Diagnostic des maladies

280 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale avec des variants du SARS-CoV-2, puis soumis à une prise de sang intracardiaque terminale sous anesthésie pour produire des sérums et prélever des organes. Le porteur indique n'attendre qu'une perte de poids transitoire et aucun autre symptôme, et présente la production de mini-organes comme un moyen de réduire à terme le recours aux animaux. Il affirme que le hamster est "le modèle animal le plus sensible" à l'ensemble des variants.

Objectifs

Le virus SARS-CoV-2 continue d'évoluer pour échapper aux réponses des anticorps neutralisants et s’adapter à de nouveaux hôtes. Il est important de comprendre et détecter la réponse immunitaire spécifique aux différents variants pour mieux suivre une éventuelle circulation des variants SARS-CoV-2 dans les populations animales. La proximité d’espèces sauvages partageant les mêmes espaces que l’Homme et la détection de matériel génétique du SARS-CoV-2 et ses variants dans les eaux usées incitent à poursuivre les recherches sur le rôle que ces espèces pourraient jouer en tant que réservoir secondaire des variants du SARS-CoV-2, avec un risque d’émergence d’un nouveau variant pour l’Homme. Il apparait donc nécessaire de développer de nouveaux outils de diagnostic permettant d’appréhender plus rapidement le risque pour l’Homme. Le hamster est le modèle animal le plus sensible à l’ensemble des variants et peut facilement être utilisé pour produire des matériaux de référence comme du sérum et des organes spécifiquement infectés par ces variants. Ces matériaux de référence issus de sérums/organes d’animaux infectés ou non-infectés permettront de développer un panel de méthodes de diagnostic. Par ailleurs les organes collectés permettront de mettre au point des méthodes de recherche d'anticorps intra-tissulaires pour chaque variant lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible. Ils permettront également de mettre au point des cultures de mini-organes en vue de constituer une réserve d’organes limitant ainsi l’utilisation d’animaux par la suite. Dès l’identification d’un nouveau variant d’intérêt par les pouvoirs publics (en fonction du nombre de personnes infectées), nous envisageons d’infecter 6 hamsters avec ce variant. Une prise de sang terminale sera effectuée en fin de procédure pour collecter du sérum, et après mise à mort, les organes/tissus infectés (cœur, rate, poumons, feces, écouvillonnages salivaire et rectal et intestins) seront collectés. Un groupe de 2 hamsters non infectés sera également utilisé afin de fournir un matériel de référence négatif. En se basant sur la fréquence d’apparition annuelle de variant, et en prenant en compte les variants actuellement disponibles au laboratoire, on estime que 35 variants maximum seront testés au cours des 5 années du projet, soit un total de 280 hamsters (35 x 8).

Bénéfices attendus

L’approche expérimentale utilisée pour ce projet permettra de développer et valider des outils de détection sérologiques adaptés à chaque variant et aux investigations dans la faune sauvage potentiellement réservoir du virus SARS-CoV-2 ou de ses variants (microprélèvements, organe/tissus d’intérêt…). La collecte des différents organes/tissus permettra de rechercher les marqueurs d’une infection passée (anticorps) pour chaque variant et de valider de nouvelles matrices lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible dans les conditions du terrain. Le travail innovant sur les mini-organes permettra l’étude in-vitro des mécanismes d’infection d’un variant sur une espèce sensible, limitant ainsi l’utilisation d’animaux de laboratoire. Dans un second temps, ce travail pourra être étendu aux espèces de la faune sauvage afin d’obtenir des réserves de mini-organes permettant de tester la réceptivité/sensibilité de ces espèces vis-à-vis des nouveaux variants. Dans cette optique et sur le long terme, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles pourront ensuite être utilisés dans d’autres études ou pour tester d’autres agents pathogènes.

Procédures

Les hamsters seront infectés une seule fois par voie intra-nasale (40μl - animaux anesthésiés - durée = 15 secondes environ) Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ traitement anti-douleur) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes)

Impact sur les animaux

Une possible perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est potentiellement attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. A partir de J+7 post-infection, les animaux commencent à reprendre du poids. Hormis cette possible perte de poids, il n’y a eu, et ce quel que soit le variant isolé depuis l'apparition de la Covid-19, aucun autre symptôme clinique durant la période d’infection et aucun décès lié à cette infection.

Devenir

Mise à mort pour collecte de sérums et tissus

Remplacement

A l'heure actuelle, seul le modèle hamster naturellement sensible au virus SARS-CoV-2 et à ses variants nous permettra d’obtenir d’une part des informations sur les mécanismes d’infection par les différents variants et d’autre part de collecter des échantillons pour développer des outils sérologiques et cellulaires adaptés à leur détection ou à leur étude dans d’autres espèces animales.

