Autres troubles humains

Injection d'un vecteur viral dérivé de l'herpès dans le coussinet plantaire sous anesthésie gazeuse, anti-inflammatoire et antalgique le jour même puis le lendemain, gêne pour se déplacer pendant les deux heures qui suivent. 239 souris immunocompétentes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Sur les études d'un an, chaque animal reçoit dix-sept administrations de luciférine suivies d'autant de séances d'imagerie sous anesthésie, que le porteur qualifie de non invasives et indolores, plus jusqu'à quatorze prélèvements de sang. Toutes sont tuées à l'issue pour quantifier l'expression du transgène dans les ganglions de la racine dorsale, la moelle épinière, le coussinet plantaire et le foie.

Objectifs

Le système nerveux périphérique fonctionne comme un réseau reliant le cerveau et la moelle épinière aux muscles, organes et tissus. Il contrôle les mouvements, les sensations (comme la chaleur ou le froid) et les réactions aux stimuli externes. Les troubles de ce système peuvent entraîner des altérations sensitives et motrices, responsables de pathologies telles des polyneuropathies, des douleurs chroniques, ainsi que des dysfonctionnements organiques comme la vessie neurogène, des troubles gastro-intestinaux (constipation ou diarrhée), des anomalies cardiovasculaires (hypotension orthostatique) ou des perturbations de la sudation. Une approche thérapeutique innovante consiste à utiliser des vecteurs viraux dérivés de l’herpès, modifiés pour être non pathogènes et non réplicatifs. Ces vecteurs modifiés exploitent la capacité naturelle du virus à remonter le long des nerfs, permettant une administration localisée au niveau des zones affectées. Ils sont conçus pour délivrer des gènes spécifiques aux neurones périphériques, notamment ceux situés dans les ganglions dorsaux, centres majeurs de ce réseau. Le projet vise à établir un modèle murin permettant d’analyser la distribution et l’expression d’un transgène transporté par ces vecteurs dans différents organes et sur des périodes prolongées. Pour suivre la localisation et l’efficacité des vecteurs, ceux-ci exprimeront un gène produisant une enzyme générant de la bioluminescence, détectable par imagerie non invasive chez la souris simplement anesthésiée. Cette méthode permettra de visualiser la présence et l’activité des vecteurs sans recourir à des techniques invasives. Ce projet inclut également l’évaluation de versions optimisées des vecteurs ainsi que la corrélation entre la bioluminescence et des marqueurs potentiellement détectables dans le sang. Si cette corrélation est confirmée, le suivi pourra être réalisé par prélèvements sanguins sans nécessiter de bioluminescence dans des projets ultérieurs.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de développer un modèle chez la souris permettant de suivre et d’analyser la pharmacocinétique des vecteurs viraux tout au long de la vie d’un même animal, en ciblant les neurones sensoriels ainsi que certains organes d’intérêt. Ce modèle vise à fournir des données essentielles pour comprendre la distribution, la durée d’action et l’efficacité de ces vecteurs en vue de futurs développements chez l'homme comme approche de thérapie génique contre des pathologies touchant le système nerveux périphérique. À court terme, le projet poursuit deux objectifs majeurs. Le premier consiste à définir les conditions optimales d’administration des vecteurs viraux afin d’obtenir une expression efficace et stable du transgène dans les organes cibles. Le second vise à évaluer l’impact de différents sites et modalités d’injection. Cette comparaison permettra de mieux comprendre le transport rétrograde des vecteurs, leur biodistribution dans les organes cibles tels que les ganglions dorsaux et la moelle épinière, ainsi que dans des organes non-cibles comme le foie. À long terme, ce modèle offrira la possibilité de prédire la durée d’action des traitements basés sur ces vecteurs viraux chez l’humain. Une meilleure compréhension de la pharmacocinétique et de la distribution des vecteurs tout au long de la vie d’un animal constituera ainsi un atout majeur pour le développement de thérapies géniques ciblées, plus efficaces et plus sûres chez l’homme Le projet donne l’opportunité d’évaluer l’activité des vecteurs par la mesure de biomarqueurs circulants en remplacement de la bioluminescence. Si cette approche s’avère concluante, ces analyses contribueront également à réduire le nombre d’animaux utilisés. Il permettra enfin l’identification de nouvelles cibles biologiques et d’ouvrir la voie à des indications supplémentaires pour lesquelles ces vecteurs pourraient être utilisés comme produits thérapeutiques, notamment dans le traitement de maladies chroniques.

