Autres troubles humains

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages ou des injections sous-cutanées, intrapéritonéales ou intramusculaires jusqu'à sept jours par semaine pendant quatre semaines, et un prélèvement sanguin sous anesthésie tous les quinze jours. Le porteur annonce des tests moteurs et comportementaux susceptibles de provoquer un stress léger à modéré et une fatigue passagère, sans préciser lesquels. L'objet réel du projet reste l'évaluation préclinique de quinze produits en cinq ans pour l'industrie agroalimentaire ou pharmaceutique, un passage chez la souris que le porteur qualifie d'"indispensable" pour mesurer les effets sur "l'ensemble de l'organisme".

Objectifs

Les muscles squelettiques assurent de nombreuses fonctions au sein de l’organisme. Aussi, leurs altérations peuvent avoir des répercussions sur la fonction motrice et la qualité de vie des patients. L’industrie du secteur agroalimentaire ou pharmacologique s’oriente vers le développement de produits qui visent à diminuer les états de fatigue ou de faiblesse musculaire. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer au niveau pré-clinique l’efficacité de nouveaux produits, alimentaire ou pharmacologique, pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, nous envisageons de tester 15 produits en 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à évaluer les effets d’approches thérapeutiques innovantes sur la fonction musculaire chez la souris, dans un objectif de transfert vers des populations humaines souffrant de troubles musculaires, notamment les patients atteints de pathologies neuromusculaires et les personnes âgées présentant une perte de la fonction musculaire. L'utilisation du modèle murin permettra également de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dégradation de la fonction musculaire. Les connaissances acquises contribueront à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à l'élaboration de stratégies innovantes pour préserver ou restaurer la masse et la fonction musculaire. À terme, les résultats obtenus pourront ainsi déboucher sur le développement de traitements efficaces, améliorant significativement la qualité de vie des patients concernés.

Procédures

(1) Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse - Fréquence maximale : 1 prélèvement tous les 15 jours ; durée : 5 min maximum (pous tous les animaux) (2) Gavage - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par gavage) (3) Injection sous-cutanée - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection sous-cutanée) (4) Injection intrapéritonéale - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection intrapéritonéale) (5) Iinjection intramusculaire sous anesthésie gazeuse : fréquence maximale : 5/7j sur une semaine, 1/7j sur 4 semaines ;- durée : 10 min maximum (pour les animaux traités par injection intramusculaire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus aux modalités d’administration retenues ou aux prélèvements de sang réalisés au cours du protocole. Les nuisances attendues sur les animaux sont : (1) inflammation transitoire au niveau du site d’injection (2) fausse-route ou blessure du tractus digestif dans le cas d’administration par gavage (3) traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang (4) risque infectieux liés à la réalisation de gestes invasifs. Les tests moteurs et comportementaux peuvent induire un stress léger à modéré du fait de la manipulation des animaux et leur isolement temporaire, ainsi qu'un fatigue passagère du fait de la répétition des mesures.

Devenir

A la fin de la durée du traitement, les animaux seront euthanasiés. Plusieurs muscles squelettiques seront ensuite rapidement prélevés pour étudier leur fonctionnalité.

Remplacement

Dans le cadre d’évaluation préclinique d’une nouvelle approche thérapeutique, le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est limité autant que possible, tout en garantissant des résultats fiables. En raison de la variabilité attendue des réponses aux traitements testés, 15 souris par groupe ont été prévues. Ce nombre permet de détecter des différences significatives entre groupes tout en respectant le bien-être animal et en limitant le nombre d'animaux. Il est basé sur nos expériences passées, où des différences de 20 à 30 % entre groupes ont pu être observées avec ce type d’effectif. Plusieurs mesures sont mises en place pour limiter encore le nombre d’animaux : (1) Utilisation de produits déjà connus comme sûrs (2) Choix réfléchi des groupes de comparaison (3) Suivi répété des mêmes paramètres chez chaque animal (4) Réalisation de tests multiples sur les mêmes animaux, sans nuire à leur bien-être (5) Combinaison de tests in vivo et in vitro sur les mêmes animaux (6) Réutilisation des données de groupes témoins dans des expériences similaires (7) Mutualisation des données issues de groupes recevant un produit de référence.