Réduction

35 variants seront testés au cours des 5 années du projet, soit un total de 280 hamsters (35 x 8). Le nombre de hamsters pour chaque variant testé a été déterminé de façon à obtenir les volumes de sérum et la quantité de tissus nécessaires pour pouvoir mener à bien le développement et la validation des différentes techniques qui permettront une meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite suite à l’infection par chaque variant. Aucune analyse statistique n’est réalisée. La collecte des organes permettra de disposer de matériel qui pourra être utilisé pour le développement notamment de mini organes qui à moyen terme permettra des études in vitro, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux de laboratoire.

Raffinement

Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc un modèle d’infection de choix. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV-2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 semaines à réception.

38 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : chacune reçoit une fois de la Listeria dans l'œil, et 20 d'entre elles subissent ensuite, éveillées et sous contention, une prise de sang par semaine pendant quatre semaines et des prélèvements vaginaux répétés. Les 18 autres passent par une étude pilote qui compare trois doses, pour trouver la plus faible qui installe la bactérie sans symptôme. Le porteur écrit que l'instillation va "certainement induire" une infection de l'œil et une inflammation de quelques jours, et que la bactérie peut provoquer fièvre, prostration, diarrhée, voire des complications neurologiques. Les résultats doivent fournir une "preuve de concept" pour analyser l'endomètre de femmes qui font des fausses couches à répétition, et un projet suivant sur la gestation des lapines est déjà annoncé.

Objectifs

La Listeria monocytogenes est une bactérie qui peut contaminer l’alimentation et induire chez la femme enceinte un accouchement prématuré ou une fausse couche. Il a été découvert ces dernières années, que la bactérie pouvait persister dans les cellules sans être détectable (dormance de la bactérie) par des méthodes classiques de bactériologie. Les objectifs du projet sont de mettre au point des outils et méthodes de détection de ces bactéries en dormance lorsqu’elles sont cachées dans les cellules en utilisant un modèle biomédical, ici la lapine. L’objectif est de définir la dose de Listeria, qui induit le portage de la bactérie mais sans symptôme de façon à tester les nouveaux outils de détection. Les résultats de cette étude, effectuée sur des lapines, permettront de valider les outils de détection de la Listeria et apporteront une meilleure connaissance des stratégies adaptatives développées par Listeria pour se cacher chez son hôte sans symptôme clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure connaissance des stratégies d’adaptation développées par Listeria monocytogenes pour se cacher (dormance) pendant plusieurs semaines, chez son hôte. Ces résultats serviront de preuve de concept pour étudier les échantillons d’endomètre humain prélevés chez des femmes présentant des fausses-couches à répétition.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure d’instillation oculaire (38 animaux, 1 seule fois, environ 3 minutes), prise de sang (2 ml, 1 fois par semaine pendant 4 semaines sur 20 animaux, environ 3 minutes) sur animal vigile, sous contention légère; à des prélèvements vaginaux (à 72h puis 1 fois par semaine sur 20 animaux), sur animal vigile, sous contention légère.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux liés à la Listeria qui peut induire comme signes cliniques : de la fièvre, une prostration, une perte d’appétit, des toubles digestifs (plutôt diarrhée) voire des complications neurologiques. Ces signes peuvent potentiellement apparaître dans un pas de temps limité dans la mesure où les doses de Listeria choisies ne doivent pas induire de symptomes cliniques. Cependant l’instillation oculaire de la Listeria va certainement induire localement, au niveau des yeux, une infection et une zone inflammatoire transitoire (quelques jours). Concernant les prélèvements, des prélèvements vaginaux et une prise de sang seront réalisées, nécessitant une contention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour plusieurs raisons : - infection à une souche de Listeria infectant l’espèce humaine - nécessité de prélever les tissus pour rechercher la Listeria entrée en dormance

Remplacement

Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit d’étudier si le portage asymptomatique (hébergement sans exprimer de symptome de la maladie) de la Listeria est possible dans différents tissus, il peut donc y avoir des bactéries dans les tissus sans manifestation de signe clinique donc cela necessite de travailler sur organisme entier vivant pour prendre en compte la complexité des processus physiologiques engagés. Il n'est donc pas possible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou un modèle de simulation informatique.

Réduction

Lors de la conception du protocole expérimental, nous avons déterminé le nombre minimum d'animaux à utiliser. Pour cette raison, nous avons prévu une étude pilote pour définir la plus faible dose permettant d’induire un portage asymptomatique de la Listeria (3 doses testées, 18 animaux en tout). Ensuite, la plus faible dose retenue permettant un portage asymptomatique de la Listeria sera testée sur 20 animaux de façon à collecter tous les tissus et valider les tests de détection de la listeria. Nous avons prévu un maximum de 20 lapines pour pouvoir valoriser ces données. L’hypothèse du portage asymptomatique a été validée in vitro sur plusieurs types cellulaires en culture, toutefois la littérature n’a pas de recul sur la proportion de lapines chez lesquelles Listeria sera soit complètement éliminée (lapines guéries) ou soit entrée en dormance chez des individus asymptomatiques après cette infection, cas de figure recherché, ou encore mortelle (non attendu). Un premier lot de lapines sera exposé, en fonction de la réponse de ces lapines et si nécessaire, un 2nd lot sera exposé pour conforter les premiers résultats et compléter les effectifs.

