Système endocrinien

Obtenir un foie gras sans gavage : 600 canards de trois génotypes vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. De l'éclosion à dix-sept semaines, ils subissent six heures par jour à dix degrés sous leur optimum thermique, des variations d'éclairage, deux semaines de restriction alimentaire à -25 %, puis une remise à volonté destinée à les faire manger au-delà de leur besoin. Vingt canards par groupe et par semaine sont saignés au sinus occipital pour doser un marqueur d'engraissement du foie, avant l'abattage et le prélèvement des tissus. Le porteur situe la recherche dans "un contexte d'intensification du questionnement sociétal relatif au bien-être animal" et juge "nécessaire" de porter l'effort sur le canard, l'oie ne représentant que 2 % de la production française.

Objectifs

Aujourd’hui, la production de foie gras repose sur le gavage des animaux. Dans un contexte d’intensification du questionnement sociétal relatif au bien-être animal, des recherches ont été entreprises sur des méthodes alternatives à cette pratique pour la production de foie engraissé. Les premiers travaux concluants ont été réalisés sur l’oie mais celle-ci ne représente que 2 % de la production française de foie gras. Il est donc nécessaire à présent de concentrer les efforts de recherche sur le canard. L’objectif du présent projet est d’utiliser plusieurs leviers physiologiques et métaboliques susceptibles d’induire un engraissement hépatique en les mettant en œuvre de façon précoce, dès le développement embryonnaire, de façon à bénéficier des périodes où l’oiseau présente une grande plasticité d’adaptation métabolique et physiologique et de les tester chez trois génotypes de canards (Barbarie, mulard et Pékin) et les deux sexes. Le canard mulard résulte du croisement d’un mâle Barbarie avec une femelle Pékin. Ces trois génotypes de canard ne présentent pas la même sensibilité aux variations de la photopériode et de la température, la même vitesse de croissance, le même comportement alimentaire, ni la même aptitude à la production de foie gras lorsqu’ils sont gavés. Ce projet a pour objectif d’explorer la réponse de ces génotypes face à une combinaison de différentes modalités de stimulation du développement des organes digestifs, de l’hyperphagie (surconsommation spontanée d’aliment) et/ou de la capacité de synthèse et de stockage des lipides par le foie. En conditions standards d’élevage, la capacité d’engraissement corporel global des femelles est en général supérieure à celle des mâles d’où l’intérêt d’étudier la réponse des canards des deux sexes. Les leviers testés seront l’exposition à une baisse de température au cours de la dernière phase de développement embryonnaire et de la croissance, la composition (ratio énergie/protéines, teneurs en fibres et antioxydants) et les modalités de distribution de l’aliment (durée et fréquence des repas, restriction suivie d’un apport à volonté), la durée et l’intensité de l’éclairage.

Bénéfices attendus

Sur le plan scientifique, ce projet mettra à profit les connaissances récemment acquises sur la programmation thermique embryonnaire et post-éclosion des oiseaux (poulets, canards) et devrait permettre d’enrichir celles portant sur le métabolisme des lipides du canard en croissance et la régulation de son ingéré alimentaire sous l’effet conjugué de différents facteurs, la photopériode (durée et intensité d’éclairage), les modalités de distribution de l’aliment (durée et fréquence des repas, restriction, distribution à volonté) et la composition de l’aliment (ratio énergie/protéines, teneurs en fibres et antioxydants). Ce projet permettra aussi d’enrichir les connaissances sur le comportement alimentaire du canard. L’objectif de ce projet est de chercher une alternative à l’alimentation forcée représentée par l’acte de gavage pour l’obtention d’un foie engraissé. Si la combinaison des leviers précités permet d’atteindre cet objectif, il représentera un changement évident de pratique d’élevage. Il s’agira ensuite de la valider et de l’optimiser puis d’évaluer son impact sur les aspects environnementaux, économiques et sociétaux. Les résultats de ce projet permettront aussi d’ouvrir un large champ d’investigation pour décortiquer les mécanismes comportementaux, physiologiques et métaboliques mis en œuvre chez les animaux aux différents stades de leur croissance et de la phase d’engraissement du foie.

Procédures

A l’éclosion, les canetons seront sexés, pesés et leur aspect visuel et leur vivacité seront évalués. Au cours de la croissance, les canards seront pesés en semaines 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Une prise de sang au sinus occipital sera réalisée sur 20 canards vigiles par groupe et par semaine d’abattage lors de la période d’alimentation à volonté de S13 à S17 soit un total de 600 canards. Cela nous permettra de déterminer la concentration plasmatique en chémerine, un marqueur de l’engraissement du foie et de vérifier que ce marqueur reste robuste même si l’engraissement du foie est éventuellement plus modéré que celui obtenu par gavage. Ces canards seront abattus pour évaluer leur composition corporelle et prélever des échantillons de différents tissus. De J1 à J70, les canards seront exposés à une diminution temporaire quotidienne (6h/24h) de la température ambiante de 10°C par rapport à leur optimum thermique, à des variations de l’intensité lumineuse (40-50 lux pendant les repas et 5-10 lux entre les repas) et de la durée d’éclairage (diminution de 24h à 16h d’éclairage de J1 à J21 puis de 16h à 8h de J70 à J78 et augmentation de 8h à 16h à J85) à une restriction alimentaire de -25% par rapport à l’ingéré à volonté de J70 à J84 suivie par une distribution à volonté de l’aliment de J85 à J119.

