement de test de diagnostic...

Réduction

Le nombre d'animaux est choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Le lama permet d'obtenir des quantités de sérum suffisantes à l'atteinte des objectifs du projet, sans porter atteinte au bien-être animal. Ainsi, 1 ou 2 lamas seront immunisés par étude permettant ainsi d'obtenir une quantité suffisante de sérum. Le nombre de 2 lamas pour une étude sera choisi dans le cas de certaines études où il y a besoin de prendre en compte le facteur diversité/variation génétique qu'il peut y avoir entre 2 animaux. Un nombre de 25 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 250 lamas sur 5 ans. Sur ces 250 lamas, il y aura des possibilités de réutilisation de lamas d'une étude pour une autre étude, après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser. Dès que le caractère naïf des lamas n'est pas demandé et n'est pas utile pour l'étude, des lamas issus d'études précédentes seront utilisés dans le respect de leur bien-être et si leur état de santé le permet. Ainsi, cela permettra de réduire le nombre de lamas différents utilisés.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : pâture extérieure, litière de paille, brosse à vache, objects à manipuler...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lama sera ici utilisé pour la production d’anticorps. En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. Les animaux sélectionnés seront de jeunes adultes (entre environ 9 mois et environ 6 ans) car c'est à ce stade qu'ils sont entièrement immunocompétents.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une irradiation localisée du côlon à dose unique pour provoquer des lésions tardives, puis sont tuées afin de prélever le côlon. Le porteur indique une dépilation de l'abdomen et affirme qu'à cette dose les animaux ne perdent pas de poids. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au modèle animal pour étudier ces séquelles des radiothérapies pelviennes.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne

Bénéfices attendus

La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers. L’objectif des médecins est la recherche d’un compromis entre le contrôle des tumeurs et la limitation des dommages aux tissus sains autour de la tumeur. En effet, dans le cas du traitement des cancers en zone abdominale, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon ou le rectum qui sont des « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement de leur épithélium muqueux. La toxicité induite par la radiothérapie du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, et donc impacter fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Le nombre de patients survivants au traitement d’un premier cancer et leur durée de vie augmentent grâce aux progrès de la médecine. L’augmentation de cette survie est associée à une augmentation du risque de complications. Une prise en charge globale du traitement du cancer intégrant le suivi des patients à long terme (> 20ans) est donc indispensable. De plus, réduire les risques de séquelles du traitement du cancer dans sa globalité et améliorer la qualité de vie des patients est un objectif du troisième plan cancer. À ce jour, la complexité physiopathologique de la PRD encore mal décrite, associée au contexte septique intestinal, limite l’efficacité des thérapies disponibles ainsi que la mise en place de nouvelles thérapies efficaces et pérennes. Les options thérapeutiques disponibles pour le traitement des complications des radiothérapies sont insuffisantes. Ce projet, utilisant des techniques d’exploration innovantes, permettra d’améliorer les connaissances sur l’effet des irradiations sur le tissu colique et de déterminer des nouvelles voies de traitement.

Procédures

Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane pour la réalisation de l’irradiation localisée (max 20 min)

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation locale du colon à la dose unique de 26 Gy, les souris vont avoir une dépilation au niveau de l’abdomen (zone irradiée). A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Les animaux sont observés tous les jours. Les animaux présentant une perte de poids trop importante seront euthanasiés

Devenir

Les animaux seront euthanasiés, les colons seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

Le développement des séquelles coliques nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vaisseaux, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes.

Réduction

Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaire (Cytométrie en flux, single cell, culture et co-culture) et moléculaires des groupes de 20 animaux sont nécessaires. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux : one- way ANOVA suivi d’un test de Tukey.

Raffinement

Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Diminution de la dose d’irradiation afin d’avoir développement des lésions attendues : utilisation de la dose de 26 Gy qui ne génère pas d’ulcères tardifs graves du colon mais de la fibrose comme les patients qui ont bénéficié d’une radiothérapie fractionnée. - Hébergement en groupe (5 animaux par cage) avec enrichissement (coton et igloo en carton) -Observation quotidienne des animaux suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration) - Les animaux seront pesés régulièrement.

Choix des espèces

Le modèle d’irradiation de la souris permet de reproduire des lésions colorectales similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (8 semaines).

