Autres troubles humains

Une prothèse en dérivé plastique est implantée dans le diaphragme d'agneaux nouveau-nés, sous anesthésie générale, avec une prise de sang pendant l'opération puis deux autres à J2 et J10. 30 agneaux sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le protocole mobilise des brebis gestantes qui ne figurent pas dans le décompte. Le RNT annonce une évaluation à dix jours et à trois mois, décrit une IRM réalisée à trois mois après la mise à mort, puis situe cette mise à mort dix jours après l'opération. Tous sont tués pour prélever la prothèse et les tissus qui l'entourent, afin de juger de son intégration avant un éventuel essai chez l'enfant.

Objectifs

1/Evaluation de la réaction de l’hote à la prothèse in situ chez le gros animal (agneau) à 10 jours et 3 mois. Une équipe de recherche a mis au point une prothèse diaphragmatique adaptée aux populations pédiatriques atteinte de hernie diaphragmatiques : une membrane en dérivé de plastique très résistante. Celle-ci a déjà réalisé les tests biologiques in vitro pour l'évaluation de la toxicité, de la réponse inflammatoire et de colonisation cellulaire. Notre objectif est l’évaluation in vivo de l’implantation de la prothèse diaphragmatique sur des agneaux sains. Des analyses microscopiques des explants seront réalisées pour décrire l'intégration de la prothèse dans l'hôte. Cette expérience nous permettra d’analyser la tolérance clinique, la sécurité de l’implantation, l’inflammation de la prothèse lors de l’implantation. A notre connaissance, c’est actuellement la seule étude en cours pour étudier l’implantation de cette nouvelle prothèse en dérivé de plastique très résistante.

Bénéfices attendus

Développement d’une prothèse en dérivé de plastique très résistante actuellement non existante sur le marché potentiellement plus adaptée à la croissance de l’enfant. Amélioration de la prise en charge de la hernie diaphragmatique de forme grave.

Procédures

Chaque agneau sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale pour la pose de la prothèse avec une prise de sang. Puis chaque agneau aura deux prises de sang (J2 et J10) après l'opération. Le bilan sera réalisé sous contention avec pose d’un patch anesthésique, une échographie sera réalisée sur le même temps. Tous les animaux à 3 mois, après une technique de mise à mort, auront une IRM.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu sera la douleur modérée pendant et suite à la chirurgie de l'agneau, dont la prise en charge de la douleur est optimisée par un protocole anti douleur

Devenir

Tous les agneaux seront gardés en vie à la suite de la procédure 1 qui est une opération sous anesthésie générale afin de poser la prothèse, puis tous les agneaux seont mis à mort en fin de procédure 2 (soit 10 jours après l'opération) afin de faire des prélèvements pour analyser l'impact de la prothèse.

Remplacement

L’implantation de cette nouvelle prothèse nécessite une étape préclinique dans le modèle expérimental chez le gros animal le plus utilisé dans cette pathologie rare, à savoir l’agneau, avant la mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’homme, il n’y a donc pas de mesures de remplacement possible dans le cadre de ce projet de recherche.

Réduction

Les agneaux seront leur propre témoin ce qui limitera le nombre d’animaux nécessaires pour le protocole. Les jumeaux seront utilisés comme groupe témoin en comparant la prothèse en dérivé de plastique très résistante à la prothèse de référence/sans mise en place de plaque.

Raffinement

Chaque brebis arrive une semaine avant son terme afin de s'acclimater à son nouvel environnement. Les brebis sont livrées au minimum par 2 afin de réduire le stress du transport. Les brebis sont hébergées à plusieurs en permanence dans les box et aucune brebis ne sera seule hébergée afin de réduire le stress lié à la solitude. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale avec une sédation avant et pendant l'opération afin d'avoir une prise en charge optimale de l'animal. Les animaux bénéficieront également de protocoles antalgiques adaptés tout au long de leur prise en charge opératoire.

Choix des espèces

Le modèle animal doit avoir des caractéristiques morphologiques et physiologiques proches du modèle humain. C’est le cas de la brebis, qui est un mammifère avec une gestation de singleton ; jumeaux ou triplet. Le poids de l’agneau sont proches de ceux du fœtus humain. Sa taille est suffisante pour permettre la pose de cathéters vasculaires, une chirurgie en période néonatale. Des études sur plusieurs jours sont possibles chez l’agneau chroniquement instrumenté, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par projet. Enfin, plusieurs modèles d’agneau instrumenté ont déjà été décrits dans la littérature et nous permettent de justifier la pertinence de notre choix. Notre protocole de recherche porte sur la réparation de la hernie diaphragmatique en période néonatale donc nos animaux utilisés est l’agneau nouveau-né. Il est donc nécessaire d’utiliser des brebis gestantes. Notre expérimentation aura au terme soit vers J 145. Cet âge est nécessaire pour que le nouveau-né soit suffisamment gros pour la chirurgie, pour la pose de cathéters vasculaires (3000-3500 g) et pour limiter les risques de perte per opératoire.