Raffinement

Les lapines seront hébergées en cage individuelle mais avec un contact visuel avec les autres lapines. Ces cages disposent de plateformes pour se mettre en hauteur ou, dessous, de se cacher, des jouets en plastique, des cubes de foin ou des batons de bois à ronger, du papier kraft ciselé sont également mis à disposition. Les paramètres d'ambiance de l'animalerie sont contrôlés. Une acclimatation d’une semaine sera réalisée pendant laquelle les lapines seront habituées à la présence humaine, au change des cages et aux manipulations par le personnel. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Ce suivi inclura l’observation du niveau d’activité, le comportement, la posture au repos, l’apparence (pelage), l’alimentation, les mouvements à la sollicitation et la manipulation d’une zone douloureuse. De plus, l’évaluation de l’état de l’œil, à savoir si l’œil est propre et brillant, sera suivie. Si la lapine présentait une douleur élévée alors une décision serait prise en concertation avec le vétérinaire quant à un recours à la mise à mort de cet animal. Des points limites reposant sur une grille de score intégrant ces différents paramètres ont été établis. Ainsi l'ensemble de ce suivi nous permettra d’intervenir rapidement et de manière graduelle si des signes de souffrance apparaissaient.

Choix des espèces

L'objectif est de reproduire des expériences anciennes de contamination par la Listeria chez la lapine, par conséquent seule cette espèce peut être utilisée pour en explorer les mécanismes. A la suite de ce projet, notre objectif est d’explorer les effets de la Listeria rentrée en dormance sur la gestation. Or ce modèle est pertinent pour étudier le placenta dont la structure est plus proche de l’homme que celle des modèles rongeurs. Nous nous appuyerons sur ces résultats pour le futur projet, le cas échéant. Seules des lapines adultes seront utilisées car l’objectif est d’évaluer le portage asymptomatique de la Listeria chez des lapines pubères.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation pulmonaire leur est induite par injection de bléomycine ou de LPS, puis elles reçoivent un agent de contraste par un cathéter posé sous anesthésie pour tester une technique d'imagerie à particules magnétiques. Le porteur indique que la fibrose pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, de la prostration et une perte de poids, les animaux perdant plus de 15 % de leur poids étant tués. Il affirme que les procédures ont un caractère de stricte 'nécessité' et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie à particules magnétiques (MPI) pour le diagnostic précoce de l'inflammation pulmonaire en utilisant un nouvel agent de contraste composé de microparticules de polydopamine couplées à un anticorps anti-VCAM-1. Ces molécules d’adhésion endothéliales VCAM-1 sont exprimées à la surface des cellules endothéliales lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Des tests préliminaires sur cet agent de contraste en imagerie à particules magnétiques ont montré que les propriétés magnétiques de cet agent de contraste permettaient une sensibilité de détection en MPI supérieur à celle de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). D’autres part, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de cet agent de contraste et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique. L'utilisation de cet agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation en MPI et nous prévoyons de tester dans ce projet la capacité de détecter l’inflammation pulmonaire dans différents modèles chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation in vivo dans le cerveau, les reins et la muqueuse intestinale. Nous savons que ces microparticules ont un signal en MPI du fait de leur propriété magnétiques spécifiques. Il est donc attendu de la technique d'imagerie MPI utilisant les M3P qu'elle puisse elle aussi permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation pulmonaire par rapport aux animaux contrôles n'ayant pas d'inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie MPI avec injection de produit de contraste (durée : environ 30min).