2 090 rongeurs, 1 640 souris et 450 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées par de nombreuses voies, jusque dans le duodénum ou la trachée sous anesthésie, pendant jusqu'à 24 semaines, pour tester des molécules de thérapie génique contre des maladies génétiques. Le porteur mentionne des modèles génétiquement modifiés au phénotype "dommageable", les animaux étant tués avant l'apparition des symptômes. Il justifie le recours à deux espèces par les exigences des études réglementaires et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un développement préclinique.

Objectifs

Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent sur des pathologies génétiques essentiellement neuromusculaires. Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi. Dans ce contexte, nous développons une approche innovante de modulation de l’épissage en interférerant avec la machinerie d’épissage des ARN pré-messagers. Il s’agit plus précisément de forcer la machinerie d’épissage à former et « libérer » des ARN messagers exempts de mutations et capables d’être traduits en protéines fonctionnelles. Pour cela nous développons de courtes séquences d’oligonucléotides antisens (AON) chimiquement modifiés qui gardent la capacité de se lier aux ARN par complémentarité de bases. Le deuxième outil est matérialisé sous la forme d’un petit ARN nucléaire, l’U7snRNA, modifié au niveau de sa séquence d’origine pour participer, au même titre que les AONs, à la modulation de l’épissage des ARN mutés. Les outils dérivés de l’U7snRNA sont délivrés par deux types de vecteurs. Les premiers sont des vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Le deuxième type de vecteur que nous développons est matérialisé sous forme de molécule d’ADN nu dérivée du génome des AAV. Le recours aux AAV comme vecteurs de gènes est largement utilisé à travers le monde et des essais cliniques de thérapie génique sont autorisés par les instances règlementaires depuis de nombreuses années.Dans le cadre de cette approche envisagée, il s’agit de trouver la meilleure molécule et la meilleure voie d’administration pour la délivrance de nos outils thérapeutiques dans l’environnement in vivo.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une amélioration significative chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients traités.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée pourront être plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. En revanche, afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 1, nous testerons des voies d’administration moins invasives chez le patient en vue d’un essai clinique, à savoir une administration orale (intra-stomachal ou intra dudodenum) et une administration pulmonaire (intra- nasale ou intra-tracheal). L’administration intra-duodenum sera réalisée uniquement sur un petit nombre d’animaux pour voir si la molécule passe le duodenum. Cette intervention durera 1h entre l’anesthesie et le réveil de l’animal et ne sera pas répétée. En revanche, pour l’administration intra stomachal, intra nasal et intra tracheal ; afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal et intra-nasale sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Pour les administrations intra tracheal elles se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. Pour cela, les animaux recevront une anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxilaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de même de facon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses. Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies seront évalués post-adminsitration jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé dûe à une potentielle toxicité de nos molécules seront sacrifiés immédiatement. Les autres nuisances qui pourraient être observées concernent surtout les animaux subissant la procédure d’administration intra-duodenum qui pourraient présenter des difficultés d’alimentation du fait du déplacement possible du duodenum lors de l’administation. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoins. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classé « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs, et les animaux dans ce projet seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si les symptômes devaient apparaitre prématurément.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de toutes les procédures afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)

Remplacement

Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.

Réduction

Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations (moins invasives pour le patient en vue d’un essai clinique) à savoir l’administration par voie orale ou pulmonaire. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini.

Raffinement

LLors de leur arrivée, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, et les animaux seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une autorisation à part au sein de notre animalerie pour la procédure d’élevage.Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.

Choix des espèces

Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique pré-clinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces étant exigés dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Cependant, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveaux-nés à 4 semaines). Enfin, un de nos objectifs consistera à vérifier la possibilité du passage de la barrière placentaire des médicaments, et nous traiterons pour cela des adultes gestantes.

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.

