Diagnostic des maladies

10 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées, elles sont infectées par le virus de la rage par injection intracérébrale, développent une succession de signes cliniques, puis sont tuées pour prélever leur cerveau infecté. Ce matériel sert à fabriquer des panels distribués aux laboratoires de référence européens pour des évaluations de diagnostic de la rage tous les deux ans. Le porteur affirme qu'aucune culture in vitro ne produit assez de tissu cérébral et présente la souris comme seul moyen d'obtenir la quantité voulue, en soulignant avoir divisé par deux le nombre d'animaux par an.

Objectifs

Le projet vise à générer du matériel biologique qui entrera dans la composition de panels d’échantillons distribués aux Laboratoires Nationaux de Référence (LNR) qui prennent part à des évaluations interlaboratoires (EIL) de diagnostic de rage organisé tous les deux ans en Europe. Afin de mimer les conditions de réalisation d'un diagnostic de routine, les panels se doivent d'être constitués de matière cérébrale. La France étant indemne de rage vulpine, il est donc impossible d’avoir recours à des prélèvements de cerveaux issus d’animaux naturellement infectés. De plus, pour certaines souches de rage, telles que celles retrouvées chez les chauves-souris, il est difficilement envisageable d'obtenir assez de matériel cérébral pour la préparation d’une cinquantaine de panels. De ce fait, il est nécessaire d'obtenir expérimentalement ce matériel biologique en infectant des souris de laboratoire. Les EILs de diagnostic de rage permettent d’évaluer les LNRs sur 4 techniques de diagnostic différentes. Les panels sont constitués d’environ une dizaine d’échantillons dont 8 composés de matière cérébrale infectée par des souches de rage représentatives des souches classiquement isolées par les LNRs (souches renard, souches canines, souches isolées chez les chauves-souris etc.) Pour chaque EIL, 8 productions de virus sont donc effectuées afin d’obtenir les 8 stocks d'échantillons dits « positifs » qui entreront dans la composition du panel.

Bénéfices attendus

Le présent projet va permettre de constituer des panels de matières cérébrales infectées avec différents lyssavirus qui seront utilisés à l'échelle Européenne pour la réalisation d'EILs. Ces EILs visent 1/ à évaluer l'aptitude des LNRs européens aux techniques de diagnostic de rage, 2/ à harmoniser les modes opératoires techniques, 3/ et ainsi à contribuer à une meilleure surveillance de la rage en Europe.

Procédures

Les souris seront anesthésiées (injection dans le péritoine) avant d'être infectées par voir intra-cérébrale par une dose de virus. L'infection est une étape qui ne dure pas plus de 5 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris infectées par les lyssavirus vont développer une succession de signes cliniques très bien caractérisés. Dès l'apparition des premiers signes cliniques imputables à la rage , les animaux seront mis à mort immédiatement tout en permettant d'atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de collecter les cerveaux infectés.

Remplacement

La France étant indemne de rage, depuis les années 2000, il n'y a plus de mammifères sauvages (renards par exemple) naturellement infectés par le virus. Il est donc désormais impossible d’avoir recours à des prélèvements de cerveaux qui seraient issus d’animaux naturellement infectés. De plus, pour certaines souches rabiques, telles que celles retrouvées chez les chauves-souris, il est impossible d'obtenir assez de matériel cérébral infecté (un cerveau de chauve-souris pèse moins d'un gramme) pour la préparation d’une cinquantaine de panels. De ce fait, seule l'utilisation d'animaux de laboratoire nous permet de préparer la quantité de matière cérébrale nécessaire à la préparation des panels utilisés pour les EILs de diagnostic. Par ailleurs les méthodes actuelles de mise en culture in-vitro de neurones ne permettent de produire qu'une quantité très limitée de tissus rendant à ce jour ces techniques inapplicables pour le présent projet.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque production virale (n=480) a été déterminé en intégrant 4 paramètres: la fréquence bisannuelle des EILS, le nombre de participants aux EILs (en moyenne 60), le nombre d'échantillons constitutif de chaque panel (10) et les contrôles qualité à effectuer sur chaque production virale tel que requis par la norme qualité pour l'organisation d'EILs. Chaque production sur 480 souris permet ainsi d'obtenir environ 120 échantillons de cerveaux (d'environ 1ml) dont 1/3 servira aux contrôles qualité et 2/3 qui servira à la constitution des panels. La fréquence des EILs de diagnostic de rage a été revu à la baisse avec l'organisation d'un EIL tous les deux ans (autrefois fréquence annuelle). Cela nous permet de réduire de moitié la quantité de souris utilisée dans le cadre de ces productions passant ainsi de l'utilisation d'environ 20000 à 10000 souris par an. L'organisation de tels EILs à l'échelle européenne permet l'évaluation d'un grand nombre de laboratoires en une seule session, et évite également l'organisation d'autres EILs rage par d'autres laboratoires et donc le recours à d'autres animaux d'expérimentation. Tout échantillon qui ne serait pas utilisé pour la réalisation d'EIL pourra être utilisé comme témoin positif pour les techniques de diagnostic de rage, comme échantillon test dans le cadre de stage technique, ou de validation de méthode.

