Diagnostic des maladies

974 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent des frottis vaginaux, des tests de mémoire nommés, reconnaissance et association objet-place, des IRM répétées et, pour 114 d'entre elles, une ovariectomie, avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau. Le porteur soutient que le phénotype de ces souris n'est pas dommageable et que leurs déficits de mémoire n'affectent pas leur bien-être. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou cellulaire ne reproduit encore les processus cognitifs de façon fiable.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par des pertes de mémoire et par la pathologie tau et la pathologie amyloïde qui sont liées respectivement à des formes de la protéine tau et de la protéine amyloïde anormalement aggrégées dans le cerveau. L’APP est la protéine précurseur du peptide amyloïde. Les modèles rongeurs actuels surexpriment des gènes humains de l’APP avec des mutations rares provoquant la MA (formes familiales) et/ou des gènes mutés de tau qui ne sont pas associés à la MA mais qui provoquent une pathologie tau. La présence de pathologies tau et amyloïde chez ces animaux ont permis des progrès dans la compréhension de la MA, mais la surexpression de l’APP et/ou de tau provoque aussi d’autres effets qui ne se retrouvent pas dans la MA. Les souris double knock-in (dKI) AppNL F/MAPT évitent ces effets car elles ont un gène de l’APP humanisé avec deux mutations familiales humaines (Swedish et Iberian : AppNL,F) et le gène humain normal de tau (MAPT) au lieu des mêmes gènes chez la souris. En analysant la mémoire de nos souris dKI de l’âge de 2 à 6 mois, nous avons découvert que les femelles dKI ne parviennent plus à reconnaitre un objet après un délai de 24h (test RO24h) dès l’âge de 2 mois. De plus, elles n’ont pas de bons résultats dans un test de changement de la règle dans un labyrinthe, contrairement aux mâles dKI. Or ces deux tests dépendent du dialogue entre deux structures du cerveau, l’hippocampe (HC) et le cortex préfrontal (CPF). Ces résultats sont cohérents avec une étude montrant une altération de la connectivité HC-CPF plus marquée chez les femmes que chez les hommes en début de MA. Une perturbation des rythmes veille/sommeil, comme celle observée chez le patient, peut perturber le dialogue HC-CPF. A 4 mois, les dKI des deux sexes oublient rapidemment une association objet-place (OiP). Cette forme de mémoire dépend du dialogue HC-cortex entorhinal latéral (CEL). Elle est atteinte chez des personnes âgées des deux sexes et c’est un signe précurseur de la MA. En conclusion, chez les souris dKI de 4 mois, la voie CEL-HC semble affectée chez les deux sexes, tandis que les femelles semblent affectées en plus et plus tôt sur la voie HC-CPF. Les souris dKI sont les premières à montrer une perturbation aussi précoce et aussi proche de celle trouvée en phase préclinique des patientes développant une MA. Le but de ce projet est de comprendre l’origine de cette vulnérabilité féminine dans la pathologie Alzheimer.

Bénéfices attendus

L’objectif du projet est de mieux comprendre l’origine de la vulnérabilité féminine dans les premiers stades de la MA. Il est important d’explorer le rôle des oestrogènes car le développement de la MA a maints fois été attribué à la baisse marquée de production d’œstrogènes privant ainsi le cerveau d’un puissant neuroprotecteur contre les pathologies amyloïde et tau. Ici, nous analyserons chaque étape clé de l’implication des œstrogènes dans les processus de mémoire affectés chez les dKI femelles dès les premiers signes de la pathologie. Si nous découvrons une altération d’une ou plusieurs étapes, cela aidera à la compréhension de cette vulnérabilité féminine et révèlera des cibles intéressantes pour mettre au point des tests de diagnostique précoce et/ou de traitements adaptés à la femme. Cette démarche s’insère dans la statégie actuelle de développement d’une médecine personalisée. Le projet décrit ici ne représente que l’approche fondamentale développée dans un vaste. Ce programme inclue aussi des approches translationnelles en utilisant des techniques applicables à l’Homme : investigations en IRM (IRM fonctionnelle, tractographie, …), en électroencéphalographie à haute densité (EEGhd) et en biologie des rythmes (évaluation comportementale du fonctionnement de l’horloge circadienne). De plus, après adaptation et validation des tests de RO24h et OiP à l’Homme, ils pourront être intégrés dans des évaluations neuropsychologiques pour un dépistage. En conclusion, le programme dans son ensemble aborde certes les cibles neurobiologiques (présente saisine) qui seront utiles à long terme, mais il ouvre également des perspectives à moyen terme pour le développement d’outils de diagnostique par IRM, par EEGhd et par de nouveaux tests neuropsychologiques. Les résultats de notre étude bénéficieront d’abord à l’Homme puisque les souris ne développent pas la MA. Néanmoins, certains animaux de compagnie (chien, octodon) ou sauvages (microcèbe, ours blanc) développent une pathologie rappelant la MA avec pathologie amyloïdes et tau. Au mois deux de ces espèces (octodon ; microcèbe) possèdent un gène de risque génétique majeur pour la MA (APOE4). Chez l’Homme, l’APOE4 peut multiplier par 10 le risque de développer une MA. Il est donc tout à fait envisageable que les progrès réalisés dans le domaine de la MA en termes de dépistage et de traitement pourraient être adaptés à des pathologies proches chez l’animal, puis intégrée dans une approche vétérinaire.