Procédures

Administration de vecteur viraux dans le coussinet plantaire (unique ou double à 24h d’intervalle) ou dans le muscle de la patte (deux administrations contemporaines), chaque administration dure environ 30s sous anesthésie générale gazeuse. Administration d’anti-inflammatoire et d’antalgique en couverture de la ou des deux administrations de vecteur (20 minutes pré-administration, en fin de journée post-administration, suivies de deux administrations d’anti-inflammatoire le lendemain de l’injection) (contention de 30s et injection d’environ 10s). Administrations de luciférine (agent nécessaire à l’imagerie par bioluminescence) chez les souris vigiles, préalables aux imageries par bioluminescence (imagerie d’une durée de 20 min maximum par session réalisée sous anesthésie à l’isoflurane) : 7 fois sur la durée d’une étude de 28 jours et 17 fois sur une étude de longue durée (1 an). Prélèvements de sang chez la souris vigile avec contention d’une durée maximale de 2 min (moins de 30s) au maximum 14 fois (pour une étude d’une durée d’1 an) et dans le respect des volémies physiologiques et délais de récupérations.

Impact sur les animaux

− l’administration du vecteur viral (une ou deux fois maximum) sous anesthésie générale peut générer du stress et une douleur légère au réveil. − des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte peuvent générer du stress et une douleur légère de courte durée. − des signes cliniques modérés observables associés à l’injection des virus (gène transitoire (moins de 2h) pour se mouvoir occasionnée par la localisation de l’injection dans le coussinet plantaire, inflammation potentielle autour du site d’injection (moins de 2h). - selon la voie d’administration du vecteur viral, les injections d’anti-inflammatoire et antalgique en aval et en couverture peuvent également générer du stress et une douleur légère. - stress et douleur légère liés aux mesures pour l’évaluation de la localisation des vecteurs viraux par de l’imagerie (répétées 7 fois pendant les études de 28 jours et 17 fois pendant les études de 1 an selon les procédures) et incluant l’administration de l’agent de bioluminescence préalable à chaque mesure - et l’anesthésie gazeuse d’une durée de 20 min maximum.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue des études puisqu’il est nécessaire d’évaluer et de quantifier l’expression des vecteurs viraux dans les organes cibles comme les ganglions dorsaux, la moelle épinière, le coussinet plantaire et le foie. Des prélèvements d’organes d’intérêt et de sang seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, transcriptomique ou protéomique…).

Remplacement

Les méthodes in vitro ou in silico actuelles ne permettent pas de vérifier la migration des vecteurs viraux sur de longues distances dans les nerfs (plusieurs centimètres) ni de localiser précisément les vecteurs. En injectant le vecteur dans la patte de la souris, on peut suivre son trajet des terminaisons nerveuses localisées dans le site d’injection jusqu'aux noyaux de ces neurones localisés dans les ganglions de la racine dorsale (appelé transport rétrograde). Avant de tester sur les souris, des essais ont été faits en laboratoire sur des modèles de culture cellulaire. Les résultats en laboratoire sur des modèles de culture cellulaire ont montré des résultats encourageants mais il est maintenant indispensable de poursuivre ces recherches en utilisant un organisme complexe et entier pour pouvoir évaluer le transport rétrograde de ces vecteurs d’un organe donné jusqu’à un autre localisé à plusieurs centimètres de distance, ce qui est impossible dans les modèles in vitro car aucun dispositif in vitro ne mime à ce jour ce type de modèle.

