Diagnostic des maladies
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- Troubles musculosquelettiques
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- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Caractérisation de lignées de rats portant des mutations dans le gène CLCN4
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Entre 12 et 20 semaines d'âge, des rats porteurs de mutations d'un gène lié à une maladie neurodéveloppementale rare, et des rats témoins, passent une batterie de tests : activité locomotrice et anxiété, coordination, force musculaire, troubles compulsifs, apprentissage et mémoire, fonction musculaire sous anesthésie, avec une prise de sang et un prélèvement de fèces sous contention. 96 rats, dont 64 mutants et 32 témoins, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Le projet doit vérifier si ces lignées reproduisent les symptômes de la maladie humaine, et pour l'une des mutations le porteur parle d'un "léger phénotype" chez des mâles plus chétifs, plus agressifs, qui peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Les tests ne sont désignés que par ce qu'ils mesurent. Le porteur évoque un test "impliquant de l'eau" seulement pour décrire le séchage des rats, et cite en passant, pour une partie d'entre eux, une perfusion au paraformaldéhyde absente de la description des procédures.
Objectifs
La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.
Bénéfices attendus
Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.
Procédures
Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant.
Impact sur les animaux
Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype : les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention rapide durant quelques secondes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur.
Choix des espèces
Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.
Étude pilote de la pathogénicité rénale d’anticorps humain sur un modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
Un rein retiré en début d'expérimentation pour concentrer l'action des anticorps sur celui qui reste, puis six injections d'anticorps humains dans le sang en soixante-dix jours et des prélèvements de sang et d'urine deux fois par semaine : six minipigs adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend des dépôts dans les glomérules et une perte de fonction rénale, et fixe comme critères de mise à mort une perte de 20 % du poids en 72 heures, une protéinurie supérieure à 3 g/L ou une immobilité totale de plus de 24 heures. Une première étude pilote menée sur des hamsters n'avait produit aucun signe clinique, ce qui a conduit l'équipe à passer au porc. Tous les minipigs sont tués à l'issue, leurs organes servant à établir le lien entre ces anticorps et l'atteinte rénale.
Objectifs
La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune du système nerveux. Plusieurs cibles des anticorps dirigés contre soi ont été découvertes, parmi lesquelles des protéines présentes sur les neurones. La survenue concomitante chez certains patients d’une maladie neurologique et d'une maladie auto-immune du rein, pouvant aller jusqu’à la perte totale de la fonction rénale, est connue de longue date. Ces deux maladies (neurologique et rénal) concomitantes ont souvent été décrites, mais leur lien n'a jamais été établi. L’objectif principal de cette étude pilote est de confirmer, sur un modèle porcin, l'implication des anticorps auto-immuns dans cette maladie rénale en reproduisant la maladie chez le porc. De plus, il s'agit d’analyser les dysfonctionnements aux niveaux clinique et tissulaire provoqués par ces anticorps, afin de mieux connaître cette maladie et d'améliorer ensuite le diagnostic et les traitements chez l'homme.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer le caractère pathogène des anticorps dirigés contre certaines protéines dans le développement d’une atteinte rénale. Nous espérons démontrer que l’injection des anticorps induit des modifications biochimiques (protéinurie, élévation de la créatininémie) et histologiques (dépôts dans les glomérules) chez le porc, conduisant au développement d’une maladie rénale. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives dans le dépistage de l'atteinte rénale de cette maladie et sur la prise en charge thérapeutique.
Procédures
Les animaux seront impliqués dans une seule procédure qui se déroulera en plusieurs étapes sur une durée de 70 jours. Des injections d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux auront lieu 6 fois au cours des 70 jours pour induire une maladie rénale. Des prélèvements sanguins et urinaires auront également lieu deux fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Les injections et les prélèvements réalisés deux fois par semaine ne dureront pas plus de 10 minutes. Les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention afin d'éviter la douleur et diminuer leur angoisse. L'un des deux reins des animaux sera retiré en début d’expérimentation pour optimiser l’action des anticorps sur le rein restant. Cette chirurgie ne durera pas plus d'une heure et sera réalisée sous anesthésie générale avec une gestion rigoureuse de la douleur.
Impact sur les animaux
Pour les porcs ayant reçu des injections d'anticorps, des nuisances liées à l'apparition d'une maladie rénale et/ou neurologique peuvent apparaitre. Cependant, grâce à notre expérience clinique acquise auprès des patients présentant cette symptomatologie et dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs. Une perte de poids de 20 % par rapport au poids des 72h précédentes, une protéinurie glomérulaire supérieur à 3g/L, ou une détérioration de l’état général de l’animal avec immobilité totale de plus de 24h (risque d'escarres) seront des critères d’euthanasie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les animaux ne pouront pas être réutilisés, replacés ou adoptés puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps.
Remplacement
L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection d'anticorps humains induit chez le minipig des modifications biochimiques quantifiables (protéinurie, majoration de la créatinémie et baisse de l’albuminémie) similaires à celles observées chez l’homme et conduit à une maladie rénale histologique. Les modèles in vitro ne permettent pas de prendre en compte l’atteinte de différentes structures du rein ni des autres organes. Cette étude ne peut pas se limiter à une approche cellulaire in vitro ou à d'autres alternatives. Le modèle minipig a été choisi car la validation in vitro de la capacité des anticorps humains à reconnaître la protéine ciblée sur des tissus nerveux et rénaux s'est avérée concluante sur ces animaux.
Réduction
Le modèle de minipig visant à recréer une maladie rénale avec des injections d'anticorps étant unique, il est difficile de prévoir quels seront les changements sur les différents paramètres cliniques et anatomopathologiques testés. Le nombre d’animaux a été réduit à 3 animaux par groupe, soit 6 animaux au total, pour la réalisation de cette étude pilote. C’est un test de faisabilité visant à induire cliniquement une maladie rénale avec des anticorps sur un minimum d’animaux.
Raffinement
Nous attachons une grande importance aux conditions d’hébergement et à la qualité de vie des animaux. Ainsi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Une zone de repos couverte de litière, permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement, leur sera accessible. De plus, ils auront des jouets suspendus à mordiller. Lors des phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie courte sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Pour l'opération chirurgicale, une anesthésie générale et une gestion rigoureuse de la douleur seront mises en place. Nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basés sur des paramètres mesurables non invasifs. Une perte de poids importante, une baisse de la fonction rénale, une infection ou une détérioration de l’état général de l’animal avec immobilité seront des critères d’interruption.
Choix des espèces
Nous avons préalablement recherché in vitro la présence de la protéine cible dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries : souris, rats, lapins et cochons d’Inde, mais aucun d’entre eux ne l'exprime. Seuls le hamster et le porc expriment cette protéine dans leurs reins. Une première étude pilote a déjà été réalisée sur le hamster. Celle-ci a montré une absence de signes cliniques pathologiques suite aux injections d’anticorps, probablement due à la faible concentration de cette protéine dans les reins de ces animaux, contrairement à l’Homme et au Porc. Notre choix s'est donc ensuite porté sur le modèle porcin, car il est plus représentatif de l'Homme. Nous travaillerons sur des minipigs car cela permettra d'avoir des animaux adultes (24-30 mois) afin de correspondre à l'âge des patients humains souffrant de maladies neurologiques et rénales simultanément.
Etude d’hydrogels théranostiques en cancérologie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
Pour tester un réservoir de médicament injecté au cœur d'une tumeur cérébrale, 513 rats reçoivent une greffe intracrânienne de cellules tumorales, dont 504 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'injection de cellules ou d'hydrogel dure dix minutes, suivie de trois séances d'imagerie IRM et rayons X d'une heure à une heure trente sous anesthésie. Le porteur indique que la croissance tumorale provoque une douleur modérée et une perte de poids à partir de deux semaines après l'implantation, et prévoit d'injecter des deux côtés du cerveau quand c'est possible pour que chaque animal apporte deux informations au lieu d'une. Tous sont tués pour prélever les cerveaux, une grille de cotation de la douleur déclenchant la mise à mort de ceux qui atteignent un point limite.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer une nouvelle stratégie de traitement des tumeurs cérébrales. Celle-ci consiste à injecter au cœur de la tumeur un réservoir à médicament qui permet de libérer le médicament au fil du temps. La réponse au traitement anti-cancéreux est suivi par imagerie en temps réel. Ce suivi par imagerie pendant le traitement anti-cancéreux pourrait permettre d’obtenir une évaluation immédiate de l’effet du médicament.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est que ce nouveau mode de traitement directement dans la tumeur du cerveau devrait maximiser l’efficacité thérapeutique du médicament anti-cancéreaux tout en minimisant les effets secondaires. Les cancers du cerveau (tumeurs cérébrales) sont parmi les cancers les plus fréquents chez les enfants. Ils sont une cause de mortalité et de morbidité importante tant chez l’enfant que chez l’adulte. La mortalité des tumeurs cérébrales agressives (type glioblastome) est systématique et rapide. La durée de survie de patients atteints de tumeur cérébrale aggressive est d’environ 15 mois, et il n’existe aucune stratégie thérapeutique efficace à ce jour. Il est donc urgent de développer de nouveaux traitements, permettant de mieux prendre en charge les patients.
Procédures
L’étude implique une injection de cellules tumorales et / ou une injection d’hydrogel (durée de l'injection : 10 min). L’étude implique également la réalisation de 3 sessions d’imagerie durant entre 1h et 1h30 (imagerie IRM et rayons X), réalisées sous anesthésie également.