Raffinement

Ces souris seront hébergées en groupe avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

La souris est une espèce très largement utilisée pour les expérimentations dans le domaine de la rage. Elle présente une très bonne sensibilité aux différents génotypes du lyssavirus. Depuis qu’il a été démontré que l’injection intracérébrale à la souris blanche déterminait une infection constante et typique, celle-ci est devenue l’animal de laboratoire de choix comparé au cobaye et au lapin. La période d’incubation du virus rabique est relativement courte, et les signes cliniques liés à la rage sont très bien caractérisés. Les souris Swiss OF1 utilisées doivent avoir un poids d'environ 15 grammes lors de l’administration du virus d'épreuve à J0. Ce poids correspond à un stade où les souris sont très sensibles au virus de la rage.

2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce volet se déroule dans le premier des deux établissements du projet, où une tumeur humaine leur est greffée avant l'administration d'un anticorps couplé à un métal radioactif et une imagerie nucléaire. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales, une déplétion des cellules sanguines et un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression" liés à l'hébergement individuel après l'injection radioactive. Il conclut que l'expérimentation animale est "requise", les données précliniques étant imposées par les autorités.

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un métal radioactif à un anticorps spécifique d'une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que l'anticorps puisse diriger et concentrer le métal dans les cellules cancéreuses. En fonction du métal choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Un anticorps spécifique de cette protéine a donc été développé afin de bloquer sa liaison avec ses récepteurs dans la cellule et ainsi conduire à leur mort. Cet anticorps est actuellement en cours d'investigation dans le cadre d'un essai clinique chez l'Homme. Dans le but de mieux sélectionner les patients exprimant fortement la protéine N, cet anticorps a été modifié par couplage à un métal radioactif émetteur de particules lumineuses afin de détecter sa présence par imagerie nucléaire. Ce nouvel outil devrait permettre d'inclure les patients sur la haute expression de la cible afin de les traiter avec l'anticorps seul (non radioactif) et ainsi déclencher la mort des cellules tumorales. Par ailleurs, les mécanismes d'échappement de la cellule tumorale concernant la protéine N étant déjà décrits, l'efficacité de l'anticorps non radioactif est donc limitée. C'est pourquoi l'ajout de la radioactivité est alors nécessaire afin de détruire les cellules cibles. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs agréés (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les patients pris en charge en clinique ne sont généralement pas testés pour l'expression de la cible, limitant ainsi les chances de réponse aux traitements. Dans ce présent projet, il est proposé de valider l'utilisation d'un test compagnon basé sur l'imagerie chez différents modèles tumoraux hautement représentatifs de la pathologie humaine afin de n'inclure que des patients exprimant un fort taux de la cible et d'augmenter l'effet anti tumoral des thérapies ciblées. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l'Homme à la fin de l'étude.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Interventions chirurgicales : greffe de tissu tumoral humain (1 ou 2 par animal en fonction de la greffe unilatérale ou bilatérale, durée : 5 minutes maximum). -Injection de produit en intraveineuse dans la veine caudale : 2 injections chez les souris incluses lors des expérimentations d'imagerie et de traitement. -Injection de produit en sous-cutanée : 2 injections prévues au moment de la greffe (peropératoire et post-opératoire). Des injections supplémentaires de produit analgésiant pourront être réalisées en cas de nécessité seulement et selon les conditions définies dans chacune des manipulations expérimentales. -Anesthésie gazeuse à l'isoflurane réalisée lors de la greffe, lors de chaque injection ou au moment de la mise à mort. -Imagerie Nucléaire : imagerie SPECT/CT dans les procédures d'imagerie. -Mesures du poids ainsi que du volume tumoral dans toutes les procédures (deux fois par semaine). La greffe de tissu tumoral humain sera réalisée dans l'EU1 tandis que tous les autres actes (injections de produit non radioactif, radioactif, imagerie nucléaire) seront effectués dans l'EU2. Les anesthésies gazeuses ainsi que les merures de poids et de volume tumoral pourront être effectuées dans les deux établissements utilisateurs.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : -douleurs générées post-intervention chirurgicale (incision réalisée sur la peau pour la mise en place du greffon), lors de la prise du greffon, lors de l'injection ou de l'application de produit d'analgésie ou d'antiseptsie, lors de l'injection des anticorps. -fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines dans les jours suivants l'injection de l'anticorps radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. -stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. -sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris inclue dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficicacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de la greffe est réduit au minimum tout en prenant en compte le taux de reprise des modèles de tumeurs humaines lors de la décongélation. Lors de l'étape d'amplification du modèle tumoral humain, une greffe bilatérale sera effectuée sur les animaux afin de réduire leur effectif. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. Les effectifs des animaux des autres procédures ne reposent sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la variabilité biologique possible entre les souris. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées et chaque étape devra montrer de bons résultats avant le passage à l’étape suivante afin de limiter le nombre d'animaux strictement nécessaire.

