Diagnostic des maladies

La finalité est de constituer chaque année une bibliothèque d'anticorps monoclonaux dirigés contre une quarantaine de cibles, destinés à des tests de diagnostic déjà déployés à l'international. 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à sept injections d'immunogène sur animal vigile et des prélèvements sanguins sous anesthésie toutes les deux à trois semaines, quatre souris étant affectées à chaque cible. La rate est prélevée après la mise à mort, et le porteur reconnaît que des anticorps peuvent être produits sans animaux tout en jugeant ces méthodes moins performantes que l'immunisation in vivo.

Objectifs

Ce projet vise à produire des anticorps monoclonaux destinés à des applications diagnostiques et thérapeutiques ciblant des agents infectieux émergents ou multirésistants, ainsi que des biomarqueurs immunitaires clés, en réponse à des enjeux majeurs de santé publique. Les anticorps monoclonaux, par leur haute spécificité et affinité, sont des outils essentiels pour détecter précocement des pathologies sévères telles que le sepsis, ou pour neutraliser des pathogènes difficiles à contrôler par les traitements classiques. Notre laboratoire s’inscrit dans de nombreux programmes de développement d’outils immunologiques ou d’immunothérapie, avec plusieurs tests rapides de diagnostic déjà déployés internationalement, notamment pour la détection de résistances bactériennes. Ce projet se concentre sur un panel limité et prioritaire d’une quarantaine de cibles annuelles, choisies selon leur impact sanitaire avéré. Par ce projet, nous visons à renforcer la capacité nationale et internationale à détecter rapidement et précisément des agents infectieux critiques et à développer des thérapies ciblées innovantes. Si la quasi-totalité des étapes de production d’anticorps monoclonaux (de leur criblage à leur caractérisation fonctionnelle) peut aujourd’hui être réalisée sans recours aux animaux, la première étape cruciale de leur création reste, en l’état actuel des connaissances, largement dépendante d’un recours à l’animal. L’immunisation in vivo permet en effet une maturation naturelle indispensable à la génération de clones à haute affinité, que les banques synthétiques ou les méthodes alternatives ne parviennent pas encore à égaler en termes de qualité et diversité. Ainsi, le recours minimal à l’animal est strictement limité à cette phase initiale de génération des anticorps. Toutes les étapes suivantes s’appuient sur des systèmes in vitro robustes, avec production en bioréacteurs, assurant une production fiable, reproductible et de haute qualité, sans recourir aux méthodes anciennes par ascite désormais non autorisées.

Bénéfices attendus

À court terme, le projet permettra de générer une bibliothèque d’anticorps dirigés contre une quarantaine de cibles prioritaires sélectionnées en fonction de leur impact clinique et épidémiologique. Ces anticorps seront utilisés pour valider des tests de diagnostic actuellement en développement, notamment des tests de type « point-of-care » destinés à être utilisés directement auprès des patients pour une orientation thérapeutique rapide. Ils aideront aussi à mieux comprendre les interactions immunitaires dans des contextes critiques, comme la réponse inflammatoire liée au sepsis. À plus long terme, les anticorps développés pourront être intégrés dans des dispositifs diagnostics améliorés, combinant rapidité, sensibilité et spécificité, facilitant ainsi la détection précoce d’infections difficiles à contrôler ou de résistances bactériennes émergentes. Par ailleurs, certains anticorps candidats pourront servir en immunothérapie, par exemple pour neutraliser directement des agents pathogènes ou moduler la réponse immunitaire dans des syndromes inflammatoires sévères, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront immunisés en vigile par plusieurs injections brèves (30 à 60 secondes) d’une molécule appelée immunogène, qui correspond à la cible d’intérêt. Des prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés, seront ensuite réalisés à intervalles réguliers (toutes les 2 à 3 semaines) afin de suivre la réponse immunitaire des animaux, c’est-à-dire la production d’anticorps en réaction à l’immunogène. Chaque animal recevra une injection initiale, suivie de trois rappels et de trois injections de boost soit un maximum de sept injections au total. Pour chaque prélèvement, la durée sera très brève (60 secondes par animal).

Impact sur les animaux

Une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injections sont susceptibles de survenir : la douleur sera très brève et l’infection peut survenir jusqu’à quelques heures après l’injection. Une douleur légère est possible lors des prélèvements sanguins. Les manipulations peuvent entrainer un stress de certains animaux pendant quelques minutes.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort à la fin du protocole. La production d’anticorps monoclonaux nécessite en effet de prélever la rate des animaux immunisés.

Remplacement

Il existe aujourd’hui des méthodes de laboratoire pour produire des anticorps sans utiliser d’animaux. Ces techniques permettent de fabriquer des anticorps à partir de grandes banques artificielles, en sélectionnant ceux qui semblent capables de reconnaître une cible donnée. Cependant, ces méthodes ont encore des limites importantes : - D’abord, les anticorps produits en laboratoire de cette façon reconnaissent souvent moins bien leur cible que ceux générés naturellement par le système immunitaire d’un animal. En effet, le système immunitaire d’un animal est capable d’améliorer progressivement ses anticorps après contact avec la cible d’intérêt. Ce processus naturel, très complexe, n’est pas encore reproductible en laboratoire avec la même efficacité. Résultat : les anticorps produits par ces méthodes sont souvent moins bons. - Ensuite, ces anticorps sont souvent incomplets (il ne s’agit que d’un fragment), ce qui peut poser problème pour leur stabilité, leur fonctionnement, ou leur utilisation dans des tests standards. Ils sont aussi plus sensibles aux variations de température, de pH ou de conditions biologiques. Leur performance reste donc largement insuffisante dans des situations réelles, comme par exemple pour détecter un agent pathogène dans un échantillon biologique complexe. Dans ce projet, nous avons besoin d’anticorps très efficaces, capables de détecter précisément certaines cibles infectieuses, y compris à de très faibles concentrations. Pour cela, la méthode la plus fiable reste encore l’immunisation d’un animal. Il est important de souligner que l’utilisation d’animaux est strictement limitée à cette première étape de production. Toutes les étapes suivantes sont réalisées en laboratoire par des techniques entièrement in vitro, maîtrisées et reproductibles, sans recourir aux méthodes anciennes par ascite désormais non autorisées.