Raffinement

Les nuisances ou effets indésirables attendus étants principalement dus aux modalités d’administration des produits à tester, des méthodes moins stressantes et moins invasives seront utilisées, tout en tenant compte des contraintes liées au composé à tester (solubilité, stabilité, dose/volume…), les objectifs de l’étude et la pharmacocinétique souhaitée : Liste des actions pour réduire la douleur et le stress des animaux liées au traitement : - Conditionnement positif des animaux à la manipulation/méthode d’administration - Utilisation préférentielle des voies orales volontaires (eau de boisson/alimentation) - Remplacement du gavage par la technique d'administration guidée par micropipette dès que possible - Remplacement des injections intrapéritonéales par des injections sous-cutanés, sans contention. Les méthodes utilisées pour étudier la fonction musculaire des animaux sont validées et non invasives, des périodes d’acclimatation et d’habituation sont systématiquement effectuées. Lors de la réalisation des tests, un renforcement positif par récompense est mis en place pour limiter le stress des animaux. Liste des actions pour réduire la douleur et souffrance des animaux liées aux tests d’exploration de la fonction musculaire - Choix de tests non invasifs pour analyse in vivo de la fonction musculaire, - Prélèvement de sang effectué sous anesthésie générale, - Observation quotidienne des animaux : définition de points d’arrêts anticipés pour identification des souris souffrantes (aspect et comportement général, poids…), exclusion du protocole et euthanasie des animaux ayant atteints ces points d’arrêt. Liste des actions pour réduire l’angoisse des animaux tout au long du protocole - condition d’hébergement selon réglementation, - réalisation des tests fonctionnels et prélèvements dans une salle d’expérimentation différente de la salle d’hébergement, - familiarisation des animaux avec dispositifs expérimentaux avant les essais, - renforcement positif : récompense de l’animale suite à la réalisation des essais, - un expérimentateur et un soigneur dédiés.

Choix des espèces

Le modèle animal est le seul permettant une évaluation de la fonction motrice dans sa globalité. Au stade préclinique, ce modèle permet également de voir non seulement les effets d’un composé sur le système ou une fonction d’intérêt mais également les effets sur l’ensemble de l’organisme. La souris est également un bon modèle pour ce type d’étude incluant de nombreux tests in vivo d’exploration fonctionnelle du fait de sa docilité et de son aptitude à effectuer les différents exercices. Aussi, sa longévité en fait un modèle de choix pour l’analyse des conséquences du vieillissement, modèle validé par des études antérieures. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté en fonction de la nature du projet : Souris de 5-6 semaines pour les souris adultes Souris âgées de de 18 à 24 mois d’âge, pour le modèle d’altération lié à l’âge avec une fonte importante de la masse musculaire (degrés d’atteinte en fonction de l’âge retenu).

Tester une thérapie génique contre les formes neurologiques de la maladie de Gaucher : 488 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. Les unes servent de donneuses et reçoivent cinq injections quotidiennes destinées à enrichir leur moelle en cellules souches sanguines. Les autres en reçoivent quinze, réparties en trois séries de cinq jours, plus une greffe sous anesthésie et jusqu'à trois prélèvements sanguins à l'œil. Le porteur décrit une fatigue et une perte de poids qui durent de quinze jours à trois semaines, et précise que les souris porteuses de la mutation "restent en bonne santé et ne présentent pas de troubles neurologiques graves", précisément ce que le projet vise à traiter.

Objectifs

La maladie de Gaucher est la plus fréquente des maladies dites "lysosomales". Elle touche environ une personne sur 50 000 dans le monde. Ces maladies se caractérisent par un problème dans le fonctionnement de cellules, qui n’arrivent plus à éliminer certaines substances. Ces substances s’accumulent alors et peuvent provoquer des dégâts, en particulier dans des organes comme le foie, la rate ou les os. Dans la maladie de Gaucher, ce dysfonctionnement est causé par la mutation du gène responsable de la fabrication d’une enzyme impliquée dans la dégradation des lipides. Quand cette enzyme ne fonctionne pas bien, les lipides s’accumulent dans certaines cellules. Il existe plusieurs formes de la maladie. La forme la plus courante, le type 1, touche surtout les organes internes et les os. D’autres formes, plus rares, comme les types 2 et 3, affectent aussi le cerveau. Le type 2 provoque des troubles neurologiques graves dès la naissance, et le type 3 entraîne des problèmes progressifs chez l’enfant ou l’adulte. Malheureusement, les traitements actuels ne parviennent pas à soigner ces troubles du cerveau. Ce projet vise à tester dans un modèle murin, un nouveau traitement pour les formes neurologiques de la maladie, en particulier la forme de type 3. L’idée est d’utiliser une approche de thérapie génique : on prélève des cellules souches du sang, on les modifie en laboratoire pour qu’elles produisent une version efficace de l’enzyme, puis on les réinjecte dans l’organisme. Les cellules corrigées pourront se rendre jusque dans le cerveau et y apporter l’enzyme manquante. Cela permettrait non seulement de traiter les symptômes dans les organes et les os, mais aussi d’agir sur les atteintes du cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de la thérapie génique à corriger les défauts neuronaux dans la maladie de Gaucher en restaurant l’activité enzymatique déficiente dans les cellules cérébrales. Cette approche thérapeutique pourra être ensuite appliqués à l’Humain.