Raffinement

Méthode utilisée pour réduire la douleur : -Anesthésie générale gazeuse. 1 anesthésie/animal lors de la greffe (5min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque injection sous la peau ou dans la veine de la queue (5 min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque acquisition d'imagerie nucléaire (45min) et 1 anesthésie lors de la mise à mort de l'animal. -Analgésie mise en place en cas de douleur chez l'animal, possibilité de renouvellement toutes les 24h. -Antisepsie : application cutanée en cas de blessure observée en zone d'hébergement ou en amont de l'incision de la peau lors de la greffe. Raffinement des conditions d'hébergement : afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection de la molécule d'imagerie, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte dans le but de permettre un contact visuel des animaux et en enrichissement de la cage (jouet) sera ajouté.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux établis à partir du tissu cancéreux de patients (PDX) est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de PDX car celles-ci se caractérisent par l'absence de thymus, ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont entre 6 et 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est greffée, puis elles reçoivent un anticorps couplé à un métal radioactif, avec imagerie nucléaire et hébergement individuel après l'injection, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour compter la radioactivité organe par organe. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales, une déplétion des cellules sanguines lors de la recherche de la dose radioactive maximale tolérée, ainsi qu'un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression" liés à l'isolement en cage. Il conclut que l'expérimentation animale est "requise", les données précliniques étant imposées par les autorités.

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un métal radioactif à un anticorps spécifique d'une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que l'anticorps puisse diriger et concentrer le métal dans les cellules cancéreuses. En fonction du métal choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Un anticorps spécifique de cette protéine a donc été développé afin de bloquer sa liaison avec ses récepteurs dans la cellule et ainsi conduire à leur mort. Cet anticorps est actuellement en cours d'investigation dans le cadre d'un essai clinique chez l'Homme. Dans le but de mieux sélectionner les patients exprimant fortement la protéine N, cet anticorps a été modifié par couplage à un métal radioactif émetteur de particules lumineuses afin de détecter sa présence par imagerie nucléaire. Ce nouvel outil devrait permettre d'inclure les patients sur la haute expression de la cible afin de les traiter avec l'anticorps seul (non radioactif) et ainsi déclencher la mort des cellules tumorales. Par ailleurs, les mécanismes d'échappement de la cellule tumorale concernant la protéine N étant déjà décrits, l'efficacité de l'anticorps non radioactif est donc limitée. C'est pourquoi l'ajout de la radioactivité est alors nécessaire afin de détruire les cellules cibles. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs agréés (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les patients pris en charge en clinique ne sont généralement pas testés pour l'expression de la cible, limitant ainsi les chances de réponse aux traitements. Dans ce présent projet, il est proposé de valider l'utilisation d'un test compagnon basé sur l'imagerie chez différents modèles tumoraux hautement représentatifs de la pathologie humaine afin de n'inclure que des patients exprimant un fort taux de la cible et d'augmenter l'effet anti tumoral des thérapies ciblées. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l'Homme à la fin de l'étude.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Interventions chirurgicales : greffe de tissu tumoral humain (1 ou 2 par animal en fonction de la greffe unilatérale ou bilatérale, durée : 5 minutes maximum). -Injection de produit en intraveineuse dans la veine caudale : 2 injections chez les souris incluses lors des expérimentations d'imagerie et de traitement. -Injection de produit en sous-cutanée : 2 injections prévues au moment de la greffe (peropératoire et post-opératoire). Des injections supplémentaires de produit analgésiant pourront être réalisées en cas de nécessité seulement et selon les conditions définies dans chacune des manipulations expérimentales. -Anesthésie gazeuse à l'isoflurane réalisée lors de la greffe, lors de chaque injection ou au moment de la mise à mort. -Imagerie Nucléaire : imagerie SPECT/CT dans les procédures d'imagerie. -Mesures du poids ainsi que du volume tumoral dans toutes les procédures (deux fois par semaine). La greffe de tissu tumoral humain sera réalisée dans l'EU1 tandis que tous les autres actes (injections de produit non radioactif, radioactif, imagerie nucléaire) seront effectués dans l'EU2. Les anesthésies gazeuses ainsi que les merures de poids et de volume tumoral pourront être effectuées dans les deux établissements utilisateurs.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : -douleurs générées post-intervention chirurgicale (incision réalisée sur la peau pour la mise en place du greffon), lors de la prise du greffon, lors de l'injection ou de l'application de produit d'analgésie ou d'antiseptsie, lors de l'injection des anticorps. -fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines dans les jours suivants l'injection de l'anticorps radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. -stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. -sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris inclue dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficicacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de la greffe est réduit au minimum tout en prenant en compte le taux de reprise des modèles de tumeurs humaines lors de la décongélation. Lors de l'étape d'amplification du modèle tumoral humain, une greffe bilatérale sera effectuée sur les animaux afin de réduire leur effectif. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. Les effectifs des animaux des autres procédures ne reposent sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la variabilité biologique possible entre les souris. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées et chaque étape devra montrer de bons résultats avant le passage à l’étape suivante afin de limiter le nombre d'animaux strictement nécessaire.

