Diagnostic des maladies

Une injection intrapéritonéale de quelques secondes, avec la souche RH de Toxoplasma gondii, dix souris par semaine. 2 600 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exploitées comme culture vivante du parasite. Les toxoplasmes ainsi multipliés alimentent un test de lyse employé par un laboratoire expert pour dater une infection chez la femme enceinte ou le nouveau-né. Le porteur écrit que cette souche tue une souris en moins de quinze jours quels que soient le mode et la voie d'inoculation, et affirme dans le même temps que les animaux sont tués "bien avant que les points limites ne soient atteints".

Objectifs

La toxoplasmose est une maladie parasitaire humaine et animale cosmopolite due à Toxoplasma gondii. Généralement bénigne, elle peut être grave pour le foetus en cas d'infection de la mère pendant la grossesse et chez les patients immunodéprimés. Le diagnostic de l’infection toxoplasmique est donc essentiellement réalisé chez les femmes enceintes (dépistage systématique) et chez les nouveaux-nés en cas de suspicion de toxoplasmose congénitale. En effet, en France, il existe un programme officiel de prévention et de dépistage de la toxoplasmose congénitale. Le diagnostic est aussi pratiqué chez des sujets suspects de toxoplasmose oculaire ou présentant des signes cliniques pour la différencier d’autres infections, chez des sujets immunodéprimés (SIDA, transplantés d’organes solides, greffés de moelle osseuse ...), chez les patients en état de coma dépassé pour le don d’organes. La sérologie (recherche d’anticorps sécifiques dans le sérum des patients) représente la base du diagnostic de la toxoplasmose. De nombreuses techniques commerciales automatiées sont actuellement disponibles, cependant leur fiabilié est variable. Le biologiste est donc souvent confronté à des difficultés d’interprétation des résultats et dans ces cas une investigation complémentaire effectuée par un laboratoire expert est indispensable pour confirmer ou infirmer les résultats. Par exemple, chez la femme enceinte, c’est des conclusions de l’analyse sé́rologique que dé́coule toute la conduite à tenir à la fois chez la maman pendant la grossesse et chez le bébé après la naissance. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de maintenir la production de tachyzoîtes vivants de Toxoplasma gondii in vivo chez la souris dont nous avons besoin pour réaliser le test de Lyse des toxoplasmes qui reste la technique de référence et qui représente un outil diagnostique précieux, extrêmement sensible et spécifique, pour mesurer les taux d’anticorps de façon plus précise.

Bénéfices attendus

Les laboratoires polyvalents utilisent pour le diagnostic sérologique de la toxoplasmose des techniques dites de 1ère ligne dont la fiabilité est très variable. Ainsi, pour les dossiers complexes, le biologiste fait appel à un laboratoire expert de la toxoplasmose qui dispose de techniques dites de confirmation et qui a l’expertise de l’interprétation des résultats. C’est dans ce contexte que nous réalisons le Test de Lyse des toxoplasmes qui associé à d’autres techniques diagnostiques complémentaires nous permet en général de conclure dès le premier sérum. Nous sommes ainsi capables de différencier une infection récente d’une infection ancienne (30% des femmes enceintes), de déterminer précisément la date de l’infection, de dépister une réactivation de la maladie chez l’immunodéprimé, de dépister une transmission passive d’anticorps par une transfusion, de confirmer l’immunité d’une patiente en cas de valeur limite ce qui permet d’éviter jusqu’à 10% des suivis de grossesse inutiles. La datation précise de la primoinfection chez la femme enceinte est indispensable puisqu’à partir de la 18ème semaine d’aménorrhée et au moins 4 semaines après la date supposée de la contamination, une amniocentèse sera pratiquée pour faire le diagnostic avant la naissance de la toxoplasmose congénitale. Un traitement précoce maternel antiparasitaire dans les 4 semaines suivant la contamination réduit le risque de lésions intracrâniennes. Le test de lyse est également utilisé pour le diagnostic après la naissance de la toxoplasmose congénitale, réalisé par la surveillance sérologique du nourrisson durant la première année de vie, en raison de sa grande sensibilité et du faible volume de sérum nécessaire pour sa réalisation. Dès que la toxoplasmose congénitale est prouvée, l’enfant est traité pendant 1 ans et suivi cliniquement jusqu’à l’adolescence. Chez l’immunodéprimé, un diagnostic précoce de réactivation ou de primo-infection est important car la maladie est constamment mortelle en l’absence de traitement adapté.

Procédures

Les animaux vigiles subissent une injection intrapéritonéale qui dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

L' injection intra-péritonéale peut engendrer une légère douleur au niveau du site d'injection. Les différentes contentions peuvent être source de stress pour les souris.

Devenir

La souche RH de type I de Toxoplasma gondii est caractérisée par une virulence importante chez la souris. Quels que soient le mode et la voie d’inoculation, une souris infectée par un parasite meurt en moins de 15 jours. C’est pourquoi, à l'issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés bien avant que les points limites ne soient atteints.

Remplacement

Le Test de Lyse réalisé́ à partir de tachyzoîtes cultivés in vitro n’offre pas les mêmes performances diagnostiques avec notamment une perte importante de sensibilité (faux négatifs). Ceci est en partie expliqué par une perte rapide de virulence de la souche entretenue in vitro et une diminution de la taille des tachyzoïtes lors du passage en culture cellulaire. Il n'existe donc pas à l'heure actuelle d'alternative à la méthode in vivo pour la production de toxoplasmes vivants. Nous ne sommes pas pour le moment en mesure de remplacer les expériences in vivo.

Réduction

Afin de restreindre le nombre d'animaux utilisés, nous avons amélioré notre démarche diagnostique pour réserver le Test de Lyse aux seuls sérums pour lesquels il est jugé comme absolument indispensable à l’obtention de résultats fiables et à la prise en charge des patients. Le Test de Lyse ne sera donc réalisé qu’une seule fois par semaine. Nous avons alors optimisé le protocole d’entretien du parasite in vivo pour éviter toute répétition inutile et ainsi réduire le nombre d'animaux à 10 par semaine alors qu’il en fallait 15 lors de la précédente demande d'autorisation de projet.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte depuis leur naissance jusqu'à leur mort. Ils sont hébergés par groupe de 5 individus et jamais isolés dans des cages ventilées de manière à maîtriser l’environnement sanitaire. Leur environnement est enrichi avec des cabanes. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié et une grille de points limites adaptés sera mise en place. Si certains signes d’inconfort ou de souffrance apparaissent, les animaux bénéficieront d'une surveillance accrue, d'un enrichissement supplémentaire (nid végétal) et de nourriture humidifiée au sol et si leur état ne s'améliore pas au bout de 24h, ils seront mis à mort. Cependant si les étapes de la procédure et les temps de prélèvement sont respectés, les points limites ne seront que très rarement atteints.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour la culture de T. gondii. C'est en effet le plus petit mammifère utilisable en animalerie de classe 2 permettant le développement des tachyzoites. A noter que la souris est un hôte intermédiaire habituel de ce parasite. Les animaux sont utilisés au stade « jeunes adultes » entre 8 et 13 semaines pour avoir une taille compatible avec la manipulation expérimentale.

