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Programme d’immunisation de poules pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Recherche appliquée
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Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.
Procédures
5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole
Raffinement
Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)
Choix des espèces
La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.
Evaluation d’une nouvelle formulation d’un agent de contraste en échographie dans le cadre du diagnostic de tumeur dans le foie
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
La demande vient d'un fabricant qui veut une formulation prête à l'emploi de son agent de contraste échographique, la version autorisée en Asie imposant une reconstitution avant injection et une lyophilisation très polluante. 28 lapins vont être utilisés pour comparer trois formulations candidates, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La moitié reçoit deux ou trois fragments de tumeur implantés dans le foie par une incision abdominale de 3 cm, chaque animal étant anesthésié jusqu'à quatre fois, pour des durées de une à deux heures trente. Les 16 lapins porteurs de tumeurs hépatiques sont tués, les 12 autres devant être réutilisés dans un autre projet ou confiés à une association de replacement, et le porteur affirme que l'animal entier est "essentiel" pour suivre la diffusion du produit, une modélisation restant hors d'atteinte faute de données publiées.
Objectifs
Les agents de contraste sont des produits injectés par voie veineuse lors d’un examen échographique afin d’améliorer le contraste entre les différents tissus. Le principe est basé sur la présence de microbulles gazeuses à l’intérieur du produit qui vont augmenter le contraste échographique lors de leur passage. Un agent de contraste autorisé surtout en Asie présente un taux de détection des tumeurs du foie très important. Cependant, il n’est pas autorisé en Europe car il doit être préparé avant injection (ajout d’un liquide dans les bulles déshydratées). Ce processus est contraignant en clinique et une fois reconstitué, le produit ne reste stable que 2 heures maximum et doit donc être utilisé rapidement. Enfin, le process de fabrication implique une étape de lyophilisation qui est extrêmement polluante (émission d’un gaz à effet de serre). C’est pourquoi le fabricant souhaite à présent développer une nouvelle formulation du produit qui soit prête à l’emploi, sans passer par une étape de lyophilisation. Trois formulations potentielles sont disponibles et doivent à présent être testées dans un organisme vivant afin de finaliser la validation du produit prêt à l’emploi. L’objectif de cette étude est 1) de sélectionner parmi les 3 candidats celui qui a le meilleur potentiel et 2) de comparer ce candidat final au produit de référence afin de valider qu’il présente bien les mêmes caractéristiques biologiques.
Bénéfices attendus
Ce produit de contraste est très reconnu dans les pays où il est autorisé dans le cadre du diagnostic des tumeurs hépatiques. Cependant, le fait qu’il soit à reconstituer et que sa production génère un gaz à effet de serre est un frein à sa mise sur le marché en Europe notamment. Si une des formulations prêtes à l’emploi s’avère être aussi performante que la formulation d’origine, il sera un outil supplémentaire en diagnostic des tumeurs hépatiques.
Procédures
La moitié des animaux subiront une petite incision de 3 cm en haut de l’abdomen pour placer 2 ou 3 fragments de tumeurs dans le foie puis l’ouverture sera suturée (muscle puis peau). Cette intervention durera environ 20 min. Les animaux seront anesthésiés 4 fois maximum (une contention de 10 secondes et une injection dans les muscles du dos). Les anesthésies dureront entre 1h et 2h30. Les animaux seront pesées 2 fois par semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables sur l’animal sont principalement marqués par : * Stress lors des contentions pour les prémédications avec douleur lors de l’injection * nuisances liées à la chirurgie : - douleur possible au niveau de la zone chirurgicale * nuisances liées au suivi : - pesée et examen clinique deux fois par semaine (stress).
Devenir
12 animaux seront réutilisés dans un autre projet si un autre projet nécessite des lapins au même moment ou ils seront replacés par l’association White Rabbit. Les 16 autres animaux seront mis à mort car ils auront des tumeurs dans le foie.
Remplacement
Une phase de mise au point a été réalisée sur cadavre issu d’un autre projet. L’évaluation du produit de contraste passant par le temps de diffusion, l’animal en entier est essentiel pour voir le comportement du produit à travers l’organe cible après avoir circulé dans la circulation générale. Une modélisation pourrait être créée mais il n’existe pas suffisamment de données à l’heure actuelle (une seule publication trouvée avec la même méthode de mesure).
Réduction
Le fait que le lapin soit son propre contrôle (il recevra toutes les formulations) permet de réduire de moitié le nombre d’animaux. Les mesures seront répétées 2 ou 3 fois par animal et ces données seront moyennées ce qui permettra de réduire l’effet de la variabilité intra individuelle (fréquence cardiaque, température centrale...). Une méthode statistique a permis de calculer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront réchauffés et monitorés pendant les anesthésies. Les animaux seront hébergés par deux ou trois. Si les animaux sont incompatibles, ils bénéficieront de temps dans un espace de « jeux » plus grand que leur cage comportant cabane, tunnel, hamac... Ces temps de 30 min maximum, permettent aux animaux d’exprimer leur comportement de curiosité. Les animaux sont habitués aux techniciens par des temps d’échanges et distribution de friandises. L’état des animaux est évalué par un score basé sur la position des oreilles, l’aspect du poil et l’alimentation. 12 animaux seront replacés s’ils ne peuvent pas être réutilisés sur le champ dans un autre projet.
Choix des espèces
Le lapin est l’animal le plus petit permettant d’utiliser le matériel d’échographie humaine. De plus le lapin est le seul gros animal pour lequel on dispose d’un modèle tumoral permettant de tester les formulations dans le contexte dans lequel elles seront utilisées. L’ expertise sur la pousse tumorale est sur le lapin jeune adulte, c’est pourquoi ce stade de développement est choisi.
Développement et évaluation de l’effet thérapeutique de cellules immunitaires modifiées pour l’immunothérapie dans des modèles de tumeurs solides chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 969 souris vont être utilisées, 7 744 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune recevant une greffe de cellules tumorales dans le cerveau ou dans le vitré des deux yeux. Après une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie, certaines portent un dispositif intracérébral relié à une pompe implantée dans le dos, et toutes passent deux à trois séances d'imagerie par semaine, avec trois ponctions de liquide céphalorachidien de trente minutes et une prise de sang toutes les deux semaines. La perte de vision provoquée par les tumeurs oculaires est présentée comme sans conséquence, la vue n'étant pas l'organe sensoriel prédominant chez les rongeurs, et les deux yeux sont greffés pour diviser par deux le nombre d'animaux. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de lymphome cérébral primitif ou de glioblastome restent renvoyés à des travaux précliniques que le porteur reconnaît nécessaires, toutes les souris étant tuées pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire est l’ensemble des éléments du corps qui surveillent et détruisent les cellules anormales. Malheureusement les cellules cancéreuses arrivent souvent à passer outre ce système. L’immunothérapie a été développée ces dernières années afin de réactiver le système immunitaire contre les tumeurs et de très bons résultats cliniques ont été rapportés. En utilisant une technique appelée thérapie cellulaire adoptive, nous permettons à certaines cellules du système immunitaire de reconnaitre spécifiquement la tumeur. Elles sont ensuite perfusées chez les patients cancéreux dans le but de reconnaître, de cibler et de détruire les cellules tumorales. L'immunothérapie cellulaire a montré récemment des résultats extrêmement prometteurs en utilisant des cellules modifiées et particulièrement dans le cas des cancers hématologiques (certains lymphomes et leucémies). Cependant, des résultats moins encourageants ont été observés dans certains cancers. Dans ce projet, nous allons génétiquement modifier les cellules immunitaires afin de les rendre plus efficaces et élargir leur utilisation à d’autres cancers. Les expériences proposées vont permettre d’identifier de nouveaux mécanismes anti-tumoraux et de nouvelles méthodes de traitement qui seront directement applicables dans le domaine d’immunothérapie des cancers.