Impact sur les animaux
La greffe intracrânienne de cellules tumorales, conduite sous anesthésie, engendre une douleur modérée – La procédure expérimentale d'IRM, qui sera utilisée pour caractériser la tumeur, engendre une douleur légère et est conduite sous anesthésie. La phase terminale est réalisée sous anesthésie profonde (procédures sans réveil) – la croissance tumorale engendre une douleur modérée et fait l'objet d'un suivi et d'une grille de points limites particulière.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses des tissus.
Remplacement
Aucune préparation in vitro ne permet de reproduire une tumeur cérébrale dans son environnement dans le cerveau avec les différentes cellules, les vaisseaux sanguins, la pression cérébrale, le système immunitaire.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Nous réaliserons, lorsque cela est possible, des injections des deux côtés du cerveau afin que chaque animal apporte deux informations au lieu d'une, ce qui permet là aussi de diminuer le nombre d'animaux.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation est prévue à l'arrivée des rats avant toute expérience. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Des points limites de douleur ont été définis. En cas d'atteinte d'un point limte, les animaux seront euthanasiés. La chirurgie et l'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. De plus, concernant la chirurgie et afin de prévenir toute douleur post-opératoire, une injection d’un anesthésique local sera effectuée ainsi qu’une injection d'un analgésique avant la procédure chirurgicale puis toutes les 24 heures si l’état de l’animal le requière. La croissance tumorale implique une perte de poids, notamment à partir de deux semaines après implantation. Les animaux auront accès à une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain. De plus, le cerveau du rat est suffisamment gros pour permettre d’obtenir des images assez résolues et de réaliser des implantations de tumeur puis d’hydrogels dans de bonnes conditions de préservation des tissus sains. Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur un plus petit nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante en imagerie. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons représentent un modèle validé pour étudier les effets de la chimiothérapie sur l'environnement tumoral. Nous validerons nos protocoles de traitement (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) sur quatre modèles tumoraux, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Enfin, l’ensemble des animaux utilisés seront adultes afin de travailler sur un cerveau mature et stable. Nous avons l’expérience sur les modèles de tumeur et sur les injections d’hydrogel à cet âge.
Imagerie moléculaire de la microthrombose dans l’AVC et dans l’embolie pulmonaire en Imagerie de Particules Magnétiques (IPM) à l’aide de microparticules d’oxyde de fer
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
210 souris vont être utilisées, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 90 autres opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Le modèle d'embolie pulmonaire, que le porteur qualifie de bien caractérisé, présente un taux de mortalité très élevé dans les heures qui suivent l'injection. Les autres souris subissent un accident vasculaire cérébral provoqué chirurgicalement, avec douleur et stress les premières heures, affaiblissement de la patte avant gauche et difficulté à mâcher liée à des lésions du muscle masséter, avant des séances d'imagerie puis la mise à mort par perfusion transcardiaque. Le bénéfice annoncé, mieux diagnostiquer la microthrombose chez les patients, reste une perspective, quand les caillots et les lésions cérébrales sont provoqués dès maintenant.
Objectifs
La microthrombose se caractérise par la présence de petits caillots (
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de comprendre le rôle de la microthrombose dans les pathologies étudiées. Grâce à la détection par les microparticules d’oxydes de fer (MPIO), elle permettra d'établir un diagnostic efficace de la microthrombose et d'évaluer à terme les bénéfices/risques de différents traitements thrombolytiques sur cette condition. En conclusion, les résultats obtenus contribueront significativement à améliorer la prise en charge des patients présentant une microthrombose lors d’un AVC ou une microthrombose pulmonaire.
Procédures
Un modèle d’AVC (ischémie thromboembolique cérébrale focale) sera induit chez les souris et la microthrombose induite sera observée immediatement par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) , puis à 24h ou par Imagerie par Particules Magnétiques (IPM). Deux modèles d’embolie pulmonaire seront réalisés chez les souris par injection intraveneuse, puis la microthrombose sera observée en IPM. Les animaux seront mis à mort par perfusion transcardiaque pour étude supplémentaire des tissus.
Impact sur les animaux
Pour le modèle d’AVC, certains animaux peuvent montrer des signes de douleur et de stress dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Une gêne est observée dans les 6 premieres heures après l'AVC pour se nourrir normalement (difficulté à mâcher suite à des lésions du muscle massicateur). Les modèles d’embolie pulmonaire, bien qu’ils soient bien caractérisés, présentent un taux de mortalité très élevée, et plus précisément dans les heures qui suivent le modèle. Ainsi les animaux seront monitorés dès l’injection des produits (Fibrinogène ou Thrombine), pour évaluer les gênes respiratoires pouvant être causées par le modèle, et tout le long des imageries jusqu’à la mise à mort des animaux (sans réveil). Nous n'attendons pas d'autres effets indésirables dans ce modèle.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort, ce qui permettra de prélever les tissus du cerveau et des poumons.
Remplacement
Une approche in vitro a été réalisée au préalable à l’aide de chambre microfluidique. Les MPIO synthétisées ont été injectés dans les chambres microfluidiques après formation d’un caillot à l’aide de sang humain. Cette technique a permis de montrer la bonne fixation des particules au microthrombi sans l’utilisation de l’expérimentation animale. Les procédures expérimentales présentées ici ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), et du taux de mortalité obtenue au début de notre étude (pour les modèles d'embolies pulmonaires), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives nous permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose (permettant aux souris de s'isoler) et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Après le modèle d'AVC, les animaux se reveilleront dans des cages de réveils spécifiques (chauffées à 30°C et dans l'obscurité), avant de rejoindre leur cage d'origine une fois réveillés. La douleur des animaux sera évaluée suivant une échelle de douleur des souris (Mouse Grimace Scale). Une pâtée de croquettes ainsi qu'une gelée alimentaire seront déposées dans la cage des animaux après la chirurgie, afin d'assurer un apport hydrique suffisant.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour l’étude des pathologies cardio-vasculaires la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la microthrombose dans l’AVC et l’embolie pulmonaire. Le stade de développement des animaux est de 8 à 10 semaines soit un poids de 35-40g. Nous effectuons donc notre modèle sur des jeunes adultes.
Lyssavirus et d’autres virus neurotropes : étude de nouveaux virus, de leur pathogenèse et développement de nouvelles approches thérapeutiques et prophylactiques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
Inoculées par le virus de la rage dans le muscle ou directement dans le cerveau, des souris développent une perte de poids, une mobilité réduite puis une paralysie des membres postérieurs. 1 500 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 60 un niveau léger, avec craniotomies, laparotomies, pompes implantées sous la peau et tests comportementaux nommés : champ ouvert, rotarod, test de serrage, reconnaissance d'objet, labyrinthe en croix surélevé. Le porteur écrit que chez les souris traitées efficacement une paralysie, souvent d'un seul membre, peut persister "sans qu'il y ait d'impact sur l'état général des animaux". Toutes sont tuées, ni réutilisées ni adoptées, parce qu'infectées par un agent de biosécurité de niveau 3, les souris non infectées subissant le même sort du fait de leur hébergement en confinement.
Objectifs
Les encéphalites chez l'humain présentent une incidence de 2 à 12 pour 100000 suivant l'âge des patients considérés et leur localisation géographique. Une fraction de ces encéphalites corresponde à des cas de rage. Ils sont très souvent la conséquence d'une morsure de chien enragé et concernent principalement des enfants. L'OMS estime l'impact de la rage sur l'humain à au moins 50000 décès par an. Ce projet a trois objectifs : 1) Diagnostic des virus agents d'encéphalite et en particulier des Lyssavirus (les agents responsables de la rage) chez l’humain et chez les animaux 2) Évaluation et mise au point de nouvelles approches thérapeutiques et prophylactiques de la rage chez l'humain 3) Compréhension des mécanismes liés à la neuroinvasion, virulence et pathogénie des Lyssavirus en lien avec leur capacité à franchir la barrière d'espèce et à infecter l'humain
Bénéfices attendus
Bénéfice à court terme : 1) La surveillance de la rage chez l'humain et chez l'animal sera assurée, ainsi que la coordination de la prophylaxie de la rage chez l'humain en France Bénéfices à long terme : 2) Contribution au développement de nouvelles approches thérapeutiques et prophylactiques de la rage chez l'humain 3) Progression des connaissances des mécanismes infectieux des Lyssavirus, notamment liés aux facteurs de virulence, les voies de neuroinvasion et la capacité à franchir la barrière d'espèce et à infecter l'humain.