280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une perte osseuse est créée chirurgicalement dans leur mâchoire, puis la régénération est suivie au microscanner pendant deux mois avant la mise à mort pour analyse histologique, afin de tester des biomatériaux de comblement. Le porteur indique que la chirurgie maxillo-faciale provoque une douleur modérée et une gêne à la mastication les premiers jours. Il affirme que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" être testés sur l'animal et qu'aucune approche in vitro ne répond à la réglementation sur les dispositifs implantables.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses représentent un challenge en chirurgie orale et une problématique de santé. Ces pertes osseuses au niveau de la mâchoire peuvent avoir différentes origines : traumatismes dû à un accident, tumeurs bénignes ou malignes, infection, .... En clinique, l'utilisation de greffe pour réparer la zone est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie lourde, problème de compatibilité et d'intégration du greffon...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier à ces limitations et optimiser la prise en charge des patients. Pour évaluer le potentiel ostéogénique des biomatériaux étudiés et envisager à terme de les utiliser chez l'homme, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal. Dans notre projet le modèle proposé est le rat, qui est une espèce pertinente et reconnue dans le cadre de la validation des biométériaux implantables à visée humaine. Le suivi de la régénération osseuse sera réalisé par de l'imagerie par un micro-scanner, cette technologie est composée d'un système d'acquisition et d'un logiciel dédié, qui effectue des analyses de densité radiologique point par point pour reconstituer des images du site d'intérêt extrêmement précises. Cette technologie permet un suivi performant du site d'intérêt et est indolore pour l'animal. Ainsi l'objectif du projet est de tester le pouvoir ostéogénique de biomatériaux implantés spécifiques de ce type de reconstruction au niveau de la face en vue de futur essai clinique chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vue d'être utilisé en clinique.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie au niveau de la mâchoire (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés de 2 semaines. L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale maxillo-faciale. Cette chirurgie engendrera une douleur modérée pour les animaux et une éventuelle difficulté lors de la mastication pour s'alimenter lors des premiers jours post-opératoires. Une surveillance sera établie afin de pallier à ces inconvénientset et toutes les mesures sont mises en place pour prendre en charge le bien-être des animaux tout au long du projet.

Devenir

Suite à la chirurgie, les animaux seront suivis par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après le dernier temps d'acquisition (2 mois après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique du biomatériau étudié.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux pour répondre à l'objectif du projet et à la réglementation en vigueur dans le cadre de l'évaluation des dispositifs médicaux implantables chez l'Homme.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur l'aspect cinétique du processus, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine au sein de l'animalerie sera respectée avant le début des expérimentations. Les mesures de raffinement sont mises en place tout au long du projet, notamment lors de la phase de la chirurgie : les animaux recevront au préalable une couverture analgésique (anti-douleur), ils seront ensuite endormis, sous anesthésie générale durant toute l'opération. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part sur tapis chauffant. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage et il sera suivi individuellement pendant quelques jours afin de s'assurer que l'opération s'est bien passé et que l'animal récupère correctement. Les critères d'évaluation et de suivi sont définis et adaptés au projet. Suite à cette surveillance, les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec un raffinement des conditions d’hébergement adapté à leur espèce : enrichissement de l’environnement d’hébergement (litière en copeaux, jouets, bâton à ronger...).

Choix des espèces

Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses chez l'homme. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l'os alvéolaire de la mâchoire. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. En cas de résultats satisfaisant et supérieur à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, le processus de validation pourra se poursuivre, afin à terme leur utilisation chez les patients. Des rats Sprague-Dawley adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance au niveau osseux pour répondre à l'objectif de l'étude.

160 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou orale, gavés chaque jour avec des probiotiques, et subissent une perte de poids progressive avant un prélèvement sanguin intracardiaque terminal sous anesthésie et une autopsie. Le porteur teste l'efficacité de bifidobactéries contre l'infection et présente le hamster doré comme un "modèle de choix" par sa sensibilité au virus. La perte de poids attendue reste sous le seuil de 15 % fixé comme point limite.

Objectifs

L’intestin héberge naturellement des milliards de microorganismes, constituant le microbiote intestinal. Outre sa fonction dans la digestion, le microbiote exerce un rôle important dans la protection de l’organisme contre les pathogènes. Lorsque le microbiote intestinal est perturbé dans sa composition et/ou son fonctionnement, on parle de dysbiose. La dysbiose peut être due à un traitement antibiotique par exemple mais aussi liée à une pathologie. Chez certains patients atteints de la Covid-19, outre les symptômes classiquement observés, on peut constater parfois un tel déséquilibre de la biodiversité de la flore intestinale, associé à des symptômes gastro-intestinaux incluant des diarrhées. Par ailleurs, les analyses des selles de ces patients démontrent que le virus SARS-CoV2 peut survivre dans le tractus gastro-intestinal suggérant ainsi que ce dernier peut constituer un site extra-pulmonaire pour la multiplication et l’activité virale. De plus, le récepteur utilisé par le SARS-CoV2 pour infecter les cellules de l’hôte (fortement exprimé dans les cellules pulmonaires) est aussi présent dans les cellules épithéliales du tractus GI et joue un rôle essentiel dans le contrôle de l’inflammation intestinale et l'équilibre microbien. L’apport de probiotiques pourrait constituer une approche de traitement à 2 niveaux : 1/En exerçant un blocage du processus de fusion du virus aux cellules de l’hôte 2/en exerçant une activité de modulation des molécules de l'immunité. Le présent projet se propose d’évaluer l’efficacité de bifidobactéries sur l’infection à SARS-CoV2 chez le hamster doré. Deux probiotiques candidats (bifidobactéries) ont été retenus pour l'essai d'efficacité in-vivo.