Produire des sérums contre le virus West Nile, la fièvre catarrhale ovine et la fièvre aphteuse suppose ici d'immuniser 20 lapins, un par antigène, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit trois injections sous-cutanées espacées de trois semaines et subit quatre prises de sang à la veine de l'oreille. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable, alors qu'il décrit une douleur à l'injection et une réaction inflammatoire locale. La procédure se termine par une ponction de 50 mL dans le cœur sous anesthésie, prélèvement dont le volume impose la mise à mort de l'animal avant tout réveil.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire des anticorps dirigés contre des virus d’intérêt en santé publique et/ou vétérinaire tels que les virus West Nile, de la fièvre catarrhale ovine, de la fièvre aphteuse. Ces virus émergents ou à risque d’émergence ont des impacts sanitaires et économiques importants. Dans le but d’assurer et de garantir une surveillance optimale de ces infections virales chez les espèces sensibles, l'amélioration des outils de diagnostic et de recherche est nécessaire. Cette activité nécessite notamment la constitution de banque de réactifs biologiques tels que des sérums issus d’animaux ayant produit des anticorps spécifiques aux virus d’intérêt, bien caractérisés. Pour permettre la production d’anticorps, des antigènes qui sont des molécules reconnues, comme par exemple des protéines virales, par l’organisme comme étant étrangères et contre lesquelles l’organisme va combattre en produisant des anticorps dirigés (immunisation), seront utilisés. Les antigènes (protéines virales ou virus ne pouvant pas se multiplier) seront donc injectés à des lapins qui produiront des anticorps dirigés contre ces antigènes. Les anticorps produits sont dits « polyclonaux » car ils sont un mélange d’anticorps dirigés contre différentes parties des antigènes. Afin de récupérer ces anticorps précieux, le sérum (phase du sang sans les globules rouges), dans lequel se trouvent les anticorps, sera collecté en fin de procédure. Ainsi, les sérums obtenus après immunisation de lapins avec des protéines (et en présence d’adjuvant) ou de virus non réplicatifs pour cette espèce serviront au développement et à la validation d’outils de diagnostic sérologiques. Les lapins sont utilisés pour leur capacité à produire des grandes quantités de sérums et donc d’anticorps dirigés contre des antigènes d’intérêt, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux requis pour cet objectif.

Bénéfices attendus

L’obtention d’anticorps spécifiques nous permettra de développer et de valider des outis sérologiques de diagnostic et de recherche pour les virus d’intérêt en santé publique et vétérinaire.

Procédures

Trois injections par la voie sous-cutanée à 3 semaines d’intervalle seront réalisées. Les prélèvements prévus sont au total 4 prises de sang à la veine de l’oreille (2mL par prélèvement) à 3 semaines d’intervalle. Le temps de prélèvement est de quelques secondes (inférieur à 1 min). En fin de procédure, un prélèvement d’un volume de 50 mL sera réalisé en ponction intra-cardiaque sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les lapins peuvent ressentir de la douleur lors des injections de l’antigène par la voie sous-cutanéée. Une légère réaction inflammatoire locale peut être observée sans conséquence pour le bien-être de l’animal. Nous n’attendons pas d’effet indésirable sur les animaux.

Devenir

En raison du gros volume de sang prélevé en fin de procédure sous anesthésie, les lapins seront mis à mort avant le réveil.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif pour la production de sérum contenant des anticorps polyclonaux dirigés contre des virus d’intérêt. La production synthétique reste actuellement moins performante. Le but de cette étude est d’avoir un panel d’anticorps dirigés contre des antigènes viraux issus de nouveaux virus émergents et/ou non commercialisés à visée de diagnostic ou de recherche.

Réduction

Dans le but de réduire la nombre d’animaux, nous avons décidé d’utiliser 1 lapin par antigène. Nous avons au total 20 antigènes pour lesquels nous avons besoin de sérum polyclonal. Un lapin permet l’obtention de sérum de bonne qualité et en quantité suffisante. Cette procédure permet de générer du matériel biologique et aucune analyse statistique sera réalisée.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés par paire dans des cages doubles munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). En cas d’agressivité observée, les lapins seront placés en hébergement individuel avec contat visuel et odorant (séparation des cages faites avec des plaques en plexiglas transparentes et ajourées). Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les prélèvements terminaux de sang en vue de la récupération des sérums contenant les anticorps polyclonaux seront effectués sous anesthésie, avec une surveillance permanente des animaux, puis mise à mort avant le réveil.

Choix des espèces

Les lapins sont utilisés pour leur capacité à produire des grandes quantités de sérums et donc d’anticorps dirigés contre des antigènes d’intérêt, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux requis pour cet objectif. Les animaux utilisés seront des adultes afin d'avoir un système immunitaire mature pour une production optimale d'anticorps

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 220 après vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses et en sucre. Chacune subit trois à cinq jeûnes de quatre heures, autant de gavages, et six prélèvements de sang en deux heures obtenus en coupant le bout de la queue puis en grattant la croûte à mesure qu'elle se reforme. Le porteur décrit le gavage comme "désagréable mais pas douloureux" et affirme que le régime gras et sucré "n'engendre aucune contrainte" pour les animaux. Le projet promet un dosage prédictif qui "permettrait" un meilleur suivi des patients atteints de stéatopathie métabolique, quand les vingt-quatre semaines de régime et les gavages sont, eux, programmés.

Objectifs

L’obésité peut entraîner des complications hépatiques nécessitant une prise en charge thérapeutique des patients. Ces complications sont regroupées sous le terme de NAFLD pour maladie du foie non alcoolique ou plus récemment MASLD pour dysfonction métabolique associées aux maladies du foie gras. La MASLD s’étend de la stéatose isolée et réversible (accumulation de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes) à l’inflammation hépatique ou stéatohépatite (MASH), la fibrose, la cirrhose et le cancer du foie. Si une stéatose qui reste bénigne est observée chez quasiment toutes les personnes obèses, l’évolution de la maladie vers des formes plus sévères n’est observée que chez certains patients. A l’heure actuelle, il n’y a pas de critères fiables permettant de prédire l’évolution de la pathologie chez les patients présentant des lésions précoces. L’impact de l’alimentation dans la MASLD et en particulier des lipides est clairement démontré. Toutefois, là encore tous les patients ayant des dyslipidémies ne développent pas des formes sévères de MASLD. Or, un des biais dans toutes ces analyses est le fait qu’elles soient toujours faites chez l’individu à jeun. Or après un repas, le métabolisme des lipides peut varier transitoirement en fonction de la sensibilité des patients. Basé sur ce concept, une étude clinique a été faite chez l’homme et à prouvé que les lipides modifiés juste après la prise d’un repas et appelés lipides post-prandiaux sont plus délétères chez des patients avec une MASLD avancée qu’avec une simple stéatose. Notre projet consiste à comprendre dans notre modèle murin, l’effet de ces lipides post-prandiaux sur les différentes cellules et organes métaboliques. La compréhension de ces mécanismes à des stades précoces de la maladie est essentielle pour disposer de marqueurs prédictifs de l’évolution des lésions hépatiques et améliorer le suivi des patients.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à documenter le rôle des lipides post prandiaux et leur impact sur les différents organes métaboliques au cours du développement de la MASLD. Cette compréhension permettrait de proposer ces dosages de lipides post-prandiaux, ou leurs cibles identifiées par notre étude, pour améliorer la prédiction de l’évolution des lésions hépatiques au cours de la MASLD et assurer un meilleur suivi des patients.