Réduction

Chaque production d’anticorps monoclonal sera réalisée avec un nombre restreint d’animaux : 4 souris seront utilisées par immunogène. Ce nombre a été défini à partir de notre expérience dans ce type de protocole et correspond au minimum nécessaire pour garantir un bon taux de réussite. En effet, une réponse immunitaire insuffisante chez un ou plusieurs animaux peut empêcher la production d’anticorps de qualité. Si trop peu d’animaux sont utilisés au départ, ce risque augmente, ce qui pourrait conduire à répéter toute la procédure, longue et contraignante, avec de nouveaux animaux. Cela irait à l’encontre de l’objectif de réduction. Par ailleurs, les étapes amont du projet (sélection des cibles antigéniques, mise au point des protocoles) ont été réalisées en laboratoire à l’aide de méthodes in vitro, ce qui a permis de limiter le recours aux animaux aux seules phases indispensables de production des anticorps. De plus, toutes les étapes après l’immunisation : criblage sélection, caractérisation fonctionnelle et production à grande échelle sont réalisées sans recours aux animaux, grâce à des techniques in vitro parfaitement maîtrisées et éprouvées. Cette stratégie globale garantit que le nombre d’animaux utilisés est strictement limité au minimum nécessaire, tout en assurant la qualité et la fiabilité des anticorps produits.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des cages collectives, favorisant leurs interactions sociales. Leur environnement sera enrichi avec des abris, des tunnels en carton, du matériel pour construire un nid, et des bâtonnets à ronger. Les procédures susceptibles de causer de la douleur seront réalisées sous anesthésie. Le niveau d’inconfort après l’intervention sera similaire à celui d’une vaccination humaine. Les animaux seront surveillés chaque jour par du personnel qualifié, en charge notamment de détecter rapidement tout signe éventuel de douleur, stress ou malaise. Un ensemble de points limites et de critères d’arrêt est mis en place. Si l’un de ces indicateurs révélait un état anormal, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix largement reconnu pour la production d’anticorps monoclonaux. Elle a été retenue pour sa capacité à induire une réponse immunitaire robuste et reproductible, indispensable pour obtenir des anticorps de haute qualité. Les animaux utilisés seront des souris adultes, car à ce stade le système immunitaire est pleinement mature. Cette maturité est essentielle pour assurer une réponse immunitaire optimale. De plus, les souris sont des petits animaux pour lesquels il est facile d’assurer des conditions de vie stables et contrôlées, et de limiter les situations potentiellement stressantes de par leur environnement, répondant ainsi aux critères éthiques et pratiques.

Fournir des anticorps monoclonaux pour des tests de diagnostic rapide suppose ici d'immuniser 200 souris, toutes tuées pour prélever leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois à quatre injections d'antigènes, à raison d'une par mois, et subit trois prises de sang. Les effets annoncés vont de l'infection au point d'injection à l'abcès, avec fièvre, perte de poids et douleur modérée liée à l'inflammation. Le porteur indique avoir sorti l'animal de la production d'anticorps à grande échelle, et affirme que l'immunisation in vitro ne donne pas des affinités suffisantes, ce qui rend selon lui le recours à la souris "toujours nécessaire".

Objectifs

Les tests « rapides » de détection et de diagnostic de microorganismes pathogènes ou de toxines responsables de maladies infectieuses sont d’un intérêt croissant non seulement dans le domaine de la maitrise et de la détection des risques biologiques mais plus largement en santé publique. Ce type de tests est particulièrement adapté à un suivi précoce de l’émergence ou de la ré-émergence de certaines maladies infectieuses responsables de pandémies mondiales pouvant avoir des conséquences extrêmement graves en santé humaine ou d’un point de vue économique (ex : Ebola, ZIKA, Covid-19, Variole du singe, etc.). Ils sont basés sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux, des protéines du vivant capables de reconnaitre de manière très spécifique des pathogènes ou toxines. Notre projet vise au développement d’anticorps monoclonaux dirigés contre différentes cibles notamment des antigènes de microorganismes pathogènes ou de toxines dans le cadre de multiples programmes de recherche, visant à suivre les émergences des maladies infectieuses responsables de différentes pathologies humaines ou animales. Le développement de nouveaux tests antigéniques nécessite donc la génération de nouvelles lignées cellulaires sécrétrices d’anticorps monoclonaux spécifiques pour répondre à ces besoins importants pour la santé publique. Bien que l’animal ne soit plus du tout utilisé dans notre laboratoire pour la production d’anticorps à grande échelle, il reste néanmoins encore indispensable pour la partie immunisation permettant in fine l’obtention des anticorps d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de générer des anticorps monoclonaux sur le territoire national pour garantir la souveraineté et la sécurité des approvisionnements dont nous avons pu mesurer l’importance lors de la pandémie de COVID19. Cela permettra la mise au point, la validation et la fourniture de moyens diagnostiques appropriés, performants et répondant aux préconisations des autorités de santé.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 ou 4 injections (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) d’antigènes pour les immuniser à la fréquence d’une injection par mois : Trois prises de sang seront réalisées par animal (durée de l’intervention environ 30 à 40 secondes) à la fréquence maximale d’un prélèvement par mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévisibles sont : - une infection au point d’injection, abcédation, risque de fièvre - une perte de poids - une douleur modérée transitoire due à l’inflammation

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. L’obtention d’anticorps monoclonaux nécessite en effet de prélever la rate des animaux immunisés.

Remplacement

L’obtention d’anticorps monoclonaux à des fins diagnostiques ou de détection nécessite d’atteindre un niveau d’immunisation très élevé. Bien que la production d’anticorps monoclonaux ait connu de grands progrès depuis quelques années, démarche dans laquelle notre laboratoire est pleinement engagé (avec une forte réduction du nombre d’animaux à plusieurs étapes et notamment celle de la production), les technologies actuelles de remplacement pour l’étape d’immunisation ne sont pas complétement satisfaisantes notamment en termes d’affinité et de spécificité des anticorps obtenus. Ces méthodes d’immunisation in vitro ne permettent pas, en l’état actuel des connaissances, d’obtenir des réponses immunitaires suffisantes pour garantir la performance de tests de diagnostic et actuellement, le recours à l’immunisation d’animaux afin d’obtenir des anticorps monoclonaux spécifiques est toujours nécessaire.

Réduction

Les immunisations sont réalisées par lots de 4 souris, un lot correspondant à une condition d'immunisation. Il est communément admis de tester 2 conditions d’immunisation par antigène (concentration ou type de solution véhicule) soit 8 animaux. La réponse immunitaire est évaluée et les animaux ayant les meilleures réponses sont sélectionnés pour réaliser les fusions lymphocytaires. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous ne testerons qu’une condition à la fois (4 animaux) ; si cette dernière ne donne pas les résultats escomptés lors des tests d’affinité, nous en testerons une deuxième. Il est à noter que dans la plupart des cas, la première condition est suffisante. Il est prévu 200 souris maximum pour les immunisations pour l’ensemble de la saisine sur 5 ans. Ce chiffre est un maximum et le nombre de lots est étroitement corrélé au nombre de sujets de recherche que nous aurons à traiter et du niveau de réponse immunitaire des animaux vis-à-vis de chaque antigène. Tous les efforts seront faits pour diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les études statistiques ne sont pas adaptables. Les résultats sont évalués en nombre d’hybridomes développés.