Brûlés en quatre endroits sous anesthésie générale à J0, opérés trois heures à J2 pour un prélèvement de peau et une autogreffe sur les zones brûlées, 16 cochons de deux mois enchaînent ensuite les changements de pansement tous les deux ou trois jours jusqu'à J28. Chaque séance se fait sous anesthésie, avec des biopsies au punch à J11, J14 et J18 et sept prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés séparément après la brûlure, pour qu'ils ne s'arrachent pas les pansements entre eux. Au vingt-huitième jour ils sont tués, les greffons et les plaies excisés pour l'histologie, les organes et le sang prélevés pour la toxicologie.

Objectifs

Cette nouvelle version constitue une demande d’amendement-1 au projet pour poursuite de l’étude. Ce projet a pour objectif de développer un nouveau protocole thérapeutique pour la cicatrisation du site donneur de greffe et la prise de greffe en associant un hémostatique cicatrisant issu des algues et une biothérapie à base des sécrétions des cellules souches.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de développer et de démontrer l'efficacité d’un pansement innovant in vivo, préalable à une étude clinique chez l'Homme.

Procédures

L’utilisation d’un nouveau pansement nécessite la modification du projet initial avec ajout de 6 animaux. Notre projet prévoit l’utilisation de 16 porcs sur une unique procédure expérimentale de 28 jours reproduisant la prise en charge classique des grands brûlés : 1. J0 : sous anesthésie générale quatre brûlures et pose de pansement seront réalisées (45min) 2. J2 : sous nouvelle anesthésie générale, intervention chirurgicale au niveau de la brulure, prélèvement de peau et autogreffe de peau sur les zones brûlées, pose pansement (3h). 3. Sous anesthésie changement de 8 pansements : 4 brûlures + autogreffe et 4 sites donneur tous les 2/3 jours de J2 à J28 (1h). 4. Sous anesthésie et au moment du changement de pansements : biopsies punch sur sites brulés + autogreffe à J11, J14, J18 et prélèvements sanguins à J0, J2, J4, J7, J14, J21, J28 (1h 30). 5- Au 28ème jour l’euthanasie des porcs sous procédure complète d’anesthésie générale (1h).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux pourraient inclure : •Douleur au site de brûlure •Possibles douleurs, inconfort ou gêne au niveau des sites d’auto-greffe et des sites donneurs de peau après la chirurgie. •Risques de complications chirurgicales telles que l'infection des plaies ou les saignements. •Effets secondaires systémiques liés à l'anesthésie générale et ou aux médicaments administrés pendant les procédures chirurgicales et pour la gestion de la douleur post-opératoire. •Hébergement isolé des animaux au sein d’une même pièce, après la brûlure pour éviter les risques d’arrachement/ grignotage des pansements entre congénères.

Devenir

Au 28ème jour les porcs seront euthanasiés sous procédure complète d’anesthésie générale pour prélèvement des greffons cutanés traités avec les pansements. Les plaies seront excisées/collectées en post-mortem pour des analyses histologiques et les principaux organes ainsi que le sang seront prélevés pour des analyses toxicologiques.

Remplacement

Les effets des produits de sécrétion et du pansement ont été préalablement étudiés sur des modèles cellulaires in vitro. De plus, la cicatrisation cutanée a été évaluée sur un modèle d’exérèse de peau chez la souris et les analyses histologiques montrent un tissu de granulation plus épais à jour 8 des plaies traitées avec la nouvelle compresse par rapport aux souris contrôles. Cependant ce modèle murin présente des limites notamment le processus de cicatrisation qui se réalise par contraction et non par ré-épithélialisation comme chez l’Homme. De plus, s’agissant de plaies chirurgicales, il ne récapitule pas les conditions inflammatoires pathologiques de la brûlure. Ainsi ce projet se propose de passer sur un modèle grand mammifère plus proche de l’Homme afin de mettre en évidence les bénéfices du traitement sur les blessures par brûlure ayant subi une greffe de peau. Le remplacement par d’autres modèles biologiques n’est pas possible ici car seuls les modèles animaux rendent compte de l’ensemble des mécanismes mis en jeu au niveau cutané et systémique pour la cicatrisation.