Impact sur les animaux

Les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. La bléomycine est un agent anti-cancéreux dont un de ces effets secondaire est d’induire de la fibrose pulmonaire, d’où son utilisation courante en recherche préclinique pour l’induction d’inflammation pulmonaire. Le LPS est un sucre que l'on trouve à la surface des bactéries dont l'injection simule la présence de bactérie et induit ainsi une réaction immunitaire forte. Il est important de noter que la dose de LPS choisie pour ce projet (100 µL à 0.5 mg/mL) n'induit pas de mortalité chez les souris. L'induction de l’inflammation pulmonaire et la fibrose pulmonaire peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par de la prostration, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie MPI, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Tous les animaux de cet étude sont mis à mort à l’issue des 2 procédures.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisées sur l'gent de contraste en imagerie à particules magnétiques (utilisation de "fantômes") et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de l'agent de contraste en imagerie MPI lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes citées, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation pulmonaire. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets, ayant utilisé des protocoles d'imagerie similaires pour évaluer l'inflammation dans d'autres tissus avec les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Les données de ces 5 animaux étaient comparées à 5 autres animaux du groupe contrôle. Il semble intéressant d'étudier l'effet sexe sur le développement de ces modèles d'inflammation ainsi que l'efficacité du ciblage de l'agent de contraste et de leur détection par imagerie photoacoustique, nous prévoyons donc de réaliser chaque modèle sur 5 souris mâles et 5 souris femelles. Avec les animaux contrôles (recevant des injections de liquide physiologique), cela fait donc 20 animaux par modèle. De plus, nous aurons besoin d'évaluer la sensibilité et la spécificité de la méthode en utilisant des microparticules non ciblées, en utilisant 20 autres animaux (10 animaux pour chaque modèle d'inflammation (5 mâles et 5 femelles) et 10 animaux contrôles (5 mâles et 5 femelles aussi) ), amenant au total à 40 animaux par modèle. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons avec pour paramètres : moyenne anticipée groupe 1 (modèle) = 10 +/- 5 et groupe 2 (contrôle) = 1, alpha = 0.05, ayant donné un résultat de 5 animaux nécessaires par groupe. Les moyennes de signal obtenues seront analysées par un test de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à œuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure (points limites cités plus loin) ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les instillations (LPS ou bléomycine), puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à l’euthanasie des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion intracardiaque réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt (reins), la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. En amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l’intubation lors de l’injection intratrachéale, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose de LPS, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Les points limites suivants et les décisions prises en conséquence sont définis comme suit : Niveau 1 : diminution de l’activité dans la cage, réduction de l’interaction avec les congénères, absence de toilettage, dos vouté, rétrécissement de l’ouverture orbitaire, changement de position des oreilles et des moustaches (oreilles vers l’extérieur, moustaches vers l’avant ou vers l’extérieur) --> Augmentation de la surveillance (4 fois par jour). Niveau 2 : perte de poids de plus de 15 %, prostration dans la cage, absence de réaction au toucher, tremblements/convulsions, saignements rectaux --> Mise à mort de l’animal par administration d’une dose létale d’anesthésique.

Choix des espèces

D’un point de vue scientifique cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic d’un mauvais état de santé chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un diagnostic positif d'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.

1359 souris vont être utilisées dans un élevage impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire une lignée modèle de la maladie d'Alzheimer à phénotype dommageable. Sur ce total, le porteur indique que 990 seront transférées vivantes vers un autre site pour y être utilisées dans des expériences, tandis que 270 reproductrices et 99 souris à phénotype dommageable seront tuées. Les souriceaux sont identifiés par tatouage des phalanges et génotypés par un prélèvement au bout de la queue au septième jour de vie. Le porteur décrit que ces souris transgéniques peuvent développer des crises d'épilepsie et devenir agressives avec l'âge, et affirme qu'aucun modèle cellulaire n'est assez complexe pour se substituer à l'étude de la rétine menée ensuite.

Objectifs

Le but du présent projet est de faire un élevage d’une colonie de souris modèle. Il s’agit d’un modèle murin de la maladie d'Alzheimer à phénotype dommageable. La production de cette colonie servira ensuite à caractériser le phénotype rétinien chez le modèle dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic précoce non-invasive de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Élevage de la colonie de souris modèle à phénotype dommageable. Cette colonie de souris servira par la suite à mettre en place une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer et aussi améliorer le parcours de soin des patients.

Procédures

Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir d’épilepsie à l’âge précoce et devenir agressive avec l’âge. Au 7ème jour de vie, un prélèvement caudal sera réalisé pour le génotypage. La procédure ne dure que quelques secondes mais peut générer un stress pour l’animal du fait de la contention ainsi qu’un saignement au niveau de la biopsie. Tous les animaux de l'élevage seront prélevés pour le génotypage une seule fois.

Impact sur les animaux

Les animaux transgéniques développant la maladie d’Alzheimer peuvent présenter des troubles épileptiques à l’âge d’environ 3 mois, cela représente moins de 5 pour cent des cas. Aussi ces souris transgéniques peuvent devenir agressifs avec l’âge. Le prélévement caudal pour le génotypage peut générer un stress pour l’animal du fait de la contention ainsi qu’un saignement au niveau de la biopsie. Une infection locale pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour génotypage.

Devenir

Gardé en vie et transféré vers un autre site agrée pour les 990 souris pour expérimentation. Euthanasie des 270 souris reproductrice. Euthanasie ou mort des 99 souris à phénotype dommageable.

Remplacement

Les souris issues de cet élevage serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de ces études concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la fonction rétinienne.