Raffinement

Une analgésie continue sera pratiquée avant tout acte potentiellement douloureux. Les animaux seront observés quotidiennement et un ensemble d’indicateurs prédictifs de douleurs ou stress éventuels a été mis place. En cas d’atteinte d’un point limite établi (prostration, dépilation, refus de s’alimenter…), une évaluation précise de l’état général de l’animal, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris est rendu inévitable pour l’obtention des hybridomes sécréteurs d’anticorps monoclonaux spécifiques. En effet, l’hybridome étant le résultat de la fusion cellulaire entre des lymphocytes issus des souris immunisées et des cellules de myélome de souris (lignée cellulaire établie et approvisionnée auprès de collections internationales de cellules), il est de ce fait techniquement impossible de réussir cette étape si les lymphocytes et le myélome ne sont pas issus de la même espèce (souris en l’occurrence). Toutes les souris que nous utiliserons seront de jeunes adultes (6 à 8 semaines). A cet âge, les animaux ont la maturité immunologique nécessaire pour obtenir de bonnes réponses immunitaires.

Douze semaines sans aucun enrichissement physique dans la cage, pour installer un état d'anxiété-dépression : 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 924 subissent quatre semaines de stress chronique léger, 564 reçoivent quatre séances d'ultrasons crâniens sous anesthésie, et chacune passe deux séances d'imagerie pouvant durer deux heures. Six tests comportementaux mesurent ensuite la motricité, la dépression et l'anxiété ainsi induites. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes et vérifier que les signaux vus en imagerie correspondent bien à des altérations réelles de la barrière hémato-encéphalique.

Objectifs

Les traitements actuels contre la dépression restent insuffisants pour une partie des patients, et les rechutes sont fréquentes. Pour développer de nouvelles approches plus efficaces, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans cette maladie. Notre projet de recherche s’intéresse à un élément encore peu exploré dans ce contexte : la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est une structure qui agit comme un filtre protecteur, en contrôlant les échanges entre le sang et le cerveau. Des études récentes suggèrent qu’elle pourrait être altérée dans certaines maladies psychiatriques, comme la dépression, et ainsi contribuer à certains symptômes. De plus, des travaux montrent qu’il est possible de moduler temporairement la perméabilité de cette barrière, ce qui permettrait de faire passer dans le cerveau des substances actives susceptibles d’agir sur les symptômes dépressifs. Ces découvertes ouvrent des perspectives nouvelles, à la fois pour mieux comprendre la maladie et pour envisager de nouvelles voies d’administration de traitements ciblés. Notre projet repose donc sur deux grands objectifs complémentaires : 1. Étudier l’état de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle animal (des souris) présentant des caractéristiques proches de la dépression humaine. Pour cela, nous utilisons des techniques d’imagerie non invasives permettant d’observer le cerveau (IRM) et son fonctionnement (TEP). 2. Tester la possibilité d’agir sur la barrière, en modifiant transitoirement sa perméabilité. Cela permettra d’évaluer si des composés potentiellement utiles contre la dépression peuvent franchir cette barrière et avoir un effet thérapeutique. Cette modulation sera testée par deux méthodes : l’utilisation d’ultrasons ciblés (FUS) et l’administration de substances spécifiques. L’ensemble de ces investigations vise à mieux comprendre le rôle de la BHE dans la dépression et à évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques en s’appuyant sur l’imagerie et la modulation ciblée de cette barrière.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dépression afin d’ouvrir la voie à des traitements plus efficaces et mieux ciblés. À court terme, il s’agit : • d’évaluer l’état de la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre naturel du cerveau, chez des animaux présentant des comportements similaires à la dépression, pour identifier d’éventuelles altérations ; • d’étudier comment des ultrasons ciblés ou certaines substances influencent la perméabilité de cette barrière et le passage de composés vers le cerveau, afin d’optimiser l’administration de médicaments ; • d’analyser les effets cellulaires de ces modulations pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ; • d’explorer un éventuel effet bénéfique des ultrasons sur le comportement de ces animaux ; • et de renforcer l’usage de l’imagerie TEP pour étudier, de manière non invasive, la BHE et les processus cérébraux associés à la dépression. À long terme, ces recherches devraient permettre : • une meilleure compréhension des mécanismes complexes de la dépression, essentielle au développement de traitements plus performants et durables ; • l’évaluation d’une approche innovante reposant sur les ultrasons ciblés, potentiellement capable d’agir à la fois sur la BHE et sur les symptômes dépressifs ; • des avancées vers des stratégies thérapeutiques non invasives, précises et personnalisables ; • une meilleure connaissance des effets des ultrasons sur le cerveau, nécessaire à leur future utilisation clinique ; • et des retombées méthodologiques utiles à la recherche en imagerie et en neuropharmacologie. En résumé, ce projet combine neurosciences, imagerie et technologies innovantes pour explorer de nouvelles voies thérapeutiques dans la dépression, avec l’ambition d’améliorer à terme la prise en charge des patients.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie (2 imageries par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum ; 1224 animaux) • Induction du modèle dépressif : la dépression sera induite par un protocole standardisé de stress chronique léger, réalisé sur une période de 4 semaines (924 animaux) • Réalisation de sessions d’ultrasons (4 sessions d’ultrasons par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes au maximum ; 564 animaux) • Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux (6 tests par animal) afin de mesurer l'activité motrice (durée = 30 minutes), la dépression (durée = 5 minutes) et l’anxiété (durée = 5 minutes). • Administration 2 fois par semaine d’un candidat médicament par injection i (réalisée en 10 secondes ; 528 animaux) pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Induction d’un phénotype dépressif • Administration de médicaments par injection, ce qui induit une douleur suite à la piqure inférieure à 3 secondes. • Absence d’enrichissement physique dans les cages afin de favoriser le modèle d'anxiété-dépression (12 semaines), les enrichissements environnementaux de type sensoriel et social sont maintenus. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les organes, d’en analyser leur composition aux niveaux cellulaires et tissulaires. Ces analyses permettront d’obtenir des informations supplémentaires sur les mécanismes biologiques en jeu, notamment la distribution des biomarqueurs d’intérêt. Elles serviront surtout à valider et à interpréter les résultats obtenus par imagerie, en s’assurant que les signaux observés reflètent bien des altérations réelles et spécifiques de la barrière hémato-encéphalique. Cette étape est essentielle pour confirmer la pertinence de l’imagerie comme outil fiable d’investigation de la BHE.

