Autres troubles humains

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.

Objectifs

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.

Bénéfices attendus

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.

Procédures

Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.

Impact sur les animaux

Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.

Devenir

Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).

Remplacement

Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse ou intrathécale d'un vecteur AAV et subit cinq à huit prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie, sur une période allant jusqu'à neuf mois, pour préparer un essai de thérapie génique chez des enfants atteints de leucodystrophie métachromatique. Le porteur indique des risques anesthésiques, infectieux et de fuite de liquide céphalo-rachidien. Les macaques sont euthanasiés en fin de projet pour prélever le cerveau, la moelle épinière et les organes.

Objectifs

Les vecteurs AAV sont parmi les vecteurs les plus efficaces pour transporter et intégrer des gènes d’intérêt dans des parties précises du système nerveux central, en particulier, le cerveau . Les AAV constituent une voie de thérapie pour des maladies neurodégénératives, notamment la leucodystrophie métachromatique. Le but de cette étude est de valider la capacité de transduction du vecteur AAVPHP.eB ARSA apres administration intraveineuse ou intrathecale chez le primate non humain, afin de realiser les étapes préclinique (efficacité et tolérance) et de de supporter le depot d'un CTA à l'agence du medicament en vue d'un essai clinique de phase I/II chez les enfants souffrants de leucodystrophie métachromatique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la validation de l'efficacité et de la tolérance de l'approche permettant les étapes precliniques chez le primate non humain, afin de supporter le depot d'un CTA à l'agence du medicament en vue d'un essai clinique de phase I/II chez les enfants souffrants de leucodystrophie métachromatique et de pouvoir ainsi proposer un traitement alors qu'aujourd'hui il n'existe que des soins palliatifs et les enfants decedent avant l'age de 4 ans.

Procédures

Injections intraveineuse ou intrathécale et prelevement de sang et de liquide céphalo-rachidien. Toutes les procédures sont réalisées sur animaux anesthésié et sous analgésie. Il y a au total une procédure d'injection (IV ou IT) et 5 prelevements de sang et LCR si maintien pour 6 semaines ou 8 prelevements si maintien pour 9 mois. Toutes les anesthésies durent moins de 1h30.

Impact sur les animaux

Les 3 effets indesirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux pour l'injection intrathécale - un risque de fuite de LCR - la formation d'hématomes lors des prises de sang

Devenir

Euthanasie à la fin du projet afin de collecter cerveau, moelle epiniere et organes peripheriques et fluides biologiques afin de valider la biodistribution, l'expression et la tolérance du produit thérapeutique

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAV. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de scale-up (efficacité, biodistribution, toxicité, etc) chez le gros animal (NHP). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique

Réduction

2 animaux par dose et approche est le minimum statistique pour repondre à l'objectif du projet soit 6 animaux au total Le projet va nous permettre de realiser les marquages pour evaluer l'expression et le coverage des zones ciblées ainsi que determiner la biodistribution. Il n'y a pas de statistiques faites sur les marquages. Nous nous basons aussi sur des résultast préalables obtenus sur d'autres projets pour pouvoir limiter le nombre d'animaux necessaires.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment l’intrathécale réalisée par un neurochirurgien expert de la technique. qui a déja posé le meme catheter d'injection chez des bébés achondroplastes (nain) ayant un rétrécissement du canal lombaire. Enfin, le nombre d'anesthesie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang, ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation de buprecare pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort et enfin des antibiotiques (amoxicilline) lors de l'intrathecale.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée. Les organes du NHP en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de vecteurs AAV chez le NHP est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. NHP : macaques (1-10 ans) (2 à 12kg) Les mâles NHP atteignent la maturité sexuelle à 6 ans et les femelles à 4 ans, de plus le cerveau est bien formé à ces âges-là. Sachant que nous travaillons sur une pathologie qui apparaît dans l'enfance, nous realiserons nos procédure sur un cerveau formé et myelinisé et non pas avant l'âge d'un an.

220 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie créant un défaut osseux au fémur, puis un suivi par micro-scanner sous anesthésie toutes les deux semaines pendant deux mois, avant l'euthanasie pour analyses histologiques. Le porteur revendique un modèle déjà maîtrisé et reproductible dans son unité, et affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'évaluer les biomatériaux au regard de la réglementation. Les retombées annoncées, de nouveaux dispositifs de comblement osseux pour les patients, restent formulées au conditionnel.