Réduction

Après une analyse statistique tenant compte de divers facteurs tels que la puissance statistique, la variabilité attendue des résultats et les objectifs spécifiques de l'étude, nous avons déterminé qu'un groupe de 8 porcs serait suffisant pour obtenir des résultats significatifs et fiables tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés, conformément aux principes de la Stratégie de Remplacement, de Réduction et de Raffinement (3R). En plus des 8 porcs, nous avons prévu 2 animaux (10 porcs au total) pour une première partie procédure servant d’étude pilote. Elle aura pour objectif d’évaluer la faisabilité de l’expérience, d’entrainer les chirurgiens aux gestes techniques et de préciser les temps de suivi et d’analyse pour apprécier les capacités de prise de greffe et de cicatrisation après traitement. Si ce groupe pilote montre des résultats satisfaisants, la totalité des 10 animaux ne sera pas utilisée, mais seuls 8 animaux seront utilisés. Suite à ce 1er groupe, un second groupe de n=6 animaux, pourra être ajouté de façon à poursuivre l’étude en tester des améliorations techniques au niveau du pansement. Si les résultats sont satisfaisants, la totalité des 6 animaux ne sera pas utilisée. Dans tous les cas, le nombre d'animaux a été réduit au maximum en considérant que chaque animal est son propre contrôle.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au raffinement dans l’hébergement et dans la prise en compte des souffrances de l’animal. La température de la pièce sera maintenue à la même température que chez l’éleveur et l’alimentation sera poursuivie telle que chez l’éleveur de façon établir une continuité et diminue le stress thermique et alimentaire. Une alimentation humidifiée sera apportée aux animaux douloureux pour faciliter la prise alimentaire. De plus une attention particulière sera apportée au confort digestif des animaux par apport d’argile blanche et de pansement gastrique. La procédure se déroulera sous anesthésie générale et des antalgiques seront utilisés pour diminuer la douleur et apaiser les animaux et ils seront installés sur des tapis chauffants. Les pansements effectués tous les 2 jours se feront également sous sédation, et une évaluation de la douleur sera réalisée chaque jour afin d’optimiser l’analgésie si nécessaire. Il est important de souligner que toutes les nuisances et effets indésirables seront surveillés de près et traités de manière appropriée pour assurer le bien-être et le confort des animaux participant à l'étude. Enrichissement du milieu : Enrichissement diversifié et en rotation (jouets, luzerne compactée pour fouissage…) seront à disposition pendant toute la phase d’expérimentation, conformément aux moyens disponibles dans l’animalerie. Les animaux seront hébergés collectivement pendant la phase d’adaptation. Après début de la phase expérimentale à proprement parler, les animaux seront séparés pour permettre le déroulement des expérimentations dans de bonnes conditions. Un hébergement collectif n’est pas possible durant cette phase à cause des risques d’arrachement des pansements avec des comportements de grignotage des pansements entre congénères. Les porcs seront cependant hébergés au sein d’une même pièce, dans des boxes accolés avec contact olfactif, visuel et auditif.

Choix des espèces

Nous utiliserons des porcs mâles âgés d'environ 2 mois, car à cet âge, leur peau a une épaisseur similaire à celle des humains, ce qui facilite la comparaison des résultats. De plus, leur poids autour de 40 kg, rend la réalisation des expériences plus pratique. Ce modèle porcin partage de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Par exemple, la peau des porcs a une épaisseur et une distribution des vaisseaux sanguins similaires à celle des humains. Ces caractéristiques font du porc un choix idéal pour étudier l'efficacité de notre nouveau pansement sur la cicatrisation après des brûlures, car il se rapproche davantage de la situation clinique chez l'homme.

Nées avec une mutation qui réduit leur poids dès le sevrage, des souris modèles d'une maladie mitochondriale deviennent apathiques entre un mois et un mois et demi, et certaines perdent brutalement du poids puis s'isolent entre quatre et sept mois. Une échographie cardiaque sous anesthésie générale, un test sur tapis roulant et cylindre rotatif, une IRM cérébrale de trente à soixante minutes, deux administrations orales par jour pendant deux mois et trois prélèvements de sang à la veine submandibulaire jalonnent le protocole appliqué à 2 720 animaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range en sévérité modérée les seules nuisances liées aux gestes expérimentaux et décrit à part la dégradation due à la mutation, tout animal isolé dans sa cage ou ayant perdu plus de 20 % de son poids étant mis à mort. Les reproducteurs sont gardés pendant leur phase reproductive, de deux à six mois, puis tués comme tous les autres.