Impact sur les animaux

L’exposition à une baisse de la température de 10°C pendant 6 h/24 h pourra induire un inconfort thermique en particulier au cours de la première semaine d’élevage (exposition à 20°C au lieu de 30°C), mais dès l’éclosion, les canetons sont capables de maintenir leur température corporelle lorsque la température ambiante ne descend pas au dessous de 20°C. Ce seuil de température ambiante au-dessus duquel les canards sont capables de maintenir leur température corporelle diminue progressivement avec l’âge et la température dans le bâtiment d'élevage diminue également. Les canetons seront élevés en groupe et sur des copeaux de bois qui apportent un confort thermique lorsque les animaux sont couchés. La phase de restriction alimentaire pourra induire une frustration des animaux. L’apport de fibres dans l’aliment et la mise à disposition de grit (mélange de graviers et de coquilles broyées) et de bottes de pailles sur le sol ont pour objectif de ralentir le transit digestif et de favoriser le comportement exploratoire des canards et donc de réduire leur nervosité éventuelle. La diminution de l’intensité lumineuse favorisera aussi une ambiance calme dans le bâtiment. Le prélèvement de sang peut engendrer une réaction de stress lors de la contention et l’animal peut ressentir une douleur modérée lors de la piqûre. Le diamètre des aiguilles qui seront utilisées pour les prélèvements de sang sera adapté au gabarit de l’animal. Il n’y a pas en principe de saignement post-prélèvement et la cicatrisation est très rapide. La prise de sang est réalisée avec du matériel stérile dans un environnement propre pour limiter le risque d’infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en respectant la règlementation en vigueur (abattage dans des abattoirs agréés) pour évaluer leur composition corporelle, l’engraissement du foie et prélever des échantillons de différents tissus.

Remplacement

Etant donné que cette étude porte sur les alternatives au gavage du canard en utilisant différents leviers physiologiques et métaboliques, l’utilisation de l’animal ne peut pas être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.

Réduction

L’effectif total d’animaux mis en procédure dans cette étude est 600. La concentration du plasma en chémerine (une hormone marqueur de l’engraissement du foie) sera déterminée sur 20 canards par sexe et par génotype qui seront abattus chaque semaine au cours de la dernière période d’élevage (S13-S17) lors de l’alimentation à volonté. Les paramètres de composition corporelle et d’expression tissulaire de la chémerine seront mesurés sur 20 canards par sexe et par génotype. Ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence un effet significatif des conditions d’élevage au regard de l’expérience acquise sur des études précédentes concernant ces différents paramètres.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe et au sol sur une litière de copeaux de bois dans un bâtiment d’élevage standard. Ils disposeront de mangeoires circulaires pour la première semaine afin de permettre un accès plus facile à l’aliment puis ensuite de mangeoires linéaires qui sont plus hautes pour éviter le gaspillage alimentaire. L’accès à l’eau sera effectué avec des abreuvoirs en cloche. En dehors des repas, l’intensité lumineuse sera réduite à 5-10 lux pour limiter la nervosité des animaux. Le milieu sera enrichi avec des bottes de paille permettant aux animaux d’exercer une activité exploratoire en particulier lors de la période de restriction alimentaire. Les effets des conditions d’élevage sur le comportement et l’activité des animaux seront évalués à 35 jours pour la phase de croissance, à 85 jours pour la phase de restriction alimentaire et à 105 jours pour la phase d’alimentation à volonté à l’aide d’une méthode d’évaluation du bien-être. Cette méthode comporte 3 étapes : un questionnaire regroupant tous les indicateurs de moyens, qui sont liés à l’environnement de l’animal, des mesures de comportement sur un échantillonnage d’animaux et des informations sanitaires. Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Une grille d'évaluation (indicateurs physiologiques, comportementaux et d'état corporel) sera mise en place afin d'assurer un suivi quotidien et de détecter précocement toute altération du bien-être des animaux. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal blessé et/ou prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation pour un placement en infirmerie ou une mise à mort selon l’état corporel de l’animal.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de tester une combinaison de leviers physiologiques et métaboliques susceptibles d’induire un engraissement du foie chez le canard en croissance. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. La possibilité d’expérimenter chez l’animal cible du projet (canard) est la plus adaptée. Le canard mulard résulte du croisement d’un mâle Barbarie avec une femelle Pékin. Ces trois génotypes de canard ne présentent pas la même sensibilité aux variations de la photopériode et de la température, la même vitesse de croissance, le même comportement alimentaire, ni la même aptitude à la production de foie gras lorsqu’ils sont gavés. Ce projet a pour objectif d’explorer la réponse de ces génotypes face à une combinaison de différentes modalités de stimulation du développement des organes digestifs, de l’hyperphagie (surconsommation spontanée d’aliment) et de la capacité de synthèse et de stockage des lipides par le foie. Nous élèverons les canards de l’éclosion jusqu’à l’âge de 13 à 17 semaines correspondant à la période de distribution à volonté de l’aliment afin de suivre l'évolution hebdomadaire de l’engraissement du foie. Pour stimuler la surconsommation d’aliment et donc la synthèse de lipides par le foie, les canards vont être soumis au préalable à une période de restriction alimentaire pendant les semaines 11 et 12. Cette restriction alimentaire ne peut pas intervenir trop tôt dans la croissance des animaux afin d’éviter un impact à long terme sur leur développement corporel.