Remplacement

En amont de ce projet, des études ont été menées en laboratoire, notamment en utilisant des matériaux simulant le cerveau (des "fantômes") et des cultures de cellules. Ces travaux préliminaires ont servi à tester et à ajuster les paramètres techniques, en particulier ceux liés à l'utilisation des ultrasons et à l'effet de certaines substances sur la barrière qui protège le cerveau (la Barrière Hémato-Encéphalique ou BHE). L'objectif était précisément de limiter le recours aux animaux. Cependant, ses recherches portent sur des pathologies complexes comme la dépression et sur les interactions fines entre le cerveau, sa barrière protectrice, et des interventions comme les ultrasons ou l'administration de substances. Actuellement, la complexité d'un organisme vivant, avec son environnement cérébral unique et l'interaction de ses différents systèmes, ne peut pas être reproduite fidèlement par des études en laboratoire sur des cellules isolées, des organoïdes ou par des simulations informatiques. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour étudier ces maladies complexes et pour évaluer la variabilité de la réponse à des approches potentielles de traitement.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences pharmacocinétique au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et toute forme d'inconfort chez les animaux, conformément au principe de Raffinement. Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 1 à 4 semaines avant toute procédure, afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social, et manipulées de manière douce et progressive pour réduire leur stress. Un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé, qui observera leur comportement, leur aspect général, leur poids, ainsi que leur consommation d’eau et de nourriture. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de mal-être. Toutes les procédures pouvant causer une gêne (examens d’imagerie, injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Pendant l’anesthésie, leur respiration et leur température seront surveillées. Le réveil se fera dans leur cage habituelle ou avec leur propre litière pour limiter le stress. Un système d’observation rigoureux des animaux a été mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance, bien que toutes les précautions soient prises pour les éviter. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Enfin, les différentes étapes expérimentales sont espacées dans le temps pour permettre aux animaux de récupérer entre les procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de cette étude, il a été décidé d'utiliser des souris. Ce choix repose sur des raisons scientifiques importantes. Premièrement, le modèle de dépression utilisé dans ce projet, qui est induit en donnant une substance (la corticostérone) dans l'eau de boisson pendant une certaine période, a été spécifiquement développé et validé chez la souris. L'utilisation de cette espèce nous permet donc de travailler avec un modèle dont les caractéristiques liées à la dépression sont bien établies. De plus, un type particulier de souris présente des avantages techniques pour les méthodes d'imagerie non invasives que nous allons utiliser, comme une meilleure transmission des ultrasons à travers le crâne. Ces souris sont également très similaires les unes aux autres, ce qui rend les résultats plus fiables et reproductibles. Concernant le stade de développement, nous utiliserons uniquement des animaux adultes. Ce choix est essentiel car la dépression est une maladie qui se manifeste principalement chez l'adulte. En travaillant sur des souris adultes, nous nous assurons que les mécanismes biologiques et les comportements que nous étudions sont pertinents par rapport à la maladie chez l'homme. Enfin, certaines des techniques d'imagerie non invasives employées nécessitent que le crâne soit complètement développé pour obtenir des données précises et comparables. Cela est généralement atteint à l'âge adulte chez la souris. En résumé, l'utilisation de souris adultes est la plus appropriée et la plus pertinente pour étudier les mécanismes de la dépression et évaluer de nouvelles approches dans ce projet.

Chaque souris reçoit six injections d'immunogènes espacées de trois semaines, six prélèvements sanguins, puis trois injections supplémentaires dans les cinq jours précédant sa mise à mort. 100 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des nanocorps dirigés contre la protéine prion. Le porteur décrit ces quinze interventions comme de "légères gênes temporaires" qui ne devraient entraîner "ni douleur importante ni effet durable", quand la gravité déclarée du projet est modérée. Toutes sont tuées dès que la réponse en anticorps est jugée correcte, pour prélever la rate.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire un type particulier d’anticorps appelés VHH ou nanocorps. Ces anticorps sont beaucoup plus petits que les anticorps classiques. Leur petite taille est intéressante car elle leur permettrait, en théorie, de franchir plus facilement la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre la possibilité d’imaginer un jour des traitements pour des maladies qui touchent directement le système nerveux. Nous voulons produire ces anticorps contre la protéine prion (PrP). Cette protéine est responsable des maladies à prion, qui touchent l’animal et l’Homme, et qui sont toujours fatales car il n’existe actuellement aucun traitement. Les nanocorps obtenus pourraient servir à mieux comprendre comment ces maladies se développent, à améliorer leur diagnostic et à explorer de nouvelles pistes de traitement. Nous cherchons aussi à produire des nanocorps capables de reconnaître non seulement la forme « normale » de la protéine prion, mais aussi certaines formes anormales associées aux maladies. Cela permettrait d’obtenir des anticorps plus spécifiques et plus utiles que ceux dont nous disposons aujourd’hui. Enfin, la protéine prion est également impliquée dans d’autres maladies, comme certains cancers ou encore la maladie d’Alzheimer et de Parkinson. La production de nanocorps dirigés contre la protéine prion pourrait donc avoir un intérêt bien au-delà des seules maladies à prion, et bénéficier à un domaine plus large de la recherche biomédicale.

Bénéfices attendus

Les anticorps de type VHH, aussi appelés nanocorps, sont des outils innovants qui possèdent plusieurs avantages par rapport aux anticorps classiques. Leur petite taille leur permet de se fixer sur des cibles difficiles d’accès et, en théorie, de franchir la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre des perspectives uniques pour envisager un jour des traitements de maladies qui touchent directement le système nerveux. Ils sont aussi très stables, faciles à produire en laboratoire et peuvent être utilisés sous différentes formes pour la recherche, le diagnostic ou le traitement. Ces nanocorps sont déjà étudiés dans d’autres maladies humaines, par exemple certains cancers, des maladies infectieuses, ou encore des maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Leur potentiel d’application est donc très large. À ce jour, il n’existe aucun nanocorps dirigé contre les maladies à prion. Ce projet vise à combler ce manque en développant une nouvelle génération d’anticorps contre la protéine prion. L’intérêt dépasse les maladies à prion elles-mêmes, car la protéine prion est aussi impliquée dans d’autres pathologies. Les bénéfices de ce projet seront donc multiples : - fournir de nouveaux outils de recherche pour mieux comprendre le rôle de la protéine prion, - permettre un diagnostic plus précoce et plus précis des maladies à prions, - et à plus long terme, ouvrir des pistes thérapeutiques innovantes grâce à la petite taille des nanocorps, qui pourrait leur permettre d’atteindre le cerveau et de cibler spécifiquement les formes anormales de la protéine prion.

Procédures

100 souris sont prévues pour le projet. Pour chaque animal, les gestes techniques seront les suivants : - injection d’analgésique avant injection des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigile. Il faut compter 30 secondes par intervention. - Injections des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigiles. Il faut compter 1 minute maximum par intervention (contention et injection) - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles 1 prélèvement avant la première injection puis toutes les 2 semaines après chaque immunisation, soit 6 prélèvements. Il faut compter 2 minutes par intervention (contention, prélèvement puis massage de la joue) - Cinq jours avant la mise à mort, 3 injections toutes les 24h d’immunogènes sur animaux vigiles. Il faut compter environ 1 minute par intervention (contention et injection).