Bénéfices attendus
De façon générale, la thérapie cellulaire adoptive correspond à l’expansion in vitro de cellules qui reconnaissent spécifiquement les tumeurs avant leur réinjection chez les patients. Ce nouveau type de stratégie thérapeutique anti-cancéreuse a montré des résultats prometteurs dans les essais cliniques récents mais des améliorations doivent encore être apportées pour notamment augmenter l'activité et la persistance des cellules immunitaires modifiées en évitant les effets indésirables tels l'épuisement (rendant les cellules insensibles à une activation ultérieure) Dans notre laboratoire, nous avons identifié un gène agissant comme un régulateur clé de la différenciation et formation de la mémoire immunologique de ces cellules. Nous avons observé que des cellules modifiées où ce gène a été génétiquement désactivé, sont beaucoup plus efficaces pour éradiquer des cellules tumorales dans un modèle de leucémie aigüe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les bénéfices de ces modifications, dans des modèles de tumeurs solides. Dans un premier temps, nous travaillerons sur des tumeurs associées à un mauvais pronostic chez les patients : comme le lymphome cérébral primitif (LCP) et le glioblastome. Les cellules modifiées que nous allons développer dans cette étude représentent une option thérapeutique intéressante pour ces patients mais des travaux précliniques restent nécessaires. Le projet permettra de faire des avancées majeures dans le domaine de la thérapie cellulaire adoptive dans le but d’améliorer le pronostic des patients atteints par ces cancers.
Procédures
Dans un premier groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectés dans le cerveau des animaux anesthésiés (durée anesthésie 30min). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Dans un second groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral sera installé (durée de l’anesthésie environ 1h30). Une semaine après l’intervention, les souris vigiles recevront des traitements directement dans le cerveau grâce au dispositif intracérébral (injection unique – durée du geste 5 min) Dans un troisième groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral relié à une pompe sous-cutanée implantée au niveau du dos de l’animal seront installés (durée de l’anesthésie environ 1h30). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Les trois groupes d’animaux seront suivis par imagerie à raison de 2 à 3 imageries/semaine. Les imageries seront réalisées sur animaux anesthésiés et dureront environ 15 min. De plus, nous prélèverons du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale (3 prélèvements à au moins deux semaines d’intervalle, durée du geste 30 min) ainsi que du sang sur animal vigile (1prélèvement toutes les deux semaines, durée du geste inférieur à 20sec) Concernant les greffes intraoculaires de cellules tumorales, les cellules seront injectées dans le vitré, sous anesthésie générale et avec antalgie adaptée. La procédure dure entre 10 et 15 minutes par œil. L’évaluation de la croissance tumorale sera réalisée de façon non invasive, soit par examen ophtalmologique (ophtalmoscopie indirecte ou par photographie du fond d’œil, quotidiennement pendant 3 jours après la greffe puis 1 fois par semaine, durée de l’examen 15 min) soit par bioluminescence (2 fois par semaine, durée de l’examen 15 min), sous anesthésie. Le traitement sera délivré 1 fois par voie intraveineuse sur animal vigile (durée du geste inf à 20 sec), ou par injection intravitréenne sur animaux anesthésiés ((durée 15 min). L’évaluation de la réponse au traitement sera réalisée de façon identique à l’évaluation de la croissance des cellules tumorales greffées.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales au niveau du cerveau vont développer des tumeurs. Les souris peuvent perdre du poids dans les jours qui suivent la chirurgie et/ ou présenter, dans de rares cas, des troubles moteurs (comportement rotatoire et/ou troubles de l’équilibre). Le traitement des souris par voie intraveineuse provoque uniquement la douleur de l’aiguille utilisée pour l’injection. Dans certains cas, des dermatites peuvent se développer 3 semaines après l’injection provoquant une perte de poils à long terme. Le traitement des souris par voie intracérébrale peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2-3 jours. Le prélèvement sanguin provoque la douleur de l’aiguille et dans de rares cas une perte de poids de l’animal. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2 jours. Les animaux greffés au niveau de l’œil développeront une tumeur dont la croissance n’est pas douloureuse mais qui entrainera une baisse de la vision. Cette baisse de la vision n’aura pas de conséquence sur les animaux (sociabilisation, alimentation), ni sur le poids de l’animal, la vue n’étant pas l’organe sensoriel prédominant chez les rongeurs. Dans de rares cas, des réactions inflammatoires ou infectieuses pourront être observées suite à la greffe ou l’administration de traitements
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture. En résumé, on a découvert que certaines modifications comme l’inactivation d’un gène spécifique induit une survie prolongée de certaines cellules immunitaires, appelés les lymphocytes T. L’association de plusieurs modifications génétiques sur ces cellules devrait améliorer l’effet antitumoral des cellules modifiées. D’autre part, un grand nombre d’études ont montré l’effet délétère de certains messagers, appelés cytokines, sur le système immunitaire . Le fait de bloquer certains de ces messagers, en ajoutant des inhibiteurs de cytokines au traitement, devrait améliorer, in vivo, l’effet antitumoral des cellules modifiées. Pour valider cette hypothèse, le modèle animal est nécessaire. En effet, après la validation in vitro des bénéfices de ces traitements par différents types de cellules, il est nécessaire de les évaluer dans un système plus physiologique avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. A ce stade, l’utilisation d’animaux est indispensable pour valider les mécanismes de régulation et d’action de ces traitements, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 10 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, car de notre expérience, il y a toujours une certaine hétérogénéité entre souris. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés. Pour finir, le suivi de croissance tumorale et évaluation de la réponse au traitement se fait in vivo, par imagerie de façon longitudinale et répétée, ce qui évite de devoir prévoir des animaux pour différents time points précis. Les deux yeux sont greffés afin de diminuer par deux le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 7 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Toutes les expérimentations sont réalisées sur tapis chauffant, et le réveil est réalisé sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante. Pour les animaux ayant subis une chirurgie cérébrale ou une injection intraoculaire des soins pré et post-opératoires sont appliqués pour prévenir et/ou gérer la douleur. Un supplément alimentaire hydratant est mis à disposition dans les cages jusqu’au rétablissement complet de la souris (récupération du poids, absence de signes extérieurs de souffrance, absence de troubles moteurs). Pour limiter les effets secondaires dus à l’injection des cellules modifiées, comme les dermatites, nous étudierons l’effet de la délétion d’un gène potentiellement responsable de ces effets secondaires. Ces animaux sont surveillés quotidiennement pour évaluer leur état général et deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans une grille bien définie. Cette grille de score permet d’évaluer, de façon objective et spécifique, l’état global de l’animal (poids, état physique général, comportement moteur). Elle est adaptée à chaque type de procédure. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées.
Mécanismes l’infection et de la transmission de Plasmodium
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 125
Quinze à trente minutes de piqûres de moustiques sur un animal profondément anesthésié, une ponction cardiaque, ou une perfusion du foie qui tue: 5 025 souris et 125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 150 d'entre eux anesthésiés et tués avant tout réveil. Infectés par une injection unique, ils subissent ensuite une ponction quotidienne de la queue pendant sept jours au maximum, jusqu'à ce que la parasitémie voulue soit atteinte. L'objet est d'amplifier un parasite du paludisme murin pour étudier ses formes dormantes dans le foie, le porteur écrivant que la souris et le rat servent de "simples flacons de culture cellulaire" à une étape du cycle parasitaire, et reconnaissant que le projet "ne comporte pas de considérations statistiques". Les rats sont retenus pour le volume de sang qu'ils fournissent, et les animaux sont inoculés à trois ou quatre semaines parce qu'ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de comprend la biologie du parasite Plasmodium et de ses interactions avec l'hôte, en particulier dans le foie. Le foie est le premier organe humain ciblé par les parasites du Paludisme dès leur entrée dans le corps par la piqûre de moustiques Anopheles infectés, où une première phase d'amplification massive aura lieu avant que les parasites matures ne soient libérés dans le sang pour causer la maladie. Le foie est également le réservoir des formes dormantes du parasite, qui provoquent des rechutes et maladie chronique. Malgré son importance reconnue pour les stratégies d'éradication, le développement de médicaments antipaludiques ciblant les formes hépatiques du parasite est entravé en raison de l'accès limité aux échantillons de parasites et aux moustiques infectés avec des souches humaines. Le modèle murin de paludisme surmonte ces limitations et permet de recréer l'ensemble du cycle de vie du parasite dans un environnement in vivo. Le projet concerne spécifiquement l'utilisation d'animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
En utilisant les parasites produits dans ce projet, nous espérons : 1) identifier les mécanismes moléculaires codés par les parasites impliqués dans l'induction et le maintien de la dormance, de l'activation et de la conversion sexuelle dans le foie, et 2) établir les relations bidirectionnelles entre le métabolisme de l'hôte et les développements cellulaires distincts du parasite et leur impact sur les résultats des traitements. Ce projet révélera les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dormance, aux rechutes et à la transmission des parasites du paludisme, et posera les bases du développement futur de biomarqueurs et nouvelles thérapies ciblant les réservoirs d'infection hépatique.