Procédures

Procédure 1 modérée: 4 groupes de souris (de génotype et sexe différents, maximum 60 au total) sont mises dans des cages individuelles placées côte à côte sur une étagère munie de détecteur de mouvement (petites cellules de détection) pour mesurer leur activité locomotrice sur 4 jours. Malgré la proximité de leur congénères, cette séparation pourrait générer un stress modéré, mais transitoire. Les autres procédures P2 à P8 et P10 sont légères pour 800 souris. Elles comportent 1) la réalisation de frottis vaginaux sur les femelles (dépôt d’une goutte à l’entrée du vagin puis réaspiration), 2) la passation d’un ou deux tests d’exploration d’objet dans un environnement rendu familier par une habituation (10 min) préalable avec leur groupe social, et 3) les manipulations préalables à la mise à mort (dislocation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde). Aucune perte de poids, inactivité/mobilité réduite ou expression d’un comportement anormal n’est connu pour ces trois types de manipulations. dans la procédure 8, les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour effectuer un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. Seule la procédure 9 modérée concerne une chirurgie pour l'ovariectomie sur 114 souris.

Impact sur les animaux

Le suivi de lignée jusqu’à l’âge de 12 mois indique que le phénotype des souris dKI n’est pas dommageable : le succès reproducteur, le poids et l’occurrence d’anomalies comportementales ou physiologiques restent identiques entre les WT et les dKI. Leur fonds génétique C57BL/6J est entretenu par backcross pour éviter une dérive génétique. Par ailleurs, il faut préciser que ces souris ont été caractérisées dans des tests de mémoire et d’anxiété classiques et dans des tests hypersensibles à la pathologie Alzheimer. Les mâles et femelles dKI de 2 à 6 mois réussissent comme leurs témoins les tests classiques (test spatial en labyrinthe de Barnes, tests de reconnaissance d’objet et de place jusqu’à un délai de 3h). Même à 12 mois, il n’y a toujours pas de déficit dans ces tests. Entre 2 et 6 mois, le problème n’apparait que dans des tests hypersensibles : une performance moindre au premier jour du changement de règle dans un labyrinthe, un déficit marqué dans les tests d’association objet-place (test OiP), de mémoire du détail et pour un long délai de rappel (RO24h). En conclusion, les souris dKI présentent des problèmes légers de mémoire qui sont présents chez des personnes âgées déclarées cognitivement normales. Ces déficits ne sont donc pas de nature à affecter le bien-être des souris dKI par rapport à leurs témoins WT. Seules deux procédures pourraient induire un stress transitoire : la procédure 1 pour l’isolement en cage permettant de mesurer l’activité locomotrice individuelle sur 4 jours et la procédure 8 où les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. La procédure 9 impliquant une ovariectomie ne devrait pas affecter le bien-être avec les traitement analgésiques et précautions de manipulation prévues. La couverture analgésique, les soins et le suivi individuel des souris devrait permettre d'éviter toute souffrance ou de l'interrompre rapidement s'il y a complication.

Devenir

Le but du projet est de découvrir les altérations neuropathologiques impliquées dans le dimorphisme sexuel face à l’émergence d’une pathologie Alzheimer afin de mieux comprendre les causes de la vulnérabilité du cerveau des souris dKI femelles par rapport aux mâles. A part pour les mises au point de techniques, les cerveaux seront systématiquement recueillis et analysés afin de déterminer ces causes.

Remplacement

L'étude des animaux modèles de la MA est encore indispensable pour progresser dans la compréhension de cette pathologie. Il n'est pas encore possible actuellement de modéliser les processus cognitifs de façon fiable et complète dans un modèle in silico ou en culture cellulaire. Il est donc encore nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie et les performances cognitives.