Raffinement

Méthode utilisée pour réduire la douleur : -Anesthésie générale gazeuse. 1 anesthésie/animal lors de la greffe (5min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque injection sous la peau ou dans la veine de la queue (5 min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque acquisition d'imagerie nucléaire (45min) et 1 anesthésie lors de la mise à mort de l'animal. -Analgésie mise en place en cas de douleur chez l'animal, possibilité de renouvellement toutes les 24h. -Antisepsie : application cutanée en cas de blessure observée en zone d'hébergement ou en amont de l'incision de la peau lors de la greffe. Raffinement des conditions d'hébergement : afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection de la molécule d'imagerie, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte dans le but de permettre un contact visuel des animaux et en enrichissement de la cage (jouet) sera ajouté.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux établis à partir du tissu cancéreux de patients (PDX) est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de PDX car celles-ci se caractérisent par l'absence de thymus, ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont entre 6 et 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéprimées reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein humain dans la glande mammaire, puis une injection d'un peptide radiomarqué et une imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque qui les tue. L'objectif est de vérifier où se fixe ce traceur dans l'organisme, première étape avant une éventuelle application diagnostique ou thérapeutique laissée au conditionnel. Le porteur affirme que les résultats in vitro ne suffisent pas et juge le recours à des souris porteuses de tumeurs "indispensable".

Objectifs

Le ciblage de récepteurs de neuropeptides par des médicaments radiopharmaceutiques connait un réel engouement aujourd’hui pour l’imagerie et la thérapie des cancers. Il a été montré une forte expression du récepteur Y5 au neuropeptide Y dans 11 lignées cellulaires tumorales (dont le sein, ovaire, colon, prostate) quel que soit le grade et le phénotype. Un programme de recherche a été établi visant à caractériser le récepteur Y5 dans diverses lignées cellulaires tumorales humaines et à développer le premier agent de ciblage utilisable en imagerie nucléaire et en thérapie. Un premier analogue du NPY spécifique du récepteur Y5 pouvant être radiomarqué avec des radiométaux (nom de code du composé : tg3) a été développé. Les résultats in vitro obtenus jusqu’à présent démontrent la bonne affinité du composé pour le récepteur. Le présent projet de recherche préclinique vise à tester in vivo ce peptide radiomarqué à des fins diagnostiques sur des modèles murins de cancers du sein exprimant ces récepteurs Y5.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si ce premier analogue du neuropeptide Y donne de bons résultats in vivo en imagerie TEP, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique.

Procédures

- xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales (cancer du sein) dans les glandes mammaires sous anesthésie gazeuse (durée 10min) pour les 24 souris balb/c nude - 1 Injection intraveineuse au niveau de la queue contenant les radiotraceurs sous anesthésie gazeuse pour les 36 souris (durée 5 min) - 1 imagerie pour la moitié des effectifs (soit 18 souris) sous anesthésie gazeuse (durée 35 min) - 1 ponction cardiaque terminale pour les 36 souris sous anesthésie gazeuse 3% (durée 5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau des glandes mammaires pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies répétées pour la mise en place du modèle et pour l'imagerie peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 36 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur Y5 est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique du peptide tg3.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude du peptide tg3 radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic TEP, il est nécessaire de visualiser leur biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs Y5. Deux modèles murins de cancers du sein dont la présence du récepteur Y5 a été validée in vitro seront étudiés. Une étude préliminaire sur des souris saines (sans tumeur) permettra la comparaison de fixation du radiopeptide sur les différents organes. Pour chaque groupe, le ligand spécifique du récepteur Y5 est comparé à un peptide similaire dont la fixation à Y5 est nulle. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 6 souris par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène.