Procédures
Les animaux vigiles sont infectés par une injection unique. Une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue par ponction avec une aiguille à usage unique. Ce prélèvement est effectué quotidiennement, sur animal vigile, généralement à partir du troisième jour après l’injection et pour une durée maximale de 7 jours et nécessite moins d’une minute pour être réalisé. Lorsque la parasitémie désirée est atteinte, les animaux pour des prélèvements sanguins (par les moustiques pendant 15 à 30 minutes ou par ponction cardiaque). Les animaux non infectés utilisés pour la perfusion de foie sont profondément anesthésiés avant de procéder à la perfusion qui est létale.
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences, les animaux pourront subir quelques effets indésirables suite à des injections ou à des prélèvements sanguins. Ces effets indésirables sont de sévérité légère de courte durée. Le rongeur vigile ne souffrira que de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané et intraveineuse), ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue. Ces effets seront limités par l’utilisation d’aiguilles à la taille adaptée et à usage unique pour chaque animal. De plus, des analgésiques et un anesthésique local seront utilisés pour réduire les effets indésirables liés à l’injections. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par des méthodes validées par le CEEA avant que l'infection palustre ne devienne symptomatique. Un prélèvement de sang sans réveil par piqûre des moustiques ou par ponction cardiaque sera réalisé dans l’animal profondément anesthésié. La perfusion hépatique sera réalisée uniquement sur des animaux profondément anesthésiés et constitue une classe sans réveil.
Devenir
Les animaux injectés avec le parasite ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux utilisés pour le repas sanguin des moustiques sont anesthésiés puis mises à mort par dislocation cervicale avant leur réveil. Les animaux non infectés utilisés pour fournir des hépatocytes sous mis sous analgésie et profondément anesthésiés avant d’être perfusés ce qui est un acte létal.
Remplacement
Le modèle animal ne sera utilisé qu'à trois fins : 1) démontrer la transmission précoce des formes parasitaires sexuelles issues du foie, 2) générer des lignées de parasites transgéniques exprimant les régulateurs de la dormance ou de l'activation, et 3) produire des cellules hépatiques sauvages et transgéniques exprimant des biosenseurs métaboliques. Dans le cas où une nouvelle méthodologie est établie et devient disponible pour produire des lignées de parasites transgéniques dans le parasite du paludisme humain causant des rechutes (Plasmodium vivax), le modèle animal sera remplacé par des modèles de foie humain in vitro infectés par les lignées de parasites transgéniques humaines.
Réduction
Les animaux seront utilisés uniquement dans les situations où les expériences sur les animaux sont inévitables. Les protocoles de ce projet sont optimisés pour minimiser l'utilisation d'animaux et réduire au maximum la souffrance pendant les procédures expérimentales. Nous sommes conscients de l'impératif de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la recherche scientifique et la majeure partie de nos activités de recherche est réalisée in vitro. Cependant, certaines étapes nécessitent encore l'utilisation d'animaux, car il n’existe pas actuellement de système qui permette de reproduire le cycle de vie complet de Plasmodium berghei in vitro. Ce projet ne comporte pas de considérations statistiques, car l'utilisation des animaux se justifie principalement par la nécessité d'amplifier les populations de parasites Plasmodium chez les rongeurs. En termes simples, la souris ou le rat sont utilisés comme de simples "flacons de culture cellulaire" pour accomplir une étape très spécifique du cycle de vie du parasite – la réinfection des globules rouges – qui ne peut être réalisée ni in vitro ni ex vivo. Mis à part cette étape, toutes les autres phases du cycle de vie du parasite seront effectuées in vitro, en accord avec le principe de réduction. Des procédures similaires sont approuvées pour d'autres équipes de recherche à l'Institut Pasteur ainsi que dans des laboratoires à travers le monde. Nous adopterons des protocoles expérimentaux issus de publications largement citées et nous travaillerons à les améliorer en réduisant le nombre d'animaux nécessaires grâce à l'utilisation de nouvelles technologies plus efficaces pour éditer le génome du parasite.
Raffinement
La conception des protocoles prendra toutes les mesures appropriées pour éviter ou soulager la souffrance, la douleur, la détresse et l'inconfort. Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés, ainsi les animaux sont mis à mort avant l'apparition des symptômes et des complications physiologiques potentiellement mortelles. De plus, nous surveillons le comportement des animaux tous les jours en utilisant une échelle de détresse pour détecter d'éventuels problèmes de santé non prévus afin d'améliorer rapidement leur bien-être. Si nécessaire, du dietgel ou un enrichissement supplémentaire seront fournis. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont réalisées sous anesthésie générale profonde et analgésie, et les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort sera utilisée. Le poids sera enregistré une fois avant de démarrer l'expérience et ensuite tous les jours dès qu'un score dans l'Apparence ou le poids corporel est >0. Prises de décision : dès qu'un score est à 2, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei sont des espèces de rongeurs sauvages telles que Grammomys et Thamnomys, originaires d'Afrique centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et aux rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est largement reconnu dans la communauté scientifique que l'infection des rongeurs par ces parasites constitue un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l'homme. Ainsi, la valeur d'une recherche rigoureuse sur les rongeurs pour éclairer ou orienter la recherche chez l'homme est désormais solidement établie. L’utilisation de rats, tout aussi susceptibles à l’infection que les souris, a essentiellement pour but d’obtenir un volume sanguin important tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour préparer de grandes quantités d’érythrocytes infectés. Les animaux sont acclimatés pendant une période de 7 jours. Les inoculations de parasites seront effectuées sur des souris et des rats jeunes adultes âgés de 3 à 4 semaines, car ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection par le parasite.
Étude de l’évolution de biomarqueurs dans le sang et le liquide céphalo-rachidien au cours de la progression de la maladie d’Alzheimer chez 3 modèles murins de la pathologie
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsiées à la queue entre sept et dix jours de vie pour établir leur génotype, une partie des 803 souris subit ensuite jusqu'à six prises de sang, puis une chirurgie d'une heure pour implanter une sonde dans la tête. Ces souris-là vivent seules jusqu'à leur mort, sept mois au plus, le temps de trois ponctions de liquide céphalorachidien de quatre heures chacune réalisées sur animal éveillé. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 185 d'entre elles et modéré pour 618. Deux des trois lignées génétiquement modifiées développent des crises d'épilepsie ou une paralysie des pattes arrière, et toutes les souris finissent tuées pour que leur cerveau soit prélevé, y compris les reproductrices et celles qui ne portent pas la modification recherchée.
Objectifs
Il existe une demande croissante pour utiliser des biomarqueurs (substances ou signes mesurables dans le corps qui peuvent indiquer la présence d’une maladie) pour comprendre et identifier les maladies comme la maladie d'Alzheimer. Ces biomarqueurs aident à voir comment la maladie évolue, comment les gens réagissent aux traitements et ce qui se passe dans le cerveau. Mais certains de ces tests sont compliqués et coûteux, comme les prélèvements de liquide céphalorachidien (LCR) ou l’imagerie du cerveau. On essaie donc de trouver des façons plus simples, comme des tests sanguins, pour diagnostiquer Alzheimer. Cependant, on ne sait pas encore très bien comment certains de ces biomarqueurs dans le sang ou le liquide céphalorachidien sont liés aux problèmes dans le cerveau lui-même. Comprendre cela est important, surtout maintenant que les essais de médicaments se font de plus en plus tôt, avant même que les symptômes n'apparaissent. Ce projet vise à examiner de près ces signes dans le sang et le liquide céphalorachidien chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer pour mieux comprendre la maladie et sa progression.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre comment les biomarqueurs (substances ou signes mesurable dans le corps qui peuvent indiquer la présence d’une maladie) dans le sang et le liquide céphalorachidien (LCR) évoluent lorsque quelqu'un a la maladie d'Alzheimer et le lien entre ces changements et la façon dont la maladie se développe dans le cerveau, notamment en termes d’atteintes tissulaires cérébrales caractéristiques de la maladie. La contribution de ce projet pour la compréhension des mécanismes de la maladie pourrait ainsi aider à trouver de nouveaux traitements pour la ralentir. Ce projet pourrait également permettre d’identifier de nouveaux biomarqueurs dans le sang et le LCR afin d’aider au diagnostic précoce de la maladie, ce qui aurait un bénéfice réel pour les personnes à haut risque notamment, qui pourraient alors bénéficier d’un traitement avant même qu'ils aient des symptômes.