Objectifs

Les mitochondries jouent le rôle essentiel de centrale énergétique dans nos cellules. Les maladies mitochondriales regroupent de nombreuses pathologies héréditaires qui résultent d'un dysfonctionnement du métabolisme énergétique mitochondrial. Ces pathologies ont été associées à de nombreux symptômes incluant désordres du mouvement, cécité, surdité, épilepsie, accidents vasculaires, atteintes cardiaques ou encore neurodégénérescence. Les maladies mitochondriales peuvent débuter à tout âge, de la naissance, dans l'enfance et chez l’adulte jeune. A ce jour il n’existe pas de traitement curatif pour ces maladies. De ce fait, la recherche dans ce domaine des thérapies pour ces maladies mitochondriales est capitale. Nous avons identifié des médicaments candidats pouvant améliorer le fonctionnement des mitochondries. Certaines de ces molécules prometteuses ont été ensuite testées sur des cellules de peau de patients de maladies mitochondriales. Afin de tester les effets bénéfiques de ces médicaments sur un modèle in vivo, nous avons généré des souris présentant une mutation retrouvée chez des patients humains. Notre objectif principal pour ce projet est donc de caractériser en profondeur la pathologie de ces souris et valider l'efficacité des médicaments candidats identifiés, qui pourront ensuite être testés chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet est justifié d'un point de vue scientifique, car il propose d'étudier les effets de médicaments candidats dans les maladies mitochondriales, maladies qui ne bénéficient pas actuellement de traitements curatifs. Le développement d’une médecine mitochondriale est fortement compromis par l’absence de thérapies efficaces avec un nombre limité d'essais cliniques à ce jour. Raison pour laquelle la recherche sur les pathologies mitochondriales humaines s’oriente aujourd'hui résolument vers la thérapeutique. La présence de mutations pathogènes mitochondriales est responsable de maladies mitochondriales sévères et souvent fatales. Ainsi, déterminer l’impact de plusieurs médicaments pourrait permettre de restaurer le fonctionnement mitochondrial, apparaissant comme un objectif important, qui pourrait déboucher sur des essais cliniques pour les patients souffrant de maladies mitochondriales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (30 minutes, 1 fois); Test de la fonction motrice sur tapis roulant et cylindre rotatif (durée variable en fonction des performances des animaux); Imagerie par Résonance Magnétique du cerveau (sous anesthésie, durée 30 à 60 minutes, 1 fois); Administration par voie orale par pipette du médicament supplémenté d’une solution appétante ayant pour but que les souris viennent spontanément prendre le médicament (gavage si nécessaire à l'aide d'une sonde adaptée dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par la technique d’administration orale par pipette ou si la solution appétante ne faciliterait pas le processus) (2 fois par jour pendant 2 mois) et un prélèvement sanguin au niveau de la veine faciale submandibulaire (5 minutes maximum) à 1.5 mois, 2.5 mois et 3.5 mois (1 fois à chaque temps).

Impact sur les animaux

Les souris des deux modèles, présentant une mutation que nous allons utiliser, sont de nouveaux modèles murins pour lesquels nous décrivons un phénotype pour la première fois. Les effets indésirables de cette mutation sur le modèle se traduit par un poids plus faible dès le sevrage et un comportement apathique qui apparaît entre 1 et 1,5 mois pour le modèle KI/KO et entre 2,5 et 4 mois pour le modèle KI/KI. Nous avons observé qu'entre l'âge de 4 mois et 7 mois, certains animaux présentent une perte de poids brutale et un isolement dans la cage. Les jeunes souris peuvent également parfois présenter une dépilation transitoire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale submandibulaire sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquences sur le bien être de l'animal. Dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par administration par voie orale par pipette, le gavage remplacera cette technique. Celle-ci, si utilisée régulièrement, pourrait entraîner un stress chez l'animal, lié au geste de contention et du geste de gavage, et une irritation de l’œsophage lié à la répétition de l'administration.