Impact sur les animaux

Les interventions prévues (injections et prises de sang) peuvent provoquer de légères gênes temporaires chez les souris, mais elles ne devraient pas entraîner de douleur importante ni d'effet durable. Les effets observés peuvent être une petite rougeur ou un léger gonflement à l'endroit de l'injection ou de la prise de sang ; une sensibilité locale passagère ; un léger inconfort dans les heures suivant la manipulation. Il peut arriver que certains animaux soient un peu moins actifs ou mangent un peu moins pendant un jour ou deux, ou qu'ils perdent légèrement du poids. Ces effets disparaissent généralement rapidement, sans conséquence sur leur état général.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la campagne d’immunisation quand les réponses en anticorps seront correctes afin de prélever la rate.

Remplacement

Il existe aujourd’hui des méthodes permettant de produire des anticorps sans utiliser d’animaux, par exemple des techniques de sélection réalisées uniquement en laboratoire., Cependant, ces approches n’aboutissent pas encore à des anticorps de même qualité que ceux produits par le système immunitaire d’un animal. En effet, l’organisme possède un mécanisme naturel qui « améliore » progressivement les anticorps pour qu’ils se fixent très efficacement à leur cible, un processus qui ne peut pas être reproduit artificiellement avec les techniques actuelles. Dans ce projet, les souris sont utilisées pour générer des cellules capables de produire durablement des anticorps. Ces cellules seront ensuite immortalisées en laboratoire et permettront de produire les anticorps sur le long terme, sans avoir à réutiliser de nouveaux animaux pour chaque antigène ou chaque série d’expériences.

Réduction

Le nombre de 5 souris par antigène a été déterminé à partir d’un calcul statistique. L’objectif est de garantir, avec une forte probabilité, que au moins deux souris par lot développent une bonne réponse immunitaire. Cela est nécessaire pour pouvoir utiliser leurs cellules et produire les anticorps sans avoir à recommencer tout le protocole depuis le début. En pratique, il est bien connu qu’une ou deux souris sur cinq peuvent ne pas répondre correctement aux immunisations. Le choix de 5 animaux tient donc compte de cette variabilité naturelle tout en évitant d’utiliser plus de souris que nécessaire. De plus, si la première tentative de production d’anticorps en laboratoire échoue (ce qui est rare), les trois souris restantes du lot servent de filet de sécurité. Cela permet de refaire un essai sans devoir réimmuniser un nouveau groupe d’animaux, ce qui contribue directement à réduire leur nombre sur l’ensemble du projet.

Raffinement

Trente minutes avant l’intervention les animaux recevront une injection d’analgésique. Après les interventions, les animaux seront surveillés et placés sur un tapis chauffant à 37°C pendant 2 heures pour favoriser leur récupération. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les lignées de souris de laboratoires sont classiquement utilisées pour l’immunisation et la production d’anticorps. Les souris transgéniques exprimant des anticorps de camélidés évitent le recours à ces espèces, protocole beaucoup plus difficile à mettre en œuvre. De jeunes adultes (6 à 8 semaines) seront utilisés au démarrage des immunisations ; ils ont en effet la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires lors des immunisations successives.

Deux heures d'anesthésie d'affilée, dont un quart d'heure avec une aiguille-capteur enfoncée au centre de la tumeur : 110 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales du sein ou du pancréas leur sont injectées dans le flanc, la tumeur pousse deux à trois semaines, puis vient l'examen complet, une heure quinze d'IRM, trente minutes d'échographie et la mesure directe de la pression interne. Toutes sont tuées ensuite pour que la tumeur soit découpée et comparée aux images. Le porteur retient la souris parce que les appareils d'imagerie ont été conçus pour elle et qu'il est plus aisé de trouver des points de comparaison dans la littérature.

Objectifs

Les tumeurs solides sont principalement composées de cellules et d'autres éléments comme les fibres de collagène, qui affectent leurs caractéristiques physiques. Certaines caractéristiques sont connues pour rendre la tumeur plus sévère et plus résistante aux traitements médicaux. Parmi ces propriétés, seule la dureté de la tumeur peut actuellement être mesurée de manière précise et non invasive en imagerie. Il est alors intéressant de développer des techniques pouvant mesurer les autres caractéristiques tumorales, pour évaluer la sévérité tumorale de manière plus précise. La technique envisagée dans ce projet est l’élastographie par imagerie par résonance magnétique (IRM) sous compression. L’élastographie est la mesure des propriétés mécaniques du tissu comme l’élasticité, la dureté, etc… On utilise un dispositif vibrant pour générer des ondes à travers le tissu d’intérêt. Pour acquérir l’image de ces ondes qui se déplacent, on peut utiliser l’IRM (dont les images sont créées grâce à des champs magnétiques) ou l’échographie (dont les images sont créées grâce à des ultrasons). On peut également mesurer des propriétés plus complexes en réalisant un examen d’élastographie sous compression, c’est-à-dire en appuyant de manière continue sur le tissu pendant l’examen d’imagerie. Des études utilisant l’élastographie échographique sous compression ont été menées sur le foie en dehors du corps et ont montré que ces propriétés étaient liées à la manière dont sont organisées les fibres à l’intérieur du cancer, ce qui affecte sa sévérité. Le but de ce projet est de transposer cette méthode développée avec les ultrasons vers l’IRM. Ce type d’imagerie informe sur un volume entier, ce que ne fait pas l’échographie. Il y aura ainsi une information complémentaire et une meilleure précision dans les mesures. Cette nouvelle technique sera appliquée sur des tumeurs implantées chez la souris, avec deux modèles différents : des tumeurs du sein et des tumeurs du pancréas. Les valeurs obtenues seront ensuite comparées à des données provenant de la microscopie pour valider l’utilisation de cette méthode pour déterminer l’organisation des tissus et la sévérité de la tumeur. La validation de la méthode sera d’autant plus assurée que ces deux modèles possèdent des compositions et des propriétés physiques différentes. Cela permettra d’offrir une méthode sans douleur qui pourrait prédire la sévérité d’un cancer et adapter ensuite le traitement donné au patient. MODIF: Prolongation.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’approfondir les connaissances fondamentales relatives aux propriétés mécaniques du cancer. En particulier, l’objectif est d’obtenir des marqueurs non-invasifs d’imagerie pouvant indiquer la sévérité tumorale qui est liée à la fois à la composition de la tumeur et à sa pression. Cette étude pourra notamment permettre de définir de nouvelles méthodes d’imagerie afin d’aider le clinicien dans le diagnostic du cancer et, également, adapter le traitement aux caractéristiques de la tumeur.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront anesthésiés pour une injection unique des cellules tumorales en sous-cutané dans le flanc. Cet acte aura une durée totale de 10 min par animal. Les animaux seront observés de manière bihebdomadaire pendant la croissance tumorale. Une fois que la tumeur aura atteint une taille suffisante (environ 2 à 3 semaines après l’injection des cellules), un examen complet sera effectué. Il comprendra un examen d’imagerie IRM, un examen d’imagerie échographie et une mesure de la pression tumorale, tous réalisés au sein d’une même anesthésie gazeuse. Pour la mesure de la pression tumorale, un capteur de pression ressemblant à une aiguille sera introduit au centre de la tumeur pour obtenir des mesures de pression qui seront comparées avec les mesures d’imagerie. Cette comparaison permettra de valider l’intérêt de l’imagerie IRM et échographie comme méthode de mesure de pression non-invasive. Au total, cette intervention aura une durée de 2h pour chaque animal, avec environ 1h15 d’acquisition d’images IRM, 30 min d’acquisition échographique et 15 min de mesures de pression.