Réduction

Compte tenu de la nature de ce projet d’élevage, il ne nécessite pas d’approche statistique. Néanmoins, les projets dans lesquels seront affectés les animaux par la suite (utilisation continue) feront quant à eux l’objet d’un calcul de puissance et d’une analyse statistique adapté. Les élevages seront adaptés afin de produire le nombre adapté d’animaux dans le respect des 3Rs. La production d’animaux a été estimée à 1359.

Raffinement

Les animaux en provenance d’éleveurs agrées seront hébergés par trois (Un mâle reproducteur et deux femelles reproductrices) dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (papier kraft, bâton à ronger et éventuellement maisonnettes rouges). Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie. Avec une mise en place d’étiquettes au niveau des cages pour un meilleur suivie (note d’observation au cas de blessure, présence de souris gestante ou naissance). Les animaux transgéniques développant la maladie d’Alzheimer peuvent présenter des troubles épileptiques à l’âge d’environ 3 mois. Cela représente moins de 5 pour cent des cas. Si l’animal présente des crises d'épilepsies une euthanasie sera effectuée. Aussi, ces souris transgéniques peuvent devenir agressifs avec l’âge. Dans ce cas, l’isolement des souris est envisagé ou une euthanasie au cas de blessure grave. Aucun autre effet indésirable n’est décrit ou connu d’après notre expérience. Les animaux seront stabulés dans un environnement avec une alternance jour (7h-19h)/nuit (19h-7h), une température de 22+/-2 degrés Celsius et une hygrométrie à 50 +/- 10.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus cette souris modèle présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les souriceaux de 7 jours seront identifiés par tatouage au niveau des phalanges. Dans le même temps, un prélèvement caudal d’environ 1 mm sera réalisé pour le génotypage. Les animaux seront étudiés à l’âge de 3, 6, 9,12, 15 et 18 mois dans une autre animalerie agrée. Les animaux seront répartis par lot. Age de 3 mois : stade de début de perte synaptique. Age de 6 mois : stade de début d’apparition des protéines amyloïdes et de gliose. Age de 9 mois : stade de début de mort cellulaires. Age de 12 mois : stade de perte cognitif. Age de 15 à 18 mois : stade ou les symptômes sont exacerbés. Ces âges ont été bien définis dans la littérature.

950 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce projet est un élevage d'une lignée transgénique modèle d'Alzheimer à phénotype dommageable, dont les animaux développent une paralysie progressive entre sept et dix mois et une mortalité élevée, avec tatouage des phalanges et coupe de la queue pour le génotypage. 800 souris sont transférées vers un autre établissement pour d'autres projets, 150 étant tuées en fin de reproduction ou pour atteinte des points limites. Le porteur présente cet élevage comme le support d'une future méthode de diagnostic.

Objectifs

Le but du présent projet est de faire un élevage d’une colonie de souris modèle. Il s’agit d’un modèle murin de la maladie d’Alzheimer à phénotype dommageable. La production de cette colonie servira ensuite à caractériser le phénotype rétinien chez ce modèle dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic précoce non-invasive de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Élevage de la colonie de souris modèle à phénotype dommageable. Cette colonie de souris servira par la suite à mettre en place une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer et aussi améliorer le parcours de soin des patients.

Procédures

Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir de déficit moteur à partir du 7ème mois. Au 7ème jour après la naissance, les souris seront identifiées par tatouage au niveau des phalanges à l'aide d'une pince Aramis. Dans le même temps, un prélèvement caudal coupé au ciseau chirurgical à bout pointu sur animal vigile pour génotypage sera réalisé. Quelques secondes seront nécessaires pour réaliser ces actes. Tous les animaux naissants seront soumis à ces deux actes une seule fois dans leurs vies.

Impact sur les animaux

Les animaux transgéniques développent une faiblesse des membres. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie entre 7 à 10 mois, associée à une posture voûtée. Suite à ce déficit, les souris peuvent souffrir de mal nutrition. Environ 80 pour cent de la mortalité survient au bout de 12 mois chez les souris à fond mixte, avec une survie médiane d'environ neuf mois. Une infection locale et une douleur pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour le génotypage.

Devenir

Les 800 animaux produits dans le cadre de ce projet seront transférés dans un autre établissement et impliqués dans différents projets dédiés à la mise en place d’une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer. En revanche, 150 animaux seront euthanasiés en fin de période de reproduction ou pour atteinte des points limites (estimation)

Remplacement

Les souris issues de cet élevage serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de cette étude concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la rétine.

Réduction

La production d’animaux a été estimée à 950. Le nombre d’animaux nécessaire pour les différentes études scientifiques a été définis en tenant compte des éventuelles pertes dues à une atteinte des points limites.