Devenir

Les reproducteurs seront utilisés pendant leur phase reproductive (2 à 6 mois) puis mis à mort. Pour toutes les autres expériences prévues, tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires humains tels que les fibroblastes de peau pour répondre à certaines questions scientifiques. Cependant ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans les maladies mitochondriales, puisqu'elles ne tiennent pas compte l’ensemble des interactions biologiques existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour la suite du programme de recherche et pouvoir valider et passer aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Aucune expérience inutile ne sera menée. Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, nos expériences solides des méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental par sexe pour la métabolomique. Pour la biologie moléculaire et l'histologie, des groupes de 8 animaux/génotype sont prévus, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux sans compromettre l'obtention de résultats statistiquement valides.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure de Bien-Etre Animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent, et seront pris en charge selon la grille de points limites suivante: Perte de poids 20% = 3 points Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points Isolement: 3 points. A partir de 1 point, un signalement sur la cage avec le numéro de l’animal concerné sera apposé, de telle sorte à ce qu’il y ait une attention particulière lors du contrôle quotidien pour déceler rapidement toute évolution négative, 2 points, surveillance bi-quotidienne de l'animal concerné, 3 points, l’animal est mis à mort en point limite. Pour les procédures de traitements des animaux, nous utiliserons au maximum, à la place du gavage, la technique dite MDA (micropipette-drug administration) qui consiste à donner oralement par pipette le médicament supplémentée d’une solution appétant pour habituer les souris à venir boire spontanément d’elle-même le médicament. En utilisant cette technique, nous évitons le stress et les irritations possibles par le gavage au niveau œsophage.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le présent projet, la souris que nous utilisons est un modèle de maladie mitochondriale unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des médicaments candidats sur les fonctions mitochondriales dans les tissus habituellement affectés dans ces pathologies, que sont le cerveau, les muscles squelettiques et les coeur. Les animaux utilisés pour la mise en place de l'élevage le seront dans leur phase reproductive (2 mois à 6 mois). Pour la caractérisation de la maladie, les animaux seront utilisés entre les âges de 2 mois et 12 mois. De plus, nous traiterons les souris avec des médicaments candidats de l'âge de 1.5 mois à 4 mois dans la phase d'expérimentation de traitements potentiels.

L'ablation des deux ovaires sert ici à fabriquer un modèle d'ostéoporose post-ménopausique sur lequel seront évaluées de nouvelles molécules candidates. 500 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées et autopsiées à l'issue. Après une chirurgie de 30 à 40 minutes, elles reçoivent des traitements répétés pendant cinq mois, deux injections sous-cutanées de marqueurs osseux et des prises de sang à la jugulaire, sur animal éveillé, jusqu'à une fois par semaine. Le porteur liste parmi les effets possibles des molécules testées des cris, de l'agitation, des difficultés respiratoires, des diarrhées et une nécrose au site d'administration, puis conclut que l'utilisation d'animaux est "indispensable".