Procédures
Pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux génétiquement modifiés un prélèvement d’un fragment de l’extrémité de la queue sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours, une fois par animal, durée inférieure à 1 minute. Pour une partie des animaux 6 prélèvements de sang maximum seront réalisés par animal avec un minimum de 2 mois de récupération entre chaque prélèvement, durée inférieure à 3 minutes par animal. Il y aura deux méthodes pour prélever le liquide céphalorachidien (LCR) : -Pour une partie des animaux, une sonde sera implantée au niveau de la tête de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie adaptées (une fois par animal, durée : 1h). Ces animaux sont ensuite hébergés seuls pendant 7 mois maximum au cours desquels des prélèvements de LCR seront réalisés sur animal vigile : 3 maximum avec un minimum d’1 mois de récupération entre chaque prélèvement et durée de la collecte environ 4h. -Une autre partie des animaux sera anesthésiée, puis le LCR sera prélevé au cours d’une procédure chirurgicale (une fois par animal, durée 30 minutes), les animaux sont ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire. 2 des lignées génétiquement modifiées utilisées dans le projet présentent un phénotype dommageable au cours du développement de la pathologie. Concrètement, des problèmes moteurs dans les pattes-arrières peuvent survenir à partir de 9 mois d’âge pour une des lignées. Les animaux de la deuxième lignée pourront présenter des crises d’épilepsie occasionnelles. En fin de procédure l’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement d'échantillons pour connaitre leur patrimoine génétique. Pendant le prélèvement des échantillons de sang, l'animal est maintenu en contention ce qui peut générer un stress passager. Lors du prélèvement l’animal pourra ressentir une légère douleur et un inconfort de courte durée. À la suite du prélèvement il existe un risque rare d’hémorragie et/ou d’hématome. L'anesthésie générale utilisée pour la procédure chirurgicale et pour le prélèvement de liquide céphalorachidien peut entraîner une hypothermie et des problèmes cardiovasculaire et respiratoire. Après la chirurgie les animaux pourront ressentir une douleur et un inconfort. Un risque rare de complications existe en post-chirurgie telles que infections ou problèmes de cicatrisations. La canule de dialyse implantée pourra induire une gêne pour l’animal due à l’encombrement qu’elle génère. Après la chirurgie, les souris seront hébergées seules, s’agissant d’animaux grégaires cela pourra générer un stress. Elles seront isolées jusqu’à la fin de leur vie (pendant 7 mois maximum). Les souris des lignées génétiquement modifiées utilisées dans le projet peuvent avoir des problèmes de santé qui raccourcissent leur durée de vie, comme des crises d'épilepsie occasionnelles ou des difficultés de mouvement pouvant aller jusqu’à une paralysie, surtout au niveau des pattes arrière. Ceci pourra générer un stress pour les animaux et des pertes de poids.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de collecter leur cerveau pour réaliser des analyses. Les animaux reproducteurs et les animaux non porteurs du patrimoine génétique d’intérêt seront euthanasiés par une méthode réglementaire car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leurs modifications génétiques spécifiques.
Remplacement
Pour le déroulement de ce projet, il est essentiel d'utiliser des modèles animaux car nous nous concentrons sur le diagnostic et le pronostic de la maladie d’Alzheimer. Nous étudions un processus vraiment complexe qui ne dépend pas seulement des mécanismes de base de la maladie, mais aussi de la diffusion de protéines dans les fluides corporels (sang et liquide céphalorachidien). Dans d'autres modèles tels que les cellules, nous ne pouvons pas étudier la libération et la détection de ces molécules dans le corps.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques et statistiques du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment élaborées et publiées et de notre expérience. Ainsi nous avons défini qu’il nous faudrait des groupes de 10 à 30 souris en fonction du type de prélèvement (sang ou liquide céphalorachidien). Afin de prendre en compte un pourcentage de perte au cours des procédures, nous prévoyons plus d’animaux que ce nombre minimal. Bien entendu nous adapterons notre production et le nombre d’animaux inclus en procédure afin de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire (très probablement inférieur à ce qui est prévu ici). Nous estimons que nous utiliserons sur la durée du projet 803 animaux maximum. Lors de la procédure d’élevage nous piloterons la production de souris pour obtenir le nombre strictement nécessaire d’animaux pour nos lots expérimentaux. Pour l’évaluation des biomarqueurs, pour l’ensemble des lignées, nous utiliserons des femelles et des mâles afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits et permettre une meilleure transposition de nos résultats. Nous réaliserons une partie de nos prélèvements de liquide céphalorachidien (LCR) à plusieurs reprises sur un même animal nous permettant d’une part de réduire la variabilité inter-individuelle et d’autre part d’éviter l’euthanasie de l’animal après le prélèvement, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires à nos analyses.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les méthodes et le traitement des animaux lors des expériences et dans l'animalerie visent à assurer leur bien-être maximal avec le moins de contraintes possible. Les conditions de vie, les soins et les procédures expérimentales sont conçus pour minimiser toute douleur ou souffrance. Les animaux seront observés quotidiennement, toute anomalie sera suivie et tracée en lien avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA). Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Lors du prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux la portée complète sera apportée dans une pièce dédiée, au calme, dans leur cage d’origine avec la mère. Nous utiliserons du matériel adapté pour le prélèvement, désinfecté entre chaque animal afin d’éviter tout risque de contamination croisée ou infection. Le prélèvement sera limité à la taille la plus petite possible et réalisé sur de jeunes animaux. Les souriceaux seront surveillés immédiatement après le geste puis 20 minutes après environ pour s’assurer de l’absence de saignement et la bonne prise en charge par leur mère. Pour les souris de phénotypes dommageables, nous ferons des observations régulières pour les détecter. En élevage nous utiliserons seulement des mâles transgéniques pour favoriser la bonne prise en charge des petits par leur mère. En cas de signes de difficultés motrices nous mettrons en place un soutien nutritionnel. Pour les souris qui seront hébergées seules, nous fournirons un enrichissement supplémentaire tel que des maisonnettes, bâtonnet de bois à ronger, papier kraft, etc. La procédure chirurgicale sera réalisée avec une anesthésie et une analgésie adaptées. La température de l’animal sera maintenue durant toute la durée de l’anesthésie à l’aide d’un tapis chauffant et d’une chambre de réveil chauffée pour éviter toute hypothermie. Nous mettrons en place une surveillance accrue en post-opératoire et un soutien nutritionnel si nécessaire. De plus, si la canule de dialyse présente une gêne pour l’animal pour l’accès à la nourriture, nous retirerons la grille de croquettes et mettrons l’aliment à disposition directement dans la cage.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur la souris car il existe de nombreux modèles génétiquement modifiés déjà caractérisés, parmi eux nous avons choisi de travailler avec 3 modèles de maladie d'Alzheimer qui présentent un intérêt pour ce projet. Pour l’étude des niveaux de biomarqueurs nous réaliserons des prélèvements de l’âge d’1.5 mois jusqu’à l’âge de 18 mois afin de suivre leur évolution au cours de la progression de la pathologie.
Caractérisation de lignées de rats portant des mutations dans le gène CLCN4
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Placés seuls en cage de 17 h à 9 h pendant trois nuits, en gardant un contact visuel avec leurs congénères, pour un test de préférence du saccharose, les rats passent aussi des tests de locomotion, d'anxiété, de coordination, de force, de mémoire et de comportement compulsif, ainsi qu'une prise de sang et une mesure de la fonction musculaire sous anesthésie. 100 rats porteurs de mutations du gène CLCN4 vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet vise à vérifier si ces lignées reproduisent une maladie neurodéveloppementale rare, et le porteur indique qu'une des mutations rend les mâles "plus chétifs, plus agressifs". Hormis le test du saccharose, il désigne chaque test par ce qu'il mesure sans dire lequel est employé, et mentionne un "test impliquant de l'eau", après lequel les rats sont séchés sous une lampe chauffante, sans l'identifier.