Procédures
Interventions uniques - Inoculation virale sur animaux vigiles (injection intramusculaire). Durée de l’intervention : moins d’une minute - Inoculation virale sous anesthésie (injection intracérébrale, et/ou dans la sous-muqueuse duodénale). Durée de l’intervention : moins d’une minute - Procédures chirurgicales (laparotomie, craniotomie, installation de pompes sous-cutanées). Durée de l’intervention : entre 30 et 60 minutes - Tests de comportement non-invasifs (test du champ ouvert, rotarod, test de serrage, test de reconnaissance d’objet, labyrinthe en croix sur-élevé). Durée de l’intervention : entre 5 et 10 minutes/test - Tests d’imagerie sous anesthésie. Durée de l’intervention : entre 5 et 10 minutes Interventions répétées - Prélèvement sanguin sur animaux vigiles. Durée de l’intervention : moins d’une minute. Nombre d’interventions : 2 à 3 - Administrations de composés antiviraux (injections intrapéritonéale, intraveineuse ou intramusculaire). Durée de l’intervention : moins d’une minute. Nombre d’interventions : 1 injection tous les 5 jours (5 injections)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont des conséquences directes de l’infection par les Lyssavirus, à savoir perte de poids et une mobilité réduite, et une paralysie des membres postérieurs. Ces effets apparaissent de façon progressive au début de l'évolution clinique et ont une durée de 2 à 3 jours avant d’atteindre le point limite de l’expérimentation. Une exception à cette durée concerne les expérimentations qui visent le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour la rage : dans certains cas de traitement efficace, les animaux traités peuvent survivre à l'injection de virus rabique tout en présentant une forte baisse de poids ou une paralysie des membres postérieurs. Avec la progression efficace du traitement, le poids revient souvent à la normalité, mais une paralysie (souvent monoplégie) peut occasionnellement persister, sans qu’il y ait d’impact sur l’état général des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car infectés par un pathogène de biosécurité niveau 3. Les animaux non-infectés ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car hébergés dans une animalerie de confinement niveau 3.
Remplacement
Les expériences proposées dans ce projet font suite et viennent compléter des expérimentations effectuées sur culture cellulaire et ne sont utilisées que lorsqu’elles représentent une étape incontournable pour l'avancement de la connaissance scientifique et non actuellement remplaçable par des tests in vitro. Dans ce contexte, l’utilisation d’animaux sera nécessaire dans 3 cas, notamment (i) pour l’isolement viral à partir du cerveau et des procédures liées au diagnostic de la rage ; (ii) pour la validation in vivo de molécules candidates pour la prophylaxie ou la thérapie de la rage ayant montré une efficacité in vitro ; et (iii) pour comprendre la pathogénie (les mécanismes utilisés par les virus pour envahir le système nerveux central) d'agents infectieux responsable d'encéphalites.
Réduction
Les analyses statistiques seront appliquées aux variables primaires suivantes : poids, score clinique, charge virale. On s'intéresse aux effets de souche virale, voie d'infection, traitement sur ces variables. 1500 animaux (en 5 ans) seront utilisés selon trois procédures décrites ci-dessous. Les effectifs prévus sont compatibles avec la recherche d'effets forts. Des tests statistiques seront appliqués pour les comparaisons multiples entre groupes. A la fin de chaque procédure les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car infectées par un pathogène de biosécurité niveau 3. Les animaux non-infectés ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car hébergées dans une animalerie de confinement niveau 3.
Raffinement
Les animaux seront suivis de façon quotidienne pour analyse de leur poids et des éventuelles signes cliniques liés à l’infection. Des mesures seront prises pour réduire la douleur et la souffrance (anesthésie, analgésie, support nutritionnel et hydrique).
Choix des espèces
La souris est l’animal de choix des modèles d’évaluation de l’efficacité de prophylaxie et du traitement antirabique chez l'humain. Elle a une durée d’incubation relativement courte et une sensibilité au virus rabique suffisante. Les souris adultes et les souriceaux sont extrêmement sensibles aux virus neurotropes en général. Leur utilisation permet d'isoler des virus dont la culture serait difficile voire impossible (absence de lignées cellulaires susceptibles). Souris adultes et souriceaux nouveau-nés. La souris adulte et le souriceau sont extrêmement sensibles aux virus à l'origine d'encéphalite en général. L'utilisation de ces animaux permet d'isoler des virus dont la culture serait délicate voire impossible autrement (absence de lignées cellulaires susceptibles).
Immunisation pour la génération d’anticorps monoclonaux in vitro
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
60 souris âgées de six semaines vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées au quinzième jour pour prélever leurs ganglions. Chacune reçoit deux injections d'antigènes de micro-organismes pathogènes dans le muscle du jarret, avec pesée et surveillance quotidiennes. Le porteur affirme que ce protocole n'entraîne jamais de détérioration de l'état général, puis liste comme effets possibles la boiterie, des grosseurs, des yeux mi-clos, une prostration et un pelage ébouriffé, la mise à mort étant envisagée en cas de nécrose au point d'injection. Les anticorps seront ensuite produits in vitro, et il conclut que la souris reste "irremplaçable" pour cette étape, invoquant notamment des "protocoles bien établis" et un "historique de succès clinique".
Objectifs
Depuis l'attribution du prix Nobel de Médecine en 1983 pour la découverte de la génération et de production d'anticorps monoclonaux, le développement et l'utilisation de ces derniers sont devenus des outils essentiels dans tous les domaines de la biologie, couvrant des questions scientifiques fondamentales jusqu'au développement de traitements des infections. La présente demande d'autorisation de projet vise à obtenir des anticorps de souris spécifiquement dirigés contre des antigènes d'intérêt impliqués dans les mécanismes infectieux de différents pathogènes affectant tant l'homme que les animaux. Ces anticorps de souris spécifiques auront plusieurs objectifs : (1) améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires du cycle de vie des micro-organismes pathogènes, (2) servir de référence en tant qu'outils d'études pour tous les laboratoires ou sociétés internationales travaillant dans le domaine de l'infectiologie, et (3) être utilisés dans le développement de stratégies thérapeutiques visant à lutter contre les agents infectieux émergents. Le processus de génération d'anticorps nécessite une étape d'immunisation des animaux pour susciter une réponse immunitaire permettant d'obtenir ces anticorps. Dans le cadre de l'immunisation, les souris sont injectées dans le muscle du jarret des pattes arrières avec les antigènes d'intérêt. Au bout de 15 jours, les souris sont euthanasiées afin de collecter les ganglions, qui seront utilisés pour développer des anticorps dirigés contre les antigènes d'intérêt. Ces anticorps joueront un rôle essentiel dans les diagnostics et les thérapies à venir contre les agents infectieux.
Bénéfices attendus
Le projet de génération et de production in vitro d’anticorps monoclonaux permettra des avancées à court, moyen et long terme, contribuant tant aux connaissances scientifiques qu'aux bénéfices thérapeutiques pour les êtres humains et les animaux contre des pathogènes infectieux. Les bénéfices à court terme résulteront d'une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires des micro-organismes pathogènes par l'étude et la compréhension de leur cycle de vie. En effet, les anticorps monoclonaux produits in vitro à partir des cellules immunitaires des souris deviendront des outils essentiels pour d'autres laboratoires nationaux et internationaux, facilitant la recherche en infectiologie. À moyen terme, l'identification de nouvelles cibles permettra le développement de thérapies pour lutter contre les maladies infectieuses émergentes. Ces connaissances acquises pourraient conduire à des stratégies thérapeutiques anti-infectieuses innovantes dans le domaine de la recherche médicale. Les impacts à long terme se feront sentir sur la santé publique grâce au développement de moyens préventifs et curatifs plus efficaces contre les agents infectieux à l'échelle nationale et mondiale. De plus, cela aura un impact positif sur l'environnement en permettant une meilleure compréhension et gestion des maladies infectieuses émergentes, réduisant potentiellement leur l'impact sur les écosystèmes. En résumé, le projet offre des bénéfices immédiats en termes d'avancées scientifiques et d'outils de recherche. À moyen et long terme, il pourrait conduire à des solutions innovantes pour traiter les maladies infectieuses, contribuant durablement à la recherche médicale et ayant des effets positifs sur la santé animale et humaine.
Procédures
Le processus de création des anticorps monoclonaux s'étend sur quinze jours et implique une immunisation chez la souris réalisée par deux injections, chacune d'une durée de 5 secondes, de protéines d'organismes pathogènes visant à stimuler leur système immunitaire. Durant ce protocole, les souris sont surveillées et pesées quotidiennement.
Impact sur les animaux
Ce protocole n'entraîne jamais de détérioration de l'état général des animaux et n'a jamais nécessité la mise en œuvre d'une médication générale dans le but de réduire la douleur, la souffrance ou l'angoisse. Cependant, les effets potentiels indésirables pourraient inclure des symptômes tels que la boiterie, la rougeur, la formation de grosseurs, des yeux mi-clos, une prostration, ou encore un aspect ébouriffé du pelage.
Devenir
Tous les animaux qui suivront le protocole d'immunisation seront euthanasiés afin de prélever leurs cellules immunitaires, permettant ainsi de générer des anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes des pathogènes étudiés.
Remplacement
Il est important de souligner que l'utilisation de souris pour la production d'anticorps monoclonaux peut être justifiée dans de nombreux cas, mais il est tout aussi essentiel de reconnaître qu'il existe des situations où d'autres alternatives peuvent être envisagées. Cependant, pour certains scénarios, les souris restent irremplaçables pour les raisons suivantes : (1) Une similitude avec la réponse immunitaire humaine : Les souris partagent une similitude dans leur réponse immunitaire avec les humains, ce qui en fait un modèle précieux pour la production d'anticorps monoclonaux destinés à des applications médicales. (2) Des protocoles bien établis : les techniques de génération d'anticorps monoclonaux chez la souris sont éprouvées et bien établies, avec des protocoles standardisés qui ont prouvé leur efficacité au fil des décennies. (3) Une polyvalence : les souris offrent une polyvalence d'applications, couvrant un large éventail de besoins de recherche et de développement thérapeutique, ce qui peut ne pas être aussi bien accompli avec d'autres modèles. (4) Historique de succès clinique : de nombreux anticorps monoclonaux développés chez la souris ont démontré leur succès clinique, soulignant leur efficacité dans la pratique médicale. (5) Une standardisation des résultats : en raison de la standardisation des protocoles et de la disponibilité de souches de souris bien caractérisées, les résultats obtenus avec les souris sont souvent plus prévisibles et reproductibles. Bien que des alternatives telles que les cellules humaines, les cellules animales autres que les souris, ou même des techniques in vitro soient envisageables dans certaines circonstances, la complexité du système immunitaire et les exigences spécifiques des applications médicales rendent souvent les souris indispensables dans la production d'anticorps monoclonaux.