Bénéfices attendus

Une activité immunomodulatrice des bifidobactéries associée à une activité de perturbation de la mutiplication du SARS-CoV2 permettraient de limiter l'infection par le SARS-CoV2 chez le hamster. Le bénéfice attendu est donc l'apport de la preuve que les bifidobactéries peuvent constituer un potentiel traitement contre l'infection au SARS-CoV2.

Procédures

Les hamsters vigiles seront traités par gavage oral quotidien (sonde) avec un volume de 200µL, soit 11 ou 13 gavages (durée = 2/3 secondes/gavage) selon les groupes Les hamsters de la procédure 1 seront infectés une seule fois par voie intra-nasale (40µl - animaux anesthésiés - durée = 15 secondes environ) Les hamsters de la procédure 2 seront infectés une seule fois par voie orale (200µl - animaux vigiles - 2/3 secondes environ) Les hamsters seront manipulés quotidiennement pour une pesée (11 à 14 pesées selon les groupes - durée = 10 secondes) Les hamsters seront anesthésiés (J+4 ou J+7) à l'isoflurane puis par injection de kétamine/xylazine afin de réaliser une prise de sang intracardiaque terminale avant autopsie (prooédure terminale de 15 minutes au total)

Impact sur les animaux

Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. La perte de poids prend généralement fin à J+6 et n'excède pas 15% du poids constaté le jour de l'infection.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de réaliser une autopsie et une collecte d'organes/sang pour étudier différents paramètres de l'infection.

Remplacement

Des experimentations préliminaires in-vitro ont été réalisées en amont du projet afin de sélectionner les souches candidates et de valider leur activité anti-protéase et immunomodulatrice. Néanmoins, l'évaluation de l'efficacité des traitements par probiotique (évalution de multiplication virale, la distribution, lésions associées) ne peut se faire in-vitro et nécessite de passer par le modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été fixé à 16 afin d'avoir 8 animaux par point de mise à mort (J+4 et J+7) afin d'obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs.

Raffinement

Ces hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

Une partie des souris de ce projet appartient à la lignée NSG, dépourvue de système immunitaire, pour qu'elles acceptent une greffe de cellules humaines. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes irradiées puis soumises sous anesthésie à une injection dans le fémur d'une molécule à tester, une injection que le porteur dit lui-même "douloureuse". 90 d'entre elles reçoivent ensuite des cellules souches sanguines humaines par voie intraveineuse. Toutes sont tuées au plus tard deux jours après l'irradiation, pour mesurer la molécule et la part de cellules humaines dans leur moelle et leur sang.

Objectifs

L’utilisation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) suscite un fort intérêt médical du fait de leur potentiel de régénération et de différenciation. Elles sont présentes dans la moelle osseuse et sont à l’origine des cellules sanguines. Elles sont utilisées au cours des transplantations hématopoïétiques dans le but de traiter les patients atteints de leucémies ou de maladies génétiques affectant les cellules du sang (leucocytes, globules rouges, plaquettes). L’une des limites de la greffe cependant, provient de la faible proportion de CSH capables de migrer vers les niches hématopoïétiques localisées dans la moelle osseuse et de s’y implanter. La grande majorité des CSHs est en réalité perdue ou détruite avant d’atteindre la moelle osseuse. Ainsi, une proportion importante des greffons, notamment ceux issus des sangs de cordons ombilicaux présentant de faibles quantités de CSHs, ne peut pas être utilisée pour la greffe. Une solution permettant d’augmenter le nombre de greffons disponibles consiste à augmenter la proportion des CSHs « utiles », c’est à dire capables de s’implanter dans la moelle osseuse. Cette amélioration permettrait en outre de limiter les risques d’échec de greffe chez les patients transplantés. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est d’évaluer l’effet de l’injection de molécules impliquées dans le guidage des cellules vers les niches hématopoïétiques médullaires, en association ou non avec des complexes stabilisateurs, préalablement à l’injection des CSHs, sur l’efficacité de l’implantation des CSHs humaines dans la moelle osseuse. Les expériences de transplantations seront réalisées dans un modèle de souris n’ayant pas de système immunitaire, ne rejetant donc pas la greffe de cellules humaines.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait d’établir la preuve de concept que l’injection de molécules (sélectionnées sur la base de leur effet sur les CSHs) augmente la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) lors d’expérience de transplantation. A terme, ces résultats concourront à l’optimisation des protocoles de transplantation de cellules hématopoïétiques chez l’humain, dans le but d’augmenter les chances de réussite thérapeutique et le nombre de patients pouvant bénéficier d’une greffe de moelle osseuse.