Objectifs

Si les greffes de tissus osseux sont désormais courantes pour réparer un os à la suite d’une fracture ou d’autres lésions, cette stratégie présente des limites. C’est pourquoi notre équipe travaille sur le développement de fragments d’os synthétiques ou hybrides (incluant des cellules souches) qui sont nommés des biomatériaux. Ces biomatériaux doivent être à la fois souples et résistants, mais aussi poreux afin qu’ils puissent être colonisés par des cellules. Pour étudier le potentiel ostéogénique du biomatériau (c'est à dire sa capacité à reformer de l'os) nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle étudié est un défaut osseux au niveau du fémur du rat afin d'évaluer le pouvoir régénérant des biomatériaux implantés. La formation de l'os sera suivie dans le temps grâce à une technique d'imagerie de pointe, indolore et non invasie : un système de tomographie préclinique micro scanner X. L'objectif étant à terme de pouvoir proposer aux patients des matériaux implantables efficaces et adaptés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) qui pourraient être proposés aux patients atteints de pathologie osseuses ou accidentés (fracture...).

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie au niveau du fémur (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Elle est réalisée sous anesthésie générale et le suivi des animaux durant la phase de récupération est renforcé. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés (toutes les 2 semaines). Lors de cette procédure d'imagerie non invasive, les rats seront anesthésiés à l'isoflurane (et maintenu au masque dans l'enceinte du scanner). L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale sur un site orthopédique, cette intervention ne nécessite pas de fixation interne de l'os. Toutefois, la chirurgie pourra engendrer une douleur modérée pour les animaux et leur mobilité sera atteinte lors des premiers jours post-opératoires. Les signes de douleur et de récupération des animaux représente ceux communément observés pour une telle intervention chez l'Homme suite à une reconstruction osseuse suite à un accident par exemple. Une surveillance rigoureuse sera établie afin de pallier à ces inconvénients et de mettre toutes les mesures en place afin de prendre en charge les animaux.

Devenir

Suite à la chirurgie, les animaux seront suivi par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après le dernier temps d'acquisition (2 mois après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique du biomatériau étudié.

Remplacement

Les produits destinés a être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux pour répondre à l'objectif du projet et à la réglementation en vigueur dans le cadre de l'évaluation des dispositifs médicaux implantables chez l'Homme.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les examen d'imagerie par micro-scanner sont réalisés sous anesthésie générale, avec un suivi des paramêtres tout au lon de l'exeman. Le raffinement des conditions d’hébergement est réalisé notamment par l'enrichissement de l’environnement d’hébergement (la litière en copeaux, jouets, bâtons à ronger mis à disposition) et suivi quotidien des animaux par le personnel qualilié et attentif au bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du fémur. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit, étape primordial dans le cadre du processus de validation d'un disposition médical à destinée humaine. Des rats adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

246 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation du cerveau sous anesthésie puis des administrations par le nez de vésicules issues de cellules souches, avec des tests comportementaux comme le labyrinthe en Y, le labyrinthe surélevé et le rotarod, pour limiter les séquelles cognitives de la radiothérapie. Le porteur indique surveiller les animaux quotidiennement et les mettre à mort en cas d'écoulement nasal marqué, de tête penchée ou d'une perte de poids de 20 %. Il affirme qu'un modèle in vivo est obligatoire pour valider cette stratégie thérapeutique.

Objectifs

La radiothérapie ou un surdosage consécutif aux applications médicales sont très souvent associés au traitement des tumeurs du système nerveux central. 50-90% des patients survivants au traitement de tumeurs du cerveau par radiothérapie présentent dans les 6 mois suivant le traitement des troubles cognitifs tardifs. Les rayonnements ionisants induisent au niveau cérébral un stress oxydatif chronique, une neuro-inflammation, l’apoptose des cellules endothéliales, une raréfaction vasculaire et une atteinte des zones de neurogenèse induisant à terme des troubles cognitifs. Par conséquent, il est indispensable de développer de nouveau traitement. L’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses pour le traitement des lésions intestinales radio-induites ou musculo-cutanées a été démontré. Les VE-CSM favorisent le processus de néovascularisation et le processus de réparation tissulaire. L’objectif de ce projet est de proposer une thérapie innovante basée sur l’administration intra-nasale des VE-CSM afin de limiter les conséquences vasculaires et neuropathologiques de la radiothérapie cérébrale et à long terme les troubles cognitifs. Dans le cadre du respect de la règle des 3R, les protocoles expérimentaux sont établis avec un nombre d’animaux réduit mais suffisant pour obtenir des résultats pertinents. Les animaux seront irradiés avec un Sarrp au niveau cérébral. Les animaux seront euthanasiés à différents temps post-irradiation. Les études fonctionnelles, moléculaires et cellulaires seront réalisé sur animaux vigiles ou anesthésiés. Des prélèvements seront réalisés sur un modèle murin anesthésié avant ou après euthanasie. Le nombre total d’animaux utilisés pour ce projet sera de 246.