Réduction

Un vecteur rapporteur utilisant la bioluminescence permet de suivre l'expression d'un gène d'intérêt qui lui est intégré. La création d'un modèle avec vecteur rapporteur facilite la vérification de la localisation de l'expression du transgène dans des organes cibles, comme les ganglions dorsaux, grâce à des techniques d'imagerie non invasive. Cela évite l'euthanasie des souris pour des mesures post-mortem à différents temps, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Cette méthode permet d'analyser la distribution et la pharmacocinétique sur une période prolongée chez un même animal, ce qui améliore la compréhension de la présence et de l'expression du transgène dérivé de vecteurs au fil du temps. À la fin de l'étude, tous les organes pertinents et des échantillons de sang sont collectés pour des analyses in vitro des gènes ou protéines cibles, optimisant ainsi les études et diminuant l’utilisation de souris supplémentaires pour obtenir des échantillons. Des études préliminaires sur des modèles animaux ont validé les conditions expérimentales, y compris les doses et les voies d'administration, nécessaires pour atteindre les objectifs du projet. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée au strict minimum en fonction de ces données, pour permettre une analyse correcte des données d’étude, fixant le nombre final à huit souris par groupe traité et une souris par groupe témoin. Le nombre de souris par groupe pourra être réévalué au cours du projet si la variabilité observée est faible grâce aux conditions expérimentales établies. Les temps de cinétique pour l'euthanasie des groupes de souris, afin de corréler les données in vivo de bioluminescence et/ou de biomarqueurs sanguins avec les données ex vivo des organes cibles, ont été définis au minimum pour obtenir des données exploitables, contribuant à réduire le nombre d'animaux nécessaires. L'imagerie constitue une méthode non invasive et indolore, permettant un suivi régulier et longitudinal d'un même animal tout au long de l'étude. Un des objectifs de ce projet est de diminuer le nombre d'animaux requis pour les études futures en explorant la possibilité de suivre l'expression du vecteur viral sur de longues périodes uniquement par bioluminescence et/ou détection de l'activité du vecteur dans le sang, sans nécessiter l'euthanasie à différents temps pour des évaluations post-mortem.

Raffinement

La procédure d’injection dans le coussinet plantaire est réalisée selon les bonnes pratiques sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture anti-inflammatoire et antalgique, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. Une vigilance sera apportée sur la reprise de la marche et l’absence de signes de douleur pour l’animal post injection (suivi d’une potentielle gène). Des études en amont de ce projet déjà réalisées chez l’animal ont permis de confirmer l’absence de toxicité ou effets adverses liés à l’injection de ces virus. Les animaux font l’objet d’une observation clinique spécifiquement en post injection sur une durée de 24h puis tout au long des études, par les expérimentateurs et par les zootechniciens, pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. Le suivi de la localisation de l’expression du transgène à partir des vecteurs herpétiques non-réplicatifs par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude. Pour la seconde partie du projet, des prélèvements sanguins de petit volume vont être réalisés pour obtenir des informations supplémentaires, comme le profil d'exposition plasmatique et l’analyse de l’expression du vecteur rapporteur dans le sang. La validation de cette opportunité de mesure du vecteur rapporteur dans le sang permettra d’émettre l’hypothèse d’une expression du vecteur dans les organes cibles. Dans ce contexte, cela permettra de raffiner la procédure expérimentale en ne nécessitant plus le recours à des anesthésies répétées (une fois par mois/1 an) pour les études de longue durée.