Réduction
Le protocole proposé dans cette demande d'expérimentation permet de réduire de moitié le nombre de souris utilisées par rapport au protocole de référence. De plus, il réduit le nombre d'injections nécessaires à seulement 2, comparé à 6 dans le protocole précédent, et raccourcit la période d'expérimentation à quinze jours au lieu de deux mois. Ce protocole d'immunisation requiert l'utilisation de deux souris pour obtenir des anticorps dirigés contre l'antigène d'intérêt.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation, en groupes de 2 à 5 individus, avec un environnement maintenu à des niveaux adéquats de température, d'éclairage, de bruit, et doté d'une litière ainsi que de matériaux de construction de nids adaptés à l'espèce. L'injection des antigènes dans les jarrets permet de maintenir une excellente mobilité des animaux. En cas de signes de douleur tels que la boiterie, la rougeur, la formation de grosseurs, des yeux mi-clos, la prostration, ou un pelage ébouriffé, un analgésique est administré. Si nécessaire, la réhydratation de l'animal est envisagée par l'injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée, et l'accès à la nourriture est facilité en plaçant celle-ci au sol dans la cage. En présence de signes de prostration, d'hypoactivité, ou de piloérection accompagnant une plaie, une infection, ou une nécrose au point d'injection, l'euthanasie est envisagée.
Choix des espèces
Afin d'identifier, de comprendre et de caractériser les mécanismes d'infection des microorganismes pathogènes étudiés, il est nécessaire de disposer d'anticorps monoclonaux spécifiques dirigés contre les facteurs impliqués dans ces mécanismes. Pour obtenir ces anticorps monoclonaux, il est essentiel de passer par une étape d'immunisation d'animaux suffisamment éloignés de l'homme pour générer une réponse immunitaire robuste. La souris est l'espèce de choix depuis la publication du protocole de génération d'hybridomes pour la production d'anticorps monoclonaux en 1975, récompensé par le prix Nobel en 1983. Les souris utilisées dans ce protocole ont un âge de 6 semaines, avec un poids supérieur à 20 g. Ces jeunes souris possèdent un système immunitaire permettant ainsi une meilleure réponse immunitaire.
Enseignement à l’éthique et à l’utilisation de la faune sauvage en conditions expérimentales
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Capturés au piège dans leur milieu, 150 mulots sylvestres et mulots à collier sauvages sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés. Chacun subit sous anesthésie gazeuse une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire, geste que le porteur chiffre à trois minutes entre la sortie du piège et la fin du prélèvement. Le projet poursuit deux objectifs déclarés, former des étudiants de master aux métiers de la conservation et suivre les pathogènes des rongeurs sauvages. Le porteur admet un taux de mortalité de l'ordre de 3 % lié au piégeage, par arrêt cardiaque, rupture des cervicales ou refroidissement, et justifie le choix de ces deux espèces par leur abondance et leur "facilité de capture".
Objectifs
Le présent projet s’inscrit dans des objectifs de formation pédagogique et scientifique des étudiants de niveau Master ayant pour projet professionnel de travailler dans les métiers de l’environnement appliqués à la conservation d’animaux sauvages. Les objectifs sont i) de fournir un niveau de connaissance adapté à l’utilisation d’animaux de la faune sauvage à travers une approche éthique (présentation des comités d’étiques en expérimentation animale, règle des 3R,…) ; ii) initier les étudiants à la capture de Micromammifères (essentiellement le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus), le Mulot à collier (Apodemus flavicollis) et le Campagnol roussâtre (Myodes glareolus), potentiellement d’autres espèces sauvages moins abondantes ; le présent projet portera cependant uniquement sur les 2 espèces de Mulots, les autres espèces seront relâchées immédiatement, cf ci-dessous) ; iii) présenter les risques liés à la contention et les bonnes pratiques de terrain ; et iv) intégrer le bien-être animal en condition de captivité. Les échantillons récoltés avec les étudiants permettront ensuite de réaliser un suivi à long terme de l’état de santé des populations de rongeurs à l’échelle régionale et de maintenir une surveillance des pathogènes présents chez les rongeurs.
Bénéfices attendus
L’apport de connaissances nouvelles à des étudiants pouvant être amenés à manipuler des animaux sauvages dans leur cursus professionnel, et l’obtention de données nouvelles, remplissent un objectif à la fois pédagogique et scientifique à travers une approche non-létale. La formation à l’éthique et au bien-être animal répond ainsi aux enjeux sociétaux et de perfectionnement personnel d’une pratique encadrée par un context légal et qui s’inscrit directement dans les plans de carrière de certains étudiants. De plus, la formation à une démarche non létale sur des mesures hématologiques, immunologiques et hormonales est innovante et offrira un panel de compétences attractives auprès de leurs futurs employeurs. Sur le plan scientifique, le suivi de l’état de santé de rongeurs sauvages sur les sites d’études permettrait une meilleure compréhension des enjeux sociétaux actuels, mais aussi de définir des risques épidémioloques pour la présence de zoonoses dans l’environnement.
Procédures
Les animaux subiront une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie. Cette procédure sera réalisée par un personnel formé et expérimenté. Le temps estimé d’une prise de sang (avec identification spécifique, sexage et mesures morphométriques) est de l’ordre de 3 minutes de la sortie du piège à la fin du prélèvement.
Impact sur les animaux
Au cours de la manipulation, les animaux peuvent ressentir un stress lié à la capture, la contention, et la manipulation. Les parties potentiellement douloureuses ou particulièrement stressantes (prise de sang notamment) se font cependant sous anesthéise gazeuse. L’anesthésie gazeuse évite une injection (intrapéritonéale), l’induction de l’anesthésie est rapide (de l’ordre de 30 secondes) et l’anesthésie elle-même est brève (de l’ordre de 3 min, permettant l’identification spécifique, le sexage, les mesures morphométriques et la prise de sang), évitant une hypothermie. A l’issue de la prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, un lubrifiant oculaire et un anesthéisant local seront appliqués sur l’œil des individus. Par la suite, les animaux seront placés dans des boîtes dortoirs pour être remis en liberté après un temps de repos (minimum 1 heure) et la vérification préalable de leur bon état de santé (œil en bon état, comportement normal, cf § relatif aux points-limites ci-dessous). Cette méthode de prise de sang n’est pas substituable à un prélèvement dans la queue qui donne un volume trop faible ou dans le sillon mandibulaire . De précédents tests de prise de sang dans le sinus mandibulaire ont été effectués par des personnes qualifiées à ce type de prélèvement sur souris de laboratoire mais n’ont pas permis de réaliser des prises de sang. L’absence de ce sinus chez les Mulots est suspectée.
Devenir
Les animaux seront relâchés à l’issue de chaque procèdure en considérant qu’aucun traitement pouvant moduler leur réponse immunitaire ou affecter leur comportement ou fonction écologique ne pourrait affecter le devenir de ces animaux en condition naturelle. Cette remise à l’état sauvage prend en compte l’expérience des responsables du projet et le travail de la SBEA ayant statué à l’unhanimité sur la possibilité de réaliser un prélèvement sanguin comme indiqué dans chaque procédure suivi du relâcher des animaux.
Remplacement
Le double objectif du projet est (i) de former des étudiants aux méthodes éthiques et réglementaires d’utilisation d’animaux de la faune sauvage à des fins scientifiques et (ii) d’acquérir des données de long terme sur l’état de santé et les pathogènes de micromammifères sauvages. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différait significativement (Abolins et al., 2017; Viney and Riley, 2017),l’utilisation d’animaux sauvages est également requise. L’étude pathogènes potentiellement zoonotiques ne peut par ailleurs se faire que sur animaux capturés dans l’environnement et non sur animaux-modèles de laboratoire.
Réduction
La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles et la reproduction de ces mêmes conditions n’est pas possible en laboratoire. De nombreuses études scientifiques commencent à intégrer les conditions environnementales comme effets modulateurs de la réponse immunitaire face aux infections (Flies and wild comparative immunology consortium, 2020). Parmi les agents infectieux susceptibles d’étre identifié, Borrelia burgdorferi, l’agent responsable de la maladie de Lyme présente des prévalences parfois très faibles au sein de populations de Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et de Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1 and 2 ne peuvent être inférieurs à 30 rongeurs (Procédure 1) et 30 rongeurs (Procédure 2) par site d’étude et par an pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.
Raffinement
En ce qui concerne les captures, les pièges sont relevés au moins une fois par jour. Cependant, la littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à un arrêt cardiaque, une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges). En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Les conditions de captivité des animaux seront conformes aux conditions des Rongeurs de laboratoires (Cages normalisées, nourriture et eau fournis ad libitum), sauf en ce qui concerne la captivité individuelle, mais avec un enrichissement aussi élaboré que possible (Dortoir et coton permettant la confection d’un nid, structures de carton, roue et balle pour le jeu). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en des lieux séparés. Les mesures et prélèvements seront effectués sous anesthésie par du personnel qualifié.