Bénéfices attendus

Le succès de cette preuve de concept thérapeutique sur l’injection des VE-CSM sera complétée par un autre modèle de radiothérapie fractionnée (3*5Gy) et dans le futur avec une validation sur gros animal qui ouvrirait vers des perspectives de transfert clinique pour limiter la toxicité associée au traitement des tumeurs cérébrales par radiothérapie.

Procédures

Irradiation cérébrale sous anesthésie gazeuse : 10 min sous anesthésie gazeuse isoflurane Administration intra-nasale sous anesthésie gazeuse : environ 5 min par administration Tests comportementaux : - Labyrinthe en Y : 10 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Labyrinthe en croix surélevé : 5 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Rotarod : 3 fois 3 min par séance (1h entre chacun des 3 passages), réalisé 2 fois (4 et 6 mois) Analyse echodoppler sous anesthésie gazeuse : 10 min sous légère anesthésie gazeuse isoflurane Prélèvement sanguin (80uL) 1 fois sous anesthésie gazeuse isoflurane avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes

Impact sur les animaux

Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. La souffrance de l’animal sera évaluée quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (piloérection, perte de poids, prise alimentaire). Si un animal montre des difficultés à se déplacer tel qu’un comportement et/ou déplacement anormal, une prise alimentaire diminuée : des croquettes humidifiées ou du gel de transport seront déposés dans la cage. Également, après l’inoculation nasale, si un animal présente un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, il sera euthanasié. Enfin, si un animal montre une perte de poids de 20%, piloérection et/ou dos rond, l’animal sera euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques. Ici le 1er modèle utilisé est la souris sur lequel nous maîtrisons les techniques fonctionnelles (vasculaire, inflammatoires, comportementales/cognitifs) pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation utilisés sont fortement influencés par la physiologie. Pour l’évaluation des paramètres vasculaires et inflammatoires le nombre de 10 animaux comptabilisés dans chaque protocole expérimental est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes (Anova, Ttest). Afin d’évaluer les paramètres cognitifs, un nombre de 15 animaux est indispensable pour obtenir des résultats exploitables (Anova, Ttest).

Raffinement

Un suivi des animaux quotidien sera réalisé afin d’appliquer les points limites pour limiter la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris hémophile reçoit une injection de thérapie génique, des prélèvements sanguins rétro-orbitaux toutes les quatre semaines, puis un test de temps de saignement où l'extrémité de la queue est sectionnée sur trois millimètres. Le porteur indique que les animaux, encore sous anesthésie et ayant perdu du sang, sont tués par dislocation cervicale sans réveil. Il affirme que les tests in vitro ne reproduisent pas l'ensemble du processus de coagulation.