Impact sur les animaux

Des cellules tumorales seront injectées dans le flanc droit de l’animal, ce qui peut occasionner un stress ou une légère douleur au point d’injection. La croissance tumorale peut engendrer une gêne, voire une perte de poids pour l’animal. Cette perte de poids sera en revanche limitée, car surveillée deux fois par semaine. De plus, la taille de la tumeur ne devrait pas excéder les 1000 mm3, ce qui limite de potentiels effets indésirables sur la mobilité de l’animal. Le fait d’être maintenu immobile pour l’imagerie et passer à l’intérieur d’un tunnel d’IRM avec un diamètre réduit peut être une source de stress pour l’animal. Cependant, les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress que l’examen peut engendrer. L’animal est surveillé et maintenu au chaud quand il est sous anesthésie, et la durée est limitée le plus possible, pour éviter d’éventuels effets indésirables de l’anesthésie tels que l’hypothermie (refroidissement de l'animal) et la diminution du rythme respiratoire.

Devenir

A la suite de l’examen complet (imageries et mesure de pression), les animaux seront euthanasiés et la lésion tumorale sera disséquée. Des analyses d’histologie seront réalisées pour obtenir des informations sur la composition tumorale. Ces analyses consistent en des coupes fines de la tumeur qui seront passées au microscope pour quantifier les éléments (cellules, fibres de collagène) qui composent la tumeur. Ces données seront corrélées avec les mesures obtenues en imagerie.

Remplacement

A notre connaissance, il n’y a pas d’alternatives en dehors d'un système vivant (construction de cellules ou morceaux de tumeurs) ou de modélisation numérique qui ont été validées et qui peuvent être utilisées comme solution de remplacement. Afin de valider l’imagerie comme solution non-invasive de mesure de la pression tumorale, les mesures doivent être effectuées sur des modèles animaux afin de reproduire l’environnement hétérogène et les propriétés tumorales qui pourront être retrouvés en clinique chez les patients atteints de lésions tumorales.

Réduction

Les dispositifs d’imagerie utilisés dans ce projet ont déjà été validés en amont, ce qui évite d’avoir une phase de test et de validation sur petit animal. Le nombre d’animaux par groupe a été défini selon des données obtenues précédemment et les données de la littérature.

Raffinement

En plus du suivi quotidien standard, un suivi clinique aura lieu deux fois par semaine : l’état de l’animal sera noté à l'aide d'une grille de score, avec surveillance du poids, de son apparence, de son comportement et de la taille de la tumeur. En cas d’atteinte des points-limites, l’animal sera euthanasié. En cas de score intermédiaire, une injection d’antidouleur sera réalisée et le suivi clinique sera réalisé quotidiennement. Tous les examens seront effectués sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress provoqués par les examens. La durée des examens sera réduite au maximum (temps total prévu de 2 heures au maximum) et tous les examens seront réalisés au cours de la même anesthésie pour éviter plusieurs anesthésies successives. Les animaux seront maintenus dans des cages de cinq maximum afin qu’ils aient suffisamment d’espace et qu’ils maintiennent un comportement social. Du matériau favorisant la nidification leur sera fourni. Les animaux seront hébergés en animalerie avec un statut adapté et manipulés sous hotte.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour cette étude, car elles permettent de greffer en sous-cutané des modèles de tumeurs humaines. Les dispositifs d’imagerie ont été développés pour les souris. De plus, la plupart des études d’imagerie sur tumeurs greffées en sous-cutané ont été réalisées sur des souris et il est donc plus aisé de trouver des informations dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés au stade adulte (au moins 8 semaines) afin de bénéficier d’animaux plus grands et plus à même de supporter les lésions tumorales étudiées. De plus, les cancers du sein et du pancréas sont généralement observés chez des patients adultes.

Jusqu'à huit chocs à la tête et vingt séances d'imagerie sous anesthésie de deux heures étalées sur quatre-vingt-dix jours : 1 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles reçoivent aussi un radiotraceur et passent trois tests comportementaux répétés à cinq dates, coordination motrice, mémoire spatiale et anxiété, pour suivre l'état de la barrière hémato-encéphalique après une commotion cérébrale. Le porteur décrit des signes passagers de désorientation et de baisse d'activité après le traumatisme, et compte sur ces travaux pour mieux diagnostiquer les séquelles chez les sportifs et les militaires. Il retient la souris parce que son cerveau ressemblerait au nôtre sur ces points, et choisit des animaux de quatre à huit semaines, jeunes adultes encore capables de récupérer d'un stress.

Objectifs

Le traumatisme crânien léger, aussi appelé commotion cérébrale, est une blessure du cerveau souvent considérée comme bénigne, mais qui peut avoir des effets à long terme, notamment sur la mémoire, l’humeur ou le comportement. Certaines études montrent qu’il pourrait être lié à des maladies neurodégénératives comme Alzheimer. Ce projet vise à mieux comprendre les effets du traumatisme crânien léger sur une structure protectrice du cerveau appelée la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cette barrière empêche les substances indésirables de pénétrer dans le cerveau. Après un choc, elle pourrait devenir plus perméable, favorisant des réactions inflammatoires durables. Grâce à des techniques d’imagerie avancées (notamment la tomographie par émission de positons, TEP) et à un modèle expérimental chez la souris, nous allons observer comment la BHE est modifiée après un choc à la tête, et pendant plusieurs semaines. Ces recherches permettront de mieux évaluer les risques, améliorer le diagnostic et, à terme, aider à mieux prendre en charge les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet a avant tout pour but d’améliorer la compréhension des effets à court et long terme d’une commotion cérébrale (ou traumatisme crânien léger) sur le cerveau et sur sa barrière naturelle, la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui pourrait être fragilisée après un choc. Les résultats pourront servir à identifier de nouveaux outils pour diagnostiquer plus tôt les complications liées aux traumatismes crâniens, mieux évaluer les risques à long terme, et adapter la prise en charge des personnes exposées de manière répétée, comme les sportifs ou les militaires. Ce projet pourrait donc contribuer à mieux prévenir les séquelles neurologiques liées aux commotions cérébrales.