Choix des espèces

Dans le cadre du projet, les souris seront utilisées. Il est crucial d'évaluer la pharmacocinétique du vecteur chez un animal doté d'un système immunitaire compétent. Le choix de cette espèce est basé sur des études antérieures qui ont permis de comprendre la biodistribution de premières générations du vecteur chez la souris immunocompétente et d’établir une transposabilité avec l’homme. En effet, tout comme chez l’homme, le système immunitaire de la souris permet le même comportement du vecteur dans l’organisme, incluant l’entrée en latence du vecteur et l’expression du transgène qu’il comporte. Dans le modèle murin, les mécanismes de transport rétrograde du vecteur viral sont conservés. Il est nécessaire de continuer à approfondir les connaissances sur cette même espèce et souche immunocompétente. Ainsi, dans le cadre de ce projet la souris constitue un modèle prédictif de l’homme. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 8 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans ce cas. L’innervation du coussinet plantaire par les neurones sensoriels provenant des ganglions de la racine dorsale est considérée bien établie et homogène entre les souris lorsqu’elles ont atteint l’âge de 8 semaines.

Un point limite doit permettre de retirer de l'étude tout animal présentant un effet secondaire sévère. 161 rats, 120 lapins et 50 porcs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour prélever les sites d'injection, dix porcs étant gardés vivants en fin d'étude pour être réutilisés. Les dispositifs médicaux injectables leur sont implantés sous la peau ou dans le derme sous anesthésie générale, suivis de prises de sang hebdomadaires puis mensuelles et, chez les porcs, de vingt biopsies cutanées au maximum par animal. Le porteur écrit que le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement européen 2017/745 et la norme ISO 10993 pour obtenir le marquage CE, et cette modification du projet augmente le nombre de lapins parce que plus de formulations qu'annoncé seront mises au point.

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'obtenir des informations relatives à la tolérance locale de dispositifs médicaux injectables résorbables (DM classe III) et de répondre aux exigences quant à la constitution des dossiers réglementaires en vue de leur mise sur le marché. Les exigences relatives à la caractérisation de ces DM sont de plus en plus élevées, afin de garantir la sécurité des patients à court et long terme. La réalisation d'études de tolérance locale sur des modèles animaux appropriés, permettant de détecter au mieux l'apparition d'effets secondaires, est essentielle dans étapes de développement des dispositifs médicaux injectables. Toutes les études réalisées, même très en amont dans le processus de développement, sont susceptibles d'être utilisées dans les dossiers réglementaires, pour la partie "conception". Les études de tolérance sont généralement couplées à des observations d'efficacité des produits évalués (versus des produits de référence), et à la caractérisation de leur comportement dans l'organisme (modification des propriétés physiques du produit, dégradation, intégration dans les tissus...): ainsi une seule étude permet l'obtention de nombreuses informations pertinentes. MODIFICATION : Augmentation du nombre total de Lapin prévu dans la demande d'autorisation de projet, dans la même période d'autorisation. Sur la période d'autorisation, nous développerons plus de dispositifs médicaux biocompatibles innovants qu'il était prévu initialement, dont il est nécessaire d'évaluer la tolérance pour chaque nouvelle formulation. Leur tolérance est mesurée conformément à des protocoles expérimentaux standard et récurrent néccessitant un nombre d'observation minimum par formulation. Ajout également d'un nouveau fournisseur d'animaux.

Bénéfices attendus

Les projet permettra d'obtenir des données fiables concernant la tolérance, l'intégration et la dégradation des dispositifs médicaux injectables. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché. Ceci afin d'assurer la sécurité des patients recevant ces produits ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux auront des injections sous anesthésie génér le à J0, pour une durée totale de 5 à 15 minutes/animal. D'autres actes sont envisagés mais non systématiques: Prises de sang: rats sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 1/mois maxi, 30 seconde par acte. Lapins vigiles avec anesthésie locale: 1 fois par semaine maximum pendant 1 mois, puis 1 fois par mois maximum, 1 minute maximum par acte. Porcs: sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 2 fois par mois maximum. Biopsies cutanées chez le Porc: sous anesthésie générale (injection intramusculaire, 30 secondes), maximum 20 biopsies réparties sur la durée de l'étude, durée 15 minutes environ par biopsie.

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatibles en solution aqueuse plus ou moins visqueuse. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu in vitro: les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. Dans de rares cas, les implantations intradermiques chez le Lapin peuvent générer des réaction un peu plus fortes, mais restant localisées au niveau du site d'injection.