Objectifs

L'hémophilie A est une maladie hémorragique rare affectant principalement les hommes (1 naissance de garçons sur 5000 environ). Il s'agit d'une maladie génétique et le gène affecté est celui du facteur VIII, une protéine clé de la cascade de la coagulation. Si la maladie n'est pas traitée, l'espérance de vie est en moyenne de 15 ans. Le traitement standard de l'hémophilie A repose sur l'injection intraveineuse régulière (2-3 fois/semaine) de facteur VIII soit recombinant, soit purifié à partir de plasma. Ce traitement est lourd et coûteux. Récemment un anticorps thérapeutique qui peut se substituer au facteur VIII a été développé. Cet anticorps (Emicizumab) a montré une très bonne efficacité chez les patients hémophiles A sévères et est désormais approuvé par les autorités de santé. Il est administrable par voie sous-cutanée 1-2 fois/mois. L’Emicizumab ne normalise pas la coagulation mais transforme une hémophilie sévère en hémophilie mineure. De ce fait, un traitement par Emicizumab n’est pas toujours suffisant et doit parfois être utilisé en combinaison avec d’autres agents procoagulants. L’effet de telles associations est encore très mal connu et lors des essais cliniques sur l’Emicizumab, il y a eu malheureusement des accidents pro-thrombotiques et des cas de décès de patients dus à un emballement du système de coagulation. De plus, son utilisation est coûteuse et de ce fait 70% des patients dans le monde n'ont pas accès à ce type de thérapie. L'objectif de ce projet est de répondre à ces 2 limites, le risque de thrombose par utilisation d'un anticorps thérapeutique mimant le FVIII et le coût élevé d'un traitement par injection d'un anticorps purifié de façon régulière. Pour répondre à cet objectif, le but de notre projet est de tester in vivo un nouvel anticorps thérapeutique développé par une biotech, qui comme l’Emicizumab a montré in vitro qu’il corrigeait l’hémophilie. Cet anticorps a montré dans des tests in vitro que contrairement à l'Emicizumab il évitait les thromboses. Il sera exprimé in vivo par l’utilisation d’un vecteur viral qui permettra en une injection une expression sur plusieurs années de la thérapie. Il s'agira de déterminer si cette nouvelle thérapie est efficace pour corriger les saignements anormaux observés chez un organisme vivant hémophile.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de répondre à plusieurs attentes actuelles concernant les traitements des patients hémophiles : 1) Eviter les effets secondaires des nouveaux traitements notamment les risques de thromboses chez certains patients. 2) Utiliser un système thérapeutique, la thérapie génique, éliminant les injections intraveineuses répétées qui sont douloureuses pour les patients. 3) Réduire le coût des traitements et rendre plus accessible les traitements au 70% de la population mondiale hémophile qui n'a toujours pas accès à une thérapie. L'espérance de vie d'un patient hémophile sévère sans thérapie est de 15 ans.

Procédures

Les souris sont injectées vigiles au niveau de la veine latérale de leur queue avec 200 µl d'un solution d'AAV. Elles sont observées pendant 12 semaines avec un prélèvement rétro-orbitalde sanguin toutes les 4 semaines. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Au terme des 12 semaines de suivi, un test de temps de saignement sera réalisé afin de vérifier l'efficacité fonctionnelle de l'anticorps exprimé. Le test de temps de saignement sera réalisé sur les souris sous anesthésie (l’extrémité de la queue de la souris est sectionnée sur 3 mm à l'aide d'un scalpel stérile). Les animaux sont gardés en vie au maximum 35 minutes lors du test de coupure de l’extrémité de leur queue (5 minutes pour l'anesthésie, suivie de 30 minutes pour le test de saignement).

Impact sur les animaux

Pendant les 12 semaines maximums de suivi de l'expérience, les souris hémophiles à la suite de l'injection de la thérapie génique risquent principalement de développer des hémorragies. Pendant le temps de saignement, l'animal sera sous anesthésie par un mélange Xylazine (10 mg/kg) –Kétamine (100 mg/kg). Si pendant cette période, l’animal présente des signes de réveil, une nouvelle dose d’anesthésiant sera administrée (demi-dose par rapport à la dose initiale).

Devenir

Tous les animaux sont encore sous anesthésie à la fin de la procédure où ils subissent un test de saignement qui dure 30 minutes. Ils auront alors perdu pour certain un volume de sang important. Il est plus éthique de ne pas réveiller les souris utilisées dans la procédure de ce projet et de les euthanasier par dislocation cervicale.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, autant des molécules procoagulantes que leurs inhibiteurs mais aussi des phospholipides membranaires, des cellules sanguines, les vaisseaux sanguins et les tissus. Actuellement les tests disponibles in vitro, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus. Par conséquent, afin de tester l’efficacité anti-hémorragique du Bi8 via thérapie génique, il est crucial de pouvoir tester son effet dans un modèle animal d'hémophilie A.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à l’ensemble de l’étude a été défini pour chaque procédure de façon à avoir une réponse statiquement analysable sur tous les paramètres mesurés. Les mêmes souris permettront de mesurer différents paramètres : taux d’expression de l'anticorps thérapeutique, efficacité du traitement à restaurer la coagulation, effet du traitement sur le bien-être et sur la survie de l’animal, sur le bilan de cellules sanguines. Nous prévoyons d’utiliser 50 souris déficientes en FVIII pour ce projet.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec des groupes sociaux stables sans isolement, un accès à volonté à la nourriture et à la boisson. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu : morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid, en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront suivis individuellement et ils seront obligatoirement euthanasiés aux points limites définis dans la procédure. L’anesthésie générale sera induite dès la sortie du groupe afin d’éviter tout stress. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin d'hémophilie A (souris déficientes en facteur VIII) est bien caractérisé et a été utilisé dans la littérature scientifique comme un modèle préclinique valide d’hémophilie, reproduisant la pathologie humaine et permettant ainsi les tests de nouvelles thérapies anti-hémorragiques notamment la thérapie génique. Les souris seront injectées entre 6-12 semaines lorsqu'elles auront atteint un poids de 18-25 gr. La durée de suivi des expériences de thérapie génique (6-12 semaines) est alors compatible avec une fin de procédure à un âge compris entre 12 et 24 semaines. A ce stade, leur poids est tout à fait compatible avec la réalisation des expériences de saignement pour tester l'efficacité de la thérapie.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie réduisant leur fonction rénale à 30 % pour reproduire une insuffisance rénale chronique, puis reçoivent deux composés dans leur nourriture cinq jours sur sept pendant six semaines, avant une mesure de pression artérielle sous anesthésie terminale et le prélèvement de nombreux organes. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" et que le remodelage des tissus ne peut être évalué que sur un animal entier, tout en menant en parallèle des tests sur cellules rénales. Les bénéfices annoncés, de nouveaux traitements, sont renvoyés au moyen terme et au conditionnel.