Six heures de jeûne, une laparotomie, une ligature de l'œsophage et la pose d'un cathéter dans le canal biliaire : 60 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées sous anesthésie à la fin de l'intervention pour prélever leurs organes. L'opération mesure les sécrétions du pancréas et de la bile chez des souris privées du récepteur CD36 dans les papilles gustatives, pour préciser le rôle du "goût du gras" dans la préparation de la digestion. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à la description de cette nouvelle lignée, qui pourra ensuite servir de modèle pour d'autres questions. Le choix de l'espèce tient à la lignée elle-même, le porteur écrivant que ce modèle génétiquement modifié n'existe que chez la souris, ce qui le rend selon lui "indispensable".

Objectifs

Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. C’est plus précisément les récepteurs gustatifs, exprimés par les cellules des bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) qui permettent la détection des saveurs. Les récepteurs de lipides (CD36, GPR120) exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Le signal gustatif est transmis au cerveau par les nerfs gustatifs, conduisant à une augmentation des sécrétions digestives préparant le corps à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue – cerveau – intestin. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas CD36 ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras, due à une altération de l’axe langue – cerveau – intestin, avec notamment une diminution des sécrétions digestives déclenchées lors d’une application linguale de lipides. Comme CD36 est exprimé dans plusieurs tissus et organes, il a été difficile de déterminer chez ces souris, le rôle oral dans les effets observés. Ainsi, des souris génétiquement modifiées qui n’expriment pas CD36 uniquement dans les papilles gustatives ont été générées. Le but de ce projet est d’étudier le rôle de CD36 lingual dans l’activation des sécrétions digestives chez les souris qui n’expriment pas CD36 dans les papilles gustatives.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description d’une nouvelle souche de souris génétiquement modifiées qui n’exprime pas le récepteur CD36 dans les papilles gustatives et qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur l’expression de CD36 et le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard et sera pesé de façon hebdomadaire. Six heures avant la manipulation, les souris seront mises à jeun (de nourriture seulement). Lors de la manipulation, une injection sous-cutanée d’analgésiant puis une injection intrapéritonéale d’anesthésiant seront effectuées. Un anesthésique local sera également appliqué. Les souris endormies seront tondues au niveau de l’abdomen. Une laparotomie, une ligature de l’œsophage et cathétérisation du canal biliaire seront réalisés sous anesthésie générale. Un prélèvement sanguin intracardiaque (sous anesthésie toujours) sera réalisé puis les souris seront mises à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux, ils auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaire pour les injections sous-cutanées (analgésiques) et intrapéritonéales (anesthésiques). Une douleur est également à prévoir lors de cette injection sous-cutanée et lors de cette injection intrapéritonéale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

La sécrétion pancréato-biliaire est une étude faisant intervenir une communication inter-organes ainsi qu’une sécrétion pancréatique in vivo. C’est un paramètre métabolique qui ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable . Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur, la désinfection des surfaces, l’utilisation d'un champ stérile, la stérilisation des outils de dissection, la tonte de la zone d’incision et la désinfection de la peau.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la phase post-ingestive et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude.

2 816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer de huit à vingt-quatre semaines sous régime gras pour développer obésité et diabète, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont irradiées puis greffées de moelle osseuse, d'autres placées seules en cage sept jours, immobilisées deux à cinq minutes dans un tube pour mesurer leur graisse corporelle, ou laissées une nuit sur une grille pour récupérer leurs fèces. Le porteur reconnaît que les injections intrapéritonéales répétées pourraient provoquer une péritonite et que les gavages peuvent causer des microlésions. Le projet ne teste aucun traitement et vise à comprendre le rôle des macrophages du foie, quand l'atteinte des souris, elle, est acquise dès la mise au régime.

