Diagnostic des maladies

22 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, vingt tuées et deux réutilisées. Elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau, puis deux IRM dont une avec injection d'un marqueur d'hypoxie, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur décrit une gêne liée à la protubérance tumorale au flanc sans entrave à la mobilité, et justifie la mise à mort par le risque infectieux propre à ces animaux immunodéprimés. Il présente l'IRM comme non invasive, ce qui autorise la réutilisation de deux souris, et affirme que la mesure du flux sanguin est impossible sur cultures cellulaires.

Objectifs

Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.

Procédures

Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.

Devenir

Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.

Remplacement

Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.

Réduction

L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.

Raffinement

Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de vancomycine déclenchant une insuffisance rénale aiguë, des prélèvements d'urine par pression abdominale, et pour une partie une incision dorsale pour microscopie in vivo. Le porteur indique que l'atteinte rénale peut provoquer une perte de poids et une déshydratation, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il cherche à comprendre puis à prévenir cette toxicité et affirme que l'étude de la fonction rénale rend l'usage de la souris "indispensable".

Objectifs

L’insuffisance rénale aiguë médicamenteuse est une cause fréquente de morbi-mortalité et d’hospitalisations. La vancomycine est un antibiotique largement utilisé dans la prise en charge des infections bactériennes à germes multirésistants. Malgré le développement de formules purifiées, le risque de toxicité rénale reste élevé et se manifeste par une insuffisance rénale aiguë . Aucune approche thérapeutique de l'insuffisance rénale provoquée par la vancomycine n’a actuellement été mise au point. Le seul mécanisme généralement proposé était la toxicité directe de la vancomycine sur un type particulier de cellules rénales. Or l'action de la vancomycine sur le rein semble plus complexe . Il a été montré un nouveau mécanisme de toxicité médiée par l'accumulation de l’antibiotique et de protéines dans le rein. Un modèle animal de souris a permis de valider la formation après une injection rapide de vancomycine de dépôts dans les cellules rénales et de caractériser ce nouveau mécanisme de toxicité. Cependant, le rôle d'autres protéines dans l'accumulation de la vancomycine reste inconnu. Une meilleure compréhension mécanistique de cette toxicité rénale ainsi que la recherche de stratégies thérapeutiques innovantes visant à la prévenir ou la prendre en charge constitue un enjeu important. Le projet vise à répondre à ces questions en explorant plusieurs hypothèses : 1) Quel est le rôle des protéines dans l'accumulation rénale de vancomycine? 2) La modulation de l'entrée et de la sortie de vancomycine dans les cellules rénales peut elle modifier la toxicité de la vancomycine? 3) La modification de l'acidité urinaire peut elle diminuer l'accumulation de vancomycine et la toxicité rénale en conséquence?

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer une approche thérapeutique innovante actuellement inexistante dans la néphropathie induite par la vancomycine et avancer dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de cette néphropathie afin d'en réduire les conséquences. Même s’il est résolutif, un épisode d’insuffisance rénale aiguë sévère s’accompagne d’un surrisque d’évolution vers l’insuffisance rénale chronique et constitue un réel problème de santé publique. Une meilleure prise en charge de ces insuffisance rénale aiguë peut également réduire les coûts liés aux hospitalisations prolongées et le nombre de patients évoluant vers l’insuffisance rénale chronique qui est associée à une baisse de la qualité de vie et des coûts élevés de prise en charge. Enfin, ces nouvelles stratégies thérapeutiques obtenues grâce à nos résultats pourront être mises à l’épreuve ultérieurement lors d’études cliniques.

Procédures

1- Injections intra péritonéales de médicaments dilués dans du serum physiologique sur animal vigile : dans une procédure, maximum trois fois par jour pendant un maximum de 2 jours consécutifs plus une dernière injection pour l'anesthésie finale. Ce qui fait un total de 7 injections sur 3 jours. Dans les autres procédures, 3 injections sur 3 jours. l'injection est rapide(quelques secondes). 2- Un prélèvement d'urine par pression abdominale sur animal vigile pendant quelques secondes. Un prélèvement d'urine est prévu à J0 ou J1 et J3, ce qui fait deux prélèvements en tout. 3- Pour la microscopie in vivo (6 animaux par lot de 20) réalisée une seule fois, une incision dorsale est pratiquée après une analgésie et une anesthésie générale. Cette étape est réalisée sur un plateau thermostaté à 37 degrés. La préparation et l'observation durent 20 minutes environ 4- Prélèvement du sang sous anesthésie ( 30 secondes environ), sur un plateau thermostaté; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analsyes necéssaires.