Réduction

Pour étudier le lien entre les performances comportementales (mémoire et rythme circadien de l’activité locomotrice) et les données neuropathologiques obtenues par des approches histologiques ou biochimiques (P1 à P6, et P10), le nombre d’animaux sera au maximum de 15 animaux par groupe pour assurer l’efficacité des statistiques dans les tests comportementaux. Cet effectif est nécessaire en particulier dans notre modèle car nous testons des souris avec une pathologie débutante et des déficits subtils qui pourraient passer inaperçus si les groupes sont trop petits. La procédure 8 est une étude longitudinale d’animaux destinés à des analyses en IRM. Elle permet donc le suivi d'un même animal à trois âges pour étudier l’émergence et l’évolution de la pathologie ce qui permet une réduction du nombre d'animaux. Le nombre de souris sera au maximum de 35 animaux par groupes (4 groupes mâles et femelles des génotypes dKI et témoins WT) afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables pour les données IRM et pour des analyses corrélatives avec les données comportementales et histopathologiques obtenues sur les mêmes animaux au sein de notre laboratoire. La procédure 9 fait appel à la technique d'ovariectomie pour tester l'origine cérébrale de la vulnérabilité des souris femelles dKI. Le risque de perte avec une opération chirurgicale est couvert en augmentant à 16 le nombre de souris par groupe. L’ensemble du projet requiert 974 souris.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’éléments d’enrichissement dans leur cage (matériel de construction du nid, un tube refuge et des boulettes de nourriture à manipuler), ainsi qu’un suivi quotidien de leur état général. Elles seront maintenues en groupe sociaux sauf pendant deux périodes de 10 minutes/jours pour chacun des tests de mémoire. Tous ces tests sont basés sur le comportement d’exploration spontanée de la souris dans un milieu adapté à l’espèce (lumière faible de 20 lux maximum et ambiance sonore atténuée à 45 dB). Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés est mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Trois nouvelles techniques de raffinement sont à mettre/mise en place au cours du projet. Elles concernent la manipulation/transport des souris, l’habituation à l’enceinte des tests de mémoire et une méthode non invasive de prélèvement pour le génotypage. Les souris sont d’ores et déjà transportées de la cage à l’enceinte de tests (et vice versa) grâce au tube refuge présent dans leur cage. L’habituation à l’enceinte des tests se fait depuis plus de 6 mois avec l’ensemble du groupe social de chaque cage. Le bien-être qui en résulte se reflète par une plus grande régularité dans la durée d’exploration des objets présents dans l’enceinte au cours des tests de mémoire réalisés ensuite en individuel. Enfin, la nouvelle méthode de prélèvement non invasive pour le génotypage à partir d’une pincée de poils (au lieu du punch d’oreille de 2 mm) est désormais appliqué en routine pour cette lignée.

Choix des espèces

A ce jour, les modèles animaux de la MA ont essentiellement été créés chez la souris, même s'il existe des modèles chez la drosophile et d'autres espèces. Nous avons un modèle de souris qui est en rupture par rapport aux modèles précédents, car il n’a pas les effets secondaires dûs à la surexpression des protéines clé. Il présente une différence entre les deux sexes dans l'apparition des premiers troubles de la mémoire qui ressemble à celle trouvée au stade préclinique de la MA, c'est-à-dire 5 à 10 ans avant le premier diagnostic. Toutes les souris seront sur un fonds génétique C57BL/6J. Dans toutes les procédures sauf une, les souris seront utilisées entre 1 et 4 mois (jeunes adultes) car c’est l’âge où apparaissent les premiers déficits de mémoire dans ce modèle de maladie d’Alzheimer. Dans la procédure 8, les souris atteindront l'âge de 12 mois pour analyser leur neuropathologie lorsqu’elle devient manifeste (plaques amyloïdes notamment).

900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils subissent pose de cathéters, injections de radiotraceurs, séances d'imagerie TEP d'une heure sous anesthésie et, pour certains, une injection cérébrale stéréotaxique d'un vecteur viral ou d'un agent neuro-inflammatoire, avant une euthanasie par exsanguination pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les radiotraceurs sont administrés à très faible dose et qu'aucune toxicité n'est attendue, les nuisances venant surtout des manipulations. Il décrit de nombreuses caractérisations in vitro et in silico en amont mais conclut que l'étape in vivo reste "indispensable" pour prédire l'affinité et le métabolisme réels.