Raffinement

Les souris sont placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour/nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie de recherche agréée. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la greffe orthotopique de tumeur humaine au niveau de la glande mammaire. La souris Balb/c sera utilisée pour l’étude de biodistribution sans tumeur puisqu’elle présente le même fond génétique que la Balb/c nude. Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les xénogreffes seront initiées à 10 semaines de développement. A ce stade, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. La pousse tumorale dure entre 2 et 4 semaines (volume minimum de 150 mm3). Les études in vivo par imagerie TEP suivi des biodistributions de l'analogue tg3 radiomarqué et de sa version "scrambled" sur les souris xénogreffées peuvent être réalisées. Pour les souris Balb/c, les biodistributions des peptides radiomarqués seront réalisées entre 12 et 14 semaines de développement pour pouvoir être comparables aux souris xénogreffées.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est exposée aux fumées de cigarette deux heures par jour, cinq jours sur sept pendant quatre semaines, puis toutes subissent trois séances d'imagerie TEP sous anesthésie et l'injection d'un vaccin anti-tabac, pour mesurer les effets de quatre vaccins en développement. Les retombées annoncées se limitent à compléter une étude clinique en cours, l'objectif immédiat restant l'imagerie du métabolisme cérébral. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut modéliser ces mécanismes et conclut que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le tabagisme fait plus de 8 millions de morts dans le monde chaque année et est reconnu comme un fléau mondial. Il est la première cause évitable de mortalité en France. La lutte contre le tabagisme est une priorité de santé publique. A ce jour, les options pharmacologiques pour arrêter le tabac sont limitées. Un vaccin anti-tabac, qui permettrait de faciliter le sevrage tabagique, serait novateur dans la lutte contre le tabagisme. L’objectif de ce projet est de mesurer les effets de différents vaccins anti-tabac (4 au total) en cours de développement par une approche d’imagerie non-invasive, la tomographie par émission de positons (TEP), qui offre la possibilité d’explorer in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans le fonctionnement cérébral, notamment les modifications du métabolisme cérébral en présence et en absence d’une addiction au tabac (avec et sans vaccin anti-tabac). Cette étude sera menée chez un modèle murin : des animaux seront exposés deux heures par jour aux fumées de cigarette pendant 4 semaines puis la moitié recevra une dose de d’un vaccin anti-tabac.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude complèteront une étude clinique en cours et fourniront de nouvelles informations sur l'utilisation de certains vaccins anti-tabac pour faciliter le sevrage tabagique.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : Mise à jeun 6h avant l’imagerie • Réalisation 3 sessions d’imagerie (injection d’un radiotraceur durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 60 minutes au maximum) • Pour la moitié des animaux, exposition quotidienne aux fumées de cigarette (2 heures par jour, 5 jours sur 7 pendant 4 semaines). • Injection d’un vaccin anti-tabac (durée 10 secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Mise à jeun 6h avant l’imagerie pouvant entrainer une perte de poids inférieure à 5%. • Exposition quotidienne aux fumées de cigarettes entrainant une perte d’appétit (ralentissement de la courbe de prise de poids) et une irritation des voies respiratoires. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances, modéliser in vitro ou in silico des tissus complexes en présence et en absence à une addiction au tabac en prenant en compte la distribution périphérique, les transporteurs, l’élimination hépatique ou hépatobiliaire, le métabolisme etc.., afin d’évaluer le métabolisme cérébral par le radiotraceur avec et sans vaccin anti-tabac n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier le métabolisme cérébral par le radiotraceur avant et après vaccin anti-tabac.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux tout au long de l'expérience ; chaque animal est son propre témoin, ce qui divise par 3 le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les rongeurs seront hébergés par groupes. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. Cette espèce fait partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études sur le tabac. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser l’exposition au tabac ainsi que d'évaluer les différents effets des vaccins testés. Les animaux seront des adultes âgés de 10-11 semaines, étant donné que nous sommes intéressés aux effets cérébraux du tabac à l'âge adulte.