Devenir

Dans la majorité des cas, les animaux devront être euthanasiés, afin de prélever les sites d'injection à des fins d'analyse. Cependant, chez les porcs, lors d'injections intradermiques, il sera parfois possible de réaliser les prélèvements par biopsie avec un biopsy punch (sous anesthésie générale) et de conserver les animaux en fin d'étude en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Les produits étudiés sont d'abord évalués de façon approfondie grâce à des expériences in vitro: culture cellulaire, modèles de peau artificielle, organe isolé. Les essais de tolérance/biocompatibilité in vivo sont indispensables en complément des tests in vitro, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permettra d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires ainsi que l'intégration des produits dans les tissus environnants. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement Européen (UE) 2017/745 tout en suivant la norme ISO 10993, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux) et également demandé pour les dossiers équivalents dans les pays tiers.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans les études réglementaires est imposé par la norme ISO 10993, les préconisations sont donc suivies, sans augmenter inutilement le nombre d'animaux et sans répéter les protocoles. Dans le cas d'études non réglementaires, on veille à n'utiliser que les animaux strictement nécessaires pour l'obtention des résultats voulus, généralement un nombre très inférieur aux exigences réglementaires. La possibilité d'injecter plusieurs produits en différents sites chez un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une période d'acclimatation systématique est respectée (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Les animaux sont hébergés en groupe et ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce (matériel de nidification pour les rats, blocs/objets à mâcher pour tous les animaux, jouets…). Des points limites, suffisamment prédictifs, permettent de sortir un animal de l’étude en cas d'effet secondaire sévère, ou de mettre en place des traitements pour des réactions locales (application de cicatrisant, administration d'antidouleur) afin que l'animal soit impacté le moins possible. Toues les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les actes trop stressants ou douloureux sont effectués sous anesthésie générale: injections à J0, prises de sang chez le Rat, chez le Porc, et biopsies cutanées chez le Porc. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine). Quelles que soient les procédures, toute éventuelle douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).

Choix des espèces

Les 3 espèces font parties des espèces préconisées par la norme en vigeur. Le rat et le lapin sont des modèles d'implantation utilisés et maitrisés dans l'établissement utilisateur depuis 2006. Leur taille est suffisante pour permettre l'implantation de plusieurs produits chez un seul animal, l'utilisation de techniques d'imagerie et d'appareils de mesures de paramètres cutanés. Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme ; notamment dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude l’effet attendu en clinique. Sa taille, plus importante, permet également l'implantation de plus de produits chez un seul animal, permettant alors de réduire le nombre d'animaux utilisé. Ces modèles sont des modèles de choix (nombreuses données dans la littérature). Leurs comportements sont bien connus, ce qui permet de détecter facilement tout signe de douleur et/ou de mal-être. Les rats utilisés seront de jeunes adultes, environ 300g (=en fin de croissance, paramètres physiologiques stables). Les lapins seront âgés d'environ 14 semaines, soit environ 3.5kg (= présence d'un derme suffisamment épais pour que l'implantation intradermique des produits ne génère pas une contrainte mécanique trop importante). Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 70kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.

Tuées aussitôt après les tests comportementaux, 96 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation reproduisant le syndrome de Rett, avec des atteintes motrices, cognitives et respiratoires et une espérance de vie réduite, et reçoivent une molécule candidate. Trois évaluations comportementales sont prévues, l'une répétée cinq fois sur cinq semaines, pour un stress déclaré léger de huit à trente minutes. Aucun des trois tests n'est nommé, la molécule n'est pas identifiée, et le porteur affirme que le recours au modèle murin est "indispensable" parce que les capacités cognitives et motrices ne s'explorent pas autrement.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule dans un modèle murin du syndrome de Rett. Cette molécule a été sélectionnée sur la base de données préliminaires suggérant une modulation bénéfique de l’activité neuronale anormale observée dans ce syndrome. Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons un modèle murin génétiquement modifié reconnu comme modèle préclinique pertinent pour l’étude du syndrome de Rett. Ces souris reproduisent plusieurs caractéristiques phénotypiques majeures de la maladie humaine, notamment des altérations motrices, cognitives, respiratoires et comportementales, ainsi qu’une réduction de l’espérance de vie. L’utilisation de ces souris est donc essentielle pour valider l’efficacité et la sécurité du traitement que nous souhaitons tester.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche translationnelle, avec l’espoir de faire progresser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patientes atteintes du syndrome de Rett, maladie orpheline de traitement actuellement.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 types de tests de comportements de 8-30min. Le 1er test sera évalué 5 fois sur 5 semaines pour une durée de 8min/évaluation. Concernant le second celui-ci sera évalué 1 fois durant 10min. Enfin le dernier sera évalué 1 fois durant 30min.