Procédures

220 souris seront soumises à un régime enrichi en graisses et sucre pendant 24 semaines. 360 souris seront soumises à un jeun imposé de 4h. Ce jeun sera effectué 3 fois pour 280 souris et 5 fois pour 80 souris. 280 souris auront 3 gavages par voie orale et 80 souris auront 5 gavages. Le temps de gavage tient entre 20 et 30 secondes. Les 360 souris auront un prélèvement de 6 gouttes de sang en l’espace de 2 heures représentant une quantité inférieure à 100 microlitres de sang.

Impact sur les animaux

Les régimes enrichis en graisses et sucre n’engendrent aucune contrainte pour les animaux. Le jeun imposé de 4h, le matin, correspond à une période digestive. Aucun effet indésirable n’est attendu. Le prélèvement de 6 gouttes de sang en 2 heures au niveau de la queue va engendrer pour les animaux un inconfort modéré pendant et après le prélèvement. On évalue la gêne et la douleur à ce qui se passe lors d’une piqure puis lors « d’un grattage d’une croutte ». Le gavage des animaux vigiles pour éviter une fausse route avec des canules souples minimise les lésions mécaniques. Le geste est désagréable mais pas douloureux. Les injections intra-péritonéales correspondent à la nuisance d’une piqure, le produit injecté n’étant pas agressif.

Devenir

A l’issu des procédures, les souris sont euthanasiés, différents tissus sont prélevés (vésicule biliaire, foie, tissu adipeux, muscle, intestins) afin de réaliser des analyses biochimiques, des analyses de sous types cellulaires ou de l'histologie.

Remplacement

Nous étudions dans notre modèle d’obésité l’impact d’un repas et des conséquences métaboliques qu’il engendre. Les approches expérimentales in vivo permettent d’intégrer les interactions entre alimentation, métabolisme et réponse des organes impliqués dans le métabolisme y compris l’absorption intestinale. L’ensemble de ces mécanismes ne sont pas actuellement accessibles par des techniques in vitro ou par des études in silico. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours pour étudier les effets sur ces différents organes est donc l’animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés, nous avons estimé le nombre d’individus à utiliser par groupe sur la base des quelques données disponibles sur les lipides post-prandiaux. Afin d’observer des différences significatives parmi ces lipides nous avons estimé que 8 souris par groupe d’étude étaient nécessaires pour obtenir des résultats significatifs lorsque l’on suit ces lipides 5 fois après le repas et que ce nombre était de 10 souris par groupe si on limitait à l’étude à 3 temps d’étude après le repas.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées par 4 ou par 5. L’enrichissement sera constitué d’un tunnel en plastique et une quantité de sciure augmentée pour favoriser l’enfouissement. Une surveillance quotidienne des animaux est réalisée. Les souris seront pesées toutes les semaines. La longueur des dents sera vérifiée lors des pesées et coupées avec des ciseaux, si nécessaire. Tout au long des procédures, les souris seront examinées régulièrement pour détecter des signes de de détresse (changements dans la respiration, poil rêche comportement inhabituel, posture voûtée, perte de poids). Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Les gavages seront réalisés sur souris vigiles pour éviter les fausses routes et réalisés avec un volume réduit et des canules de gavage fines et courtes bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les gavages seront réalisés par le même ingénieur, formé à cette technique, tout du long du protocole pour limiter le stress des animaux. Le jeûne imposé de 4h sera le matin, en période digestive avec un libre à un biberon d’eau. Lors du prélèvement des gouttes de sang, la coupure initiale au niveau de la queue sera réduite au minimum (de l’ordre du mm) puis comprimée par une compresse qui arrête le saignement. La récupération des 5 autres gouttes de sang se fera en ‘grattant la croûte’ nouvellement formée. Une compresse sera réappliquée en pression après chaque prélèvement. La surveillance de la bonne cicatrisation au point de prélèvement sera faite dans le cadre de la surveillance quotidienne des animaux. L’injection en intra-péritonéale est réalisée sans application préalable de lidocaïne afin d’éviter le stress de 2 contentions successives.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie sont proches de ceux observés chez l’Homme même si le stade n’évolue pas vers les formes les plus sévères. Le modèle de MASLD chez la souris est bien décrit dans la littérature et c’est un modèle largement utilisé par la communauté scientifique pour étudier cette pathologie. Ce projet vise à étudier le rôle des lipides post-prandiaux au cours de l’obésité chez l’adulte. Des souris adulte, agées de 6 semaines seront utilisées.

2 480 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau, une injection radioactive dans la veine de la queue, jusqu'à six anesthésies chacune et des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes, puis vivent seules en cage à partir de l'injection radioactive. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel provoque un sentiment d'isolement et une absence de liberté d'expression, et attend aussi des lésions au point d'injection, de la fatigue et des troubles digestifs. L'objectif immédiat reste de compter la radioactivité organe par organe sur les cadavres, la phase I chez l'être humain étant renvoyée à la fin de l'étude, et le porteur conclut que l'expérimentation animale est "requise" parce que les données précliniques sont "imposées par les autorités".

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un élément radioactif à une molécule, ou vecteur, capable de se lier de manière spécifique à une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que le vecteur puisse diriger et concentrer l’élément radioactif dans les cellules cancéreuses. En fonction de l’élément radioactif choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur par imagerie nucléaire ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Ces rayonnements détruisent l’ADN des cellules cancéreuses, ce qui mène à la destruction de la tumeur. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Plusieurs types de vecteurs capables de se lier spécifiquement à la protéine N ont été développés. A la différence de nombreuses autres protéines exprimées par les cellules cancéreuses, la protéine N est capable de transporter les vecteurs qui s’y lient jusqu’à son noyau cellulaire qui contient l’ADN. En rapprochant l’élément radioactif de l’ADN, il est possible de potentialiser l’effet de la thérapie, tout en diminuant sa toxicité pour les cellules saines. Nous avons sélectionné deux vecteurs se liant à la protéine N de manière différente afin de maximiser les chances d’identifier un système efficace. Comme il existe plusieurs types d’élément radioactif avec des propriétés très différentes, il est nécessaire de comparer l’efficacité de plusieurs combinaisons vecteur-élément radioactif afin d’identifier le couple le plus efficace. Alors que certains de ces éléments radioactifs émettent des rayonnements ionisants capables de détruire les cellules cancéreuses, d’autres peuvent être utilisés pour détecter les tumeurs par imagerie, ce qui permettra dans un premier temps de vérifier que les vecteurs s’accumulent bien dans la tumeur chez la souris. Dans un second temps, l’imagerie permettra de sélectionner les patients dont les tumeurs expriment la protéine N et qui seront donc éligibles à la thérapie. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels par radiothérapie interne vectorisée sont presque systématiquement accompagnés d’effets secondaires graves dus aux dommages provoqués aux cellules non-cancéreuses. En dirigeant les éléments radioactifs de manière spécifique au noyau des cellules cancéreuses, la stratégie de ce projet a pour but d’augmenter l’efficacité de ces thérapies tout en diminuant leur toxicité. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l’Homme à la fin de l’étude