Impact sur les animaux

Le stress généré par les injections intrapéritonéales (contention et douleur au site d'injection) . Stress lié aux traitements dans l'eau de boisson (néophobie du rongeur). L'incision cutanée (pour une partie des animaux) et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : - douleur provoquée par l'incision cutanée - altération de l'état général : perte de poids, déshydratation. - stress induit par des manipulations quotidiennes. Complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

Une partie des expériences concernant la précipation de la vancomycine selon le pH a pu être effectuée in vitro mais pour étudier l'impact des différents traitements proposés sur la fonction rénale, l'utilisation de la souris est indispensable. Il est nécessaire de suivre le comportement de la vancomycine du compartiment sanguin au compartiment rénal qui est un système tissulaire complexe composé de plusieurs types cellulaires.

Réduction

Les expériences précédentes qui ont mis en évidence la précipitation de la vancomycine dans les cellules rénales ont permi d'évaluer l'hétérogénéité de certains paramètres étudiés. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence des différences entre les groupes et s'assurer de la reproductiblité des résultats d'une série à l'autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants chez des mâles. Puis nous confirmerons les résultats sur un troisième lot de 10 souris femelles. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 520 souris. Des test statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie au moins une semaine avant le début de la procédure. L’animalerie est agréée par le ministère de l'agriculture. Elle dispose d’un système de ventilation et de traitement de l’air avec une hygrométrie et une température contrôlées quotidiennement. Hygrométrie 55 plus ou moins 10 pour cent et température 20-24 degrés. Cycle d’éclairage rongeurs 12heures par jour. Isolation phonique. Les animaux seront hébergés dans des cages en portoir ventilées (5 souris maximum par cage) avec un enrichissement par litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes tels que des morceaux de bois pour leur permettre de ronger, et des billes de cellulose pour les obliger à les déployer pour faire des nids. Une surveillance quotidienne du bien-être animal (pesée et comportement) sera réalisée par le personnel de l’animalerie et le porteur de projet. Le critère d'arrêt est la perte de poids de plus de 20 pour cent par rapport au poids initial (avant traitement). La durée du traitement par la vancomycine est très court et ne devrait pas engendrer une insuffisance rénale trop sévère et dommageable pour les souris. Pour assurer le bien être des animaux, les étapes les plus délicates que sont l'imagerie in vivo et l'euthanasie seront réalisées sous anesthésie générale avec une antalgie en plus pour l'incision dorsale nécéssaire à l'observation au microscope.

Choix des espèces

Ce modèle animal de souris déja utilisé a permis de valider antérieurement la formation de dépots dans les cellules rénales après un bolus de vancomycine et de caractériser le phénomène obstructif conduisant à l'insuffisance rénale. Afin d'assurer la reproductibilité des résultats, il apparait préférable de poursuivre la recherche sur ce même modèle de souris. Un modèle in vitro ne permet pas de modéliser la néphropathie à la vancomycine du fait de la complexité et diversité cellulaire du rein. 8-12 semaines d'age, période d'acclimatation d'une semaine. Etat adulte de maturation du rein chez la souris et âge avec lequel le modele a été validé.

196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe intracérébrale de cellules humaines de glioblastome lors d'une chirurgie stéréotaxique, suivie de trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur attend une neuroinflammation, un état fébrile temporaire, une perte d'appétit et une léthargie après l'injection. Il caractérise un biomarqueur d'imagerie du gliome et qualifie le recours à des animaux vivants d'"indispensable" pour le caractère translationnel des lignées humaines.