Objectifs

La tomographie par émission de positons (TEP) est une technique d’imagerie médicale non invasive utilisée à l’hôpital pour le diagnostic qui utilise essentiellement le fluorodésoxyglucose marqué au fluor-18. Le développement de nouveaux radiotraceurs plus spécifiques donne accès à une imagerie moléculaire de hautes sensibilité et spécificité pour le diagnostic et la thérapie et pour une meilleure compréhension des maladies, notamment celles du système nerveux central. L’objectif de ce projet est de caractériser et de valider chez le rongeur de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie TEP en évaluant leur interaction avec des cibles impliquées dans différentes maladies neurodégénératives associées à la neuroinflammation Trois types de caractérisations seront effectuées au cours du projet : - les caractérisations pharmacologiques in vitro aident au choix du radiotraceur et permettent d’optimiser sa structure chimique ; - les caractérisations ex vivo permettent d’étudier la biodistribution tissulaire du radiotraceur et ses métabolites. Lors de cette étape, nous développerons de nouvelles méthodes analytiques originales pour localiser et quantifier les nouveaux radiotraceurs et leurs principaux métabolites dans le cerveau, en amont des étapes de radiomarquage pour maximiser le transfert en clinique et diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Cette première étape de validation nécessitant des animaux est limitante et cruciale dans la sélection des meilleurs candidats ; - l’évaluation préclinique in vivo nécessite ensuite l’administration du radiotraceur chez l’animal afin d’étudier son métabolisme et sa pharmacocinétique plasmatique ainsi que sa spécificité et sélectivité pour la cible d’intérêt par imagerie TEP et de déterminer les paramètres pharmacocinétiques caractéristiques de cette interaction. Cette étape in vivo est indispensable et nous permet d’obtenir les données nécessaires pour l’utilisation ultérieure du radiotraceur chez l’homme (transversalité).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie de la neuroinflammation associée à différentes maladies neurodégénératives à travers des cibles cérébrales impliqués dans le métabolisme des stéroïdes du cerveau comme le cholestérol. En effet, la modification de ces cibles pharmacologiques a été associée à des pathologies comme les maladies d’Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, la sclérose en plaques ou encore l’épilepsie. A court terme, la sélection et la validation de nouveaux radiotraceurs évalués en préclinique (sur les animaux) permettront de tester des molécules plus spécifiques chez l’homme dans des protocoles de recherche. A long terme, le développement et l’utilisation en routine clinique de traceursspécifiques de la neuroinflammation pourraient permettre le diagnostic, le suivi et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques dans des maladies neurodégénératives pour lesquelles il n’existe que très peu ou pas de traitement efficace, en particulier dans la maladie d’Alzheimer. Ces marqueurs permettront également d’optimiser les traitements en matière de dose et de limitation des effets toxiques potentiels. Cela implique l’étude et la compréhension de l’action des traitements et de leur devenir dans l’organisme.

Procédures

Dans ce projet, les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane afin de limiter au maximum douleur, souffrance et angoisse. Elles comprennent la pose de cathéters veineux/artériels (environ 15 min) pour les prélèvements sanguins, les injections de produits (durée

Impact sur les animaux

Les radiotraceurs développés dans ce projet seront administrés à doses extrêmement faibles, ce qui limite voire élimine tout risque de toxicité. Concernant les autres molécules utilisée, les doses chez l’animal sont généralement connues dans la littérature, notamment chez les rongeurs, en terme d’efficacité et d’effet secondaires. Ainsi aux doses prévues dans cette étude, aucune toxicité n’est attendue. Cependant, des effets indésirables ou nuisances possibles comme du stress, changement de comportement, douleur éventuelle peuvent provenir des manipulations (en particulier lors de l’injection d’une durée maximale de 5 min ou lors de la phase de réveil d’une durée maximale de 60 min avant l’euthanasie) oudes pathologies induites (animaux AD en particulier).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter le cerveau (et autres organes) pour des analyses ex vivo (radio-HPLC, spectrométrie de masse, immunohistochimie, autoradiographie…).