Objectifs
La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.
Bénéfices attendus
Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.
Procédures
Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); AMENDEMENT - ajout d'un test pour évaluer la dépression (3*16h); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide AMENDEMENT - sous anesthésie. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant.
Impact sur les animaux
Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype, les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention durant quelques secondes. AMENDEMENT - une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux. AMENDEMENT - Le test de préférence du saccharose nécessite d'isoler les animaux pendant 3 nuits, tout en gardant le contact visuel avec leurs congénères: les animaux seront placés seuls dans des cages d'hébergement de 17h à 9h le lendemain matin pendant 3 jours. De 9h à 17h, les animaux retrouveront leur cage et leur congénère d'origine.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. AMENDEMENT- L'isolement des animaux lors du test de préférence du saccharose (3*16h) se déroulera dans des cages d'hébergement avec enrichissement (nid, bâton et balle à ronger). Ces cages sont transparentes et les animaux continueront d'avoir un contact visuel avec leurs congénères.
Choix des espèces
Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.
Détection précoce de la fibrose cardiaque dans un modèle de rat atteint de dystrophie musculaire de Duchenne par imagerie médicale non invasive
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
93 rats porteurs de la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, 36 d'entre eux étant anesthésiés puis tués sans reprendre conscience, les 57 autres subissant des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon leur groupe, ils reçoivent jusqu'à huit injections, subissent jusqu'à deux anesthésies générales d'une heure, une pose de cathéter, une scintigraphie et une IRM. Le but est de vérifier si la fibrose du cœur, première cause de décès chez les patients, se détecte par scintigraphie avant d'être visible autrement. Le porteur écarte le chien, modèle "gros animal" jugé lourd à manipuler, et la souris, qui ne reproduit la maladie que partiellement, et retient le rat comme intermédiaire.
Objectifs
La maladie de Duchenne est une maladie incurable causée par des mutations génétiques entraînant une maladie grave et progressive affectant les muscles. Les principaux symptômes de la maladie de Duchenne sont une fonte et une faiblesse musculaire associées à des anomalies cardiaques et respiratoires, conduisant finalement au décès des patients au cours de la troisième décennie de leur vie. L'insuffisance cardiaque est la principale cause de décès chez les patients. Bien que la cause cellulaire principale soit la mort des cellules cardiaques, il devient de plus en plus évident que d’autres cellules contribuent largement à la gravité et à la progression de la maladie, en particulier les cellules de fibrose. La fibrose cardiaque, entrainant une rigidité du cœur, apparaît en effet à un stade précoce de la maladie. Dans cette étude, nous visons à évaluer si les lésions précoces associées à la fibrose du cœur dans un modèle de rat de la maladie de Duchenne peuvent être détectées par scintigraphie non invasive. L'apparition de la fibrose dans le cœur sera également suivie non invasivement par imagerie de résonance magnétique. Si l'hypothèse testée dans cette étude est confirmée, la scintigraphie pourrait émerger comme marqueur précoce pour l'évaluation de nouveaux traitements dans la maladie de Duchenne, à la fois dans les modèles animaux et chez les patients.
Bénéfices attendus
Si l'hypothèse de ce projet est confirmée, le protocole de scintigraphie développé pourrait émerger comme indication précoce pour le suivi de la fibrose du cœur et l'évaluation de nouveaux traitements à la fois dans la maladie de Duchenne, mais aussi pour d'autres pathologies cardiaques, dans des modèles animaux et chez les patients.
Procédures
Un premier groupe de rats subira : Injection sous-cutanée vigile (
Impact sur les animaux
Les rats utilisés sont atteints de la maladie de Duchenne. Cependant, les animaux utilisés auront au maximum 5 mois, donc avant l'âge critique où leur état de santé se dégrade. Les seules interventions prévues qui ne se feront pas sous anesthésie générale sont les injections nécessaires à l'anesthésie des animaux. Cela peut générer un stress du à la manipulation des animaux et de la douleur au point d'injection. Les anesthésies générales peuvent causer de la fatigue.
Devenir
A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle alternatif pour tester les méthodes non invasive de détection du développement de la fibrose du cœur dans la maladie de de Duchenne. Le développement de fibrose musculaire est un processus physiologique global faisant interagir différents types cellulaires, éventuellement issus de différents organes. De plus, les méthodes de détection testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale que nous voulons appliquer ensuite chez l'être humain. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide d'un logiciel d'aide à l'expérimentation animale, proposant un outil de calcul statistique. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur la bonne détection de la fibrose par nos méthodes d'imagerie. Le nombre d'animaux obtenu est cohérent avec nos expériences précédentes de protocoles d'imagerie lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les méthodes d'imagerie que nous utiliserons dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen. Afin de prévenir au maximum la souffrance et le stress infligés aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance régulière par les expérimentateurs. Des points limites ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Le bien-être animal passera également par de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Le rat modèle de la maladie de Duchenne possède comme les patients une mutation d'un gène essentiel au fonctionnement des muscles. Les autres espèces utilisées comme modèle de la maladie de Duchenne, la souris et le chien, présentent des limites. Le chien présente une évolution de la maladie proche de celle des patients, mais est un modèle "gros animal" lourd à manipuler. La souris ne reproduit que partiellement la maladie. Le rat est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Dès l’âge de 1,5 mois, les rats modèle de la maladie de Duchenne présentent les premières anomalies dans leurs muscles. A 3 mois d’âge, ces anomalies sont bien développées mais pas encore détectables sans biopsie. A 5 mois d’âge, la fibrose du cœur est suffisamment développée pour être observable en imagerie par résonance magnétique. Les catégories d'âge choisies (1,5 mois, 3 et 5 mois) devraient nous permettre d'observer la fibrose à 5 mois et de tester sa détection à des stades de développement plus précoces. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre l'âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère (au-delà de 8-9 mois).
Détection de la Listeria monocytogenes en dormance dans les tissus dans un modèle lapin
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles urogénitaux
38 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation de Listeria monocytogenes dans l'œil, dont le porteur indique qu'elle va "certainement" provoquer une infection et une zone inflammatoire locales, puis subissent une prise de sang et un prélèvement vaginal par semaine pendant quatre semaines, maintenues éveillées sous contention. L'infection peut aussi entraîner fièvre, prostration, perte d'appétit, diarrhée voire des complications neurologiques, alors que la dose recherchée est justement celle qui installe un portage sans symptôme. Le recours à l'animal est présenté comme "indispensable" et le travail sur "organisme entier vivant" comme le seul possible, la mise à mort étant justifiée par la "nécessité" de prélever les tissus pour y chercher la bactérie en dormance.
Objectifs
La Listeria monocytogenes est une bactérie qui peut contaminer l’alimentation et induire chez la femme enceinte un accouchement prématuré ou une fausse couche. Il a été découvert ces dernières années, que la bactérie pouvait persister dans les cellules sans être détectable (dormance de la bactérie) par des méthodes classiques de bactériologie. Les objectifs du projet sont de mettre au point des outils et méthodes de détection de ces bactéries en dormance lorsqu’elles sont cachées dans les cellules en utilisant un modèle biomédical, ici la lapine. L’objectif est de définir la dose de Listeria, qui induit le portage de la bactérie mais sans symptôme de façon à tester les nouveaux outils de détection. Les résultats de cette étude, effectuée sur des lapines, permettront de valider les outils de détection de la Listeria et apporteront une meilleure connaissance des stratégies adaptatives développées par Listeria pour se cacher chez son hôte sans symptôme clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure connaissance des stratégies d’adaptation développées par Listeria monocytogenes pour se cacher (dormance) pendant plusieurs semaines, chez son hôte. Ces résultats serviront de preuve de concept pour étudier les échantillons d’endomètre humain prélevés chez des femmes présentant des fausses-couches à répétition.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure d’instillation oculaire (38 animaux, 1 seule fois, environ 3 minutes), prise de sang (2 ml, 1 fois par semaine pendant 4 semaines sur 20 animaux, environ 3 minutes) sur animal vigile, sous contention légère; à des prélèvements vaginaux (à 72h puis 1 fois par semaine sur 20 animaux), sur animal vigile, sous contention légère.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont ceux liés à la Listeria qui peut induire comme signes cliniques : de la fièvre, une prostration, une perte d’appétit, des toubles digestifs (plutôt diarrhée) voire des complications neurologiques. Ces signes peuvent potentiellement apparaître dans un pas de temps limité dans la mesure où les doses de Listeria choisies ne doivent pas induire de symptomes cliniques. Cependant l’instillation oculaire de la Listeria va certainement induire localement, au niveau des yeux, une infection et une zone inflammatoire transitoire (quelques jours). Concernant les prélèvements, des prélèvements vaginaux et une prise de sang seront réalisées, nécessitant une contention.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour plusieurs raisons : - infection à une souche de Listeria infectant l’espèce humaine - nécessité de prélever les tissus pour rechercher la Listeria entrée en dormance
Remplacement
Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit d’étudier si le portage asymptomatique (hébergement sans exprimer de symptome de la maladie) de la Listeria est possible dans différents tissus, il peut donc y avoir des bactéries dans les tissus sans manifestation de signe clinique donc cela necessite de travailler sur organisme entier vivant pour prendre en compte la complexité des processus physiologiques engagés. Il n'est donc pas possible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou un modèle de simulation informatique.