Choix des espèces
Les espèces choisies sont le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et le Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Le Mulot sylvestre et le Mulot à collier sont des Micromammifères abondants, ubiquistes, opportunistes avec un régime alimentaire varié. Leur positionnement trophique intermédiaire les place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leur utilisation dans des travaux scientifiques en écologie, écotoxicologie, ou écoépidemiologie est fréquente, permettant une relation des résultats obtenus ici avec la littérature internationale, tant par les étudiants concernés que par l’équipe de recherche (Chrono-environnement). Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Seuls les Rongeurs d’âge adulte et les femelles non gestantes seront utilisés pour cette étude.
OBTENTION DE MATERIEL BIOLOGIQUE POUR LE DIAGNOSTIC IMMUNOLOGIQUE DE LA TOXOPLASMOSE CHEZ LA SOURIS
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Fabriquer un réactif de diagnostic sérologique : 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour récolter les parasites de leur cavité abdominale. Elles reçoivent une inoculation intrapéritonéale de toxoplasmes et une inoculation de cellules tumorales qui déclenche une ascite. L'infection se manifeste par des poils hérissés et un dos courbé, signes que le porteur décrit comme la preuve que l'inoculation a fonctionné. La culture cellulaire est écartée au motif du rendement : il faut environ 80 milliards de parasites par production, quantité que le porteur affirme ne pas pouvoir obtenir in vitro.
Objectifs
En France, la surveillance sérologique mensuelle (recherche d’anticorps dans le sang) de la toxoplasmose durant toute la durée de la grossesse chez les femmes enceintes séronégatives pour la toxoplasmose, est nécessaire en vue du dépistage de séroconversion en cours de grossesse pour la mise en place précoce d’un traitement adapté et limiter les complications pour le foetus. Le diagnostic sérologique est également utile pour les immunodéprimés, les patients susceptibles d'être greffés, les donneurs d'organes. L’utilisation d’antigènes est nécessaire pour la recherche d’anticorps. En l'absence d'antigène de toxoplasme seul commercialisé, la fabrication de l'antigènes de toxoplasma est donc une activité nécessaire pour les contrôles sérologiques faits en dehors de tests commerciaux.
Bénéfices attendus
Le projet est d’avoir des tests fiables permettant le diagnostic de la toxoplasmose, pathologie potentiellement grave puisque, elle peut entraîner des malformations congénitales mais aussi le décès de patients immunodéprimés chez l'Homme.
Procédures
Inoculation intrapéritonéale de parasites et de cellules effectuées pour créer une infection parasitaire qui se traduit par l'apparition de signes cliniques, preuve de l’infection.: 1 inoculation/souris, 1 minute. Inoculation intrapéritonéale de cellules TG180 induisant une ascite: 1 injection, 1 minute. Anesthésie flash à l'isoflurane: 1 seule, 1 min
Impact sur les animaux
L’inoculation intrapéritonéale de parasites chez la souris provoque une infection parasitaire. Les souris présentent des symptômes cliniques d'infection (poils hérissées, dos coubés), rentrant dans la grille de score et nous permettant de déterminer les points limites.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour le recueil des parasites de la cavité abdominale.
Remplacement
L’alternative à l’utilisation d’animaux serait de produire l’antigène par culture cellulaire. Cependant plusieurs problèmes se posent et nous empêchent de basculer sur une technique de culture : - la reproductibilité de la méthode qui n'est pas fiable. En effet, nous savons par expérience que la multiplication des parasites in vitro est incertaine, avec un nombre de parasites variables d’une boîte de culture à l'autre ne permettant pas d'assurer un antigène reproductible entre les différents lots contrairement à la multiplication in vivo. - la qualité de l'antigène est différente entre une production d'antigène in vivo et une production in vitro. Les deux préparations de parasites sont différentes jouant sur la sensibilité de chaque méthode. - la quantité de parasites. Il faut pour la fabrication de cet antigène, la production d'un nombre très élevé de toxoplasmes. Cette énorme quantité de parasites (environ 80 milliards de parasites) ne peut pas être obtenue en culture cellulaire. La production en cultures cellulaires nécessiterait une grande quantité de boîte de culture pour obtenir la même quantité de parasites. A notre connaissance, aucune autre alternative n’a été développée pour obtenir une si grande quantité de parasites. Il y a quelques années, nous avons travaillé (pour la multiplication parasitaire) avec des cellules en suspension qui ne permettaient pas d’avoir un nombre suffisant de parasites. Nous avons donc changé de type cellulaire pour travailler avec des cellules adhérentes. Nous avons ainsi amélioré notre rendement de parasites en le multipliant par 5. Cependant, ce type cellulaire bien que facilitant l’invasion et la multiplication cellulaire n’est pas suffisant pour obtenir la grande quantité de parasites exigée pour la production d’antigène. Les approches in silico ne peuvent pas être envisagées car le diagnostic de la toxoplasmose se fait biologiquement avec les sérums des patients mis au contact de l’antigène.
Réduction
La standardisation de cette technique (concentration de parasites, cellules, réactifs, …) réalisée par notre laboratoire depuis plus de 30 ans permet de prévoir un nombre minimum de souris nécessaire à la fabrication d'antigène. Pour la fabrication de cet antigène, un nombre d'animaux a été estimé : en dessous de ce nombre de souris, le rendement pour l’obtention du nombre de parasites est trop faible pour assurer la fabrication d’un volume d’antigène suffisant. De plus, le protocole de fabrication a été optimisé pour minimiser le nombre de souris au maximum. Ainsi, historiquement la souche de parasite et la lignée cellulaire (nécessaire pour la multiplication des parasites) étaient entretenues sur souris (passages successifs) toute l’année de façon continue consommant un nombre important de souris. Actuellement, les parasites et la lignée cellulaire sont stockés congelés et décongelés en prévision de la production de l’antigène. C’est donc une approche expérimentale validée au cours du temps qui nous a permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire avec une variabilité du volume obtenu. Nous ne pouvons prévoir la quantité d’antigène que par les volumes antérieurs utilisés annuellement.
Raffinement
Une surveillance accrue des souris (2 fois/ jour) est effectuée dans les 72 heures après leur inoculation par des personnels formés et expérimentés afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. Après l’inoculation parasitaire, une attention particulière est portée sur 5 critères : l’apparence physique de l’animal (aspect du poil), son comportement (réponse aux stimuli externes, mobilité) et la présence de signes cliniques (respiration). L’utilisation d’un analgésique permettra de prévenir toute douleur éventuelle. Il sera administré aux souris (5mg/kg) per os (dans un biberon) après inoculation de la souche parasitaire. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne).
Choix des espèces
Le modèle souris décrit dans les publications sont des souris (femelles) âgées de 8 semaines (20g) qui présentent un système immunitaire fonctionnel.
Investigation par IRM de la neurotoxicité des ganglions de la racine dorsale induite par des AAV chez le primate non humain 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Déjà utilisés dans d'autres projets et pour cette raison présentés comme habitués aux manipulations, trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du protocole. Ils subissent quatre anesthésies, dont une chirurgie de quatre heures avec ouverture des vertèbres pour poser un cathéter dans l'espace sous-arachnoïdien, des ponctions de liquide céphalorachidien et des prises de sang. L'injection d'un virus adéno-associé vise à provoquer une atteinte des ganglions de la racine dorsale, que l'équipe cherche à détecter par IRM, et du bleu de méthylène est injecté en fin de procédure pour vérifier le trajet du cathéter. Le porteur affirme que cette étude est "nécessairement réalisée chez l'animal", au motif qu'elle a "pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale".