Objectifs

La mortalité due à l'insuffisance rénale chronique (IRC) et l'insuffisance rénale terminale devrait devenir la 5ème cause mondiale de décès d'ici 2040. L'IRC altère significativement la qualité de vie et la sociabilisation des patients et représente une charge économique importante puisque la thérapie de remplacement rénal (dialyse) coute environ 38 000 €/patient/an. Ainsi, pour des raisons médicales, sociales et économiques, les efforts visant à réduire le nombre de patients atteints d'IRC présentent un intérêt majeur. Le rat va être utilisé comme modèle d’IRC induite par réduction chirurgicale de la masse rénale car il récapitule fidèlement la maladie humaine avec une atteinte des différentes structures du rein. L'objectif principal du projet est de contribuer au futur traitement de l'IRC en validant l'efficacité de deux composés innovants.. Les deux composés, administrés dans un cadre préventif précoce, ont montré des effets très prometteurs chez l'animal. Le projet a pour but : 1) la validation des 2 composés dans ce modèle de rat avec une focalisation sur la fibrose rénale et la synergie avec les traitements existants dans un cadre curatif ; 2) fournir une vue détaillée des mécanismes d'action des composés ; 3) évaluer la valeur translationnelle des composés, c’est-à-dire les possibilités de transposition des résultats chez l'homme et application en clinique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement à moyen terme de nouveaux traitements afin de lutter contre la progression de l'insuffisance rénale chronique. De nombreux médicaments initialement prometteurs dirigés contre la progression de l'IRC ont échoué en clinique. Nous visons à valider l'efficacité de 2 composés dans le traitement de l'IRC en nous focalisant sur leurs possibilités de transposition en santé humaine. Ainsi, les deux composés seront testés chez le rat en parallèle avec les traitements déjà utilisés chez l'homme. L'étude des protéines modifiées dans le rein, combinée à une analyse bio-informatique poussée et à une validation in vitro sur des cellules rénales, nous permettront d’étudier les processus affectés par les composés pour : 1) valider que les mécanismes anticipés sont bien ciblés; 2) prédire les effets secondaires/hors cibles et ; 3) proposer de nouveaux composés qui pourraient être utiles dans le traitement de l’IRC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour ne laisser que 30% de la fonction rénale pour mimer l'insuffisance rénale chronique humaine. Des injections sous cutanée deBuprenorphine sont effectuées pour prévenir la douleur lors de la chirurgie et pendant la période post-opératoire (pendant 24h à 48h). Un groupe contrôle suivra une chirurgie « simulée » (incision de l’abdomen et manipulation des reins sans ligature ni excision) . La durée de la chirurgie est de 35 minutes. Deux prélèvements d'urine auront lieu au cours du projet: 1 mL environ sera prélevé par massage abdominal au niveau de la vessie en moins de 2 minutes. La fonction rénale des animaux sera évaluée deux fois au cours du projet à l’aide d’un dispositif miniature placé en 10 minutes maximum. Ce dernier permet de mesurer à travers la peau l’élimination par le rein d’une substance fluorescente injectée en intraveineux sous anesthésie. Les dispositifs miniatures sont maintenus sur la peau des rats à l’aide d’un adhésif et d’une gaze et les mesures sont ensuite effectuées pendant 2h sur les rats vigiles, libres de leur mouvement (pas de douleur et peu de stress). Cette technique évite la réalisation d’un prélèvement sanguin. Les traitements seront administrés 5 jours sur 7 pendant 6 semaines dans la nourriture des animaux (boulettes contenant les produits à tester). Les rats sont isolés en présence de la boulette de nourriture et remis dans leur cage une fois qu’ils l’ont mangée (évite les gavages). A la fin du protocole, la pression artérielle des rats sera mesurée sous anesthésie générale gazeuse, cette partie de la procédure étant sans réveil. Un cathéter est implanté dans la carotide droite et relié à un capteur de pression. Après 5 à 10 minutes d’enregistrement, un prélèvement sanguin sera effectué, puis les rats anesthésiés seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Plusieurs étapes du projet sont susceptibles d’induire des nuisances pour les animaux : la chirurgie sous anesthésie gazeuse et la réduction de la fonction rénale. L’utilisation d’analgésiques lors de l'opération et pendant 48h post-opératoire permet de limiter la douleur. L'analgésie post-opératoire sera évaluée avec une grille de score. Trois à 5 jours après l’opération, une perte de poids de maximum 10 % peut être observée. Le poids doit revenir à la normale au bout d'une semaine post chirurgie. La perte de poids est due en partie à la laparotomie (incision des muscles abdominaux) qui peut causer une gêne pour l’alimentation, la nourriture étant sur le couvercle des cages. Afin de favoriser l’alimentation des rats, de la nourriture hydratée sera placée dans le fond des cages. Les rats sont isolés pendant 24h (jusqu'à 48h) suite à la chirurgie, ce temps leur permet de retrouver une activité normale (exploration, mobilité) et permet de vérifier la bonne cicatrisation de leur plaie. L’isolement des animaux pouvant être une source de stress, ils seront ensuite hébergés en cages de 3 à 4 le plus tôt possible. Les prélèvements d’urines sont faits par massage abdominal au niveau de la vessie des animaux. Ce mode de prélèvement permet d’éviter d’isoler les rats dans des cages métaboliques pendant plusieurs jours (source de stress). Les nuisances induites se limitent alors à une contention de quelques secondes. Lors de l’étude de la fonction rénale, les rats sont anesthésiés avant d’être rasés et un dispositif miniature est fixé sur le dos, puis l’injection intraveineuse du traceur fluorescent est réalisée sous anesthésie également. La mesure se déroule pendant 2 h sur les rats vigiles, libres de leur mouvement. Ainsi, ce protocole ne provoque pas de douleur et peu de stress. Les traitements seront administrés dans la nourriture ce qui permet d’éviter le stress et les possibles lésions de la trachée induites par la réalisation quotidienne de gavages. Les traitements ont déjà été administrés chez le rongeur et n’ont pas entrainé d’effet indésirable.