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - 1 Injection en sous-cutané au moment de la greffe de cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum). - 1 injection de produit en intraveineuse dans la veine de la queue lors des expérimentations d'imagerie ou de traitement (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum). - Anesthésie à l'isoflurane réalisée lors de la greffe des cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum), lors de l’injection intraveineuse des produits (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ou au moment de la mise à mort (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ainsi que pendant l’acquisition des images (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). Il y aura au total 6 anesthésies au maximum pour chaque animal. - Imagerie à l’aide d’un scanner dans les procédures d’imagerie (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). - Mesures du poids et de la taille des tumeurs dans les procédures d’imageries et d’évaluation de l’efficacité des traitements (réalisée dans l'établissement 2, 1 min maximum).

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : - douleurs générées lors de la greffe des cellules tumorales, lors de l’injection des agents d’imagerie ou de thérapie. - lésions locales au site d’injection dû à la rétention du composé radiomarqué. - gêne ou douleur provoquée par la croissance des tumeurs - fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines ou troubles digestifs dans les jours suivant l'injection du traitement radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. - stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. - sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie et de biodistribution.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris incluse dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. La procédure d’imagerie permet d’observer la localisation du vecteur au cours du temps sans avoir mettre l’animal à mort (suivi longitudinal), ce qui permet de maximiser les informations recueillies en minimisant le nombre d’animaux mis à mort. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées.

Raffinement

Méthodes utilisées pour réduire la douleur : Raffinement des conditions d'hébergement : - Dans les procédures 1 et 2, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection du vecteur radiomarqué et de permettre un contact visuel des animaux. Chaque boite sera également enrichie d'un igloo et d'une roue en polycarbonate. - Dans toutes les procédures, des croquettes mouillées seront rajoutées dans les cages des souris souffrant de fatigue ou de faiblesse. Dans les procédures 3 et 4, des croquettes mouillées seront ajoutées systématiquement la première semaine suivant l’injection des vecteurs radiomarqués. - De la litière de cellulose sera utilisée pour limiter l’apparition de plaie chez les souris porteuses de tumeurs. - Le transport des animaux de l’EU1 à l’EU2 sera réalisée à l’aide de cages opaques à couvercle filtrant. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés lors de la greffe des tumeurs (5 min maximum), lors de l'injection intraveineuse des composés (5 min maximum), lors des acquisitions d'image (45 min maximum) et lors de leur mise à mort (5 min maximum). Analgésie: en cas d'apparition de douleur, des analgésiques seront administrés aux animaux. Des points limites spécifiques à ce projet ont été mis en place pour limiter la souffrance des animaux au minimum. Ces points limites seront appliqués de manière stricte.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux humains est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de tumeurs humaines car celles-ci se caractérisent par l'absence d’un organe (le thymus), ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge, et ils sont plus résistants aux radiations.

Réintégrées au troupeau de truies expérimentales à la fin des procédures, 16 truies vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sous anesthésie l'implantation d'une capsule de mesure de la température interne et la pose d'un cathéter dans l'oreille, puis trois prises de sang par jour pendant quatre jours et trois mesures de température rectale quotidiennes, autour de la mise bas. Un capteur vaginal est également posé, que le porteur retirera en cas d'inflammation ou d'écoulements. L'objectif déclaré est d'affiner le diagnostic d'un syndrome de dysgalactie présenté d'abord comme la source de "pertes économiques importantes" en maternité et comme le premier motif d'antibiothérapie chez la truie.

Objectifs

Le déroulement de la mise bas et la phase post-partum chez la truie est sujet à des perturbations responsables de pertes économiques importantes en raison de la relation étroite entre la santé des porcelets nouveaux nés et de leur mère. En maternité, la prévalence du syndrome de dysgalactie post-partum (SDPP) peut atteindre 20-30% des truies mettant bas et est le principal motif de traitement par antibiothérapie chez les truies. Le SDPP se caractérise par une diminution de la production de lait des truies et/ou une incapacité à allaiter correctement leurs porcelets. La physio pathologie du SDPP est complexe avec des composantes multiples (hormonales, métaboliques, inflammatoires, infectieuses, etc..) qui interagissent probablement entre elles. Même si les facteurs de risques ne sont encore pas tous connus, le SDPP peut être causé par des erreurs de gestion des animaux ou des bâtiments combinées à la présence d’agents pathogènes dans la porcherie. Par exemple, une mauvaise gestion du plan d’alimentation en gestation rendant les truies trop grasses peut augmenter l’occurrence de SDPP. Après la mise bas, les truies sont généralement plus sensibles aux agents infectieux. Leur système immunitaire est affaibli par le stress, et les voies de mise bas ouvertes ainsi que les morsures sur les trayons et sur la peau des mamelles favorisent aussi le SDPP. Le SDPP se manifeste souvent par une hyperthermie transitoire et les truies malades peuvent présenter des mamelles rouges et dures, des écoulements vaginaux purulents, des troubles digestifs (constipation) et manifester des comportements particuliers (manque d’appétit, se couche sur leur mamelle, refus d’allaitement, etc.). Une utilisation raisonnée d’antibiotiques pour soigner cette pathologie passe par un bon diagnostic qui repose à la fois sur les signes cliniques mentionnés plus haut et sur la mesure de la température interne afin de détecter une montée en température indicatrice de fièvre. A l’heure actuelle, il reste des questionnements sur le seuil de température à partir duquel la décision de traiter la truie doit être prise mais également sur période de mesure (jour, et heure de la journée) la plus appropriée pour détecter si possible précocement le début du SDPP. L’objectif de l’étude est de faire une analyse comparative des méthodes actuellement disponibles pour monitorer la température interne des truies autour de la mise-bas et pendant la première semaine de lactation.