Objectifs
Ce projet a pour but d’investiguer la possibilité d'un suivi en IRM (imagerie par résonance magnétique) de la neurotoxicité induite par l'injection intrathécale d'un AAV (Virus adéno-associé) au niveau des ganglions spinaux de la racine dorsale (GRD), chez le primate non humain. Les AAVs sont des vecteurs viraux dont le plasmide a été modifié de manière à en diminuer la pathogénicité, supprimer la capacité de réplication, et surtout permettre au vecteur d'exprimer un gène d'intérêt dans les cellules de l'hôte. Dans le cadre de thérapie génique visant le système nerveux central, les AAVs peuvent être injectés directement en intrathécale (=dans l’espace sous-arachnoïdien). Cependant, de récentes recherches ont montré une toxicité au niveau des GRD, lors du passage en clinique de certains médicaments, mais aussi chez le primate non humain. Cette toxicité a pris la forme de dégénérescence neuronale ou axonale, et elle ne peut être investiguée que par enregistrement électrophysiologique invasif ou par une inspection microscopique des GRD post-mortem. Le but de ce projet est d’investiguer la possibilité d’observer cette toxicité par IRM chez le primate non humain. Il est en effet possible que de nouvelles séquences d'IRM permettent de mettre à jour une désorganisation des fibres nerveuses au niveau spinal liée à cette toxicité, comme cela a déjà été montré dans le cas d'Alzheimer. Une telle méthode non-invasive permettrait un meilleur suivi de la toxicité potentielle de nouveaux AAV. Cela représentera une meilleure maitrise scientifique du suivi des thérapie génique, et une limitation du recours à des méthodes invasives pour les animaux. Enfin, ce projet va permettre de comparer deux méthodes de cathétérisations intrathécale en région lombaire : une méthode chirurgicale invasive, et une méthode moins décrite dans la littérature mais ne nécessitant pas de chirurgie. En effet, des méthodes de cathétérisations peuvent être nécessaire afin d’injecter de manière lente un AAV dans le système nerveux centrale. La deuxième méthode étant moins décrite, elle doit être comparée à la première méthode et ne sera testée qu'au moment de la mise à mort de l'animal. Une fois maitrisée, cette méthode produira un net gain en termes de bien-être animal, en supprimant le recours à la chirurgie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’investiguer l’observation de la dégénérescence des GRD par IRM suite à l’injection d’un AAV. L’IRM est une méthode non-invasive et pourra être utilisée dans des études précliniques pour détecter la neurotoxicité d’un AAV sans avoir besoin d’euthanasier l’animal en fin de procédure ou de le soumettre à des examens électrophysiologiques invasifs. Plus réalistement, l'IRM agirait comme une première sélection permettant d’objectiver une suspicion de toxicité pour certains candidats AAV. De plus, cette méthode permettrait d'enrichir les études d'efficacités sur l'expression des transgènes chez les animaux, en permettant un suivi longitudinal de la toxicité neuronale des AAV. Une telle méthode diagnostique permettrait de faire la différence entre une lésion temporaire et une lésion définitive, ce qui permettrait de raccourcir la durée d'investigation nécessaire et d'enrichir la qualité scientifique des données. Les séquences d’IRM utilisées se feront avec un système 1.5T. Ce système permet, par rapport à un système 3T d’obtenir des images de diffusion de meilleure qualité du fait de l’homogénéité du champ magnétique . De plus, nous ajouterons au protocole une qualification de la graisse, qui nous donnera un taux de graisse avant et après injection des AAVs dans les muscles pour pouvoir observer les conséquences indirectes de l’atteinte des DRG. A la vue de la taille relativement fine des structures analysées, un focus sera mis sur l’acquisition d’images avec une résolution spatiale importante. L’injection de l’AAV sera réalisée par une cathétérisation intrathécale suite à une laminectomie. Cette méthode permet d’assurer que tout le produit est bien injecté dans l’espace sous-dural. Cependant, cette méthode étant assez invasive (nécessitant une chirurgie longue), une seconde méthode de cathétérisation sera évaluée (collecte de LCS propre, injection de marqueur coloré). Cette deuxième méthode est moins documentée et moins connue, et sera donc réalisée juste avant l’euthanasie de l’animal. Si cette deuxième méthode fonctionne, elle pourra permettre dans le futur de réaliser des injections intrathécales longues et répétées, en réduisant l'invasivité pour l’animal.
Procédures
Les animaux subieront des anésthésies. Deux d'entre elles dureront environ 1h (pour l'imagerie IRM), la chirurgie lourde sera d'une durée de 4h environs et la dernère anesthésie sera réalisé avant l'euthanasiedes animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de liquide cerebrospinale se feront pendant la chirurgie et avant l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les animaux seront anesthésiés pour chacun des actes qu’ils subiront (IRM et injection de l’AAV), ce qui représente un total de 4 fois sur la totalité du projet. Ceci nécessitera une mise à jeun (diète hydrique). Lors des IRM, l’animal présentera un risque d’hypothermie dans la machine ou lors du transport de son hébergement à la salle d’IRM . L’injection intrathécale de l’AAV et la collecte de LCS présentent un risque de douleur ou de réactions locales au site de la chirurgie. Éventuellement, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivants les administrations. De plus, les animaux pourraient présenter des signes cliniques neurologiques dus à la méthode d’injection, ainsi qu’au potentiel dommage provoqué par l’AAV au niveau des ganglions dorsaux (même si les travaux publiés jusqu'alors chez le primate ne font pas état de troubles visibles). Un suivi neurologique sera réalisé tout au long de l’étude afin de surveiller de près ce paramètre. Lors de l’évaluation neurologique quotidienne, les animaux devront être isolés de leurs congénères le temps d’évaluer leur vision et motricité faciale. Les prises de sang peuvent provoquer un hématome au site de prélèvement. Les animaux seront sous anesthésie lors de celle-ci.
Devenir
Afin de pouvoir corréler les résultats observés à l’IRM, les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Les ganglions dorsaux seront récoltés ainsi que le cerveau, d’une part pour investiguer sur la présence du transgène injecté (afin de valider que l’AAV est bien présent dans les tissus nerveux) et d’autre part afin de réaliser de l’histologie pour observer et corréler la dégénérescence neuronal et axonal, avec les résultats d’imagerie IRM. De plus, pour valider la deuxième méthode de cathétérisation, du bleu de méthylène sera injecté dans le cathéter à la fin de la procédure. L’observation de la présence de bleu de méthylène au niveau des tissus nerveux, ainsi que le prélèvement de LCS propre, permettra de valider la méthode d’injection.
Remplacement
Cette étude permet de développer une méthode de détection de la neurotoxicité de manière non invasive grâce à l’IRM. Cette étude est nécessairement réalisée chez l'animal, car elle a pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale. La ressemblance physiologique du système nerveux et immunitaire du primate avec celui de l’homme permettra ensuite de transférer les méthodes développées aux essais cliniques chez l'humain.
Réduction
Dans cette étude, 3 animaux seront utilisés lors de cette étude afin de pouvoir répondre à des objectifs scientifiques. Cela permettra de rapprocher différents possibles niveaux de toxicité neuronale avec leur valeur en signal IRM correspondante et permettra d'établir des corrélations. Étant donné qu'un seul type d'AAV sera utilisé, Il n'est pas nécessaire d'utiliser plus d'animaux que cela. Enfin, une méthode de cathétérisation moins invasive, mais moins documenté, sera réalisé sur ces animaux avant leurs euthanasies, afin de pouvoir confirmer que cette méthode fonctionne par l’injection de bleu de méthylène. L’observation des tissus nerveux sera une étape clef de la validation de ce protocole. Ce projet permet donc de ne pas mettre à mort des animaux dans le seul but de valider cette méthode de cathétérisation.
Raffinement
Les animaux utilisé dans ce projet ont déjà été utilisé pour d’autres projets et sont donc habitués au contact ainsi qu’aux manipulations avec les techniciens d’animalerie. Ils seront hébergés et socialisés dans des volières conformes à la réglementation. Un fond musical sera diffusé en journée. L’entretien sanitaire des hébergements et le contrôle des paramètres environnementaux seront réalisés quotidiennement. Les animaux disposeront d’eau de boisson à volonté. Un aliment adapté à l’espèce et au poids de l’animal, ainsi que des fruits et légumes frais, seront distribués quotidiennement. Des jouets seront mis à disposition et renouvelés une fois par semaine. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse et de le prendre en charge. Un score neurologique sera mis en place en place à cet effet. Il permet d’évaluer précisément les fonctions suivantes : l’état de conscience de l’animal, sa posture, la coordination motrice et équilibre de l’animal, la motricité des membres et enfin un examen rapproché permet d’évaluer la neuro-ophtalmologie (oscillation des yeux, tailles des pupilles etc..). Ce score prend aussi en compte des signes cliniques plus classique tel que des fèces liquides ou des vomissements. Les mises à jeûn hydrique n’excèderont pas les 16h. Si nécessaire, du sirop et/ou des fruits pourront être distribués tôt le matin pour les animaux dont l'anesthésie est en fin de matiné ou dans l'après-midi. Un minimum de 3 jours de repos sera accordé suite aux anesthésies. Le jour des prélèvements de LCS, de sang ainsi que le jour de la chirurgie, les animaux recevrons de la buprénorphine afin de limiter toute douleurs potentiel. L’analgésie pourra être prolongé jusqu’à trois jour suivant la chirurgie afin de prévenir de toute douleur. Les volumes de prélèvement de LCS ainsi que de sang respecteront des normes et des volumes précis. Des points limites spécifiques seront définis et si nécessaire pourront amener une euthanasie des animaux. Lors des anesthésies, il sera suivi au minimum la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène ainsi que la température rectale des animaux. Des coussins chauffants, ainsi que des couvertures pourront être mise en place. Enfin, un relais d’oxygène sera mis en place si nécessaire.
Choix des espèces
Le but de ce projet est d’investiguer l’observation d’une neurotoxicité par IRM suite à l’injection d’AAV chez le primate on humain. La proximité phylogénétique de l’homme et du primate non humain permet d’obtenir des résultats prédictibles au niveau neurologiques et immunitaires. Les animaux utilisé seront des jeunes adultes ou adultes, afin que le système nerveux central et immunitaire soient suffisamment développés.
Investigation par IRM de la neurotoxicité des ganglions de la racine dorsale induite par des AAV chez le primate non humain 1/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Une laminectomie de quatre heures, quatre anesthésies, des jeûnes hydriques allant jusqu'à seize heures et des ponctions de liquide céphalorachidien : trois macaques à longue queue subissent ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du projet. Un virus adéno-associé leur est injecté dans l'espace sous-arachnoïdien pour provoquer une atteinte des ganglions de la racine dorsale, que l'équipe cherche à visualiser par IRM. Chaque jour, l'animal est isolé de ses congénères le temps d'évaluer sa vision et sa motricité faciale, et une seconde technique de cathétérisation, moins documentée, est essayée juste avant la mise à mort. Le porteur présente ce projet comme un gain de bien-être qui supprimera le recours à la chirurgie, alors que son protocole repose sur une chirurgie lourde et se termine par le prélèvement du cerveau et des ganglions.