Objectifs

Les cancers du cerveau sont encore aujourd’hui de mauvais pronostic, et notamment le plus agressive le glioblastome qui est aussi le plus fréquent. Ces cancers sont classés et identifiés grâce à des analyses réalisées directement sur le tissu malade à partir de biopsies cérébrales. L’un des critères majeurs est la présence d’une mutation spécifique sur le gène appelé IDHmut. Cette mutation apporte des éléments pronostics important pour les patients puisque les tumeurs cérébrales IDHmut ont un meilleur taux de survie que les IDH non mutés. La greffe de cellules humaines de glioblastome est un modèle animal de cancer du cerveau largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes de croissance du cancer. Ce modèle permet aussi de tester et d’évaluer de nouvelles thérapies. Des lignées cellulaires portant la mutation IDHmut seront greffées sur des souris afin de créer un modèle se rapprochant des caractéristiques des cancers humains. Ce projet permettra de caractériser les différences entre les souris portant la mutation et des souris témoins et fournira de nouvelles méthodes d’imagerie in vivo. Ces nouvelles méthodes en imagerie médicale sur les souris seront utilisées pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les glioblastomes (GBM) sont les plus fréquents et les plus grave des gliomes diffus de l’adulte, avec une médiane de survie globale qui ne dépasse pas 15 mois. Ce projet permettrait de caractériser un nouveau biomarqueur d’imagerie (mesuré en spectroscopie par résonance magnétique) dans un modèle bien connu de GBM chez la souris. Ce biomarqueur sera ensuite associé à d’autres marqueurs fonctionnels (grâce aux ultra-sons ou aux biomarqueurs d’imagerie en tomographie d'emission de positrons) qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, la possibilité d’obtenir ces biomarqueurs sur des modèles précliniques sera une aide précieuse pour une évaluation précoce de nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule chirurgie d'une durée de 30 minutes. Par la suite les animaux auront 3 examens d'imagerie non invasive de 1 heure maximum chacun pendant lesquels les animaux seront anesthésiés et endormis.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une perte d’appétit et une léthargie. Cette nuisance exclusivement liée à l’injection stéréotaxique ne sera pas répétée et ne durera pas plus de 12 heures. Une douleur pendant la chirurgie et post-chirurgicale peut apparaître et sera anticipée, évaluée et traitée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure, afin de permettre des analyses post-mortem in vitro seront réalisées sur les échantillons de cerveaux. En effet, les données d’imagerie in vivo doivent être complétées par les analyses in vitro qui permettent d’apporter des mesures plus variées et précises sur les problématiques métaboliques et vasculaires.

Remplacement

Le projet a été construit après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP, IRM, ultrasons) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Les équipements d’imagerie (microTEP, microIRM et sonde ultrasonore) sont adaptés à la souris. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celle obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés, et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’humain.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux est réalisée grâce au suivi longitudinal, en imagerie non invasive IRM, de la taille de la tumeur. Ce type de suivi augmente la puissance statistique et les tests statistiques permettent de réduire de 51 à 34 le nombre souris. Ce projet permettra de contrôler le bien-être des souris en rapport avec le volume de la tumeur cérébrale. Cette étude pilote guidera les étapes suivantes qui seront adaptées en fonction des résultats observés. L’ensemble du projet nécessite 196 souris. Les expérimentations se dérouleront en sous-groupes expérimentaux : l’ensemble de l’étude étant constitué de 2 groupes (un groupe contrôle et un groupe test), chaque groupe sera divisé en sous-groupes (de 5 à 7 souris) ce qui permettra d’analyser par des tests statistiques les résultats après les données obtenues sur chaque sous-groupe. Si les analyses montrent des données significatives, les blocs suivants ne seront pas utilisés, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille d’évaluation neurologique et des points limites adaptés. La mutation portant sur le gène IDH n’apportera pas de changement majeur par rapport à la lignée sauvage, dite wild-type "wt", (si ce n’est une vitesse de croissance diminuée), les points limites seront les mêmes pour tous les animaux. Il a été démontré que la lignée utilisée dans ce protocole ne provoque pas de déficits moteurs chez les souris avant le jour 27 après injection intracérébrale en comparaison des souris contrôles. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (anti-inflammatoires), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques en cas d’apparition de signes de souffrances. En cas de signes de détresse, la procédure sera interrompue et si nécessaire, l’euthanasie sera effectuée. Les séances d’imagerie avec ultra-sons seront réalisées avec une sonde de taille adapté aux crânes des souris.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau de la souris est proche de celle de l’humain. Ce modèle est aussi pertinent car le model de greffe de glioblastome humain chez la souris est très bien décrit. Enfin, l’imagerie par ultra-sons fonctionnels peut être réalisée chez la souris à travers le crâne directement car les os du crâne sont suffisamment fins pour ne pas provoquer d’atténuation du signal. De la même façon que l’échographie, le signal ultrasonor est atténué grandement par les os. Souris adultes de 2 mois afin de modéliser les gliomes diffus de l’adulte.