Bénéfices attendus

La mesure en continu de la température et des constantes physiologiques des truies pendant la période peripartum doit permettre d’affiner le diagnostic du SDPP. En particulier, le projet va permettre de déterminer le timing le plus informatif de la journée et de la période peripartum pour mesurer la température interne des animaux. Les connaissances acquises dans ce projet sont de nature à contribuer à mieux comprendre la physio-pathologie du SDPP pour, à terme, raffiner les pratiques promouvant une utilisation raisonnée des antibiotiques chez la truie.

Procédures

Implantation de la capsule de mesure de la température interne et du cathéter veineux auriculaire pour permettre des prises de sang et des mesures de la température interne en évitant de stresser l’animal. Ce geste s'effectuera sous anesthésie. Les sédatifs sont injectés par voie intramusculaire et les truies sont placées en décubitus ventral pendant une durée totale de 15 minutes (durée de l'intervention chirurgicale). - Prélèvements de sang à l’aide du cathéter auriculaire (3 fois par jour pendant 4 jours à raison de 2,5 mL par prélèvement) pour le suivi des constantes physiologiques (marqueurs de l’inflammation). Chaque prélèvement durera moins d'une minute. - Mesure de la température rectale (3 fois par jour pendant 4 jours). la prise de température rectale durera moins de 30 secondes

Impact sur les animaux

- Implantation de la capsule de mesure de la température interne et du cathéter veineux auriculaire : Le protocole de monitoring des animaux en place dans l'établissement d’expérimentation permettra d'appréhender le risque lié à la sédation. La sécurisation du cathéter auriculaire par une bande adhésive autour de l'oreille peut entraîner une gêne pour l’animal. - Prélèvements de sang à l’aide du cathéter auriculaire : Les prélèvements de sang étant réalisés par du personnel compétent dans le cadre de procédures où les points limites sont définis et où des observations quotidiennes sont faîtes sur les animaux, nous ne nous attendons pas à des nuisances particulières liées aux différents prélèvements. Toutefois, nous ne pouvons pas totalement exclure la possibilité d'avoir des infections locales liées à la présence et à l'utilisation du cathéter veineux auriculaire. Le cas échéant, l'infection sera très rapidement mise en évidence par la mesure en continu de la température interne et l'animal recevra un traitement adapté. - Prise de température rectale : cette mesure étant réalisée sur des animaux non contraint par du personnel formé nous ne nous attendons pas à des nuisances particulières liées à ce geste.

Devenir

L'ensemble des animaux réintègre le troupeau de truies expérimentales à la fin des procédures.

Remplacement

Le porc est l'espèce cible de ce projet qui vise à raffiner les méthodes pour diagnostiquer le SDPP chez la truie. Il n'est pas possible d'étudier les variations de la température interne et des constantes physiologiques sans utiliser des truies de génotype conventionnel (Large White x Landrace) pour objectiver les actions à mettre en place ensuite en élevage, et au bénéfice de leur santé et leur bien-être. L'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour rendre compte de processus biologiques extrêmement dynamiques et sujets à une large variabilité entre individus. Le remplacement n’est pas possible car l’utilisation d’animaux est inhérente au type d’étude.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum statistique en fonction des mesures effectuées, sachant que l'objectif du projet est d’évaluer par des mesures en continu ou des mesures ponctuelles l’évolution de la température de chaque truie et de la relier au déroulement de la période peripartum et à des marqueurs d’inflammation mesurés dans le sang. Compte-tenu de la variation inter-individuelle des mesures, il s'agit d'obtenir un suivi complet sur au moins 10 truies. A partir des résultats de l’étude ayant mise au point l’implantation du cathéter auriculaire, un total de 12 truies est un nombre optimal pour prendre en compte les échecs de fonctionnement du cathéter. Les prélèvements de sang au cathéter jugulaire sont réduits au volume nécessaire pour les dosages métaboliques (2,5 mL/prélèvement) pour une cinétique journalière avec 3 points de prélèvements. Ainsi, un volume total de 30 mL de sang sera prélevé pendant l’ensemble de l’essai (soit environ 0,2% du volume sanguin total à l'issue de l'expérimentation, en considérant qu'il y a 65 mL de sang /kg de poids vif). L’étude sera précédée par une phase de pré-test réalisée sur un maximum de 4 animaux.

Raffinement

Toutes les mesures seront réalisées par du personnel formé et expérimenté. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera contrôlée, et les animaux suivis dans les minutes ou heures qui suivent. En cas de souci de santé, le vétérinaire en charge du suivi de l’élevage expérimental sera consulté et les animaux traités en conséquence. Dans le cadre de prélèvements répétés de sang, le recours à un cathéter veineux auriculaire permet de réduire significativement le niveau de stress induit par un prélèvement de sang obtenu à l'aide d'un lasso nasal sur un animal en contention. Enfin, les capteurs de température ont pour objet d'obtenir un grand nombre de données (toutes les 2 à 5 min) en continu pendant l’ensemble de la période de mesure sans avoir à manipuler l'animal. La surface des loges (64 m² pour un groupe de 16 truies en gestation et 9 m² pour chaque truie en lactation) permet à l'animal d'avoir une activité minimale et elles offrent la possibilité d'interactions avec les congénères. Dans chaque loge, des jouets (toile de jute) et d'autres dispositifs d'enrichissement (chaine) seront placés dans les loges et régulièrement renouvelés afin de limiter l'ennui. L’anesthésie est pratiquée 15 min avant l’intervention d’une durée de 10-15 min. Le protocole de monitoring des animaux en place dans l'établissement d’expérimentation (suivi de la saturation de l'hémoglobine en oxygène par oxymétrie de pouls et du rythme cardiaque) permet d'appréhender le risque lié à l'anesthésie. L’analgésie est assurée pendant les 3 jours après les interventions chirurgicales. Pour les points limites en lien avec le mode de logement / conduite des animaux, l’apparition de problème digestifs (constipation), de troubles locomoteurs (arthrites ou blessure) ou respiratoires nécessitera un traitement adapté. Les animaux ne seront pas exclus du dispositif expérimental si le traitement permet une guérison rapide de l’animal. Pour les points limites spécifiques (implantation du cathéter veineux auriculaire, du capteur de température et la pose du capteur vaginal), le risque d'inflammation de la zone chirurgicale sera évalué quotidiennement et le cas échéant qui sera prise en charge. Pour la pose du capteur vaginal, une inflammation ou d'une infection détectée par une augmentation de la température interne au-delà de 38,9°C et/ ou par la présence d’écoulements vaginaux sera traitée de la manière suivante : le capteur sera retiré et l’inflammation sera traitée.

Choix des espèces

- Le porc ne peut pas être remplacé par une espèce modèle compte tenu de la spécificité de ses réponses physiologiques pendant la période peripartum de la femelle reproductive - Le porc est l'espèce cible du projet qui vise à trouver une méthode alternative pour étudier les évolutions des constantes physiologiques dans une période de sa vie productive (début de lactation) où la truie est particulièrement sensible au développement du SDPP qui est la cause principale de l’utilisation d’antibiotiques chez la truie reproductrice. Nous avons choisi de travailler sur la truie reproductrice gravide car ce stade est spécifiquement touché par le SDPP. Nous travaillerons sur des truies en 3ème ou 4ème portées ce qui correspond à la parité moyenne des truies en élevage commercial. Pour le pré-essai, nous utiliserons des truies de réformes non gravides.