Objectifs

Avec l’allongement de l’espérance de vie, l’ostéoporose et les fractures qui lui sont associées représentent un problème de santé publique important : autour de l’âge de 65 ans, on estime que 39% des femmes souffrent d’ostéoporose. En effet, la ménopause est une période clé pour la santé de la femme car elle s’accompagne de modifications physiologiques comprenant, notamment, une modification de la composition corporelle (baisse de la masse maigre et augmentation de la masse grasse) et un changement de la répartition des graisses corporelles conduisant notamment à un risque élevé pour la santé cardiovasculaire, métabolique , ostéo-articulaire et musculaire (perte de densité osseuse, fonte musculaire, …). A ce jour les traitements existants réduisent la perte osseuse mais présentent des effets secondaires importants qui peuvent altérer la qualité de vie des patients. Le présent projet a donc pour but d’évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques pouvant cibler la perte osseuse dans un contexte d’ostéoporose sans induire d’effets néfastes. L’objectif du projet est donc d’évaluer l'effet de nouvelles molécules thérapeutiques sur le processus de formation et de résorption de l’os dans un modèle d’ostéoporose induite par ovariectomie chez le rat (modèle qui consiste à retirer les ovaires de l’animal, mimant l’ostéoporose post-ménopause rencontrée chez l’Homme, décrit et reconnu par la communauté scientifique), afin de proposer aux professionnels de la santé et aux patients des approches thérapeutiques plus appropriées. Ce modèle d’ostéoporose induite par ovariectomie a pour principaux avantages (i) de mimer le développement d’une ostéoporose post-ménopause, avec une reproductibilité élevée pour analyser de manière robuste et efficace les mécanismes mis en jeu dans le développement de la pathologie et dans la réponse induite par les nouvelles molécules thérapeutiques testées (ii) d’accéder à de plus amples informations indispensables au développement de nouvelles approches thérapeutiques (iii) d’être prédictif en clinique de l’activité des nouvelles molécules thérapeutiques testées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. Ce projet permettra à court terme d’obtenir des informations sur (i) la tolérance ou la potentielle toxicité des nouvelles molécules thérapeutiques étudiées au niveau général et osseux (ii) l’efficacité des nouvelles molécules thérapeutiques étudiées dans un contexte d’ostéoporose. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle des modifications physiologiques ayant lieu post-ménopause, d’établir des diagnostics robustes et de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une opération chirurgicale unique réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie pré- et post-opératoire afin de réaliser l’ablation des ovaires. Cette opération dure 30 à 40 minutes par animal. Les traitements à tester seront appliqués plusieurs jours avant et/ou après l’induction du modèle et répétés tout au long de la durée de l’étude, 5 mois maximum après l’ablation des ovaires. Chaque administration dure 1 à 2 min. La fréquence d’administration des traitements sera définie selon le mode d’administration ainsi que selon le ou les nouvelles molécules thérapeutiques utilisées pour chaque étude. Des injections sous-cutanées de produits permettant le suivi de la formation osseuse seront réalisées dans les 2 dernières semaines du protocole. Chaque animal recevra 2 injections à 1 semaine d’écart, chacune durant de 1 à 2 min. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire pourront également être réalisés, ces prélèvements auront lieu sur animal éveillé, dureront moins de 5 min par animal, et pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées au modèle et à l’induction et au développement de l’ostéoporose. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour estimer une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par l’acte chirurgical, tel qu’un traumatisme et une inflammation au niveau de l’incision réalisée pour l’ablation des ovaires. Des nuisances liées aux nouvelles molécules thérapeutiques à tester peuvent être rencontrés, tels qu’une perte de poids, un comportement anormal de l’animal (prostration, état défensif, hérissement des poils, vocalisation anormale, …), une toxicité durant l’administration (cri, agitation, difficultés respiratoires, diarrhées, inflammation/nécrose au site d’administration). Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyés d’une veille bibliographique inhérente aux nouvelles molécules thérapeutiques à tester.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les os, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et synoviaux seront utilisés pour doser le principe actif et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les principes actifs et/ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière générale, les nouvelles molécules thérapeutiques que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des molécules thérapeutiques testées, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies rhumatismale, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes et la complexité de la pathologie. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture in vitro. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs à tester, 10 animaux par groupe et 10 conditions (groupes) au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le raffinement du nombre des animaux. Ce nombre d’animaux a été déterminé à partir de nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif pourra être revu à la baisse après analyse des premiers résultats avant chaque protocole et dans le cas où le traitement évalué est connu (e.g., traitement de référence), afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des traitements anti-douleur dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué ainsi qu’un suivi approfondi au minium 2 fois par semaine, avec prise de poids et observations des caractéristiques spécifiques au modèle, tel qu’un traumatisme et une inflammation au niveau de l’incision réalisée pour l’ovariectomie. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs point(s) limite(s) (repérés le plus précocement possible grâce au suivi clinique et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort (lors de l’administration du traitement expérimental, des prélèvements de sang et lors des prises de mesures).

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car ce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et des réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observées chez l'Homme. Ces rongeurs, étant fréquemment utilisés à des fins de recherche, permettent d’extrapoler assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, leur taille permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ces animaux permettent l’extrapolation des petits animaux aux humains (première dose de principe actif chez l’homme) connue sous le nom de dose équivalente humaine (HED)) dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux molécules thérapeutiques. Les rats femelles et adultes auront dépassé la majorité squelettique (âgés de plus de 10 semaines). Autrement-dit leur squelette ne sera plus en phase de croissance.

Gavées chaque jour pendant vingt et un jours, infectées à J0 par Clostridioides difficile après une injection d'antibiotique, 60 souris âgées de douze à dix-huit mois subissent neuf prélèvements de sang et neuf prélèvements de fèces. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées sous anesthésie profonde après un dernier prélèvement. L'objet déclaré est de vérifier si une souche de Clostridium butyricum réduit la mortalité de cette colite, première cause de diarrhée nosocomiale dans le monde. La rubrique des effets indésirables tient en trois lignes, mentionne des "changements temporaires dans l'appétit ou le comportement" et des effets "potentiellement réversibles", sans décrire ni la diarrhée ni la mortalité que le projet annonce pourtant vouloir réduire.