20 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur colorectale humaine greffée sous la peau, elles reçoivent un peptide radiomarqué au fluor-18 puis passent en imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque terminale. L'objectif est d'évaluer la distribution de ce traceur pour le diagnostic du cancer du côlon. Le porteur affirme que les résultats in vitro sont insuffisants et qu'un modèle animal porteur de tumeur est "indispensable".

Objectifs

On estime, en 2018, à plus de 43 000 le nombre de nouveaux cas de cancer colorectal en France. Il s'agit du troisième cancer le plus fréquent et du deuxième cancer en termes de mortalité, avec plus de 17 000 décès par an en 2018. Le cancer du côlon est guérissable dans plus de 90% des cas lorsqu'il est diagnostiqué tôt. Ainsi, le diagnostic précoce de ces cancers est un enjeu majeur afin d'établir un traitement le plus tôt possible et par conséquent avoir un impact direct sur la survie du patient. Même s'il existe des tests biologiques de plus en plus performants, l'imagerie médicale, si elle est optimisée, reste un outil performant et quasi non invasif pour la détection précoce de ces cancers. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés au récepteur de la neurotensine qui est exprimé au niveau du cancer du côlon (lignée HT 29). Aujourd’hui, il n’existe pas de médicament radiopharmaceutique ciblant le récepteur de la neurotensine utilisé en routine. Dans ce projet préclinique, 1 peptide radiomarqué au fluor-18 sera étudié sur 20 souris porteuses de tumeurs du colon (lignée HT-29).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si cet analogue de la neurotensine donne de bons résultats in vivo en imagerie PET, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique tel que le Lutétium-177.

Procédures

Les différentes interventions sur les 20 souris Balb/c nude sont les suivantes : - 1 xénogreffe sous-cutanée de cellules tumorales (cancer colorectal) sur le flanc droit (5 min) - 2 Injections intraveineuses au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse pour les 20 souris (5 min) - 2 imageries de 20 min sous anesthésie gazeuse - 1 ponction cardiaque terminale sous anesthésie gazeuse 3% (5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau du flanc droit pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies pour les imageries ([18F]FDG et du radiopeptide étudié) peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 20 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue de la neurotensine radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur à la neurotensine est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique par le peptide radiomarqué.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude de l'analogue de la neurotensine radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic PET, il est nécessaire de visualiser la biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs à ce neuropeptide. Pour cette étude, un modèle murin présentant une xénogreffe sous-cutanée d'une lignée de cancer humain du colon sera utilisé. La présence du récepteur à la neurotensine sur cette lignée a été validée in vitro. La saturation de tous les récepteurs cibles par la neurotensine froide injectée en large excès (groupe dit de "blocking") permet une non fixation du peptide radioactif. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 10 souris xénogreffées par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène. Ainsi, 10 souris seront injectées avec le radiopeptide seul et un groupe dit "blocking" incluant 10 souris injectées avec le radiopeptide + un large excès de neurotensine "froide".

Raffinement

Les souris étant immunodéprimées, celles-ci sont logées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes à l’intérieur des salles de stabulation de l’animalerie de recherche agréée où l’ambiance est parfaitement contrôlée (hygrométrie, température, ventilation, bruit). De plus les cages sont équipées d’enrichissement pour limiter le stress. Les souris immunodéprimées sont hébergées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes (SOPF). Une limitation du nombre de souris par cage est également requise. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur. Si un des points limites est atteint l'animal sera sorti de l'étude et la décision sera prise par le vétérinaire soit de soigner l'animal soit de l'euthanasier par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la xénogreffe sous-cutanée de tumeur humaine. Des souris femelles seront utilisées pour cette étude car moins agressives que les mâles (moins de risques de blessures au niveau de la tumeur). Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les études seront initiées à 10 semaines de développement. L’induction des tumeurs se fera à 10 semaines. A ce stade de développement, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. Lorsque les tumeurs atteindront un volume minimum de 150 mm3, l'étude de biodistribution pourra être initiée.