Une injection d'huile minérale dans le ventre déclenche chez les souris de ce projet un lupus qui se développe ensuite sur huit à vingt-quatre semaines. 1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent jusqu'à dix injections intrapéritonéales en quinze jours et un prélèvement sanguin sous anesthésie, l'objectif étant de savoir si la suppression d'une cellule immunitaire rare, le basophile, freine la maladie. Le porteur écrit que ni douleur chronique ni souffrance permanente ne sont attendues et qu'aucun médicament contre la douleur n'est donc "nécessaire", tout en décrivant une maladie inflammatoire chronique entretenue pendant six mois.

Objectifs

Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles) dans l'amplification des facteurs responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs protéines dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de la suppression de ces cellules dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de Lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales »), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et certains seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale une seule fois dans le but d'induire la maladie étudiée. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois sur une période de 8 ou 24 semaines: une fois dans le but de d'induire la maladie étudiée et 4 fois dans le but d'éliminer les cellules étudiées sur une période de 10 jours. Ces dernières souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale une seule fois avant d'éliminer les cellules d'intérêt la première fois. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant et après élimination des cellules. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale de huit à dix fois sur une période de 15 jours dans le but d'étudier l'effet de l'élimination des cellules d'intérêt dans un modèle de vaccination.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables induits sur les animaux sont de deux catégories. La première catégorie concerne le stress et les douleurs brèves induites par la contention manuelle des animaux, les injections intrapéritonéales multiples et les prélèvements sanguins (une seule fois) sous anesthésie générale. La deuxième catégorie concerne l’induction d’une maladie inflammatoire chronique (le lupus) par l’injection d’une huile minérale (pristane) dans le péritoine (le ventre) des souris. Cette huile peut induire, chez un faible pourcentage de souris, une difficulté respiratoire sur 2-3 jours, 2 à 3 semaines après l’injection. Après ce stade, la gêne disparaît. Les souris seront suivies de très près pendant cette phase pour s’assurer qu’aucune ne développe une forme respiratoire grave. La maladie induite (lupus) se développe alors sur une période de 8 à 24 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'en analyser différents organes. La mort sera confirmée par vérification de l'arrêt cardio-respiratoire.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des procédures seront également utilisés pour réaliser des cultures cellulaires et des expériences in vitro après leur mise à mort. Les échantillons des souris chez lesquelles la maladie a été induite serviront de contrôles positifs pour des expériences ultérieures. Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux qui seront utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.

Raffinement

Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Aucun médicament contre la douleur n'est donc nécessaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Afin de réduire au minimum le stress et la douleur qui pourraient être ressentis par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions : Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents infectieux. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons pour construire des nids, maisonnettes en plastiques pour se cacher…) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Les animaux devant être prélevés d'un peu de sang pour des analyses le seront après une brève anesthésie générale. Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Les procédures dureront 24 semaines maximum pour notre modèle induit (souris âgées de 32 à 36 semaines au maximum en fin de procédure). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des paramètres de la pathologie. Aucun animal ne sera réutilisé dans des expériences ultérieures. L’état général des animaux chez qui la pathologie est induite sera suivi sur une grille de score permettant de s’assurer que l’état des animaux n’est pas altéré. En cas d’altération trop marquée, les animaux concernés seraient euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris) est le seul modèle de mammifères disposant des animaux modifiés génétiquement pertinents pour les objectifs scientifiques de notre projet ayant trait au lupus. Toutes les souris entreront en procédure à l’âge adulte (minimum 8 semaines d’âges) et seront analysées au maximum à 36 semaines d’âge.

Cathéter posé sous anesthésie générale, injections de sang ou d'un agent vasoconstricteur, séances d'imagerie par ultrasons : 198 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure. Le porteur annonce des douleurs et un mal-être liés à l'inflammation provoquée par ces injections, une gêne au point d'incision et une perte de masse corporelle. Il s'agit de mettre au point une échographie super-résolue capable de détecter tôt le vasospasme après une hémorragie sous-arachnoïdienne chez les patients. Sur l'effectif, il écrit qu'il est difficile de l'estimer avec exactitude et l'évalue à 10 animaux pour valider la technique, sans expliquer comment on arrive aux 198 souris déclarées.

Objectifs

L’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) correspond à une issue de sang dans les espaces sous-arachnoïdiens du cerveau et figure parmi les premières causes d’admission en réanimation. L’impact socio-économique de cette pathologie est majeur puisqu’elle touche des sujets jeunes dont un tiers des survivants conservent des séquelles neurologiques. Le principal facteur associé à l’importance du handicap post-HSA est la survenue d’une ischémie cérébrale retardée (ICR). Or, à ce jour, en dépit de plusieurs décennies de recherche, aucun diagnostic précoce testée chez l’homme a pu empêcher l’incidence de l’ICR. Nous souhaitons développer et utiliser l’échographie super-résolue pour diagnostiquer l’ICR chez l’homme après une phase de développement chez l’animal. La technique de Microscopie par Localisation Ultrasonore (ULM en anglais) a été inventée en 2010 et a fait l’objet d’une récente revue de la littérature. Cette technique consiste à tracer à l’échelle du micromètre le parcours d’un agent de contraste ultrasonore approuvé en clinique qui consiste en une solution de bulles injectables et restreintes au domaine vasculaire. L’ULM a ainsi pu cartographier la structure vasculaire à l’échelle des pré-capillaires chez l’animal et a aussi été utilisé depuis chez l’homme. L'objectif du projet est de développer un outil d'imagerie par échographie 3D ultra-résolu, qui permettrait d’identifier de manière précoce le vasospasme (un des facteurs impliqués dans l’IRC) ainsi que les troubles de perfusion intracrânienne post-hémorrhagie afin de pouvoir diagnostiquer l’ICR. Cette nouvelle technique sera évaluée dans quatre modèles précliniques différents de HSA (deux de vasospasme avec l’injection d'un agent vasoconstricteur) et deux modèles d'hémorragie sous-arachnoidienne. Le but serait de pouvoir rendre plus accessible et précoce le diagnostic de l’ICR ainsi que permettre la localisation précise de vasospasmes et les troubles de perfusion vasculaires cérébrales grâce à l'imagerie ultrasonore, couplée à une injection d'un agent de contraste non radioactif et biocompatible.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet étant de proposer un modèle de détection précoce de troubles de perfusion, vasospasme et ICR par une modalité d'imagerie plus accessible, les bénéfices attendus seraient : - De proposer un agent de contraste peu coûteux, biocompatible, non radioactif et donc avec moins de risques sanitaires et accessibles à plus de patients, qui pourraient être exclus des méthodes d'imagerie habituelles. - De proposer une technique d'imagerie novatrice, qui pourrait être mise à chevet du patient et nécessitant moins d'infrastructures spécifiques, qui pourrait être portable, en plus d'être moins coûteuse et accessible à plus de patients que les méthodes d'imagerie habituelles, comme l’imagerie à resonance magnétique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des inductions d'anesthésie gazeuse, à des poses de cathéter sous anesthésie générale, à des injections intraveineuses et des injections d’agent vasoconstricteur ou de sang.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient : - De mal supporter la concentration de microbulles nécessaires. - Une gêne possible au niveau de l'incision (démangeaison ou douleurs les premiers jours). - Une gêne possible au niveau du site d'insertion du cathéter. -Des douleurs et un mal-être des souris liés à l'inflammation provoqués par les injections d'agent vasoconstricteur ou sang. - Une perte de masse corporelle liée à l'anesthésie générale. - Des douleurs post-opératoires possibles au niveau du point d'incision.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. Cependant un degré de sévérité a été estimé pour chaque procédure au lieu de les classer toutes en "sans réveil" car les animaux seront amenés à être réveillés au sein des procédures. De plus, il a été choisi de classer les procédures selon un degré de sévérité afin d'adapter le raffinement (analgésie, conditions per-opératoires ...).