Objectifs
Ce projet a pour but d’investiguer la possibilité d'un suivi en IRM (imagerie par résonance magnétique) de la neurotoxicité induite par l'injection intrathécale d'un AAV (Virus adéno-associé) au niveau des ganglions spinaux de la racine dorsale (GRD), chez le primate non humain. Les AAVs sont des vecteurs viraux dont le plasmide a été modifié de manière à en diminuer la pathogénicité, supprimer la capacité de réplication, et surtout permettre au vecteur d'exprimer un gène d'intérêt dans les cellules de l'hôte. Dans le cadre de thérapie génique visant le système nerveux central, les AAVs peuvent être injectés directement en intrathécale (=dans l’espace sous-arachnoïdien). Cependant, de récentes recherches ont montré une toxicité au niveau des GRD, lors du passage en clinique de certains médicaments, mais aussi chez le primate non humain. Cette toxicité a pris la forme de dégénérescence neuronale ou axonale, et elle ne peut être investiguée que par enregistrement électrophysiologique invasif ou par une inspection microscopique des GRD post-mortem. Le but de ce projet est d’investiguer la possibilité d’observer cette toxicité par IRM chez le primate non humain. Il est en effet possible que de nouvelles séquences d'IRM permettent de mettre à jour une désorganisation des fibres nerveuses au niveau spinal liée à cette toxicité, comme cela a déjà été montré dans le cas d'Alzheimer. Une telle méthode non-invasive permettrait un meilleur suivi de la toxicité potentielle de nouveaux AAV. Cela représentera une meilleure maitrise scientifique du suivi des thérapie génique, et une limitation du recours à des méthodes invasives pour les animaux. Enfin, ce projet va permettre de comparer deux méthodes de cathétérisations intrathécale en région lombaire : une méthode chirurgicale invasive, et une méthode moins décrite dans la littérature mais ne nécessitant pas de chirurgie. En effet, des méthodes de cathétérisations peuvent être nécessaire afin d’injecter de manière lente un AAV dans le système nerveux centrale. La deuxième méthode étant moins décrite, elle doit être comparée à la première méthode et ne sera testée qu'au moment de la mise à mort de l'animal. Une fois maitrisée, cette méthode produira un net gain en termes de bien-être animal, en supprimant le recours à la chirurgie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’investiguer l’observation de la dégénérescence des GRD par IRM suite à l’injection d’un AAV. L’IRM est une méthode non-invasive et pourra être utilisée dans des études précliniques pour détecter la neurotoxicité d’un AAV sans avoir besoin d’euthanasier l’animal en fin de procédure ou de le soumettre à des examens électrophysiologiques invasifs. Plus réalistement, l'IRM agirait comme une première sélection permettant d’objectiver une suspicion de toxicité pour certains candidats AAV. De plus, cette méthode permettrait d'enrichir les études d'efficacités sur l'expression des transgènes chez les animaux, en permettant un suivi longitudinal de la toxicité neuronale des AAV. Une telle méthode diagnostique permettrait de faire la différence entre une lésion temporaire et une lésion définitive, ce qui permettrait de raccourcir la durée d'investigation nécessaire et d'enrichir la qualité scientifique des données. Les séquences d’IRM utilisées se feront avec un système 1.5T. Ce système permet, par rapport à un système 3T d’obtenir des images de diffusion de meilleure qualité du fait de l’homogénéité du champ magnétique . De plus, nous ajouterons au protocole une qualification de la graisse, qui nous donnera un taux de graisse avant et après injection des AAVs dans les muscles pour pouvoir observer les conséquences indirectes de l’atteinte des DRG. A la vue de la taille relativement fine des structures analysées, un focus sera mis sur l’acquisition d’images avec une résolution spatiale importante. L’injection de l’AAV sera réalisée par une cathétérisation intrathécale suite à une laminectomie. Cette méthode permet d’assurer que tout le produit est bien injecté dans l’espace sous-dural. Cependant, cette méthode étant assez invasive (nécessitant une chirurgie longue), une seconde méthode de cathétérisation sera évaluée (collecte de LCS propre, injection de marqueur coloré). Cette deuxième méthode est moins documentée et moins connue, et sera donc réalisée juste avant l’euthanasie de l’animal. Si cette deuxième méthode fonctionne, elle pourra permettre dans le futur de réaliser des injections intrathécales longues et répétées, en réduisant l'invasivité pour l’animal.
Procédures
Les animaux subieront des anésthésies. Deux d'entre elles dureront environ 1h (pour l'imagerie IRM), la chirurgie lourde sera d'une durée de 4h environs et la dernère anesthésie sera réalisé avant l'euthanasiedes animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de liquide cerebrospinale se feront pendant la chirurgie et avant l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les animaux seront anesthésiés pour chacun des actes qu’ils subiront (IRM et injection de l’AAV), ce qui représente un total de 4 fois sur la totalité du projet. Ceci nécessitera une mise à jeun (diète hydrique). Lors des IRM, l’animal présentera un risque d’hypothermie dans la machine ou lors du transport de son hébergement à la salle d’IRM . L’injection intrathécale de l’AAV et la collecte de LCS présentent un risque de douleur ou de réactions locales au site de la chirurgie. Éventuellement, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivants les administrations. De plus, les animaux pourraient présenter des signes cliniques neurologiques dus à la méthode d’injection, ainsi qu’au potentiel dommage provoqué par l’AAV au niveau des ganglions dorsaux (même si les travaux publiés jusqu'alors chez le primate ne font pas état de troubles visibles). Un suivi neurologique sera réalisé tout au long de l’étude afin de surveiller de près ce paramètre. Lors de l’évaluation neurologique quotidienne, les animaux devront être isolés de leurs congénères le temps d’évaluer leur vision et motricité faciale. Les prises de sang peuvent provoquer un hématome au site de prélèvement. Les animaux seront sous anesthésie lors de celle-ci.
Devenir
Afin de pouvoir corréler les résultats observés à l’IRM, les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Les ganglions dorsaux seront récoltés ainsi que le cerveau, d’une part pour investiguer sur la présence du transgène injecté (afin de valider que l’AAV est bien présent dans les tissus nerveux) et d’autre part afin de réaliser de l’histologie pour observer et corréler la dégénérescence neuronal et axonal, avec les résultats d’imagerie IRM. De plus, pour valider la deuxième méthode de cathétérisation, du bleu de méthylène sera injecté dans le cathéter à la fin de la procédure. L’observation de la présence de bleu de méthylène au niveau des tissus nerveux, ainsi que le prélèvement de LCS propre, permettra de valider la méthode d’injection.
Remplacement
Cette étude permet de développer une méthode de détection de la neurotoxicité de manière non invasive grâce à l’IRM. Cette étude est nécessairement réalisée chez l'animal, car elle a pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale. La ressemblance physiologique du système nerveux et immunitaire du primate avec celui de l’homme permettra ensuite de transférer les méthodes développées aux essais cliniques chez l'humain.
Réduction
Dans cette étude, 3 animaux seront utilisés lors de cette étude afin de pouvoir répondre à des objectifs scientifiques. Cela permettra de rapprocher différents possibles niveaux de toxicité neuronale avec leur valeur en signal IRM correspondante et permettra d'établir des corrélations. Étant donné qu'un seul type d'AAV sera utilisé, Il n'est pas nécessaire d'utiliser plus d'animaux que cela. Enfin, une méthode de cathétérisation moins invasive, mais moins documenté, sera réalisé sur ces animaux avant leurs euthanasies, afin de pouvoir confirmer que cette méthode fonctionne par l’injection de bleu de méthylène. L’observation des tissus nerveux sera une étape clef de la validation de ce protocole. Ce projet permet donc de ne pas mettre à mort des animaux dans le seul but de valider cette méthode de cathétérisation.
Raffinement
Les animaux utilisé dans ce projet ont déjà été utilisé pour d’autres projets et sont donc habitués au contact ainsi qu’aux manipulations avec les techniciens d’animalerie. Ils seront hébergés et socialisés dans des volières conformes à la réglementation. Un fond musical sera diffusé en journée. L’entretien sanitaire des hébergements et le contrôle des paramètres environnementaux seront réalisés quotidiennement. Les animaux disposeront d’eau de boisson à volonté. Un aliment adapté à l’espèce et au poids de l’animal, ainsi que des fruits et légumes frais, seront distribués quotidiennement. Des jouets seront mis à disposition et renouvelés une fois par semaine. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse et de le prendre en charge. Un score neurologique sera mis en place en place à cet effet. Il permet d’évaluer précisément les fonctions suivantes : l’état de conscience de l’animal, sa posture, la coordination motrice et équilibre de l’animal, la motricité des membres et enfin un examen rapproché permet d’évaluer la neuro-ophtalmologie (oscillation des yeux, tailles des pupilles etc..). Ce score prend aussi en compte des signes cliniques plus classique tel que des fèces liquides ou des vomissements. Les mises à jeûn hydrique n’excèderont pas les 16h. Si nécessaire, du sirop et/ou des fruits pourront être distribués tôt le matin pour les animaux dont l'anesthésie est en fin de matiné ou dans l'après-midi. Un minimum de 3 jours de repos sera accordé suite aux anesthésies. Le jour des prélèvements de LCS, de sang ainsi que le jour de la chirurgie, les animaux recevrons de la buprénorphine afin de limiter toute douleurs potentiel. L’analgésie pourra être prolongé jusqu’à trois jour suivant la chirurgie afin de prévenir de toute douleur. Les volumes de prélèvement de LCS ainsi que de sang respecteront des normes et des volumes précis. Des points limites spécifiques seront définis et si nécessaire pourront amener une euthanasie des animaux. Lors des anesthésies, il sera suivi au minimum la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène ainsi que la température rectale des animaux. Des coussins chauffants, ainsi que des couvertures pourront être mise en place. Enfin, un relais d’oxygène sera mis en place si nécessaire.