110 souris vont être utilisées, chacune passant deux heures sous une même anesthésie gazeuse pour une IRM d'environ 1 h 15, une échographie de 30 minutes et 15 minutes de mesures de pression au moyen d'un capteur en forme d'aiguille introduit au centre de sa tumeur. Auparavant, chaque souris reçoit sous anesthésie une injection de cellules de tumeur du sein ou du pancréas sous la peau du flanc, puis porte cette tumeur deux à trois semaines, avec une gêne et une perte de poids possibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées après l'examen, et leur tumeur est disséquée pour comparer sa composition au microscope aux mesures d'imagerie. Le porteur présente le but comme une méthode "sans douleur qui pourrait prédire la sévérité d'un cancer" chez les patients, et la met au point en introduisant dans la tumeur de chaque souris le capteur qui sert de mesure de référence.

Objectifs

Les tumeurs solides sont principalement composées de cellules et d'autres éléments comme les fibres de collagène, qui affectent leurs caractéristiques physiques. Certaines caractéristiques sont connues pour rendre la tumeur plus sévère et plus résistante aux traitements médicaux. Parmi ces propriétés, seule la dureté de la tumeur peut actuellement être mesurée de manière précise et non invasive en imagerie. Il est alors intéressant de développer des techniques pouvant mesurer les autres caractéristiques tumorales, pour évaluer la sévérité tumorale de manière plus précise. La technique envisagée dans ce projet est l’élastographie par imagerie par résonance magnétique (IRM) sous compression. L’élastographie est la mesure des propriétés mécaniques du tissu comme l’élasticité, la dureté, etc… On utilise un dispositif vibrant pour générer des ondes à travers le tissu d’intérêt. Pour acquérir l’image de ces ondes qui se déplacent, on peut utiliser l’IRM (dont les images sont créées grâce à des champs magnétiques) ou l’échographie (dont les images sont créées grâce à des ultrasons). On peut également mesurer des propriétés plus complexes en réalisant un examen d’élastographie sous compression, c’est-à-dire en appuyant de manière continue sur le tissu pendant l’examen d’imagerie. Des études utilisant l’élastographie échographique sous compression ont été menées sur le foie en dehors du corps et ont montré que ces propriétés étaient liées à la manière dont sont organisées les fibres à l’intérieur du cancer, ce qui affecte sa sévérité. Le but de ce projet est de transposer cette méthode développée avec les ultrasons vers l’IRM. Ce type d’imagerie informe sur un volume entier, ce que ne fait pas l’échographie. Il y aura ainsi une information complémentaire et une meilleure précision dans les mesures. Cette nouvelle technique sera appliquée sur des tumeurs implantées chez la souris, avec deux modèles différents : des tumeurs du sein et des tumeurs du pancréas. Les valeurs obtenues seront ensuite comparées à des données provenant de la microscopie pour valider l’utilisation de cette méthode pour déterminer l’organisation des tissus et la sévérité de la tumeur. La validation de la méthode sera d’autant plus assurée que ces deux modèles possèdent des compositions et des propriétés physiques différentes. Cela permettra d’offrir une méthode sans douleur qui pourrait prédire la sévérité d’un cancer et adapter ensuite le traitement donné au patient.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’approfondir les connaissances fondamentales relatives aux propriétés mécaniques du cancer. En particulier, l’objectif est d’obtenir des marqueurs non-invasifs d’imagerie pouvant indiquer la sévérité tumorale qui est liée à la fois à la composition de la tumeur et à sa pression. Cette étude pourra notamment permettre de définir de nouvelles méthodes d’imagerie afin d’aider le clinicien dans le diagnostic du cancer et, également, adapter le traitement aux caractéristiques de la tumeur.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront anesthésiés pour une injection unique des cellules tumorales en sous-cutané dans le flanc. Cet acte aura une durée totale de 10 min par animal. Les animaux seront observés de manière bihebdomadaire pendant la croissance tumorale. Une fois que la tumeur aura atteint une taille suffisante (environ 2 à 3 semaines après l’injection des cellules), un examen complet sera effectué. Il comprendra un examen d’imagerie IRM, un examen d’imagerie échographie et une mesure de la pression tumorale, tous réalisés au sein d’une même anesthésie gazeuse. Pour la mesure de la pression tumorale, un capteur de pression ressemblant à une aiguille sera introduit au centre de la tumeur pour obtenir des mesures de pression qui seront comparées avec les mesures d’imagerie. Cette comparaison permettra de valider l’intérêt de l’imagerie IRM et échographie comme méthode de mesure de pression non-invasive. Au total, cette intervention aura une durée de 2h pour chaque animal, avec environ 1h15 d’acquisition d’images IRM, 30 min d’acquisition échographique et 15 min de mesures de pression.