Réduction
Lors de la conception du protocole expérimental, nous avons déterminé le nombre minimum d'animaux à utiliser. Pour cette raison, nous avons prévu une étude pilote pour définir la plus faible dose permettant d’induire un portage asymptomatique de la Listeria (3 doses testées, 18 animaux en tout). Ensuite, la plus faible dose retenue permettant un portage asymptomatique de la Listeria sera testée sur 20 animaux de façon à collecter tous les tissus et valider les tests de détection de la listeria. Nous avons prévu un maximum de 20 lapines pour pouvoir valoriser ces données. L’hypothèse du portage asymptomatique a été validée in vitro sur plusieurs types cellulaires en culture, toutefois la littérature n’a pas de recul sur la proportion de lapines chez lesquelles Listeria sera soit complètement éliminée (lapines guéries) ou soit entrée en dormance chez des individus asymptomatiques après cette infection, cas de figure recherché, ou encore mortelle (non attendu). Un premier lot de lapines sera exposé, en fonction de la réponse de ces lapines et si nécessaire, un 2nd lot sera exposé pour conforter les premiers résultats et compléter les effectifs.
Raffinement
Les lapines seront hébergées en cage individuelle mais avec un contact visuel avec les autres lapines. Ces cages disposent de plateformes pour se mettre en hauteur ou, dessous, de se cacher, des jouets en plastique, des cubes de foin ou des batons de bois à ronger, du papier kraft ciselé sont également mis à disposition. Les paramètres d'ambiance de l'animalerie sont contrôlés. Une acclimatation d’une semaine sera réalisée pendant laquelle les lapines seront habituées à la présence humaine, au change des cages et aux manipulations par le personnel. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Ce suivi inclura l’observation du niveau d’activité, le comportement, la posture au repos, l’apparence (pelage), l’alimentation, les mouvements à la sollicitation et la manipulation d’une zone douloureuse. De plus, l’évaluation de l’état de l’œil, à savoir si l’œil est propre et brillant, sera suivie. Si la lapine présentait une douleur élévée alors une décision serait prise en concertation avec le vétérinaire quant à un recours à la mise à mort de cet animal. Des points limites reposant sur une grille de score intégrant ces différents paramètres ont été établis. Ainsi l'ensemble de ce suivi nous permettra d’intervenir rapidement et de manière graduelle si des signes de souffrance apparaissaient. En cas de signes de douleur, ceux-ci seront pris en charge par l'administration d'analgésiques adaptés (anti-inflammatoires, opioïdes).
Choix des espèces
L'objectif est de reproduire des expériences anciennes de contamination par la Listeria chez la lapine, par conséquent seule cette espèce peut être utilisée pour en explorer les mécanismes. A la suite de ce projet, notre objectif est d’explorer les effets de la Listeria rentrée en dormance sur la gestation. Or ce modèle est pertinent pour étudier le placenta dont la structure est plus proche de l’homme que celle des modèles rongeurs. Nous nous appuyerons sur ces résultats pour le futur projet, le cas échéant. Seules des lapines adultes seront utilisées car l’objectif est d’évaluer le portage asymptomatique de la Listeria chez des lapines pubères.
Evaluation de nouveaux outils radiothérapeutiques ciblant le noyau des cellules cancéreuses – EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
Les souris retenues sont dépourvues de thymus, donc privées d'une grande partie de leurs cellules immunitaires, pour que leur organisme ne rejette pas la tumeur humaine qu'on leur greffe. 2 480 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit jusqu'à six anesthésies, une greffe sous-cutanée, une injection intraveineuse de composé radiomarqué, jusqu'à 45 minutes d'imagerie et des mesures de tumeur au pied à coulisse, avec hébergement individuel après l'injection radioactive, ce que le porteur décrit comme un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression". La mise à mort sert à compter la radioactivité organe par organe, le cadavre étant lui aussi récupéré.
Objectifs
Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un élément radioactif à une molécule, ou vecteur, capable de se lier de manière spécifique à une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que le vecteur puisse diriger et concentrer l’élément radioactif dans les cellules cancéreuses. En fonction de l’élément radioactif choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur par imagerie nucléaire ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Ces rayonnements détruisent l’ADN des cellules cancéreuses, menant à la destruction de la tumeur. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Plusieurs types de vecteurs capables de se lier spécifiquement à la protéine N ont été développés. A la différence de nombreuses autres protéines exprimées par les cellules cancéreuses, la protéine N est capable de transporter les vecteurs qui s’y lient jusqu’à son noyau cellulaire qui contient l’ADN. En rapprochant l’élément radioactif de l’ADN, il est possible de potentialiser l’effet de la thérapie, tout en diminuant sa toxicité pour les cellules saines. Nous avons sélectionné deux vecteurs se liant à la protéine N de manière différente afin de maximiser les chances d’identifier un système efficace. Comme il existe plusieurs types d’élément radioactif avec des propriétés très différentes, il est nécessaire de comparer l’efficacité de plusieurs combinaisons vecteur-élément radioactif afin d’identifier le couple le plus efficace. Alors que certains de ces éléments radioactifs émettent des rayonnements ionisants capables de détruire les cellules cancéreuses, d’autres peuvent être utilisés pour détecter les tumeurs par imagerie, ce qui permettra dans un premier temps de vérifier que les vecteurs s’accumulent bien dans la tumeur chez la souris. Dans un second temps, l’imagerie permettra de sélectionner les patients dont les tumeurs expriment la protéine N et qui seront donc éligibles à la thérapie. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels par radiothérapie interne vectorisée sont presque systématiquement accompagnés d’effets secondaires graves dus aux dommages provoqués aux cellules non-cancéreuses. En dirigeant les éléments radioactifs de manière spécifique au noyau des cellules cancéreuses, la stratégie de ce projet a pour but d’augmenter l’efficacité de ces thérapies tout en diminuant leur toxicité. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l’Homme à la fin de l’étude
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - 1 Injection en sous-cutané au moment de la greffe de cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum). - 1 injection de produit en intraveineuse dans la veine de la queue lors des expérimentations d'imagerie ou de traitement (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum). - Anesthésie à l'isoflurane réalisée lors de la greffe des cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum), lors de l’injection intraveineuse des produits (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ou au moment de la mise à mort (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ainsi que pendant l’acquisition des images (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). Il y aura au total 6 anesthésies au maximum pour chaque animal. - Imagerie à l’aide d’un scanner dans les procédures d’imagerie (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). - Mesures du poids et de la taille des tumeurs dans les procédures d’imageries et d’évaluation de l’efficacité des traitements (réalisée dans l'établissement 2, 1 min maximum).
Impact sur les animaux
Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : - douleurs générées lors de la greffe des cellules tumorales, lors de l’injection des agents d’imagerie ou de thérapie. - lésions locales au site d’injection dû à la rétention du composé radiomarqué. - gêne ou douleur provoquée par la croissance des tumeurs - fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines ou troubles digestifs dans les jours suivant l'injection du traitement radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. - stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. - sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie et de biodistribution.
Devenir
Les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris incluse dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficacité thérapeutique.
Remplacement
Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. La procédure d’imagerie permet d’observer la localisation du vecteur au cours du temps sans avoir mettre l’animal à mort (suivi longitudinal), ce qui permet de maximiser les informations recueillies en minimisant le nombre d’animaux mis à mort. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées.