Procédures

Les interventions prévues sont listées ci-dessous : • Réalisation sous anesthésie gazeuse d’un traumatisme crânien léger (ou commotion cérébrale) (durée 1 seconde répétable 8 fois au maximum, 1078 animaux) • Réalisation au maximum de 20 sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, espacé sur 90 jours, 1232 animaux) • Injection d’un radiotraceur, sous anesthésie générale (durée 1 min ; 1232 animaux) • Des tests comportementaux seront réalisés chez 1232 souris. Chaque animal réalisera trois types de tests évaluant la coordination motrice (10 min), la mémoire spatiale (15 min) et l’anxiété (10 min). Ces tests seront conduits à J3, J15, J30, J60 et J90 selon un calendrier alterné pour limiter la fatigue. La durée cumulée n’excédera 30 minutes par session et par animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans la cage de l’animal. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important. • Après le traumatisme crânien les souris peuvent montrer des signes passagers de désorientation, de baisse d'activité ou de modifications légères de leur comportement..

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les organes d’en analyser leur composition aux niveaux cellulaires et tissulaires. Ces analyses permettront d’obtenir des informations supplémentaires sur les mécanismes biologiques en jeu, notamment la distribution des biomarqueurs d’intérêt. Elles serviront surtout à valider et à interpréter les résultats obtenus par imagerie, en s’assurant que les signaux observés reflètent bien des altérations réelles et spécifiques de la barrière hémato-encéphalique.

Remplacement

Ce projet utilise un modèle animal (la souris) car il n'existe pas, à ce jour, de méthode alternative permettant d'étudier de manière fiable et complète les effets d’un traumatisme crânien léger (comme une commotion) sur le cerveau vivant. En particulier, il s’agit ici d’observer la barrière hémato-encéphalique (BHE), une structure essentielle qui protège le cerveau, et de suivre dans le temps ses éventuelles altérations à l’aide d’imagerie cérébrale et de tests comportementaux. Aucun modèle informatique ou sur cellules ne permet aujourd’hui de reproduire toutes les réactions complexes du cerveau après un choc : inflammation, circulation sanguine, comportements, etc. Les souris sont donc utilisées pour observer ces effets dans un organisme entier, en conditions réelles. Cependant, afin de réduire le recours aux animaux, les étapes de préparation du projet (comme les tests sur les doses ou les images de référence) sont réalisées autant que possible à partir de données déjà existantes ou sur cellules.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences pharmacocinétiques au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et toute forme d'inconfort chez les animaux, conformément au principe de Raffinement. Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 1 à 2 semaines avant toute procédure, afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social, et manipulées de manière douce et progressive pour réduire leur stress. Un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé, qui observera leur comportement, leur aspect général, leur poids, ainsi que leur consommation d’eau et de nourriture. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de mal-être. Toutes les procédures pouvant causer une gêne (examens d’imagerie, injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Pendant l’anesthésie, leur respiration et leur température seront surveillées. Le réveil se fera dans leur cage habituelle ou avec leur propre litière pour limiter le stress. Un système d’observation rigoureux des animaux a été mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance, bien que toutes les précautions soient prises pour les éviter. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Enfin, les différentes étapes expérimentales sont espacées dans le temps pour permettre aux animaux de récupérer entre les procédures.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utilisons des souris car elles sont l’un des modèles les plus couramment employés en recherche biomédicale. Elles présentent des similitudes importantes avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne la barrière hémato-encéphalique (BHE), les processus inflammatoires et les réactions au traumatisme crânien. Leur petite taille, leur génétique bien connue et la possibilité de suivre leur comportement en détail en font un modèle adapté pour ce type d’étude. Les souris utilisées ont entre 4 et 8 semaines au début des expériences. Cet âge correspond à un stade jeune adulte, c’est-à-dire à un moment où le cerveau est complètement formé, mais où l’animal est encore en bonne santé et capable de récupérer d’un stress. Ce choix permet de mieux modéliser les effets du traumatisme crânien léger (TCL) chez l’humain adulte, tout en garantissant que les résultats soient pertinents et reproductibles.

Issues du cheptel de l'établissement, 40 brebis sont saillies pour en retenir 25 gestantes, dont les agneaux entreront eux aussi dans le protocole. 160 moutons au total vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, 141 tués et 19 renvoyés à l'élevage. Les brebis gestantes reçoivent huit injections intramusculaires sur dix-huit semaines pour reproduire un syndrome des ovaires polykystiques, leurs descendants subissent quatorze prises de sang de la naissance à vingt-quatre semaines, et les femelles pubères jusqu'à 36 prélèvements par cathéter jugulaire, immobilisées douze heures en cage individuelle sans pouvoir se retourner. Le porteur écrit en majuscules que le nombre de brebis a été doublé "suite à un problème sanitaire, résolu depuis", sans dire combien d'animaux la première version prévoyait.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la cause la plus fréquente d'infertilité féminine (8 à 13 % des femmes en âge de procréer dans le monde). Les critères du diagnostic du SOPK sont basés sur au moins deux des trois caractéristiques suivantes : 1/ irrégularité ou absence des règles, 2/ un taux élevé d’hormones masculines dans le sang, et 3/ ovaires renfermant de nombreux kystes folliculaires de 2 à 6 mm. La plupart des patientes atteintes de SOPK présentent également des taux d'hormone AMH (anti-müllérienne) et LH (hormone lutéinisante) élevés. De plus, ce trouble est généralement associé à une résistance à l'insuline, de l’obésité, des taux de cholestérol élevés et une hypertension artérielle. Il est important de noter que la plupart des caractéristiques du SOPK sont transmises aux filles des femmes atteintes de ce syndrome, puisque 60 à 70 % de leurs filles développent ce syndrome. Malgré le nombre de femmes touchées par ce trouble, les causes du SOPK restent incomprises. Parmi les facteurs impliqués dans le SOPK, les androgènes, et l'AMH ont été reconnus comme jouant un rôle central. L'hypothèse actuelle est que l’excès d'androgènes ou d'hormones sexuelles masculines durant la grossesse pourrait entraîner des modifications au niveau de l’activité ovarienne et la sécrétion de certaines, ce qui entraînerait le développement du SOPK à l'âge adulte. Notre projet qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) a pour objectif de tester si un anticorps dirigé contre l’AMH peut supprimer les défauts d'ovulation observés dans un modèle de brebis ayant reçu un excès d'androgènes mimant le SOPK chez la femme. En effet, la brebis est une espèce proche de la femme en terme de développement ovarien. Nous étudierons également chez la mère et chez ses descendants mâles les conséquences d’un taux élevé d’hormones masculines au niveau des tissus périphériques et reproducteurs.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de constituer un corpus de données visant à évaluer si un anticorps anti-AMH est un bon candidat pour des essais ultérieurs chez l'humain, en l'occurence chez la femme développant un syndrome des ovaires polykystiques. Elle permettra aussi de mieux comprendre les effets moléculaires de la testostérone chez la femme et les conséquences chez la descendance mâle.