Impact sur les animaux

Des cellules tumorales seront injectées dans le flanc droit de l’animal, ce qui peut occasionner un stress ou une légère douleur au point d’injection. La croissance tumorale peut engendrer une gêne, voire une perte de poids pour l’animal. Cette perte de poids sera en revanche limitée, car surveillée deux fois par semaine. De plus, la taille de la tumeur ne devrait pas excéder les 1000 mm3, ce qui limite de potentiels effets indésirables sur la mobilité de l’animal. Le fait d’être maintenu immobile pour l’imagerie et passer à l’intérieur d’un tunnel d’IRM avec un diamètre réduit peut être une source de stress pour l’animal. Cependant, les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress que l’examen peut engendrer. L’animal est surveillé et maintenu au chaud quand il est sous anesthésie, et la durée est limitée le plus possible, pour éviter d’éventuels effets indésirables de l’anesthésie tels que l’hypothermie (refroidissement de l'animal) et la diminution du rythme respiratoire.

Devenir

A la suite de l’examen complet (imageries et mesure de pression), les animaux seront euthanasiés et la lésion tumorale sera disséquée. Des analyses d’histologie seront réalisées pour obtenir des informations sur la composition tumorale. Ces analyses consistent en des coupes fines de la tumeur qui seront passées au microscope pour quantifier les éléments (cellules, fibres de collagène) qui composent la tumeur. Ces données seront corrélées avec les mesures obtenues en imagerie.

Remplacement

A notre connaissance, il n’y a pas d’alternatives en dehors d'un système vivant (construction de cellules ou morceaux de tumeurs) ou de modélisation numérique qui ont été validées et qui peuvent être utilisées comme solution de remplacement. Afin de valider l’imagerie comme solution non-invasive de mesure de la pression tumorale, les mesures doivent être effectuées sur des modèles animaux afin de reproduire l’environnement hétérogène et les propriétés tumorales qui pourront être retrouvés en clinique chez les patients atteints de lésions tumorales.

Réduction

Les dispositifs d’imagerie utilisés dans ce projet ont déjà été validés en amont, ce qui évite d’avoir une phase de test et de validation sur petit animal. Le nombre d’animaux par groupe a été défini selon des données obtenues précédemment et les données de la littérature.

Raffinement

En plus du suivi quotidien standard, un suivi clinique aura lieu deux fois par semaine : l’état de l’animal sera noté à l'aide d'une grille de score, avec surveillance du poids, de son apparence, de son comportement et de la taille de la tumeur. En cas d’atteinte des points-limites, l’animal sera euthanasié. En cas de score intermédiaire, une injection d’antidouleur sera réalisée et le suivi clinique sera réalisé quotidiennement. Tous les examens seront effectués sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress provoqués par les examens. La durée des examens sera réduite au maximum (temps total prévu de 2 heures au maximum) et tous les examens seront réalisés au cours de la même anesthésie pour éviter plusieurs anesthésies successives. Les animaux seront maintenus dans des cages de cinq maximum afin qu’ils aient suffisamment d’espace et qu’ils maintiennent un comportement social. Du matériau favorisant la nidification leur sera fourni. Les animaux seront hébergés en animalerie avec un statut adapté et manipulés sous hotte.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour cette étude, car elles permettent de greffer en sous-cutané des modèles de tumeurs humaines. Les dispositifs d’imagerie ont été développés pour les souris. De plus, la plupart des études d’imagerie sur tumeurs greffées en sous-cutané ont été réalisées sur des souris et il est donc plus aisé de trouver des informations dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés au stade adulte (au moins 8 semaines) afin de bénéficier d’animaux plus grands et plus à même de supporter les lésions tumorales étudiées. De plus, les cancers du sein et du pancréas sont généralement observés chez des patients adultes.