Remplacement

Dans ce projet, il n'est pas possible de remplacer le modèle animal, il s'agit d'étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires et tissulaires physiopathologiques associés, survenant lors d'une hémorragie sous-arachnoïdienne / vasospasme. L'imagerie de la perfusion vasculaire cérébrale ne peut être réalisée autrement que par un modèle in vivo.

Réduction

Il est difficile d'estimer avec exactitude le nombre d'animaux nécessaires à ce projet. Il n'est pas possible d'avoir une idée de taille d'effet puisque l'on ne comparera pas des réponses à des traitements. Pour la mise au points des modèles de vasospasme, nous avons estimé des concentrations qui semblent être cohérentes avec ce qui est décrit dans la littérature. Pour la partie du projet ou on cherche le diagnostic d’ICR par ULM l'idée sera de valider la robustesse et la reproductibilité de l'agent de contraste et la méthode développé en le comparant à l’imagerie à résonance magnétique et le doppler. Nous estimons le nombre d'animaux nécessaires à 10, afin de valider cette technique malgré les différentes variations possibles liées à la physiologie des animaux.

Raffinement

Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole. Cela permettra de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et à apprendre aux souris à coopérer. Les souris vivront en groupe dans des cages enrichies (coton, kraft et maisonnette en papier) afin de respecter leur mode de vie. Après chaque anesthésie, les souris bénéficieront de croquettes humides dans une coupelle au sol afin de favoriser la prise de nourriture et l'hydratation. Durant chaque chirurgie, les souris seront analgésiées, et sous anesthésie locale au niveau de l'incision de la peau et de la zone d'insertion du cathéter. Une application d'anesthésiant est également prévue sur les sutures pour éviter les démangeaisons ou les douleurs post-opératoires éventuelles. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux lors de chaque anesthésie afin d'éviter le dessèchement oculaire. Le réveil postopératoire se fera dans une enceinte post opératoire dédiée à cet effet avec une température optimale pour les animaux ne régulant plus leur température corporelle avec de l'eau et de la nourriture, jusqu'à ce que les animaux retrouvent une bonne mobilité. Concernant l'application des points limites, les animaux seront mis à mort immédiatement dans l'une des situations suivantes : - Signes de douleurs indexés sur le Grimace-Scale Souris ; -Absence de réaction ; - Animal inactif dans sa cage ; - Complications chirurgicales inattendues; - Perte de poids; - Ré ouverture de l'incision de la peau.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies neurovasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour permettre la localisation précise de vasospasmes et les troubles de perfusion vasculaires cérébrales. Nous utiliserons des souris adultes en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études précédentes. Les souris seront de jeunes adultes. Le projet est réalisé avec de jeunes adultes afin de rester cohérent avec l'âge des souris couramment employées lors de protocoles d'étude de hémorrhagie sous-arachnoidienne (qui touche des patients jeunes) et d'optimiser la reproductibilité du protocole. Enfin, les souris ne doivent pas être trop âgées afin de pouvoir réaliser les acquisitions en imagerie ultrasonore. En effet, le crâne s'épaississant avec l'âge, il serait difficile d'imager le tissu cérébral chez des souris trop âgées.

Immunisés cinq à plus de seize fois par an, puis saignés jusqu'à vingt et une fois par an pour produire du sérum, 1 500 lapins, 1 000 cobayes, 30 chèvres et 30 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués une fois le titre d'anticorps et le volume de sérum jugés suffisants, après un dernier prélèvement plus important. Les anticorps polyclonaux obtenus alimentent des tests de diagnostic vendus dans le monde entier, le porteur mentionnant jusqu'à un test utilisé par seconde et un nombre d'animaux fixé par le "Donneur d'ordre". Il indique que la réaction inflammatoire au point d'injection disparaît en quelques jours et qu'aucune conséquence néfaste n'est observée ensuite, description difficile à tenir pour des animaux immunisés et ponctionnés pendant deux ans avant d'être tués.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l'immunisation des animaux afin d’obtenir des anticorps polyclonaux. Après immunisation et prélèvement du sang, le sérum obtenu contient les anticorps polyclonaux spécifiques de l’antigène utilisé. Après purification, les anticorps servent à produire différents tests par exemple : hémostase, thrombose, infections inflammatoires, détermination des groupes sanguins (utilisés pour les transfusions et les transplantations…). Ces tests de laboratoire permettent de doser les facteurs concernés dont le déficit est responsable des troubles cliniques dans le suivi des patients en thérapie ou en postopératoire. Les tests peuvent aussi permettre de confirmer des résultats sérologiques faibles ou peu clairs avant une transfusion ou une transplantation… Les tests immunologiques produits à l’aide des anticorps polyclonaux purifiés à partir des sérums des animaux hyperimmunisés sont marqués CE, ou enregistrés IVDR pour l’Europe, ou FDA (510(k)) pour les USA, ainsi que dans les systèmes règlementaires de la majorité des pays, afin de pouvoir les utiliser dans les hôpitaux pour le diagnostic et le suivi des pathologies. Le projet est principalement à visée humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la production d’anticorps polyclonaux, sont la mise à disposition des laboratoires hospitaliers et cliniques de tests diagnostiques performants et précis, utilisant directement ou indirectement la technologie immunologique. L’utilisation du processus d’immunisation sur animaux permet d’obtenir des anticorps polyclonaux, d’isotype IgG, reconnaissant l’ensemble de la structure de la protéine (utilisée comme antigène), avec une grande affinité, c’est-à-dire une réaction spécifique et très forte avec cette protéine. Cela permet de l’identifier, de la quantifier ou de l’extraire dans un milieu très complexe, comme le sang, tout liquide biologique (ascites, liquide céphalo-rachidien, urines, etc…), ou un lysat cellulaire. Deux applications importantes sont mises en œuvre dans le projet : a) test l’utilisation des anticorps pour la production de tests de diagnostic médical, permettant de quantifier précisément une protéine ou un anticorps dans un liquide provenant du corps humain, à des fins de diagnostic, de pronostic, ou de suivi de traitement thérapeutique. b) Extraction spécifique d’une protéine d’un milieu complexe, comme le plasma humain, afin de produire un plasma déficient en cette protéine. Ce plasma est ensuite utilisé dans des trousses de diagnostic, pour doser l’activité de la protéine concernée, apportée par le plasma à tester. Le bénéfice est très important car une faible quantité de sérum permet de fournir une très grande quantité de tests, ils sont utilisés au niveau mondial à très grande échelle (jusqu’à un test utilisé par seconde dans le monde).