Procédures

Pour les 40 brebis adultes : 1 prise de sang (PS) intra-veineuse (IV) (jugulaire) sera réalisé à 18 jours après la saillie. Pour les 25 brebis gestantes sélectionnées : 8 Injections intra musculaire (IM) sur 18 semaines. 4 PS IV (jugulaire) pendant la gestation. Pour tous les descendants mâles (n=20) : 14 Prises de sang par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Pour tous les descendants femelles (n=20) : 14 PS par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Autour de la puberté, 6 PS par IV (jugulaire) sur 3 semaines. 1 anesthésie générale pour 1 passage à l’IRM à la puberté. Pose de cathéter à la puberté sous anesthésie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Pour les femelles pubères issues des mères androgénisées (n=16) : 18 Prises de sang sur 9 semaines. 4 injections intra veineuse (jugulaire). 1 anesthesie genérale pour un passage à l’IRM après l’injection de l’anticorps. 1 pose de cathéter après le passage à l’IRM sous anesthesie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Dans l'EU1 seront effectuées toutes les expérimentations sauf l'anesthésie générale et le passage à l'IRM qui seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les differentes injections peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose des cathéters jugulaires peut entraîner des douleurs au point d'injection. Pour les animaux traités, il existe un risque d’apparition de kystes et d’anomalies de la vessie (observés par IRM). Il peut arriver mais trés rarement des signes extérieurs associés à une douleur comme une dérivation urinaire entre les cuisses qui peut entrainer des brûlures. Les nuisances en lien avec l’anesthésie de l’IRM sont une irritation des voies respiratoires lors de l’intubation et l’extubation, un possible hématome lors l’intraveineuse et un potentiel stress lors des manipulations.

Devenir

Sur les 40 brebis saillies, 25 seront utilisées, les 15 brebis non selectionnées retourneront à l'élevage. Les 25 brebis sont nécessaires afin d'obtenir suffisamment de descendants femelles pour tester l'effet de l'injection d'anticorps . Une fois l'agnelage effectué, les 20 brebis androgénisées et les 5 témoins seront euthanisées afin de récupérer les tissus périphériques et reproducteurs pour une analyse moléculaire. Sur les 40 descendants, 4 descendants femelles issues des mères témoin pourront retourner sur l'élevage. Ainsi, seront euthanasiés 12 descendants mâles issus des mères androgénisées et 4 descendants mâles issus des mères témoin mais aussi 16 descendants femelles injectés soit avec l'anticorps (n=8) ou avec une solution témoin (n=8) afin de pouvoir mener une étude moléculaire sur les tissus périphériques et reproducteurs.

Remplacement

Nous ne pouvons tester les anticorps que sur un organisme entier. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. D'autre part, il a été démontré dans la littérature que la brebis androgénisée est un bon modèle syndrome d'ovaires polykystiques chez la femme.

Réduction

Nous allons utiliser 25 brebis gestantes, 20 (16+4) agneaux mâles et 20 (16+4) agneaux femelles jusqu’à la puberté. Ce nombre a été estimé en utilisant un test de comparaison de deux moyennes (nombre de follicules antraux) dans chaque groupe. Avec des lots de 8 descendants femelles issues de mères androgénisées cela donne une puissance tout à fait satisfaisante. Afin d’avoir 16 brebis issues de mères androgènisées, il faut partir d’au moins 20 brebis au départ. Afin de vérifier que le traitement de testostérone fonctionne, nous suivrons également 5 brebis qui seront non traitées, et leurs descendants.

Raffinement

NOUS MAINTIENDRONS LES AGNEAUX SOUS LEUR MÈRE, CONTRAIREMENT À CE QUI ÉTAIT PRÉVU INITIALEMENT. CETTE STRATÉGIE PRÉSENTE UN DOUBLE AVANTAGE : D’UNE PART, LA PROTECTION VACCINALE DES MÈRES SERA TRANSMISE AUX AGNEAUX VIA LE COLOSTRUM, RENFORÇANT AINSI LEUR IMMUNITÉ PASSIVE ; D’AUTRE PART, LA PRÉSENCE MATERNELLE FAVORISERA UNE TRANSITION ALIMENTAIRE PLUS PRÉCOCE VERS LE FOURRAGE, APPORTANT UNE PROTECTION DIGESTIVE SUPPLÉMENTAIRE. Les animaux seront gardés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. LA PÉRIODE D’ACCOUPLEMENT SERA AVANCÉE DE 15 JOURS PAR RAPPORT AU RESTE DU CHEPTEL POUR PERMETTRE UNE SURVEILLANCE RENFORCÉE DES NOUVEAUX NÉS PAR LE PERSONNEL ZOOTECHNIQUE. Pour limiter les stress liés à la manipulation, ils seront visités tous les jours avec contact direct ou non, permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Nous récompenserons les animaux après chaque session de prises de sang en distribuant du concentré à l’auge excepté lorsqu’un suivi métabolique sera prévu sur ces prélèvements. Lors de la pose des cathéters, le comportement et l'apparence des brebis (notamment au niveau de l’implantation du cathéter) seront suivis avec attention. Les animaux seront maintenus en cage individuelle (107 cm de long sur 67 cm de large) le temps des prélèvements (12 heures), ils ne pourront pas se retourner mais auront tout de même un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Avant toute injection intramusculaire ou intraveineuse, une application de gel antalgique (type Vétobiol) sera réalisée. Les deux veines jugulaires seront utilisées en alternance pour limiter le risque d’hématome. Les animaux seront mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie pour le passage à l’IRM, afin de limiter tout risque de régurgitation. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Le transport des animaux avant l'opération et leur retour sera réalisé par un technicien formé et expérimenté dans une bétaillère agréée pour le transport d'animaux vivants. Le trajet est de moins de 5 minutes et la bétaillère sera abondamment remplie de paille.

Choix des espèces

SUITE À UN PROBLÈME SANITAIRE, RÉSOLU DEPUIS, LE NOMBRE DE BREBIS A ÉTÉ DOUBLÉ. Afin de pouvoir mimer le SOPK chez la femme nous souhaitons utiliser des brebis gestantes pour plusieurs raisons : 1. contrairement aux rongeurs, la brebis présente l'avantage d'avoir un développement ovarien similaire à la femme. 2. De plus, ce modèle a déjà été validé dans nos unités. - 40 brebis saillies seront utilisées pour la détection de 25 brebis gestantes qui rentreront dans la procédure. Cet effectif doit permettre d'assurer la production de descendants assez conséquente pour poursuivre nos travaux. - 20 descendants mâles seront étudiés de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 20 descendants femelles seront étudiées de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 16 femelles pubertes sur les 20 entreront dans la 2ème phase de l’expérimentation (de J168 jusqu’à J235).