Procédures

Chaque animal (450 au total) sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe (3Gy soit 3min environ pour les souris NSG et de 2 fois 5.5Gy soit 2 fois 5 min environ pour les souris C57) et à l’injection intrafémorale d’une molécule sélectionnée sur la base de son activité sur les CSHs. Cette injection qui dure quelques minutes sera réalisée sous anesthésie (1h environ) avec une prise en charge analgésique. Certains animaux (90 au total) seront également transplantés avec des CSHs humaines par voie intra veineuse. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes, est réalisée sous anesthésie et analgésie. Ces procédures permettront de tester 5 molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs La durée maximale de chacune des procédures est de 2 jours et aucun prélèvement n’est réalisé sur animal vivant.

Impact sur les animaux

Compte tenu du délai très court entre l’irradiation (3Gy pour les NSG et 2x5.5Gy pour lesC57/Bl6) et l’euthanasie précose des animaux (2 jours maximum) aucune altération significative de leur santé n’est attendue. L’infusion intra-veineuse de cellules hématopoïétiques humaines ne provoquent pas de douleur et se fait sous anesthésie générale. L’injection dans l’os est douloureuse. Elle sera effectuée sous anesthésie et sera accompagnée d’une prise en charge analgésique.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier, dans la moelle et dans le sang, la concentration de la molécule étudiée pour les études de pharmacocinétique ainsi que la proportion de CSH humaines présente dans la moelle des souris pour l’expérience de transplantation.

Remplacement

La prise de la greffe au cours des transplantations de CSH est un phénomène complexe et il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de mimer ce processus in vitro. Le passage par une expérience de transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs à se loger au niveau de la moelle osseuse et ainsi d’identifier des molécules capables d’améliorer cette étape.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous déterminerons sur un petit nombre de souris les conditions expérimentales optimales de transplantation en fonction de chaque molécule testée. L’effet de cinq molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs sera évalué. Notre expérience ainsi que la littérature dans le domaine nous montrent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe et par expérience est de 6 animaux afin que nous puissions rendre des résultats statistiquement significatifs sur le plan hématologique. Nos expériences préliminaires par étapes successives nous permettront d’optimiser les paramètres expérimentaux et de vérifier que ce nombre d’animaux est valide lorsque l’on combine injection intra-fémorale d’une molécule à tester et injection intra-veineuse de cellules hématopoïétiques.

Raffinement

Pour limiter au maximum l’impact sur le bien-être des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Par ailleurs, une prise en charge analgésique sera effectuée si besoin au site de l’injection intra-fémorale. Enfin une surveillance accrue (minimum 2 fois par jours) sera réalisée entre le moment de l’irradiation et l’euthanasie de l’animal (soit 2 jours maximum) afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'humain. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de CSHs. Nous utiliserons 2 lignées de souris, les C57BL6 et les NSG La comparaison des résultats obtenus entre ces deux lignées nous permettra de déterminer le dosage optimal de la molécule injecté et le modèle murin qui sera utilisé pour l’étude pharmacocinétique. Les souris NSG seront utilisées pour les expériences de transplantation car ces souris sont immunodéficiences et acceptent par conséquent la greffe de cellules humaines. Ces animaux seront maintenus et manipulés stérilement. Les souris sont hébergées en groupe de 6 dans des cages stériles en portoir ventilé et un enrichissement (coton) est ajouté à leur environnement.