Procédures

Animaux donneurs des cellules souches sanguines : - Injection en vigile (souris éveillée) une fois par jour (quelques secondes) durant 5 jours d’une molécule permettant d’enrichir la moelle en cellules souches sanguines. Animaux receveurs des greffes de cellules souches sanguines : - Injection (quelques secondes) en vigile une fois par jour pendant cinq jours d’une molécule permettant une bonne prise de greffe des cellules souches sanguines. - Greffe des cellules souches du sang : 1 injection qui ne dure que quelques secondes et qui est réalisée sous anesthésie et analgésie. - Injection (quelques secondes) en vigile une fois par jour pendant cinq jours d’une molécule permettant une bonne colonisation du système nerveux central par les cellules greffées. - 3 prélèvements sanguins maximum (quelques secondes)

Impact sur les animaux

Injections nécessaires à une bonne prise de greffe et une bonne colonisation du système nerveux central : ces injections provoquent une brève douleur ainsi qu’un stress dû à la manipulation des animaux. Par ailleurs, ils peuvent entrainer une perte de poids et provoquer une fatigue des animaux entre15 jours et 3 semaines après l’injection. Intervention pour enrichir la moelle en cellules souches sanguines: L’injection durant 4 jours provoque du stress et une douleur au moment de l’injection (quelques secondes). Injection des cellules souches sanguines : L’injection intra-veineuse de cellules souches du sang dure quelques secondes, et se fait sous anesthésie générale. Cependant, il y a un risque d’infection. Expression de l’enzyme : l’expression de l’enzyme devrait avoir un effet bénéfique. En revanche, on ne peut exclure qu’elle produise des effets secondaires non prévisibles. Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin entraine un stress dû à la contention, une brève douleur à l’œil ainsi qu’un risque d’infection.

Devenir

Il est prévu d’euthanasier tous les animaux afin de pouvoir analyser différents organes et quantifier l’activité de l’enzyme étudiée et de ses substrats.

Remplacement

La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines ainsi que la colonisation du cerveau par certaines cellules transplantées sont des phénomènes complexes. Il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer ces phénomènes et les processus physiologiques mis en jeu lors de l’’implantation, de la survie, de la différenciation et de la colonisation des cellules. La transplantation chez un modèle animal est la seule façon aujourd’hui d’évaluer la capacité des cellules souches sanguines modifiées à se loger dans la moelle osseuse, reconstituer le système sanguin à long terme, atteindre le cerveau des receveurs et exprimer la molécule thérapeutique.

Réduction

Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des vecteurs de thérapie génique exprimant l’enzyme étudiée dans des systèmes de culture in vitro. Seuls les vecteurs permettant la sécrétion par les cellules modifiées de cette enzyme capable d’être réabsorbée par des neurones et ne générant pas de toxicité cellulaire seront évalués in vivo. Afin que les résultats soient statistiquement significatifs tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés pour répondre à la question scientifique posée, les logiciels ainsi que notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines montre que le nombre d’animaux minimum requis est de 8 par groupe.

Raffinement

Pour limiter au maximum les nuisances sur les animaux, la greffe de cellules souches du sang sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Suite aux injections nécessaires à une bonne prise de greffe et une bonne colonisation du système nerveux central et à la greffe cellulaire, les souris seront examinées quotidiennement et une grille de d’évaluation sera remplie. Des points limites adaptés ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Au bout d’un mois, les souris continueront d’être observées une fois par semaine en plus de la visite journalière des animaliers afin de continuer à remplir la grille d’évaluation et de pouvoir intervenir en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris ont un système sanguin très proche de celui de l’être humain. C’est pourquoi elles sont souvent utilisées pour tester des greffes de cellules souches sanguines et pour évaluer l’efficacité de nouvelles approches de thérapie génique. Dans ce projet, on utilise des souris porteuses d’une mutation qui imite la maladie de Gaucher. Elles ont un déficit de l’enzyme, comme les patients, mais elles restent en bonne santé et ne présentent pas de troubles neurologiques graves. Elles nous permettront d’évaluer si les vecteurs de thérapie génique permettent aux cellules modifiées de produire suffisamment d’enzyme, vérifier si elle est bien sécrétée, et voir si cela permet de diminuer les substances anormales qui s’accumulent dans le cerveau et les autres organes. Les expériences seront faites chez de jeunes souris adultes, afin d’être dans des conditions où la prise de greffe est optimale.