Impact sur les animaux

3 évaluations comportementales auront lieu et engendreront un stress léger de 8 à 30 minutes.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux après les tests comportementaux.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours «in vivo» pour mimer les symptômes pathologiques de ce syndrome de rett et rechercher des biomarqueurs associés. En effet pour mimer cette pathologie de l'Homme et rechercher d’éventuelles thérapies médicamenteuses, certains points comme les capacités cognitives et motrices ne peuvent être explorées que sur des modèles "in vivo".

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront lde limiter le nombre d'animaux au minimum possible par groupe, en l’occurrence 12 par groupe, pour obtenir une puissance statistique. Tous les tests comportementaux sont effectués sur les mêmes lots de souris pour limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Tous les animaux seront hébergés selon les normes de bien-être en vigueur (5 individus par cage, présence d’enrichissement (papier doux, cotons, abris faciles d’accès et nourriture adaptée). Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 5 minutes par souris avant le début des expériences. Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définies permettant de déterminer la conduite à tenir.

Choix des espèces

Afin de refléter les symptômes du syndrome de Rett la souris génétiquement modifiée reste à ce jour un des modèles les plus utilisés pour reproduire plusieurs caractéristiques phénotypiques majeures de la maladie humaine, notamment des altérations motrices, cognitives, respiratoires et comportementales, ainsi qu’une réduction de l’espérance de vie. Les expériences débuteront sur des animaux de 5 semaines, âge jeune adolescent des souris.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, trente d'entre elles nourries pendant trente-huit semaines avec un régime riche en graisses et en cholestérol pour les rendre obèses. Vingt subissent un jeûne nocturne allant jusqu'à quinze heures, puis une injection de glucose et six prélèvements sanguins à la queue en deux heures, sur animal conscient. Le porteur écrit que ces souris prendront du poids et deviendront moins actives à cause de l'obésité, et qu'elles pourront ressentir la faim pendant le jeûne. Le bénéfice annoncé, un traitement contre la fibrose du foie, reste au futur, tandis que les tissus prélevés après la mise à mort alimenteront aussi d'autres projets de l'équipe sur l'obésité, le prédiabète et les atteintes cardiaques et rénales.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent un enjeu majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Parmi ces maladies, la stéatose hépatique non alcoolique, qui correspond à une cirrhose du foie sans consommation d’alcool, est en forte progression à cause de l’augmentation de l’obésité ou encore du diabète de type 2. Dans cette maladie, il y a une accumulation importante de graisses dans les cellules du foie ,ce qui entraine une cicatrisation du foie appelée fibrose hépatique. Cette fibrose va rigidifier des parties du foie conduisant progressivement à une perte de fonction du foie et pouvant évoluer vers une insuffisance hépatique terminale. De plus, la fibrose hépatique chronique peut être responsable du développement de cancer du foie, ce qui accentue la gravité de cette pathologie. La stéatose hépatique non alcoolique est souvent diagnostiquée à un stade avancé, lorsque les lésions dans le foie sont déjà présentes. A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace pour inverser ou ralentir cette fibrose. Le développement de traitements efficaces contre la fibrose étant un enjeu majeur en santé, l’objectif principal de ce projet est de tester chez la souris un nouveau composé pour traiter la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement d’un traitement efficace pour lutter contre la progression de la fibrose hépatique. De plus ce projet permettra de mieux connaitre les mécanismes biologiques encore mal connus responsables du développement de la maladie.