Choix des espèces
Le but de ce projet est d’investiguer l’observation d’une neurotoxicité par IRM suite à l’injection d’AAV chez le primate on humain. La proximité phylogénétique de l’homme et du primate non humain permet d’obtenir des résultats prédictibles au niveau neurologiques et immunitaires. Les animaux utilisé seront des jeunes adultes ou adultes, afin que le système nerveux central et immunitaire soient suffisamment développés.
Production et élevage de modèles pathologiques rongeurs induits par une alimentation spécifique.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 5000
Rendus obèses et diabétiques par un régime riche en matières grasses avant même le début de toute expérience, 10 000 souris et 5 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le protocole tient à peu de chose, une pesée pour tous et un ou deux prélèvements sanguins pour moins d'un pour cent d'entre eux, le reste étant les signes cliniques que l'alimentation installe. Le porteur décrit un service, ces 15 000 rongeurs étant produits en fonction des "besoins stricts de chaque scientifique" et expédiés à qui les commande. Ceux qui ne partent pas sont tués, un animal "non standard" ne pouvant pas passer d'un projet à un autre si les spécifications diffèrent.
Objectifs
Dans le but d’étudier certaines maladies, il peut être nécessaire d’induire une modification de métabolisme et/ou de paramètres physiologiques en modifiant le régime alimentaire des animaux. Par exemple, une alimentation riche en matières grasses a été liée à un grand nombre de maladies, dont l'obésité, les maladies métaboliques et inflammatoires. Ce projet vise à produire des modèles animaux pathologiques avec des modifications physiologiques induites par l’alimentation dans le but de répondre aux attentes des chercheurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont le développement pour la communauté scientifique d’un modèle diabétique/d’obésité permettant de mieux comprendre et étudier ces phénomènes pathologiques qui touchent à la fois l’humain et l’animal, et de chercher des traitements à ces maladies et leurs comorbidités.
Procédures
Microprélèvements (moins de 1% des animaux, durée du geste : environ 1 minute), prise de sang (moins de 1% des animaux, durée du geste : environ 2min), pesée (100% des animaux, durée du geste : environ 30 secondes par souris et 1 minute par rat). Un animal subira 1 seule pesée et au maximum deux prélevements sanguins pendant l’étude.
Impact sur les animaux
Signes cliniques associés à l’obésité et au phénotype diabétique, stress et douleur associés aux prélèvements sanguins, stress associé à la pesée, stress associé à la contention.
Devenir
Les animaux sont mis à mort car il s’agit d’animaux non standards, suivant un protocole de nourissage et de prise de poids spécifiques aux attentes des scientifiques. On ne peut pas réutiliser les animaux d’un projet pour un autre projet à moins que les spécifications soient identiques ou les animaux sont expédiés chez le scientifique.
Remplacement
Ces modèles pathologiques sont issus de mécanismes complexes avec des processus de régulation impliquant l’ensemble de l’organisme. Ils permettent d’observer les conséquences des pathologies dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques et qui ne peuvent être remplacés par aucune méthode alternative.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et à prendre les deux sexes. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal afin d’adapter les traitements et de diminuer la morbidité et mortalité éventuelle.
Raffinement
Les animaux ont accès à de l’enrichissement dans leurs cages (mouchoirs et frisure de carton). Les animaux sont manipulés avec des méthodes à faible stress (manipulation par le corps). Afin de limiter le stress lors des prises de sang, dès que possible, les microprélèvements sont favorisés au lieu de prise de sang. Des points limites spécifiques et précoces ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces très utilisées en recherche. Ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d'études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Stade adulte compte tenu que l’aliment est donné aux animaux après sevrage (généralement à 6 semaines), comme le demande le modèle pathologique.
Étude de la dysfonction rétinienne au niveau des photorécepteurs chez un modèle murin d’une maladie neurodégénérative
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Un morceau de queue d'environ un millimètre coupé au ciseau chirurgical sur animal vigile, à dix jours de vie : tous les souriceaux nés dans ce projet subissent ce prélèvement pour génotypage. 370 souris porteuses d'un transgène humain lié à la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 120 reçoivent des injections directement dans l'œil sous anesthésie, 280 passent trois ou quatre séances d'imagerie, 90 subissent une heure d'enregistrement de potentiels évoqués, et le porteur reconnaît que ces manipulations peuvent provoquer inflammation, opacité cornéenne ou paupières mi-closes. Quarante souris passent des "examens d'acuité visuelle" à trois reprises dans leur vie, sans que le RNT précise en quoi ils consistent.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative caractérisée par des troubles cognitifs et psychocomportementaux entraînant une perte d’autonomie. L’incidence de cette maladie est en augmentation avec le vieillissement de la population. Un diagnostic précoce représente un véritable enjeu de santé public. Aussi, déterminer des signes de diagnostic précoce, est indispensable pour le traitement dans les meilleurs délais des patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Lors des études précédentes, il a été découvert qu’un modèle murin (souris) de la maladie d'Alzheimer, présentait des altérations au niveau rétine dès l’âge de 6 mois avec l’apparition de protéines Tau phosphorylés, ainsi qu’un déficit visuel accompagné d’un retard de la transmission synaptique au niveau de la couche des photorécepteurs de la rétine. Le but du présent projet est de comprendre le mécanisme de ces changements physiologiques précoces durant la maladie d'Alzheimer et de visualiser les protéines Tau phosphorylé (enchevêtrements) in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus dans le cadre de ce projet sont d’établir un nouvel outil de diagnostic précoce de la maladie d’Alzheimer ainsi que de comprendre le mécanisme de ces changements physiologiques précoces durant la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir de déficit moteur à partir du 7ème mois. Au 10ème jour après la naissance, un prélèvement caudal d’environ un mm coupé au ciseau chirurgical à bout pointu sur animal vigile pour génotypage sera réalisé. Quelques secondes seront nécessaires pour réaliser cet acte. Tous les animaux naissants seront soumis à cet acte une seule fois dans leurs vies. Durant cette étude des examens d’acuité visuelle seront réalisés sur des souris vigiles. Quarante animaux seront soumis à cet examen d'une duré de quelques minutes trois fois dans leurs vie. Les examens d’imageries seront réalisé sur 280 souris anesthésiés. La procédure d'imagerie dure 5 à 10 min, le groupe de quarante souris non injecté sera soumis a ce test 3 fois dans leurs vie, les 240 souris injecté seront quant à elle soumise 4 fois à l'examen d'imagerie. Les injections en intraveineuses des molécules d’intérêt sur animal vigile sont une procédure à durée de moins d'une minute, cela concernera 120 souris. Les injections intraoculaire des molécules d’intérêt seront réalisés sur 120 animaux anesthésiés , cette procédure dure 5 à 10min. L'enregistrement des potentiels évoqués se fera une seule fois sur 90 animaux sous anesthésie générale, la durée de l'enregistrement est d'une heure. Des analgésiques seront donnés aux animaux afin de réduire la sensation de douleur. Les 370 souris seront euthanasiées par différentes méthodes réglementaires selon les besoins expérimentaux.
Impact sur les animaux
Les animaux développent une pathologie neurodégénérative avec l’âge et pourront donc présenter une perte de poids après le 7ème mois de vie ainsi qu’un déficit cognitif pouvant entraîner une agressivité accrue. Les animaux seront soumis à une biopsie caudale (environ 1mm) afin de réaliser l’identification génétique des animaux et à un transport de courte durée. Pendant les anesthésies, il est possible que les animaux présentent des difficultés respiratoires ou une mauvaise réaction à l'anesthésie pouvant aller jusqu’à l’arrêt cardio-respiratoire (très rare). Au cours de l’étude, et suite aux manipulations (imagerie de l’œil, injection intra-veineuse/intra-oculaire, etc.) une atteinte oculaire est possible telle que : inflammation, opacité cornéenne, paupières mi-closes, etc.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien par différentes méthodes réglementaires pour la réalisation des différentes analyses.
Remplacement
Les animaux serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de cette étude concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la rétine.
Réduction
Une analyse de puissance statistique a été établie et le nombre d’animaux utilisé a été estimé à 370 animaux en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux nécessaire. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons, tunnel en carton et un bâton en bois) alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine à partir du 7ème mois. La première pesée sera prise comme référence. L’atmosphère est contrôlée pour les conditions d’hébergement (température et hygrométrie stable). Les animaux bénéficieront si nécessaire d’une anesthésie gazeuse ou fixe par injection intrapéritonéale. Deux différents analgésiques seront aussi administrés pour réduire la douleur pendant les expérimentations. Tous signes d’inconfort ou d’atteinte oculaire sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte de poids (à partir de 6 mois), dos courbé, couché sur le côté ; comportements anormaux : agressivité soudaine, isolement, réduction de la mobilité. Les points limites sont : atteinte oculaire (cataracte, inflammation...), léthargie, immobilité, perte de 20 pour cent de poids et difficultés respiratoires (gasps). Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées et de notre expérience sur ce modèle dans notre laboratoire.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus la souris modèle présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les souris seront étudiées à trois différents âges : - 3 mois : âge où un début de gliose et de perte synaptique sont observé - 6 mois : âge auquel les enchevêtrements sont observés avec un début de déficit cognitif - 9 mois : âge correspondant à une perte neuronale Ces âges ont été bien définis dans la littérature