1 300 cochons, moutons, bovins et chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation d'un dispositif vasculaire, parfois précédée d'une seconde intervention destinée à lui créer la lésion à traiter, par section d'un nerf, découpe de tissu ou ligature d'un vaisseau. Ces opérations peuvent durer plusieurs heures et s'accompagnent d'une mise à jeun de douze à seize heures, de prélèvements de sang hebdomadaires et d'une douleur postopératoire que le porteur annonce sur plusieurs jours. La mise à mort finale sert à ouvrir les corps pour évaluer la tolérance et la durabilité des implants, dans un cadre que le porteur présente comme une "obligation règlementaire" pour la mise sur le marché de dispositifs médicaux.

Objectifs

Le système vasculaire comprend les réseaux artériels et veineux qui, reliés à la pompe cardiaque, permettent de faire circuler le sang dans l'ensemble de l'organisme et d'assurer la perfusion de tous les organes. La circulation veineuse est connectée avec le réseau des vaisseaux lymphatiques qui vient s'y déverser avant le coeur. Les pathologies vasculaires telles que les thromboses, les sténoses, les anévrismes, les traumatismes, etc... avec leurs conséquences telles que les accidents vasculaires cérébraux ou l'infarctus du myocarde représentent un enjeu majeur pour la santé publique et constituent une préoccupation croissante avec l’augmentation des populations à risque liée au vieillissement de la population, à la sédentarité et aux nouveaux modes de vie. L’implantation ou la mise en oeuvre de techniques et dispositifs médicaux vasculaires (endoprothèses, filtres, stents, delivery systems, cathéters, ballons et guides ou encore dispositifs pour embolisation ou pour thrombectomie par exemple) sont des approches thérapeutiques indispensables pour soigner ces maladies mais aussi pour permettre un accès régulier au compartiment vasculaire (exemple des chambres implantables pour dialyses ou chimiothérapies). Avec le développement de nouvelles technologies, les limites des actes chirurgicaux sont sans cesse repoussées avec le souci permanent de réduire le traumatisme chirurgical et les complications, de raccourcir les temps opératoires et les phases de récupération. La chirurgie mini-invasive, la chirurgie assistée par la robotique, la chirurgie transluminale, la chirurgie endovasculaire, la chirurgie vasculaire sous coelioscopie sont autant d’exemples qui illustrent ces avancées et la transformation de la pratique de la chirurgie vasculaire. Ce projet de recherche a pour objectif le développement et l'évaluation de nouveaux dispositifs et techniques pour le traitement des affections vasculaires au niveau des coronaires, des vaisseaux périphériques et des vaisseaux cérébraux."

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif vasculaire avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif vasculaire associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins, 12 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion nerveuse, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux : recours systématique à l’anesthésie générale avec prise en charge de la douleur durant les interventions d’imagerie, pendant et après les procédures chirurgicales, utilisation de tapis chauffants et suivi du réveil. La réalisation des examens d’imagerie sur le site même des animaleries permet de réduire au maximum le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - Le système vasculaire du mouton, du porc et du chien reproduisent fidèlement les réactions vasculaires humaines et le processus de cicatrisation des vaisseaux est similaire à celui observé chez l'homme. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements angiographiques et échographiques standards. - Chez l'ovin, la taille des veines iliaques externes est comparable à celle des humains. - Le modèle porcin est pertinent pour l'évaluation de la thrombogénicité des dispositifs. - Les débits et les volumes dans la veine cave inférieure ou les veines jugulaires du canidé peuvent être similaires à ceux des veines fémorales humaines, la structure hémodynamique des veines est similaire à celle des veines fémorales humaines. - Le modèle veau est pertinent pour les endoprothèses aortiques complexes. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Les souris de ce projet développent seules une maladie neurologique, avec perte de poids, retard de croissance, faiblesse musculaire et troubles de l'équilibre ou de la marche. 180 d'entre elles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tuées à un âge choisi ou dès qu'un point limite est atteint, pour que leurs organes soient examinés. Le porteur écrit pourtant que "les animaux ne vont pas subir d'intervention", la procédure consistant à les laisser tomber malades et à les observer. Leurs géniteurs, eux, retournent à l'accouplement pour produire d'autres animaux atteints.