Procédures

Pendant 38 semaines, 30 souris seront nourries avec un régime riche en graisses et cholestérol pour les rendre obèses et 10 souris recevront un régime standard. Pour tester la glycémie au cours du régime, 20 souris parmi les 40 souris du projet seront mis à jeun sur la nuit (maximum 15h). Le lendemain, une injection de glucose (moins de 20 secondes) sera réalisée sur l'animal conscient et des prélèvements de sang se feront au niveau de la queue. Les prélèvements seront réalisés sur un temps court (durée inférieure à 2 minute) et de façon répétée en 6 fois sur une période de 2h dans la même journée. Un autre prélèvement sanguin au niveau de la queue (une seule prise) sur la totalité des 40 souris sera réalisé 11 semaines plus tard.

Impact sur les animaux

Les souris qui recevront sur 38 semaines le régime riche en graisses et cholestérol vont prendre du poids et devenir un peu moins actives à cause de l'obésité. Durant la période de jeûne de 14-15h sur la nuit, les souris privées de nourriture pourront ressentir une sensation de faim. Lors de l’injection de glucose, le passage de l’aiguille de petite taille au travers de la peau sera de très courte durée (moins de 20 secondes) et entrainera un inconfort chez les souris. Des prélèvements sanguins à la queue seront pratiqués sur animaux conscients après 16 et 27 semaines de régime. Ces prélèvements bien que rapides (durée < 2 minutes) sont susceptibles d’induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Après les 38 semaines de régime, tous les animaux seront mis à mort par une méthode d'euthanasie réglementaire pour prélever les tissus et le sang. L'analyse de ces prélèvements nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement dans le foie de la fibrose et d'identifier les cibles thérapeutiques de notre composé.

Remplacement

ll n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire de manière fiable l’environnement in vivo que l'on retrouve dans un organisme vivant et dans lequel plusieurs types de cellules interagissent entre elles et participent au développement de la fibrose . De plus, cette maladie se développe lorsqu’il y a des problèmes métaboliques (ex hausse de la glycémie) dans l’organisme entier suralimenté, ce qui justifie l’utilisation d’animaux. Enfin il n’existe pas de méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire pour tester l’efficacité d’un composé sur la fibrose hépatique.

Réduction

Le nombre total de souris a été calculé pour avoir un effet statistique significatif sur les paramètres étudiés. A la fin de l’étude, des tissus autres que le foie pourront être prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe en lien avec d’autres maladies étudiées dans notre laboratoire (obésité, pré-diabète, atteintes cardiaques, rénales). Pour l’analyse des données recueillies lors des différentes expériences nous appliquerons les tests statistiques appropriés en utilisant un logiciel d'analyse.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement et la litière des cages sera plus fréquemment changée. Les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel expérimenté. Pour diminuer le stress lors des prélèvements de sang, les animaux seront habitués au mesure de contention quelques semaines avant la prise de sang. Pour éviter d’avoir recours au gavage source de stress, le traitement sera administré quotidiennement (5 jours sur 7) dans de la nourriture constituée de beurre de cacahuète pour l’appétence. Le traitement avec le composé a déjà été administré chez le rongeur (rat et souris) dans de précédents travaux sans entrainer d’effets indésirables

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont très sensibles au régime riche en graisses et développe une obésité et une stéatose hépatique non alcoolique similaire à la maladie humaine. Les souris utilisées seront de jeunes mâles âgés de 5 à 6 semaines car la plupart des études sur le modèle murin pour étudier cette maladie sur une longue période utilisent de jeunes souris adultes. Ainsi, grâce aux nombreuses études scientifiques publiées, de nombreuses informations sur la souris sont disponibles et permettront de mieux comparer les résultats obtenus dans ce projet.