Devenir

A l’issue de la procédure, la pression artérielle des rats sera mesurée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2%), cette partie de la procédure étant sans réveil. Après 5 à 10 minutes d’enregistrement de la pression artérielle, un prélèvement sanguin sera effectué, puis les rats anesthésiés seront euthanasiés par injection intraveineuse d’une dose létale de pentobarbital (Exagon ou Euthasol, 400 mg/kg, I.V.). L’euthanasie des animaux est nécessaire afin de permettre le prélèvement de leurs organes en vue de nombreuses analyses biochimiques, histologiques, génétiques et protéomiques, entre autres. De nombreux tissus seront prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe et avec des équipes partenaires. Seront notamment prélevés et étudiés : rein, cœur, plasma, artères (aorte thoracique, abdominale, …), intestins, urine et fèces, muscles (soléaire, gastrocnémien), tibias, cerveau, foie et tissus adipeux (épididymal, péri-aortique, sous-cutané).

Remplacement

Le modèle animal est indispensable à cette étude pour induire une insuffisance rénale chronique et une fibrose des reins, permettant ainsi l’évaluation du potentiel thérapeutique des molécules d’intérêt. Le remodelage de la structure des tissus (rénal notamment) est un processus complexe qui ne peut être évalué que sur l’animal. Ses déterminants ne peuvent pas être fidèlement reproduits par des méthodes alternatives. L'interaction entre différents organes (rein, cœur, vaisseaux sanguins, muscles, cerveau …) est nécessaire afin de représenter la pathologie humaine affectant divers organes cibles à divers stades de l’insuffisance rénale chronique. Le projet prévoit par ailleurs des tests in vitro sur différents types de cellules rénales. Ces tests permettront d’évaluer les mécanismes d’action des composés testés. Les résultats obtenus dans le modèle animal seront ainsi approfondis et complétés. L’étude sur cellule ne permet cependant pas de reproduire et d’appréhender le processus complexe de fibrose des reins.