Raffinement

Les animaux en provenance d’éleveurs agrées seront hébergés par trois (Un mâle reproducteur et deux femelles reproductrices) dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (papier kraft, bâton à ronger et éventuellement maisonnettes rouges). Les animaux seront stabulés dans un environnement avec une alternance jour (7h-19h) /nuit (19h-7h), une température de 22+/-2 degrés Celsius et une hygrométrie à 50 +/- 10. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie. Avec une mise en place d’étiquettes au niveau des cages pour un meilleur suivie (note d’observation au cas de blessure, présence de souris gestante ou naissance). Les animaux transgéniques développent une faiblesse des membres. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie entre 7 à 10 mois, associée à une posture voûtée. Suite à ce déficit, les souris peuvent souffrir de mal nutrition. Environ 80 pour cent de la mortalité survient au bout de 12 mois chez les souris à fond mixte, avec une survie médiane d'environ neuf mois. Un raffinement spécifique tel qu’un apport de nourriture à hauteur de la souris, un suivie du poids hebdomadaire à partir du 7 ème mois ainsi qu’une surveillance quotidienne par un personnel qualifié seront mis en place. Une infection locale pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour le génotypage. Dans ce cas, les souris seront traitées par vétédine.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus cette souris présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les animaux seront étudiés à partir de 3, 6 et 9 mois dans une autre animalerie agrée. Les animaux seront répartis par âge. Les souris seront étudiées à trois différents âges : - 3 mois : âge où un début de gliose et de perte synaptique sont observé - 6mois : âge auquel les enchevêtrements sont observés avec un début de déficit cognitif - 9 mois : âge correspondant à une perte neuronale Ces âges ont été bien définis dans la littérature.

Entre 6 et 10 babouins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent, sous anesthésie, des ponctions de sang, de liquide céphalo-rachidien, de salive et de selles, dont un prélèvement sanguin terminal de 450 mL, et une partie reçoit un médicament destiné à réactiver un virus proche du HTLV-1 humain. Le porteur reconnaît un risque de traumatisme de la moelle épinière lors des ponctions et présente la mise à mort comme imposée par le statut sanitaire de ces animaux, qualifiant l'étude de "valorisation scientifique". Il décrit le modèle primate comme "incontournable" faute d'autre colonie naturellement infectée en Europe.

Objectifs

Le rétrovirus oncogène humain T-lymphotrope de type 1 (HTLV-1) infecte cinq à dix millions de personnes dans le monde. Trois à dix pourcents d’entre elles développeront une des maladies graves associées à l’infection, dont la leucémie / lymphome T de l’adulte, ou la paraparésie spastique tropicale / myélopathie associée à HTLV-1. Le dépistage des infections à HTLV-1 est réalisé par un test sanguin de type ELISA. Les individus ne présentant pas de réaction à ce test ELISA sont considérés HTLV-1-négatifs.. Le statut « infecté » des individus ayant réagi au test ELISA est confirmé par un autre test de dépistage sanguin, le plus souvent de type "Western Blot". En cas de réaction à ce test, le statut « infecté » est alors définitivement confirmé par recherche du virus dans le sang par une technique de biologie moléculaire (PCR). Le rétrovirus simien T-lymphotrope de type 1 (STLV-1) est un virus très étroitement apparenté au virus humain HTLV-1. Une colonie de Papio anubis naturellement infectée par STLV-1 est présente en France. Au cours de nos précédents projets, nous avons obtenus des résultats intrigants : quelques animaux négatifs en ELISA, et donc considérés comme « non infectés », se sont révélés positifs en PCR, indiquant que de telles infections « occultes » pourraient être plus fréquentes que couramment accepté. Nous proposons d’explorer les mécanismes virologiques et immunologiques à la base de ce profil d’infection « occulte », en réalisant le suivi longitudinal (i) du statut de dépsitage sanguin ; (ii) de la charge du virus dans le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive et les fèces ; (iii) de l’expression virale dans le sang ; (iv) de la réponse immunitaire. En fin de protocole, la distribution du virus dans les organes sera explorée. Si seule une très faible présence du virus dans le sang est observée, nous posons l’hypothèse qu’elle pourrait expliquer l'absence de réaction au test de dépistage sanguin classique. Nous proposons de tester cette hypothèse en essayant de réactiver le virus dans le sang à l'aide d'un médicament et de voir si les animaux réagissent alors au test de dépistage classique. Ce projet permettra de mieux caractériser les bases virologiques et immunologiques des infections « occultes » à STLV-1, et pourrait permettre de plaider pour une ré-évaluation des méthodes de diagnostic chez l’homme.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, le dépistage des infections à STLV-1/HTLV-1 est réalisé par test sanguin de type ELISA, que ce soit lors des contrôles sanitaires dans les élevages de primates non humains, ou chez l’homme. Nos observations indiquent que des infections « occultes », caractérisées par une absence de réaction à ce tes, pourraient être plus fréquentes que couramment accepté. Si certains cas d’absence de réactions ont été rapportés chez l’homme, ces cas sont peu documentés, peu compris, et restent ignorés des politiques de dépistage mises en œuvre dans les populations. Ce projet permettra à court terme de caractériser ces infections « occultes », sur le plan virologique et immunologique. A moyen terme, il permettra d’obtenir les données indiquant qu’un dépistage par ELISA n’est pas suffisant, et qu’un dépistage par PCR pourrait être plus sensible, du moins chez Papio anubis. A plus long terme, ces données obtenues dans ce modèle de primates non humains pourront justifier la mise en place d’études épidémiologiques d’envergure chez l’humain, afin de déterminer la fréquence de ces infections « occultes » chez l’homme, et, le cas échéant, d’appeler à la révision des politiques de dépistage de cette infection grave.