Objectifs

Il existe plus de 1 000 maladies neurologiques d'origine génétique, dont plus de 500 affectent l’appareil neuromusculaire. La grande majorité d’entre elles ne disposent d’aucun traitement. Pour une fraction significative des cas (>30 %), l'origine moléculaire reste inconnue. L'objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux modèles de maladies neurogénétiques apparaissant spontanément chez les souris de laboratoire élevées couramment pour d'autres projets. L’identification des défauts moléculaires chez la souris est partiellement facilitée par l’uniformité du fond génétique des souris de laboratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’identification des nouveaux défauts moléculaires responsables de maladies neurologiques utilisables comme nouveaux modèles de maladie neurologique pour la recherche biomedicale. L’identification de nouveaux modèles de maladies neurogénétiques est une étape indispensable pour progresser dans la compréhension des mécanismes des maladies et pour favoriser le développement de nouveaux traitements.

Procédures

Les animaux ne vont pas subir d'intervention. Ils seront suivis régulièrement afin mettre en évidence l'apparition ou non de phénotypes dommageables puis ils seront mis à mort dès qu'ils atteindront l'âge requis pour un prélèvement d'organes post-mortem ou s'ils atteignent les points limites établis dans cette procédure. Leurs géniteurs seront remis en accouplement afin de générer d'autres animaux malades.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet pourront développer des problèmes neurologiques se manifestant avec une perte de poids, un retard de croissance, une faiblesse musculaire, des troubles locomoteurs ou de l'équilibre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure et prélevées à différents âges pour vérifier les changements histologiques et biochimiques associés à leur pathologie.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car les modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire des problèmes neurologiques.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser, en nous limitant à utiliser seulement la fratrie, ainsi que les géniteurs des animaux développant des nouveaux phénotypes neurologiques d’apparition spontanée qu’on avèrera être d’origine génétique. Les fratries composées d'aucun animal à phénotypes dommageable ne seront pas étudiées.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En cas d’apparition de symptômes, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Si l'état des animaux atteint les points limites fixés, ils seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies neurologiques humaines, car l'organisation de son système nerveux est très similaire à celles de l'homme. A priori, il est impossible de savoir si les nouvelles souches auront une diminution de l’espérance de vie. Il est donc impossible d'établir à quel âge les animaux vont développer un phénotype neurologique, quel phénotype neurologique, ni si cela sera sévère. Il sera nécessaire de poursuivre une étude d’observation clinique dans le temps pour déterminer ces éléments. Les souris seront utilisées à divers stades post-naissance, avant qu’elles ne développent les points limites définis.

Un gavage ou une injection par jour, jusqu'à dix semaines d'affilée : 269 souris porteuses de la mutation de la progéria vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi des prélèvements sanguins et des électrocardiogrammes sous anesthésie, et des tests d'agrippement qui mesurent la perte de force musculaire. Le projet teste une molécule sur une lignée portant la mutation sur un seul chromosome, plus proche en cela de la maladie humaine que celle utilisée jusqu'ici. Le porteur retient cette lignée parce que ses signes cliniques apparaissent plus tard et restent moins sévères en début de vie, ce qui simplifie aussi la constitution des groupes.