Objectifs

Les macrophages sont des cellules du système immunitaire présents dans tous les tissus. Ils participent au maintien de l’organisme en éliminant notamment les cellules mortes ou bien des pathogènes (bactéries, virus). Ces cellules ont toutefois été aussi fortement impliquées dans un grand nombre de maladies dites chroniques, où on leur prête bien souvent un rôle délétère, et notamment dans la maladie du foie gras (NAFLD), l’athérosclérose (maladie des artères à l’origine des infarctus du myocarde) ou bien dans le tissu adipeux chez les individus avec surcharge pondérale (obésité) et diabète. Les macrophages sont des cellules très diverses qui sont fortement influencées par le tissu où elles résident et leur environnement, notamment en conditions pathologiques. Notre projet vise à mieux définir le rôle des macrophages du foie dans le développement des pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras (NAFLD), obésité). Pour reproduire les différents contextes pathologiques, des modèles animaux seront nourris avec différents types de régimes alimentaires qui favoriseront la survenue d'obésité, de la NAFLD ou bien encore de l'hypercholestérolémie (facteur de risque majeur de l’athérosclérose). Certains traitements pourront aussi être conduits sur les animaux pour modéliser un aspect bien précis de l’évolution pathologique de la NAFLD, à savoir la fibrose du foie. En modifiant, la fonction de ces macrophages, leur capacité à survivre ou bien même en éliminant ces cellules du foie de manière momentanée ou durablement, nous essaierons de comprendre leurs rôles et l’importance de leur diversité (origine, activation) dans le contexte de la pathologie et comment ces cellules peuvent influencer le développement des maladies cardio-métaboliques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies métaboliques, comme l’obésité, a augmenté à un rythme exponentiel au cours des dernières décennies. Il est important de noter qu'en plus d'avoir ses propres comorbidités, l'obésité a un impact considérable sur la santé d'un patient et augmente sa susceptibilité à d'autres conditions, comme le cancer. Les comorbidités reconnues depuis longtemps de l’obésité comprennent la résistance à l’insuline et le diabète de type 2, l’hypertension, la dyslipidémie, les maladies cardiovasculaires et la stéatose hépatique. Il est à noter que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) soit également un facteur de risque indépendant majeur pour le développement de maladies cardiovasculaires, notamment l’athérosclérose. Il existe de plus en plus de preuves d’une association étroite entre l’obésité et la NAFLD, et une attention considérable de la recherche est désormais portée sur cette association en raison de la prévalence croissante de la NAFLD et de sa capacité à évoluer vers un dysfonctionnement et une insuffisance hépatique. Le fardeau de la NAFLD devrait augmenter et les projections actuelles estiment que, d’ici 2030, plus de 300 millions de personnes développeront la NAFLD en Chine, plus de 100 millions aux États-Unis et 15 à 20 millions dans les principaux pays européens. Les coûts économiques actuels associés à la NAFLD et à ses comorbidités sont extrêmement élevés. Ainsi, de gros efforts sont en cours pour développer des traitements innovants pour lutter contre cette maladie, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement approuvé. Dans ce contexte, ce projet vise à mieux comprendre le rôle et l’importance que jouent les macrophages (origine, quantité tissulaire, activation) dans le développement de ces pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras ou NAFLD, obésité).