Procédures

Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie qui devrait durer entre 20 min et 1h maximum. Le nombre de prélèvements pour chaque animal dépendra de l’évolution de son statut sérologique au fil du projet, mais chaque animal subira maximum : 4 prélèvements sanguins de 50mL, 4 prélèvements de LCR, 4 prélèvements de salive par écouvillon, 4 prélèvements de selles et 1 prélèvement sanguin terminal de 450 mL. Les animaux seront isolés 24h maximum après les prélèvements pour surveillance avant d'être réintroduits dans leurs groupes. Si une très faible expression du virus dans le sang est constaté lors des premières analyses, un médicament sera administré par voie orale à 4 animaux pendant 1 semaine pour stimuler l'activation du virus dans le sang.

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Anesthésies. Prélèvement sanguin (risque hématome). Prélèvement LCR (traumastisme iatrogène de la moelle épinière). Isolement par paire ou plus pour surveillance après le prélèvement de LCR (moins de 24h en général). Administration d'un médicament aux effets indésirables possibles suivants : nausées, tremblements, troubles digestifs (vomissements diarrhée), prise de poids, réaction allergique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en raison de leur statut sanitaire. En effet ces animaux sont porteurs d'une maladie contagieuse qui est en plus une zoonose, et la gestion sanitaire de l'élevage de la station de primatologie impose leur euthanasie. De plus, des prélèvements seront prélevés après l'euthanasie et permettront d'étudier la distribution du virus dans les organes.

Remplacement

Ces données épidémiologiques ne peuvent être obtenues que sur des animaux vivants. Pour l’étude de cette infection, le modèle primate est incontournable. Les individus qui participeront à cette étude sont des individus naturellement infectés par STLV-1 et, à notre connaissance, la seule colonie européenne de primates non humains présentant ces caractéristiques. Les observations ne peuvent donc être réalisées sur aucun autre modèle animal. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.

Réduction

Notre objectif est de réaliser le suivi longitudinal pendant 12 mois de 6 animaux conservant un statut « ELISA-négatif / PCR-positif » sur la durée de l’étude. Si certains animaux deviennent positifs au test sanguin ELISA au cours de l’étude, ils seront euthanasiés, et d’autres individus seront inclus en remplacement, avec un maximum de 10 animaux inclus au total. L’inclusion sera arrêtée dès que le suivi longitudinal de 6 individus est obtenu. Le nombre final d’animaux inclus sera donc compris entre 6 et 10 animaux. Le protocole complet tel qu’il est prévu comporte deux groupes, un groupe sans médicament et un groupe avec médicament, ce dernier étant une expérience pilote pour tester l'hypothèse d'un lien entre l'expression du virus dans le sang et la réaction au test de dépistage sanguin classique. Un nombre de 6 animaux au total, et de 4 animaux dans le groupe médicament, est le minimum nécessaire pour obtenir caractériser de statut infecté « occulte », et le lien éventuel avec une expression virale faible. On s'attend à ce que l’expression virale soit fortement affectée par le traitement, dans environ 50% des animaux traités. Par conséquent, l'analyse de 4 animaux devrait permettre l'observation de 2 animaux au moins répondant bien, ce qui sera nécessaire pour établir un lien éventuel de cause à effet entre expression virale et réaction au test sanguin. L'effet du médicament sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l’administration. Si on obtient en effet 2 animaux au moins répondant au traitement, cela sera suffisant pour cette expérience pilote. Aucun test statistique ne sera réalisé. Dans le bras sans médicament, nous avons besoin de 2 animaux au minimum à euthanasier en fin de protocole, ce qui amène à 6 le nombre total d'animaux à inclure.