Raffinement
Méthodes utilisées pour réduire la douleur : Raffinement des conditions d'hébergement : - Dans les procédures 1 et 2, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection du vecteur radiomarqué et de permettre un contact visuel des animaux. Chaque boite sera également enrichie d'un igloo et d'une roue en polycarbonate. - Dans toutes les procédures, des croquettes mouillées seront rajoutées dans les cages des souris souffrant de fatigue ou de faiblesse. Dans les procédures 3 et 4, des croquettes mouillées seront ajoutées systématiquement la première semaine suivant l’injection des vecteurs radiomarqués. - De la litière de cellulose sera utilisée pour limiter l’apparition de plaie chez les souris porteuses de tumeurs. - Le transport des animaux de l’EU1 à l’EU2 sera réalisée à l’aide de cages opaques à couvercle filtrant. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés lors de la greffe des cellules tumorales (5 min maximum), lors de l'injection intraveineuse des composés (5 min maximum), lors des acquisitions d'image (45 min maximum) et lors de leur mise à mort (5 min maximum). Analgésie: en cas d'apparition de douleur, des analgésiques seront administrés aux animaux. Des points limites spécifiques à ce projet ont été mis en place pour limiter la souffrance des animaux au minimum. Ces points limites seront appliqués de manière stricte.
Choix des espèces
Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux humains est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de tumeurs humaines car celles-ci se caractérisent par l'absence d’un organe (le thymus), ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge, et ils sont plus résistants aux radiations.
Production d’oeufs de canes de barbarie EOPS (exempts d’organismes pathogènes spécifiés)
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Tests réglementaires
Produire des œufs exempts d'organismes pathogènes spécifiés pour les analyses du laboratoire : 700 canards de barbarie vont être utilisés à cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit des prises de sang répétées, à 10 semaines d'âge puis à 19, 27, 37, 47, 57 et 67 semaines, 2 ml par prélèvement. Le porteur ne retient comme source d'angoisse ou de souffrance que ces prélèvements sérologiques, et affirme que le maintien du troupeau est "indispensable" à la poursuite des activités du laboratoire. Tous les canards sont tués à 67 semaines au motif qu'en fin de production, ils "ne peuvent pas avoir d'autres utilisations".
Objectifs
Les objectifs du projet sont de maintenir un troupeau de canards de barbarie EOPS, produisant des œufs utilisés pour assurer les activités du laboratoire : analyses virologiques et expérimentation animale. Ces activités sont nécessaires pour étudier les pathologies majeures du canard, en santé animale et santé publique.
Bénéfices attendus
Le maintien de ce troupeau de canards EOPS est indispensable à la poursuite des activités du laboratoire, pour étudier les pathologies majeures du canard, en lien avec la santé animale et la santé publique.
Procédures
Prélèvements sérologiques sur animaux vigiles à 10 semaines d’âge puis 19, 27, 37, 47, 57 et 67 semaines d’âge. A 10 et 37 semaines d’âge, l’ensemble des animaux présents sont prélevés alors qu’à 19, 27, 47, 57 et 67 semaines d’âge, 15 femelles et 5 mâles sont prélevés. Le volume de chaque prélèvement est de 2 ml.
Impact sur les animaux
La seule source d’angoisse ou de souffrance peut être les prélèvements sérologiques répétés, réalisés par du personnel expérimenté.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort, ces animaux en fin de production à 67 semaines ne peuvent pas avoir d'autres utilisations
Remplacement
Le remplacement n’est pas possible car il s’agit de produire des œufs EOPS
Réduction
Le nombre d’animaux est basé sur les besoins en œufs EOPS du laboratoire. Cette procédure permet de générer du matériel biologique et il ne sera réalisé aucune analyse statistique.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (caillebotis plastique au sol avec une partie litière en copeaux de bois, abreuvement et alimentation à volonté, différents éléments de perchage) et en ayant des contacts avec leurs congénères (élevage en groupe, 40 femelles et 15 mâles dans la même animalerie).
Choix des espèces
Le besoin concerne les œufs de canard de babarie EOPS Les animaux sont éclos à un jour dans notre bâtiment, sont élevés jusqu’à 27 semaines et commencent à pondre à 28 semaines jusqu’à 67 semaines d’âge
Production d’antigenes specifiques a but de diagnostic medical de l’Echinococcose
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
150 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une seule injection leur est faite, dans l'abdomen, avec du matériel infectieux d'Echinococcus multilocularis qui provoque la formation de kystes péritonéaux chroniques. Ces kystes servent de matière première à des antigènes vendus aux laboratoires d'analyses médicales pour le diagnostic sérologique de l'échinococcose, et le porteur décrit une évolution "sans altération de l'état général" tout en listant une mobilité réduite et une douleur parmi les atteintes possibles. Il écrit que "la volumétrie d'animaux utilisée pour la production d'Ag sera fonction du volume de commercialisation des tests".
Objectifs
Le diagnostic de maladies infectieuses repose sur différents critères : signes cliniques, radiologiques, facteurs de risque associés… et sur les résultats de tests biologiques. L’utilité des tests biologiques est d’autant plus grande que certaines infections présentent peu ou pas de signes cliniques caractéristiques. Un large panel de tests biologiques existe de la culture de prélèvements à la recherche d’anticorps spécifiques dans le sang des patients. Cette recherche d’anticorps spécifiques est dans de nombreuses maladies infectieuses le seul moyen de diagnostiquer et secondairement de traiter certaines maladies. C’est dans ce but qu’une collaboration entre un laboratoire Hospitalo-Universitaire et une entreprise française a été mise en place avec l’objectif de développer des tests diagnostiques de maladies pour l’homme et/ou les animaux. Nous avons mis au point des tests fiables, spécifiques et sensibles de recherche d’anticorps de pathogènes parasitaires d’origine alimentaire comme Echinococcus granulosus et Echinococcus multilocularis, responsables de maladies graves et parfois mortelles chez l’Homme avec 1 million de personnes concernées. L’utilisation d’antigènes de ces parasites est la clé de voute de la mise au point de tests sérologiques. En l’absence d’alternative de bonne qualité, l’obtention de tels antigènes passe par l’expérimentation animale. Suite à l’injection d’agents infectieux de E. multilocularis, l’animal va développer un ou plusieurs kystes péritonéaux d’évolution chronique sans altération de l’état général. Ces kystes permettront de produire des antigènes de grande qualité pour développer des tests sérologiques permettant de réaliser le diagnostic de patients infectés. L’objectif de ce projet est donc de permettre la production d’Ag de E. multilocularis pour pouvoir continuer de rendre accessible aux professionnels de santé les tests de diagnostic correspondants et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.
Bénéfices attendus
La production d’Ag d’échinococcose est un élément essentiel à la fabrication de nos tests de diagnostic médicaux. Ces tests, parce qu’ils sont reconnus comme des réactifs de référence, sensibles et spécifiques, sont utilisés par les laboratoires des CHU et des plateformes d’analyses médicales de France et du monde entier. Ils sont destinés aux professionnels de santé dans le cadre de diagnostic de dépistage et de confirmation de la sérologie parasitaire. Les bénéfices attendus du projet sont donc directs et immédiats : permettre de maintenir la production de tests de diagnostic de la toxoplasmose et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.
Procédures
Un seul geste technique sera réalisé sur animal vivant : il s’agit de l’inoculation inaugurale par voie intrapéritonéale. Cela nécessite la contention de l’animal de quelques secondes par un personnel qualifié afin d’éviter au maximum le stress et la douleur des animaux.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les nuisances possibles sur les animaux sont les suivantes : stress physique, mobilité réduite, douleur dus à une complication infectieuse. Le projet a été conçu de manière à minimiser les dommages causés aux animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’unique procédure expérimentale afin de réaliser des prélèvements post-mortem.