Procédures

Les animaux seront nourris avec différents types de régimes riches en graisses de 8 à 24 semaines pour les faire grossir et développer un diabète. Ils pourront également être nourris en alternance avec un régime riche en graisses ou avec un régime normal. Ils pourront être mis à jeun pendant quelques heures, recevoir un gavage ou une injection et subir 1 ou 2 tests de 2 heures avec quelques petites prises de sang sur animal vigile pour évaluer leur diabète. Les animaux pourront être anesthésiés et recevoir une injection en intra-veineux (durée de quelques minutes) une seule fois. Certains animaux pourront avoir deux prises de sang (vigile, une minute de contention) à quelques jours ou quelques semaines d’écart. Certains animaux pourront être placés dans un tube ou dans un compartiment d’une boite avec restriction de mouvements pendant 2 à 5 mins pour mesurer leur graisse corporelle. Certains animaux pourront être placés seuls dans une cage de dimension normale pendant 7 jours (isolement des animaux avec contact visuel et olfactif avec ses congénères) pour évaluer leur état général et leur niveau d’activité. Certains animaux recevront des traitements par injection de molécules (une seule fois ou deux fois par semaine pendant 6 semaines) ou par addition de molécules dans la nourriture pour induire des perturbations hépatiques. Certains animaux pourront être irradiés quelques minutes et subir une greffe de moelle osseuse immédiatement après par injection sous anesthésie (durée quelques minutes) pour étudier les cellules de leur moelle osseuse. Certains animaux pourront être placés sur une grille déposée sur le sol de leur cage pendant une nuit pour récupérer leur fèces. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour génotypage pourront induire une douleur légère et de courte durée. Les animaux nourris avec les régimes riches en graisses présenteront une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité avec diminution de leur activité quotidienne. La composition de ces régimes riches en graisses les rend plus mous et pourrait favoriser une pousse des dents plus importantes. Les contentions de courtes durées, les administrations par gavage, les injections et les prélèvements sanguins sur animal vigile nécessaires aux différents tests pourront être sources de stress et d’inconfort pour l’animal. Les injections intra-péritonéales répétées pourraient induire un risque de péritonite. De façon rare, les gavages pourront induire des microlésions ou des irritations. Certains tests pourront également induire un stress pour les animaux en raison d’une courte période de mise à jeun. Les mesures de composition corporelle (mouvements limités dans un tube pendant 2 mins) pourront être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Les courtes anesthésies gazeuses pour les injections intra-veineuses pourront engendrer un stress thermique et les injections une douleur temporaire au réveil. Certaines injections ou administration de molécules pourront induire une inflammation temporaire, être source d’inconfort pendant 1 à 2 jours, et s'accompagner parfois d'une perte de poids. L’isolement (une nuit) sur grille pour la récupération des fèces pourront induire un stress. Les animaux irradiés (doses modérées) pourront être stressés au cours de l’irradiation par restriction de leur mouvement (durée 5 mins) dans une petite boîte.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser l'analyse de leurs tissus post-mortem.

Remplacement

L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs cellulaires pouvant orienter le développement des pathologies cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras, obésité). Nous avons besoin d’étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de certains gènes dans nos cellules d’intérêt, et d'étudier les conséquences dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires qui rentrent en jeu et la répercussion de leur activité sur le fonctionnement du tissu.

Réduction

Un total de 2816 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de notre d’expérience utilisant des approches similaires et à l’aide d’un calcul de puissance, nous estimons que 2 lots de 8 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour certaines expériences mâles et femelles seront étudiés séparément car les réponses tissulaires peuvent différer selon le sexe de l’animal. Toutefois, pour certaines études les mâles seront préférentiellement utilisés. Les femelles générées seront alors utilisées pour d'autres expériences, permettant de réduire le nombre d’animaux. A l'issue des expérimentations, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans les conditions standard d'animaleries EOPS (exempte d'organismes pathogènes spécifiques) avec hébergement en portoirs ventilés, avec respect des cycles jour et nuit de 12h, un contrôle de l’hygrométrie et de la température comprise entre 20 et 24 degrés. Les changes litière et de nourriture sont effectués de façon hebdomadaire avec surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie. Les souris disposeront de lanières de papier kraft, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Si des males se battent ou se blessent, ils seront immédiatement pris en charge avec l’avis de la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et ou du vétérinaire de l’établissement utilisateur. Une solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux sera recherchée (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Après transfert des animaux des zones d’élevages, les animaux seront acclimatés à l’animalerie pendant 1 à 2 semaines et habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. Pour toutes les procédures, les injections, les administrations de molécules ou les prélèvements sanguins seront réalisées par une personne en charge de l'étude, habilitée à réaliser les expérimentations sur ce modèle, maîtrisant le geste et avec un matériel adapté afin de réduire le stress et la douleur des animaux. Pour les procédures où une douleur est attendue, les animaux seront suivis quotidiennement. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et,ou le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant. Si des points limites définis en amont sont atteints, les animaux en souffrance seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle des invalidations géniques et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être facilement réalisées. De plus, de nombreuses lignées ont déjà été développées et sont donc disponibles pour les chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’Homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. L’expression des maladies cardio-métaboliques est par ailleurs assez bien reproduite dans le modèle murin avec un recul expérimental de plusieurs décennies à travers le monde. Les animaux utilisés devront avoir atteint la maturité sexuelle et être de jeunes adultes au début des expérimentation. Ils seront donc utilisés à partir de l’âge de 8 semaines.

Pour tester si la perte d'action de l'insuline dans l'intestin fragilise la barrière intestinale, 816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, chaque souris subit un jeûne de quatorze heures, de deux à neuf contentions de trente secondes pour jusqu'à sept gavages, un prélèvement de sang et une ou deux injections, le prélèvement final se faisant sous anesthésie. Le porteur envisage, dans les modèles d'inflammation ou d'infection intestinale, des poils hérissés, une léthargie, une ataxie, des tremblements, des diarrhées et des saignements rectaux. Le bénéfice annoncé, concevoir des stratégies préventives et thérapeutiques, reste une hypothèse, là où les jeûnes et les gavages sont déjà planifiés.