Réduction

Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé en teant compte de la diminution de la fibrose rénale (-35%) à atteindre, de la variabilité attendue des observations et des tests statistiques pour étudier l’efficacité des composés. Des animaux mâles et femelles seront inclus dans l’étude afin que nos résultats soient plus représentatifs. Ainsi, 12 animaux (6 femelles et 6 mâles) seront inclus dans les différents groupes et au total : 8 x 12 = 96 animaux seront nécessaires à la réalisation de l’étude. L’inclusion de groupes traités avec les thérapies existantes, les analyses approfondies de l'expression des protéines et les résultats très prometteurs dans d’autres modèles doivent permettre l’obtention de résultats positifs et transposables en clinique. L'étude des protéines apportera aussi une meilleure compréhension du modèle et des thérapies actuelles. Le test de 8 groupes en parallèle permet d’éviter de devoir répéter les groupes « contrôles » (animal sain et animal avec IRC non traitée) plusieurs fois. De nombreux tissus seront prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe et avec des équipes partenaires afin d’obtenir un maximum de résultats à partir d’un animal. Seront prélevés et étudiés : rein, cœur, plasma, artères (aorte thoracique, abdominale, …), intestins, urine et fèces, muscles (mollet), tibias, cerveau, foie et tissus adipeux (gras). Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant les logiciels GraphPad Prism v5.0 et SAS v9.4.

Raffinement

L’opération chirurgicale deréduction de la masse rénale est réalisée sous anesthésie gazeuse et en une seule étape, ce qui évite d’avoir à opérer 2 fois les animaux. Des injections d’analgésique sont effectuées afin de prévenir la douleur lors et la chirurgie et pendant la période post-opératoire ( évaluation de la douleur avec une grille de score). La plaie sera désinfectée et une pellicule d’Ercefilm y sera déposée (pansement pelliculaire transparent qui protège les plaies des contaminations et permet le contrôle visuel de la cicatrisation). Un protecteur oculaire (« Ocry-gel ») sera utilisé pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Les animaux seront surveillés quotidiennement (activité, cicatrisation) pendant la semaine post-opération et de la nourriture hydratée sera placée dans le fond des cages afin de favoriser leur prise alimentaire. Les rats sont isolés pendant 24h (à 48h) suite à la chirurgie, jusqu’à retrouver une activité normale (exploration, mobilité et cicatrisation). Ils seront ensuite hébergés en cages de 3 à 4 le plus tôt possible. Les prélèvements d’urine sont faits par massage abdominal au niveau de la vessie des animaux (pas d’isolement stressant pour les rats). La mesure de la fonction rénale se déroule pendant 2 h sur les rats vigiles, libres de leur mouvement. Le protocole ne provoque pas de douleur et peu de stress. Cette technique de mesure récente permet d’avoir accès à une mesure très précise de la fonction rénale et évite un prélèvement sanguin. Avant les traitements, la mesure permettra de vérifier que les fonctions rénales des rats dans les différents groupes sont homogènes et qu’il n’y a pas de biais d’un groupe à l’autre. Les traitements seront administrés dans la nourriture (après entrainement d’une semaine) pour éviter le stress et les possibles lésions de la trachée occasionnées lors de gavages quotidiens. Cela limite aussi l’utilisation de solvants (type éthanol) nécessaires à la dissolution de certains composés testés, pouvant présenter une toxicité et confondre les résultats. Les traitements ont déjà été administrés chez le rongeur sans entrainer d’effet indésirable.