Remplacement

Nous mettons en œuvre de nombreuses approches in vitro pour les premières caractérisations des radiotraceurs et la sélection des meilleurs candidats. Ces expériences sur membranes, homogénats tissulaires, cellules, protéines recombinantes nous permettent d’estimer leur affinité et leur sélectivité pour une cible d’intérêt et de détecter leurs principaux métabolites et les enzymes responsables de ces biotransformations. Cette étape nous permet aussi de modifier éventuellement la structure des composés pour les rendre plus stables in vivo en diminuant le niveau de métabolisme. En parallèle, des études in silico peuvent également être mises en œuvre pour sélectionner les composés les plus enclins à interagir avec une cible d’intérêt (récepteur/enzyme). Cependant l’étude in vivo sur les rongeurs s’avère indispensable par la suite car les approches in vitro ne sont pas suffisamment quantitativement prédictives de l’affinité/spécificité in vivo et du taux de métabolisme in vivo. L’extrapolation in vitro-in vivo nécessite la mise en place de modèles mathématiques complexes qui ne sont pas adaptés à tous les paramètres pharmacologiques. Par ailleurs, les paramètres d’absorption, de distribution et de pharmacocinétique du radiotraceur dans le sang et les organes doivent être mesurés dans l’organisme de l’animal. Cette étape préclinique est essentielle à l’évaluation du meilleur candidat pour un passage chez l’homme (transversalité).

Réduction

Dans cette étude, le nombre d’animaux prévu a été déterminé d’après des études antérieures réalisées au laboratoire et des articles bibliographiques. Pour les études de biodistribution et de métabolisme, des groupes de 120 animaux ont été prévus, correspondant à l’analyse de 3 animaux/temps (nombre minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs,). Pour les études d’imagerie, les groupes de 6 animaux permettent d’obtenir des résultats significatifs compte tenu des variations interindividuelles observées chez le rat. L’ensemble des études in vitro permettant de caractériser pharmacologiquement les radiotraceurs et de ne sélectionner que quelques candidats présentant des propriétés adéquates pour l’imagerie nous permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux. Parmi ces propriétés, nous vérifierons par des méthodes alternatives que la molécule peut entrer dans le cerveau, présente une haute affinité et sélectivité pour sa cible, peut être radiomarquée avec des isotopes compatibles avec l’imagerie et que son métabolisme n’est pas incompatible avec son développement. Nous développerons par ailleurs des méthodes analytiques de quantification des radiotraceurs et de leurs métabolites, les plus sensibles possibles pour utiliser des volumes de sang ou de tissus les plus faibles possibles et réduire ainsi le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés aux conditions d’hébergement pendant au moins 7 jours avant le début des expérimentations et seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés par paire dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Lors de toutes les expériences in vivo et/ou ex vivo, biodistribution, métabolisme et imagerie, les animaux seront anesthésiés. Dans certains cas particuliers, afin d’éviter toute influence de l’anesthésique sur le métabolisme d’un radiotraceur ou une pollution du signal par l’anesthésique, les injections pourront être réalisées sur animaux vigiles placés dans un tube de contention. Dans ce cas, les animaux seront entraînés à la manipulation de manière à limiter la douleur et le stress le jour de l’expérimentation. Les animaux seront étroitement suivis tout au long de l’étude par du personnel expérimenté, permettant l’application des critères d’arrêt en amont afin d’empêcher toute souffrance animale. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.

Choix des espèces

Les rongeurs et en particulier le rat font partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études de biodistribution, de métabolisme et d’imagerie cérébrale. Il existe par ailleurs de nombreux modèles de maladies neurodégénératives décrits chez le rat (Alzheimer, Sclérose en plaques, Huntington, …) qui nous permettent de tester les meilleurs candidats sélectionnés sur des animaux pathologiques/génétiquement modifiés et d’étudier les modifications de leur interaction avec la cible d’intérêt. Les animaux utilisés dans ce projet auront entre 4 semaines et 6 mois selon les modèles de rats (sains ou pathologiques) et les procédures. Pour les études de métabolisme, des rats jeunes seront utilisés (environ 40 jours). En effet, une diminution du métabolisme avec l’âge a été observée et décrite dans la littérature. Pour les études d’imagerie, le cerveau doit être assez développé. Les rats transgéniques et contrôles seront utilisés à l’âge de 6, 12 et 18 mois afin d’investiguer la capacité des traceurs à détecter leur cible à un stade précoce (6 mois), moyen (12 mois) ou tardif (18 mois) du développement de la maladie d’Alzheimer. Pour le modèle de rat injecté par un vecteur viral l’imagerie sera réalisée entre 5 et 10 semaines après l’injection du vecteur afin de vérifier l’absence de vecteur viral et l’expression du récepteur humain. L’injection du vecteur viral étant réalisée à l’âge de 8 semaines, les rats auront entre 13 et 18 semaines lors de l’examen d’imagerie.