Remplacement
Pour pouvoir ainsi répondre à l’exigence qualitative et quantitative de la demande, l’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du présent projet et la gerbille reste le modèle le plus adapté. L’obtention d’un profil antigénique complet ne peut pas se faire par clonage et génie génétique. De même, la possibilité de mettre en culture in vitro E. multilocularis n’a pas permis de produire un antigène complet et de quantité suffisante (diagnostic couplé et différentiel des 2 types d’échinococcoses impossible). Ainsi, pour ces raisons majeures de volume de production, de défaut de reproductibilité et de qualité médiocre de l’antigène obtenu, la culture in vitro d’échinococcoses ne permet pas une production d’antigène compatible avec le développement et la production des tests de diagnostic présentant des performances au niveau des tests actuellement commercialisés, soumis au marquage CE, à la conformité avec la norme ISO 13485 et à l’attestation CE de conformité délivrée par un organisme notifié et devant répondre aux exigences du règlement européen IVDR 2017/746. En conséquence, ces expérimentations ne peuvent être conduites qu’in vivo.
Réduction
La volumétrie d’animaux utilisée pour la production d’Ag sera fonction du volume de commercialisation des tests. Malgré une croissance de la demande des produits, la réévaluation du nombre d’animaux nécessaires à la production d’Ag par rapport au précédent projet permet de significativement le diminuer. Ceci s’explique par l’expérience acquise sur ce modèle et par les analyses réalisées par le laboratoire pour augmenter la qualité des échantillons récoltés.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. Les gerbilles seront hébergées par groupes d’individus compatibles, dans des conditions contrôlées et avec la mise en place d’un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Aucun des animaux ou groupe d’animaux ne sera traité différemment de ses congénères. Une fiche de suivi sera rédigée pour chaque cage avec un suivi de signes comportementaux, physiques et physiologiques. Chacun de ces critères étant évalué fréquemment, la détermination de point(s) limite(s) bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, permettra immédiatement de déterminer un animal en souffrance. Nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Dès lors que l’animal montre des signes de positivité à l’infection, il est mis en armoire ventilé afin de ne pas stresser ses congénères. En cas de gêne dans ses déplacements, l’accès à l’alimentation lui est facilité (dépôt d’une coupelle au sol). Les soins et les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel qualifié et permanent. En effet, les gerbilles ont le temps de se familiariser avec les manipulateurs spécialement affectés à leur suivi.
Choix des espèces
La gerbille est l’espèce qui présente un cycle naturel de l’infection parasitaire sans développement d’autres signes cliniques avant l’atteinte d’une taille de kyste significative. En conséquence, la production d’antigène d’E. multilocularis est réalisée in vivo sur ces animaux. Les gerbilles utilisées seront de jeunes adultes, mâles ou femelles.
EU2/2 Évaluation de l’intérêt dans le diagnostic et le suivi thérapeutique d’anticorps radiomarqués dans des modèles murins tumoraux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Injectées dans la peau avec des cellules cancéreuses, puis anesthésiées pour recevoir des anticorps radiomarqués par voie intraveineuse, 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La prise de sang finale se fait dans le thorax, sur animal anesthésié et sans réveil, et les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et des troubles fonctionnels qui figurent parmi les points limites. Il s'agit de mesurer où se fixent des anticorps radioactifs dans l'organisme, pour développer un outil de diagnostic du mélanome par imagerie TEP. Le porteur annonce que tous les animaux seront tués à l'issue de chaque procédure, puis écrit quelques lignes plus loin que les souris saines seront conservées, si possible, pour d'autres manipulations.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic et le suivi de pathologies tumorales, telles que le mélanome. L’arrivée des nouveaux anticorps thérapeutiques sur le marché, tels que les inhibiteurs de checkpoint immunitaire (ICI), notamment les anti-PD-1 et anti-CTLA_4, nécessite de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer. En effet, les anticorps, de par leur spécificité, peuvent être utilisés en thérapie et en diagnostic ce qui en fait des candidats prometteurs pour la théragnostic. La variabilité de la réponse des patients à l’immunothérapie, malgré une analyse préalable de leur marqueur sanguin ou de leur biopsie, démontre la nécessité de développer ces outils théragnostiques. Nous proposons de développer et valider des radiotraceurs permettant un diagnostic précoce et un suivi de la réponse thérapeutique par imagerie nucléaire.Des études de biodistribution après administration intraveineuse seront réalisées sur les radiotraceurs d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques d’intérêt. Les études précliniques se dérouleront en 2 phases : études par imagerie de Tomographie par Emission de Positons (TEP) et études post-mortem sur les organes d’intérêt. Ces études seront réalisées avec l'aide des modèles de cancers pertinents. Face à l’hétérogénéité des cancers et des mécanismes immunitaires, il est nécessaire de travailler sur plusieurs modèles murins pour ce projet. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques par imagerie TEP et par études post-mortem permettront d’étudier la biodistribution des anticorps thérapeutiques radiomarqués d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques. Ainsi nous pourrons évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic de pathologies tumorales, telles que le mélanome. Cette étude préclinique permettra de pouvoir évaluer par la suite nos anticorps radiomarqués chez l’homme afin de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer.
Procédures
Les animaux seront soumis à une induction des tumeurs par injection intradermique de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales de traitement, basé sur des anticorps. Quel que soit le modèle, l’administration du radiotraceur, sous anesthésie à l’isoflurane, par voie intraveineuse. Prélèvement sanguin transthoracique terminal réalisé sur l’animal anesthésié sans réveil. L’établissement des tumeurs avant immunoTEP sera réalisé dans l’EU1. Toutes les sessions d’ImmunoTEP seront réalisés dans l'EU2.
Impact sur les animaux
L’injection d’anticorps radiomarqués n’influera pas sur l’état de l’animal. Les quantités injectées d’anticorps sont à doses traceuses, c’est-à-dire inférieure à la dose nécessaire à un possible effet thérapeutique. Quant au radioélément, il n’influera pas sur l’état de santé de l’animal car les activités administrées restent faibles et il s’agit de radioéléments émetteurs béta+ à usage diagnostic. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les conditions d’hébergement seront optimisées par ajout d’enrichissement adapté pour assurer le bien-être des animaux. L’induction de modèles tumoraux peut entrainer une perte de poids de l’animal qui sera surveillée et qui fait partie des points limites. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal (points limites). Une observation visuelle quotidienne des animaux pour l’apparition des signes de douleurs sera faite par l’expérimentateur et le personnel animalier. Tout animal présentant des signes de souffrance ou de léthargie, décrit dans les points limites des procédures, sera exclu de l’étude et mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque procédure. La procédure d’étude de biodistribution des anticorps radiomarqués permettra de sélectionner les temps pertinents pour l’étude post mortem. Le protocole sera optimisé afin coïncider l’euthanasie des animaux avec l’étude post mortem. Les animaux malades ne peuvent pas être gardés et l’euthanasie est nécessaire au vu des modèles de maladie induits. Pour les animaux sains, si cela est possible, ils seront conservés pour d’autres manipulations afin de réduire au maximum le nombre d’individus nécessaires.
Remplacement
Une étude préalable in vitro des anticorps radiomarqués a été préalablement effectué pour vérifier l’intérêt des anticorps avant l’injection chez l’animal. Il a été testé la stabilité in vitro, l’affinité et l’immunoréactivité des anticorps radiomarqués sur un modèle cellulaire adapté. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.
Réduction
Une étude complète de la littérature a été effectuée pour ne pas reproduire des expériences. Nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats et limiter le nombre d’expériences. Par ailleurs, le suivi longitudinal des animaux sur 24 à 170h permis par l’imagerie non invasive TEP permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux impliqués dans l’études par comparaison avec la méthode plus classique de biodistribution ex vivo qui nécessiterait la mise à mort de lots d’animaux à chaque temps d’observation.
Raffinement
Nous porterons une attention particulière à la souffrance et au stress des animaux ainsi qu’à anticiper l’atteinte des points limites. Le suivi de l’état général des souris sera effectué quotidiennement par le porteur de projet et le personnel. Pour diminuer la souffrance liée au procédures expérimentales et au développement du cancer, un traitement analgésique en locale (lidocaïne). L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations comportementales. Si un changement chez l’animal traduit un point limite, l’animal sera mis à mort, en accord avec le vétérinaire désigné. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool).
Choix des espèces
L’utilisation de modèles animaux de cancer est incontournable si nous voulons préciser les mécanismes sous- jacents à son développement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décris pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine. Les expériences seront réalisées sur des jeunes adultes (6-16 semaines). Avant le système immunitaire est immature et après il est affaibli, de plus la croissance tumorale n'est pas la même sur des souris jeunes adultes que sur des souris âgées.