Objectifs

Ce projet fait suite à une étude qui visait à évaluer l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS), maladie génétique extrêmement rare qui se déclare dès l’enfance et conduit à un vieillissement prématuré et une mortalité précoce. Nos études ont été réalisées sur un modèle souris portant la mutation responsable de la pathologie sur les 2 chromosomes, récapitulant le tableau moléculaire et clinique de la pathologie humaine, avec notamment un tableau clinique post-natal évoluant en quelques semaines (premiers signes cliniques à 9 semaines d'âge), permettant de tester rapidement l’efficacité d’une molécule sur plusieurs paramètres. Grâce à ce modèle, nous avons pu obtenir des données pré-cliniques dans plusieurs organes d’intérêt et définir les doses minimales permettant d'obtenir un effet thérapeutique. Cela n’aurait pas été possible avec le modèle ne portant la mutation que sur un seul chromosome, qui ne présente les premiers signes cliniques qu'à l'âge de 41-42 semaines. Cependant, la mutation n'est présente que sur un seul chromosome en clinique humaine. Il nous semble donc pertinent d’utiliser le modèle souris avec la mutation sur un seul chromosome pour nous rapprocher davantage des conditions humaines. L’utilisation de ces souris présente plusieurs avantages : 1) La constitution des groupes de souris sera plus simple et rapide; 2) Le tableau clinique est moins sévère en début de vie, réduisant les impacts sur les animaux; 3) Les quantités de protéines toxiques étant moins importantes, il sera possible de comparer plus facilement différentes voies d'administration, tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires. MODIFICATION: les doses et fréquences de traitement ont été ajustées en fonction des études préliminaires pour se placer dans des conditions thérapeutiques optimales, sans aucun signe de toxicité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra : - d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine, dans un modèle de souris portant la mutation sur un seul chromosome; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule Prodrug et de comparer les résultats obtenus ceux obtenus dans la modèle portant la mutation sur les 2 chromosomes, étudié précédemment. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir une preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.

Procédures

Injections ou gavage oral (1X/jour ou 2X/semaine, MODIFICATION: ou 1X/semaine, sur une durée maximale de 10 semaines; durée de chaque administration: environ 1min). Prélèvements sanguins (sous anesthésie, durée 3-5 min par prélèvement). Mesure de la composition corporelle, méthode non-invasive (3 fois; durée 3 min). Test d'agrippement, méthode non-invasive (3 fois; durée 5 min). Analyse cardiaque par électrocardiographie ECG (3 fois, sous anesthésie; durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle animal utilisé présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris portant la mutation sur un seul chromosome présentent un léger décrochage dans les courbes de poids à partir de 32 semaines, puis une perte de poids plus importante à partir de 41-42 semaines, accompagnée d'une baisse de la force musculaire et d'une diminution de la fréquence cardiaque. La moyenne de survie de ces souris est de 47 semaines environ d'après la littérature. Après raffinement, notamment l'ajout de nourriture en gel, la perte de poids devrait être limitée, sachant que les procédures seront réalisées avec des animaux de moins de 42 semaines, donc avant apparition des signes cliniques sévères (à 45 semaines). Les animaux subiront des injections, induisant une douleur légère de courte durée; ou des gavages, de douleur légère de courte durée liée à la contention et pouvant potentiellement entrainer des irritations; des pesées, sans douleur hormis la préhension pour sortir l'animal de la cage (test non invasif); des prélèvements sanguins, de douleur légère, pouvant potentiellement entrainer une baisse du volume sanguin; des mesures de la composition corporelle, de douleur très légère liée à la contention (test non invasif); des tests d'agrippement, de douleur très légère liée à l'agrippement en soi sur une grille (test non invasif); et des analyses cardiaques par ECG, de douleur légère liée à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses protéiques. Les animaux utilisés pour réaliser les croisements seront gardés en vie, puis euthanasiés à l'age de 6 mois maximum.

Remplacement

Notre projet s’inscrit dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients HGPS. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes métaboliques qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie de la progéria. Le seul mammifère modèle de la maladie qui nous permet de réaliser des essais pré-cliniques en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme est la souris. Il existe aussi un modèle de porc, cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’analyse de l’efficacité précoce comporte 8 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement. La deuxième cohorte destinée à l’évaluation de différentes voies d'administration comporte également 8 animaux par groupe. Enfin la dernière cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, paramètres cardiaques), qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adéquats (mesures simples ou répétées). Pour l’ensemble des cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, l’apparence physique. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas d’inflammation des yeux, les animaux seront traités avec une crème ophtalmique, 1 à 2 fois par jour pendant minimum 5 jours). En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray cutané seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine et observés quotidiennement. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gel, facile à ingérer par les souris afin d’éviter toute malnutrition. Lors des prélèvements sanguins, une compensation du volume prélevé sera effectuée avec du sérum physiologique.

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de la pathologie HGPS, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Les animaux seront traités de l’âge de 5 à 7 semaines dans les études de pharmacocinétique et d'évaluation de l'effet du traitement sur la quantité de protéine toxique. Nous utiliserons des animaux de 32-42 semaines pour évaluer l'effet du traitement sur les symptomes cliniques qui commencent à apparaitre à 41-42 semaines environ, hormis un léger décrochage dans la courbe de poids qui peut être noté à partir de 32 semaines. Nous utiliserons des animaux hétérozygotes agés de 8 semaines a minima pour générer les cohortes expérimentales.