Objectifs

L’intestin exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) la production de messages circulants et iii) un rôle de barrière contre l'entrée de substances toxiques ou de micro-organismes dans le corps. Bien que la perte d'étanchéité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète, les mécanismes à l’origine des défauts d’intégrité intestinale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action intestinale de l'insuline contribue à l'hyperperméabilité et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales au cours du diabète. Ce projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les mécanismes intracellulaires permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Sur animaux vigiles : 240 animaux (1 mise a jeun de 14h, 2 à 7 contentions de 30 secondes pour 0 à 5 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit), 216 animaux (1 mise a jeun de 14h, 3 à 8 contentions de 30 secondes pour 0 à 5 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 2 injections de produit), 144 animaux (2 mises à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 14h, 4 à 9 contentions de 30 secondes pour 2 à 7 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit), 216 animaux (1 mise à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 14h, 3 à 8 contentions de 30 secondes pour 1 à 6 gavages de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit). Sur animaux anesthésiés : 816 animaux (un prélèvement sanguin, 30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucune des lignées d'animaux génétiquement modifiés ne présente de caractère dommageable. Il y a un stress lors de l’anesthésie, de la contention et des injections. Concernant les modèles d'inflammation intestinale ou d’infection par un pathogène intestinal, l’apparition de signes généraux de souffrances (tels que poils ébouriffés ou hérissés, perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement, diarrhées et saignements rectaux) est envisageable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques), qui reposent sur des phénomènes complexes et faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Ces modèles seront utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro car ils permettent d'obtenir une représentation de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, dans des études préliminaires, nous avons utilisé des systèmes de culture à partir de fragments intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux sera réalisée avec un logiciel approprié. La "significativité" des résultats sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique qui nécessitant pas de traitement sur animaux vigiles et permettant d’étudier plusieurs parties de l’intestin et l'effet de plusieurs traitements à partir d’une seule souris, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

Pesées deux fois par semaine pendant huit semaines, dont la moitié sous régime hypercalorique jusqu'à peser près de 50 grammes et devenir prédiabétiques, 144 souris reçoivent ensuite un gavage de glucose ou une injection d'insuline, puis six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Quarante-huit autres passent seize heures à jeun avant deux prélèvements, et vingt-quatre subissent une contention de trente minutes, un stress que le porteur présente comme "nécessaire" à l'activation de l'axe nerveux étudié. Au total 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, pour analyser leur métabolisme du glucose et leur régulation du stress.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de l’équilibre de la glycémie (concentration de sucre (ou glucose) dans le sang), notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Dans cet optique, le récepteur de glucose SGLT3 (pour sodium-glucose transporter 3) est une cible de choix. En effet, l’expression ce récepteur, présent dans les neurones de l'intestin grêle et dans les régions du cerveau qui contrôle la faim– est diminuée chez des souris obèses et varie également après une chirurgie gastrique, un traitement très efficace de l'obésité sévère, en particulier chez les patients diabétiques. Néanmoins, ces différentes études anatomiques et fonctionnelles restent aujourd’hui incomplètes pour définir le rôle de SGLT3 dans la détection du glucose et l’équilibre de la glycémie. Ce projet vise à déterminer si la détection du glucose par le récepteur SGLT3 est important dans le contrôle de la glycémie et du poids et, à plus long terme, de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre de l’obésité et du diabète. Pour cela, nous étudierons une lignée de souris transgéniques qui n’expriment pas le récepteur de glucose SGLT3.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet nous permettrons de compléter les travaux sur les mécanismes de détection du sucre-glucose et de transmission des informations de l’alimentation envoyées par l’intestin. En effet, plusieurs études ont suggéré que SGLT3 est impliqué dans le métabolisme du sucre, notamment dans des situations pathologiques telles que l’obésité. Néanmoins ces travaux n’ont pas encore permis de montrer précisément le rôle de SGLT3. Ce projet nous permettra peut-être d’identifier une nouvelle cible de choix dans la lutte contre l’obésité et ses complications.

Procédures

-144 souris (72 nourries avec un régime standard et 72 nourries avec un régime hypercalorique) seront pesées et leur prise alimentaire sera mesurée deux fois par semaine pendant 8 semaines. Ces souris recevront ensuite soit un unique gavage avec une solution de glucose, soit une unique injection d’insuline (d’une durée d’environ 45 secondes par souris pour chaque geste). Des mesures de glycémie par prélèvement d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue seront réalisées 0,15,30,60,90 et 120 minutes après le gavage ou l’injection. - 48 souris seront mises à jeun pendant 16h et subiront 2 prélèvements d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue. - 24 souris subiront un test de contention d’une durée de 30 minutes ainsi que 3 prélèvements d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue.