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur une durée de 2 ans maximum : Prélèvements sur animaux vigiles : 1 prélèvement de sang sain. Immunisations sur animaux vigiles : 5 à plus 16 par an. Prélèvements sur animaux vigiles : 1 à plus 21 prélèvements sanguins par an pour la production sérum. Lorsque le titre des anticorps et le volume de sérum seront jugés suffisants, le protocole d’immunisation sera arrêté et les animaux euthanasiés après prélèvement d’un volume sanguin plus important.

Impact sur les animaux

L’expérience acquise avec ces protocoles permet de dire que la principale nuisance sur les animaux concerne la réponse au processus d’immunisation, qui peut induire une réaction inflammatoire au point d’injection. Cette réaction inflammatoire disparait généralement en quelques jours, et aucune conséquence néfaste n’est observée ensuite. Les autres nuisances possibles concernent la contention et l’introduction de l’aiguille sous la peau des animaux pendant le prélèvement, pouvant provoquer de l’inconfort, une sensibilité légère limitée à la durée du prélèvement. L'anesthesie a répétition chez le cobaye. Cette étape n’a pas d’autre conséquence particulière sur les animaux.

Devenir

Tout animal ayant étaient immunisés sera mis à mort car l'immunisation ne permet pas de les utiliser dans d'autre procédures.

Remplacement

A chaque fois que cela est possible, des anticorps monoclonaux produits par culture cellulaire, ou des anticorps recombinants, sont utilisés, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés pour la production d’anticorps polyclonaux. Toutefois, les anticorps polyclonaux présentent des caractéristiques uniques par leur grande affinité vis-à-vis de la protéine utilisée pour leur immunisation, et par la reconnaissance globale des structures de cette protéine. A l’inverse, les anticorps monoclonaux ou recombinants, ne reconnaissent qu’une seule structure de la protéine, et si cette structure est affectée par une mutation génétique, la reconnaissance et perdue, et le variant n’est pas détecté. Les anticorps obtenus par immunisation des animaux permettent ainsi d’obtenir des caractéristiques uniques pour les besoins du laboratoire et la mise à disposition d’outils de diagnostic performants. Le client s'engage à faire la production in vitro lorsque cela est possible et respecte les normes réglementaires de diagnostic.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu résulte de 2 contraintes : a) Utiliser un nombre suffisant d’animaux pour réduire la variabilité inter-animaux de la réponse immunitaire. b) Utiliser le nombre requis pour obtenir la quantité de sérum suffisante pour la quantité d’immunoglobulines IgG purifiées nécessaires pour répondre aux besoins. Le nombre d'animaux utilisés correspond au minimum en fonction des volumes souhaités, définis par le Donneur d'ordre. La ré-immunisation des animaux au long terme permet de limiter le nombre d’animaux utilisés. En moyenne, nous pouvons produire 26 litres de sérum par an avec 6 moutons ou 6 caprins, 130 litres de sérum par an avec 300 lapins et 13 litres de sérum par an avec 200 cobayes.

Raffinement

Les animaux sont tous contrôlés de façon journalière, ils ont à disposition des enrichissements adaptés et variés avec des roulements périodiques si possible (Lapin: bloc de cellulose à ronger, bout de bois.../Ovins, caprins:balai, un gros ballon, sapin perchoir(tronc d'arbre).../Cobayes: petite balle, bloc de cellulose...).- Pour les lapins, les cages disposent de mezzanines et de petits trous sur les parois leurs permettant de voir et de sentir les lapins dans les cages voisines . Les prélèvements se font dans une pièce séparée des hébergements. Après chaque prélèvement les lapins sont placés dans une piscine remplie de copeaux et de balles en plastique le temps du prélèvement d’un autre lapin.- Les ovins et caprins,sont dans une bergerie qui leurs est dédiée avec accès sur 2 hectares de prairie. Ils sont hébergés dans un box recouvert de paille. L'alimentation est composée de foin, pierre à sel, graines d'orge et d'avoine. Les prélèvements se font dans une partie dédiée, séparée de l'enclos. -Les cobayes sont hébergés dans une unité indépendante dans des cages par groupes sociaux harmonieux (2ou 3) avec mise à disposition d'une maison . Après chaque prélèvement ou immunisation ils reçoivent une récompense .Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être provoqué lors des procédures avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Des isolements de quelques minutes seront appliqués le temps des immunisations. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor. Un tableau d’évaluation des points limites est mis à disposition pour suivre l’évolution d’un animal qui présente des signes cliniques. (voir arbre décisionnel et critères d'arrêt des souffrances en pièces jointes). Les administrations ou les prélèvements s’arrêteront si un animal atteint un score de 3 sur la grille d’évaluation. Le dernier prélèvement est réalisé sous anesthésie générale , (excepté s' il y a contre-indication scientifique). Dans ce cas, l’animal ne se réveille pas, il est mis à mort dans la foulée du prélèvement .

Choix des espèces

Les lapins, les ovins, caprins et cobayes font partis des espèces les mieux documentées et les plus appropriées pour la production d’anticorps polyclonaux selon les recherches des donneurs d’ordres L'un des facteurs qui influence la production d'anticorps est la nature de l'immunogène utilisé (spécifique à chaque espèce). Le lapin est facile à manipuler et à prélever, il produit des volumes suffisants d'antisérum à titre élevé et à forte affinité. Les ovins et caprins ont une longue durée de vie, sont facile à manipuler et le prélèvement sanguin est facile à réaliser (veine jugulaire). La grande taille des animaux apporte un volume important d'immunsérum et réduit par la même occasion le nombre d'animaux. Les lapins ont au minimum deux mois et demi à la première immunisation et 5 mois aux premiers prélèvements. Les ovins et caprins ont au minimum trois mois à la première immunisation et 5 mois et demi aux premiers prélèvements. Les cobayes ont au minimum trois mois à la première immunisation et de 4 mois et demi aux premiers prélèvements. Cet âge à l’avantage de permettre une bonne acceptation des administrations par les animaux avec le développement d’une réaction immunitaire correcte et de permettre prélever une quantité intéressante de sang.