Objectifs

La colite à Clostridioides difficile est la première cause de diarrhée nosocomiale dans le Monde avec une mortalité élevée. Nous avons, au cours de précédents travaux in vitro, observé une capacité inhibitrice de certaines souches de Clostrdidium butyricum sur la croissance de souches toxinogènes de Clostridioides difficile. Le projet consisite à évaluer l’efficacité et la tolérance de l’administration de Clostridium butyricum par voie orale afin de réduire la mortalité sur un modèle murin de colite à Clostridioides difficile.

Bénéfices attendus

- Identification de C. butyricum comme probiotique potentiel pour prévenir ou traiter les infections à C. difficile. - Contribuer à la recherche sur les mécanismes d'action des probiotiques dans le microbiote intestinal. - Fournir des informations sur l'interaction entre les bactéries bénéfiques et pathogènes dans l'intestin.

Procédures

Les souris seront soumises aux prélèvements suivants : neuf prélèvements sanguins seront effectués aux jours J-6, J-1, puis les jours J1 à J3 après le gavage de Clostridioides difficile, et ensuite aux jours J6, J8, J10 et J14. En parallèle, neuf prélèvements de fèces seront effectués aux mêmes dates. Chaque prélèvement prendra moins de 5 minutes. Par ailleurs, les souris recevront un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution (groupe témoin) depuis J-6 jusqu'à J14, d'une durée maximale de 5 minutes par gavage. Un gavage unique de Clostridioides difficile ou de solution de dilution sera administré au jour J0, également pendant 5 minutes maximum. De plus, les souris recevront une injection d'antibiotique (ou de tampon de dilution pour le groupe témoin) au jour J-1. A la fin de la procédure, pour l’acte d’euthanasie, l’animal sera en contention pour une durée de moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

- Réactions au site d'injection. - Changements temporaires dans l'appétit ou le comportement. - Effets liés à l'infection, potentiellement réversibles avec des soins appropriés.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.

Remplacement

Il s'agirait ici d'une étude préclinique pour confirmer l'effet probiotique de certaines souches de C. butirycum sur l'infection à C. difficile. Nous avons choisi le modèle murin pour la colite à C. difficile comme décrit dans la littérature. Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie.

Réduction

L'outil statistique approprié, utilisé pour notre étude, suggère qu'il faudrait 60 souris au total pour ce projet comprenant 2 procédures. Une étude pilote sera réalisée en première intention sur 20 souris afin de réduire le nombre d'animaux dans l'ensemble de ce projet.

Raffinement

Lors de nos différentes procédures d’infection, les souris seront immobilisées pour une durée de moins de 5 min. A la fin de nos procédures ou en cas d’atteinte d’un point limite, les souris seront anesthésiées avant euthanasie. Un test de réflexe (pincement extrémité patte) sera effectué afin de valider l’anesthésie. En cas de survenue de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplé à ce projet, la température corporelle sera prise et un analgésique pourra être administré. Une surveillance appropriée sera mise en place par du personnel habilité.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie. Nous utiliserons des souris adultes (12 à 18 mois), car elles sont représentatives des conditions humaines en matière de réponse immunitaire et d'infection, ce qui est essentiel pour notre étude sur l'inhibition de C. difficile.

24 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur moelle osseuse. Le nombre vient d'un calcul que le porteur détaille : environ trente mégacaryocytes observables par souris, cent nécessaires par condition, six conditions, donc quatre souris chacune. Elles reçoivent une chimiothérapie qui fait chuter leurs plaquettes, puis une injection de Romiplostim et un prélèvement de sang sous anesthésie. Le porteur décrit la thrombopénie induite comme sans impact sur le bien-être des animaux non-humains en l'absence de saignement, tandis que le bénéfice clinique annoncé, faire progresser la prise en charge des patients sous chimiothérapie, reste renvoyé à plus tard.