Choix des espèces

Le rat est un animal dont la fonction rénale et les pathologies associées sont très proches de celles de l’homme. Les genèse de l’IRC humaine est mieux reproduite chez le rat que chez la souris et seul des modèles complexes à utiliser (techniquement et éthiquement) tel que le chien ou le porc présentent une IRC plus proche de celle de l’homme. Le modèle de réduction de la masse rénale chez le rat est bien caractérisé et les outils immunologiques, biochimiques et moléculaires sont largement disponibles pour cette espèce, permettant une bonne exploitation des échantillons. Les rats sont réceptionnés à l'âge de 7 semaines (150-175g pour les femelles et 200-225g pour les mâles). La chirurgie sera effectuée après 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement soit à l’âge de 8 semaines. A cet âge les animaux ont récemment atteint leur maturité sexuelle (stade jeune adulte). La réduction de masse rénale à ce stade « jeune » permet d’obtenir une insuffisance rénale mimant bien la pathologie humaine. Les rats suivront ensuite des traitements entre leur 14ème et 20ème semaine de vie (stade adulte). Agés de 14 semaines après avoir suivi la chirurgie de réduction de masse rénale à 8 semaines, les rats présentent une pathologie bien installée tout en ayant encore une fonction rénale résiduelle assez importante (pathologie pas trop sévère permettant aux potentiels traitements d'agir).

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).

Procédures

4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle

Raffinement

Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour une maladie rénale rare, elles sont gavées quotidiennement pendant deux mois, placées en cage métabolique 48 heures, puis soumises à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie le jour de leur mise à mort. Le porteur indique que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de passage de la solution dans les poumons. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier un rein in vitro.

Objectifs

La néphronophtise (NPH) est une maladie rénale héréditaire rare affectant l’enfant et l’adolescent. Cette affection est responsable de 10% des cas d’insuffisance rénale terminale chez l’enfant et nécessite le recours à la dialyse ou à la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. La maladie se révèle par une augmentation du volume des urines et une soif excessive. En parallèle, le rein subit de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein aboutissant à sa transformation en un tissu fibreux non fonctionnel. Au cours de l'évaluation d'une grande quantité de composés chimiques, pour la plupart déjà utilisés en clinique, sur différents modèles cellulaires, des molécules avec un fort potentiel thérapeutique ont été mis en évidence. Récemment, un modèle murin transgénique récapitulant en partie la néphronophtise humaine a été développé. Ces souris présentent des atteintes oculaires, une infertilité masculine et des anomalies de structure du rein à partir de 3 mois sans insuffisance rénale. Dans ce modèle, l’administration par voie intrapéritonéale, d’un des composés identifiés, le composé C1, permet d’améliorer l’état du tissu rénal. L’étude proposée ici a pour objectif d’évaluer l’efficacité thérapeutique du composé chimique C1 administré cette fois-ci par voie orale, dans le même modèle murin de néphronophtise.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’administration orale d’un composé thérapeutique identifié in vitro permettant ainsi à terme d’éviter la greffe rénale aux patients.

Procédures

Les 80 animaux seront soumis à un gavage quotidien pendant 2 mois à l’aide de sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal. A la fin du protocole, si après avoir réalisé le spot urinaire, un défaut de concentration des urines a été observé chez certains animaux, les 80 animaux seront également soumis à une mise en cage métabolique, dans le calme dans une pièce dédiée, pendant 48 h : 24h d’adaptation et 24h de recueil des urines des 24h. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Enfin, chacun des 80 animaux sera soumis à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale (test des réflexes et de la mesure de la fréquence respiratoire pour vérifier l’endormissement) une seule fois le jour du sacrifice à l’aide de micro-capillaires héparinés. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Si cela est observé, on attendra de voir si l’animal reprend souffle dans les minutes qui suivent. Si cela n’est pas le cas, l'animal sera mis à mort immédiatement par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement. Afin de limiter ce stress, une période d’adaptation de 24h est réalisée. La mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée.

Devenir

A l’issue de la Procédure 1, les 80 animaux âgés de 3 mois, seront euthanasiés afin de collecter les organes post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les recherches préliminaires ayant permis l’identification du composé C1 qui fait l’objet de l’étude ont été menées sur des lignées de cellules afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’un rein in vitro, il n’a pas été possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum (10 animaux par groupe de traitement) permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Pour l’étude statistique, nous utiliserons un test de one-way ANOVA suivi d’un test de Tukey pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie. Afin de réduire le traumatisme lié aux gavages répétés et réduire les risques de perforation de l’œsophage, des sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal seront utilisées. Toutes les procédures douloureuses sont effectuées sous anesthésie générale associée à une analgésie pré- et post-opératoire. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Des points limites spécifiques à la procédure ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par inhalation de CO2 dans un système dédié.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. De plus, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Le traitement avec le composé C1 sera initié à 1 mois de vie (avant le début de la maladie) et sera poursuivi jusqu’à 3 mois de vie.

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.