Raffinement

Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par les responsables du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. En cas d’échec de cette méthode, l’animal sera capturé par télé-anesthésie. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie chimique par injection intramamusculaire avant d’être stabilisé sous anesthésie gazeuse. Chaque anesthésie devrait durer entre 20 minutes et 1 heure maximum. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires. Les animaux ne seront isolés de leur groupe d’origine que transitoirement (24h à 36h, 2 jours maximum) et toujours avec un congénère. Les animaux seront réintroduits le lendemain des prélèvements après validation de l’état de santé par un vétérinaire, dans leurs groupes sociaux suivant la procédure validée par la SBEA. Des points limites sont définis et mis en place. Notamment, en cas d'effets secondaires liés au médicament, les animaux seront pris en charge par l'équipe vétérinaire par un traitement symptomatique et adapté.

Choix des espèces

D'autres modèles animaux existent pour l'étude du virus HTLV-1. Cependant, la colonie de Papio anubis proposée est la seule colonie, à notre connaisance, naturellement infectée par le virus STLV-1 en Europe. Dans le cadre de la gestion sanitaire des colonies, tous les animaux infectés par STLV-1 seront mis à mort. Il s'agit ici donc d'une valorisation scientifique des animaux dont l’euthanasie est par ailleurs inévitable, du fait de leur statut infecté. Dans la mesure du possible, tous les individus seront des individus adultes, présentant le même statut sanitaire. Si nous n’avons pas assez d’animaux adultes à inclure, alors des jeunes pourront être inclus.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Un appareil de déplacement orthodontique est posé sous anesthésie et maintenu sept jours, le porteur anticipant une douleur liée à la pression de l'appareil ainsi qu'une perte de poids et un arrêt possible de l'alimentation. Les mandibules sont ensuite prélevées pour étudier le ligament parodontal chez des souris diabétiques et non diabétiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour simuler l'influence du diabète sur ce ligament, un suivi analgésique n'étant prévu qu'au-delà d'un score de douleur défini.

Objectifs

L’ objectif de ce projet est d’étudier et de comparer les propriétés des différents compartiments du ligament parodontal chez les souris diabétiques et non diabétiques. Cela va nous permettre de mimer la fonctionnalité du ligament chez les humains diabétiques afin de développer de nouvelle approche thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont : - Comparaison des ligaments chez les patients diabétiques et non-diabétiques en fonction d’une force de pression exercée. - Peut-être une contribution au développement des nouveaux traitements pour les maladies concernant les ligaments parodontaux.

Procédures

Un seul type d’intervention : la mise en place d'un système de déplacement orthodontique des dents chez les souris. Un appareil dentaire va être placé pendant 7 jours sur 48 souris (anesthésiées durant la pose de celui-ci).

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à une perte de poids, donc les effets indésirables prévus sont : un animal qui ne boit ou ne s’aliment plus. Et l’on peut également s’attendre à une douleur causée par la pression de l’appareil dentaire.

Devenir

Tous les souris vont être euthanasier ce qui va nous permettre le prélèvement des mandibules et l'étude de la structure du Ligament parodontal (LPD).

Remplacement

Ce projet de recherche consiste à étudier la structure des LPD in vivo sur un modèle animal proche de l’homme pour essayer de comprendre la composition et les propriétés mécaniques de cette structure. Cela va être réalisé pour essayer de trouver de nouvelles méthodes du diagnostic et du traitement des maladies parodontales. Il n’existe pas d’alternatives non animales pour simuler l’influence de du diabète sur le LPD dans des conditions in vitro.

Réduction

La mandibule qui va être divisé en deux hemi-mandibules va réduire le nombre de souris par deux. Concernant le dépôt de l’appareil (effet d’une force parodontale), les expériences de contrôle vont être faites sur la même mandibule, plus précisément avec la deuxième hemi-mandibule qui n’a pas subi la force ce qui va encore réduire le nombre de souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies en Coton, papier Craft et igloo. Concernant les animaux portant l’appareil dentaire nous disposerons du Gel Diet pour faciliter l’accès à la nourriture de nos animaux. Et si la souffrance causée par l’appareil dentaire dépasse le scoring prédéfinie alors un suivi analgésique sera mis en place.

Choix des espèces

La souris représente aussi une espèce mammifère avec une qualité tissulaire proche de celle de l’homme qui nous permettra d’obtenir des conditions expérimentales proches des situations cliniques. L’étude va être faite sur des animaux en croissance (4 semaines) et animaux adultes (10 semaines): pour pouvoir comparer et suivre les changements de la structure du LPD

22 souris vont être utilisées, dont 20 tuées à l'issue et 2 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Partiellement immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau puis deux examens d'IRM, avant que la tumeur ne soit prélevée après mise à mort. Le projet vise à valider des séquences d'IRM pour évaluer les tumeurs sans biopsie. Le porteur justifie la mise à mort par le risque infectieux lié au statut immunodéprimé et affirme que la mesure du flux sanguin est "impossible" sur cultures cellulaires.

Objectifs

Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.

Procédures

Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.

Devenir

Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.

Remplacement

Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.

Réduction

L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.

Raffinement

Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.