Impact sur les animaux

- Des hypoglycémies peuvent survenir lors du test de tolérance à l’insuline. Le contrôle régulier de la glycémie permettra d’anticiper une baisse de la glycémie trop importante. - Le jeûne de 16h ainsi que le test de contention vont entrainer un stress de l’animal, nécessaire à l’activation de l’axe nerveux que nous étudions ici. - Le régime hypercalorique favorise la prise de poids et l’induction du diabète. Après 8 semaines de régime, les souris WT sont prédiabétiques et en surpoids (environ 50g) mais sans impact sur leur mobilité. - Les souris recevant un gavage de glucose oral pourront présenter une légère irritation de l’œsophage.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort afin d’étudier différents paramètres de leur métabolisme glucidique ainsi que de leur régulation du stress.

Remplacement

Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose a des impacts sur l’ensemble du corps et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept, soit 6, 9 ou 18 souris par groupe. Ce nombre a été établi sur différents paramètres prenant en compte les seuils de détection des techniques utilisées, l’analyse statistique et la variabilité entre individus. La mesure de prise alimentaire se fait par la pesée des croquettes dans la mangeoire. Toutes les souris étant hébergées 3 par cage, il est nécessaire de se baser sur le nombre de cage et non sur le nombre d’animaux, pour calculer la taille nécessaire d’échantillon. Ainsi, avec 18 souris par groupe, nous fixons une taille d’échantillon de 6 par groupe. Si aucune différence n’est observée entre les individus mâles et femelles, les données seront regroupées pour augmenter le nombre d’échantillons. Enfin, la réalisation de la procédure 3 est conditionnée aux résultats obtenus au cours de la procédure 2. Si nous n’observons pas de différences dans la contre-régulation induite par le jeûne de 16h, nous ne réaliserons pas cette dernière procédure. Au total, ce projet nécessitera au maximum 216 souris.

Raffinement

Les souris contrôles seront commandées à l’âge de 4 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des tests à l’âge de 14 semaines. Pendant cette phase d’acclimatation, les animaux seront observés et pesés régulièrement. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Pour les différentes procédures, les animaux seront en groupe et manipulés dans le calme pour éviter tout stress superflu. Pour prévenir la douleur due à l’incision de la queue, de la crème anesthésiante à base de lidocaïne (anesderm) est appliquée localement sur la queue des souris, 30min avant l’incision. Pour limiter le stress des animaux, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales. Pour minimiser le stress lié à l'éclairage, nous utiliserons un éclairage diffus et faible (

Choix des espèces

Le rôle du récepteur SGLT3 dans le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles. Les animaux provenant d’un éleveur agréé seront commandés à 4 semaines afin qu’ils soient hébergés dans les mêmes conditions que les animaux transgéniques (sevrés à 4 semaines). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (à partir de 14 semaines). Les résultats décrit dans la littérature ne proviennent que de souris mâles. Notre objectif est d’approfondir ces résultats mais également d’étudier si nous observons les mêmes résultats chez les femelles. Nous utiliserons donc à la fois des souris mâles et femelles.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur expose les fœtus puis les nouveau-nés à un cocktail de molécules polluantes par l'alimentation pendant 33 jours, et suit les atteintes du foie et de la fertilité jusqu'à huit mois. Les femelles servant à entretenir la colonie sont tuées à six mois, et les animaux dont le génotype ne sert pas au projet sont tués vers trente jours, après génotypage. Il indique n'attendre aucun phénotype délétère majeur, tout en listant perte de poids anormale, hypoactivité, dos voûté et yeux enfoncés parmi les signes qu'il surveille.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de définir si les expositions à des polluants environnementaux lors de la grossesse ou bien lors de l'enfance peuvent entrainer des maladies à l'âge adulte et plus particulièrement des maladies du foie ou bien des troubles de la fertilité.

Bénéfices attendus

Les expositions environnementales sont suspectées d’être à l’origine d’un grand nombre de pathologies telles que les troubles de la fertilité ou l’apparition de maladies métaboliques. L'identification d'acteurs impliqués dans la prédisposition et la survenue de ces pathologies permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Cela est d’autant plus nécessaire que dans le cadre d’une exposition systémique, les communications entre les organes par des voies notamment endocriniennes, peuvent participer à l’apparition de pathologies multiples et parfois interdépendantes. Ce projet permettra de définir l’implication de ces signalisations cellulaires dans la survenue et/ou la progression des pathologies hépatiques et des troubles de la fertilité masculine, tout en définissant la part relative des dialogues bidirectionnels entre le foie et les testicules dans l’apparition de ces pathologies. De plus ce projet définira de nouveaux marqueurs de diagnostic, de pronostics ; voire de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux seront soumis au prélèvement d'une biopsies pour le génotypage entre 7 à 10 jours après la naissance. Certains animaux sont des animaux génétiquement modifiés avec une invalidation tissu spécifique pour le gène CAR, les conséquences pouvant toucher les pathologies hépatiques et les troubles de la fertilité seront suivies au plus jusqu'à 8 mois. Les animaux seront soumis à des expositions à des cocktails de molécules environnementales part voie alimentaire pendant 33 jours (à partir de 6.5 jours de vie embryonnaire et jusqu'à 20 jours après la naissance). Les conséquences seront suivi au plus jusqu'à 8 mois.