Objectifs

Chaque année, en France, environ 370 000 personnes atteintes de cancer reçoivent un traitement de chimiothérapie. Ce traitement provoque fréquemment une forte baisse de la numération plaquettaire, appelée thrombopénie, exposant les patients à des saignements. Ces thrombopénies peuvent avoir des conséquences très graves, notamment des retards dans le traitement du cancer. Les plaquettes sont produites dans la moelle osseuse par les mégacaryocytes. Ce processus est sous l’influence d’une hormone, la thrombopoïétine (TPO). Un médicament prometteur, le Romiplostim, qui imite l'action de la TPO, pourrait aider à traiter la thrombopénie induite par la chimiothérapie. Cependant, la moelle osseuse des patients n’étant pas facilement accessible, on ne connait pas encore son impact réel sur les mégacaryocytes dans la moelle osseuse. L’objectif de cette étude est une analyse quantitative et qualitative de l’état fonctionnel des mégacaryocytes (MK) de la moelle après traitement au Romiplostim, notamment en évaluant l'impact du Romiplostim sur la morphologie des MKs ex vivo à J+8. Pour se faire il sera utilisé 1) un modèle préclinique murin déjà validé par le laboratoire, 2) des souris génétiquement modifiées, sans phénotype dommageable, possédant des mégacaryocytes fluorescents et 3) une approche d'imagerie de pointe, permettant d’imager en temps réel le comportement des mégacaryocytes dans leur environnement natif.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de la PodoPZ des mégacaryocytes. La PodoPZ est une structure présente sur tout le pourtour du mégacaryocyte qui joue un rôle majeur dans la production et la libération des plaquettes dans le sang. Sur le plan clinique, l’impact du Romiplostim en tant qu’analogue de la thrombopoïétine permettra de faire avancer les traitements de restauration de la numération plaquettaire chez les patients sous chimiothérapie. Une thrombopénie est un réel frein au traitement des cancers puisque la seule prise en charge actuelle est de décaler le traitement de chimiothérapie, nuisant ainsi à l’efficacité du traitement anti cancéreux.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 injections et un prélèvement. Une injection sur animal vigile avec une durée de moins d’une minute et une sur animal anesthésié avec une durée de 2-3 minutes. Le prélèvement sanguin s’effectue sur animal anesthésié et dure moins d’une minute. La durée totale de l’anesthésie est d’environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux sont: - Le stress lié à la préhension et contention de l’animal (léger)- La douleur liée aux injections et prélèvements (léger) - La thrombopénie induite par le traitement (léger) - La baisse, éventuelle, du système immunitaire (léger). Concernant le Romiplostim, il n’est pas attendu d’effets indésirables ; au contraire ce dernier devrait améliorer les effets liés au traitement, notamment pour la thrombopénie. La durée de la procédure n’excédant pas 8 jours, il n’est pas attendu d’altération de l’aspect et du comportement des animaux (état corporel, pelage, mobilité, respiration, etc).

Devenir

Les analyses par imagerie auront lieues sur les moelles osseuses des souris, ex vivo. Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre la capacité des mégacaryocyrtes à franchir une barrière vasculaire dans des conditions où le microenvironnement est fortement perturbé par une chimiothérapie. En effet, le franchissement de la barrière vasculaire met en œuvre, simultanément, des interactions entre les mégacaryocytes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Des expériences préliminaires réalisées in vitro sur des mégacaryocytes, indiquent que ces cellules ne franchissent pas naturellement une membrane poreuse. Afin de répondre à nos questions, nous devons travailler sur le fonctionnement du système hématopoïétique (création des cellules sanguines) dans sa globalité ; en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. C’est pourquoi, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’un organisme vivant, en l’occurrence des rongeurs, par une autre méthode.

Réduction

Nous savons par expérience qu'il nous est possible d'observer en moyenne 30 mégacaryocytes par souris en imagerie. Afin d’effectuer des tests statistiques cohérents, nous devons obtenir environ 100 mégacaryocytes par condition. Il nous faut donc 4 souris par condition, qui sont au nombre de 6, ce qui fait un total de 24 souris.

Raffinement

Les animaux étant habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. Pour les injections, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, selon la procédure en vigueur et un anesthésique local ainsi qu’un onguent ophtalmique seront utilisés. Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress lié à la contention. En ce qui concerne la thrombopénie induite par le traitement, en l’absence de saignement, cette dernière est non impactante pour le bien-être animal. Toutefois, nous anticipons tout risque potentiel de saignement, notamment en cas de bagarre, par un enrichissement supplémentaire (tunnel) et un suivi, rigoureux, des animaux sera effectué deux fois par jour. Cela permettra de détecter au plus tôt tout comportement agressif au sein d’une cage. Pour ce qui est du risque lié à la baisse du système immunitaire induite par le traitement, celui-ci est minime ; toutefois les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé qui permettra d’éviter le développement d’une infection. De plus, des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués le cas échéant.

Choix des espèces

Pour ce qui est du choix de l'espèce, la souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir des mégacaryocytes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptées à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à une seule injection), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmacologiques, qui dans notre cas est le Romiplostim. En ce qui concerne le stade de développement des souris : les souris adultes (8–18 semaines, 25–30 g) constituent le modèle le plus adapté car leur système hématopoïétique est pleinement mature, stable et comparable à celui de l’adulte humain, ce qui permet une interprétation pertinente des résultats.