Impact sur les animaux

Il est à noter que selon la littérature sur le l'invalidation du gène étudié ne présentent pas de phénotype délétère majeur. Aussi, le ciblage de l'invalidation dans un organe en particulier ne devrait pas engendrer de phénotypes dommageables systémiques conduisant à une atteinte majeure de la santé de l'individu. Cependant, les signes observés seront la perte anormale de poids de l’individu ou bien des troubles au niveau de son activité (hypoactivité), dos vouté, yeux enfoncés.... Chaque souris sera surveillée de façon quotidienne par le personnel animalier.

Devenir

Les animaux surnumérères de génotypes qui ne sont pas intéressants pour le projet seront mis à morts. Les animaux utilisés pour les analyses seront mis à morts pour les prélèvements d'organes.

Remplacement

Afin d'analyser l'impact à long terme à l'âge adulte d'exposition à des polluants environnementaux survenues lors de la grossesse et pendant la petite enfance, il n'y a pas à l'heure actuelle de possibilité de remplacer les modèles in vivo. D'autant plus dans notre étude où en plus de la considération temporelle, nous analyserons également les impacts d'un point de vue des dialogues entre plusieurs organes (foie et testicule). Ces considérations de communications entre les organes combinées avec les aspects développementaux (embryons/enfants jusqu'à l'adulte) ne permettent donc pas d'utiliser les approches en culture cellulaire. Cependant des analyses de la littérature combinée à certaines approches en culture cellulaire ont quand même permis de définir les doses à utiliser, permettant cependant partiellement remplacer l'utilisation de l'animal sur certaines questions. Ce qui in fine a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Réduction

Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible dans le contexte des hypothèses des origines développementales de la santé et des pathologies (DOHaD) car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes de discussion bidirectionnelle entre les organes sur une cinétique de temps entre une exposition embryonnaire/néonatale et l'apparition de pathologies à l'âge adulte. Des analyses de la littérature combinée à certaines approches en culture cellulaire ont quand même permis de définir les doses à utiliser, permettant cependant partiellement remplacer l'utilisation de l'animal sur certaines questions. Ce qui in fine a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux à utilisés a été réduit au maximum Le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre les groupes a été évalué en amont grâce aux expériences précédentes, menées ces dernières années dans le cadre d'autres projets et qui nous ont permis d'évaluer les variations attendues dans la réponse des animaux aux expositions à des polluants environnementaux. De plus, sur les animaux qui seront mis à mort dans le cadre de cette étude, nous prélèverons un maximum d'autres tissus que ceux directement ciblés par le projet, afin de pouvoir permettre le partage de tissus avec d'autres collègues permettant ainsi d'alimenter d'autres projets de recherche sans utiliser d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Le raffinement reposera sur un hébergement et une surveillance des animaux ainsi que l'élaboration de protocoles prenant en compte au maximum le bien-être animal. Cela reposera notamment avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages et un maintien de plusieurs animaux par cage. De plus, nous avons défini un arbre décisionnel (annexe) avec des critères adaptés d'arrêt de l'expérimentation en cas de souffrance de l'animal.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris mâles modifiés génétiquement pour lequel le laboratoire a une très forte expertise dans l'analyse des impacts de molécules environnementales tant sur la physiologie hépatique que sur la physiopathologie testiculaire et les retombées sur la fertilité. Il s'agit ici d'exposition à un mélange de molécules environnementales permettant de développer ce type de pathologies avec une incidence suffisante pour réaliser des études moléculaires et physiologiques donnant des résultats statistiquement fiables. Des femelles seront utilisées pour l'entretien de la colonie et seront mis à mort à 6 mois; Les femelles et mâles qui ne seront pas utilisées ou de génotype sans intérêt pour le projet seront mis à mort après génotypages soit à 30 jours postnataux. Des mâles de génotypes intermediaires seront utlisés pour l'entretien de la colonie. Pour les mâles du génotype d'intérêt, nous utiliserons des souris à 5 jours, 10 jours, 1 mois, 3 mois et 12 mois postnatal pour l'analyse des phénotypes. Ces différents temps d'analyse correspondent à des moments précis où se déroulent des étapes clefs de la mise en place des fonctions testiculaires et hépatiques ainsi que la mise en place et le maintien de la fonction de reproduction.