Système endocrinien

Des souriceaux nouveau-nés reçoivent sous la peau un antagoniste de l'ocytocine qui perturbe leur tétée, puis sont tués deux à trois heures plus tard. 496 souris vont être utilisées dans ce projet sur le syndrome de Prader-Willi, 280 dans des procédures déclarées de souffrance légère et 216 de souffrance modérée, avec séparation des souriceaux de leur mère pendant quatre heures pour standardiser leur motivation à téter. Le porteur qualifie chaque injection de nuisance de moins de trois secondes, sans revenir sur le trouble de la tétée qu'il attend de l'atosiban, et les effectifs annoncés dans son texte, 504 souriceaux et 40 femelles, dépassent les 496 individus déclarés dans le tableau des gravités. Les souriceaux sont tués pour le génotypage et la conservation d'organes, les 40 femelles reproductrices le sont parce qu'elles auront environ huit mois et cinq portées derrière elles.

Objectifs

Ce projet porte sur la compréhension des déficits de tétée chez des souris modèles d’une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW) et le rôle d’une hormone, l’ocytocine (OT), comme effet thérapeutique. En effet, il a été montré que l’ocytocine est impliquée dans l’initiation ou le maintien de l’activité de tétée, qu’il y a un dysfonctionnement de cette activité chez les souris modèles Magel2 et que l’administration d’ocytocine rétablit une activité de tétée normale chez ces souris modèle. Ces études précliniques sur souris modèle ont engendré des essais cliniques chez des bébés atteints du SPW qui ont montré une stimulation de l’activité de tétée en présence d'OT. Des travaux précédents suggèrent enfin que chez la souris, l’effet de l’ocytocine est différent entre la première tétée et les tétées suivantes. Les objectifs de ce projet sont donc de caractériser 1) les déficits physiologiques et comportementaux de tétée chez les souriceaux mutants à la naissance, lors de la première tétée et après la première tétée, 2) comment une tétée normale peut être restaurée chez les souriceaux mutants après une administration exogène d’OT juste après la naissance et 3) comment un antagoniste de l’OT peut perturber la tétée chez des souriceaux contrôles. Dans cette étude, nous utiliserons 40 femelles contrôles qui seront réutilisées 3 voire 4 fois pour générer des portées de souriceaux, à l’aide de 10 mâles contrôle et 10 mâles Magel2 au phénotype contrôle (allèle maternel muté mais silencieux). Au total 504 souriceaux et les 40 femelles adultes seront inclus dans une des 4 procédures expérimentales de ce projet.

Bénéfices attendus

Les 3 objectifs permettront d’identifier les altérations sensorielles ou motrices lors de la tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi chez l'homme (SPW), d’identifier le rôle de l’ocytocine (OT) dans la tétée, d’argumenter l’intérêt d’utiliser l’OT dans le traitement de déficit de succion, de définir les conditions optimales pour traiter les souris modèles du SPW. Cette étude aura des retombées sur le traitement des patients PW.

Procédures

Les injections intrapéritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance malgré la durée très courte de cette intervention (

Impact sur les animaux

Les injections IP d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance (durée inférieure à 3 secondes). Les injections sous cutanée d’ocytocine ou d’atosiban sur souriceaux à P0 et P2, et le tatouage des souriceaux de la procédure 1 à P6 peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance (durée inférieure à 3 secondes). Concernant les injections d’atosiban (antagoniste de l’ocytocine) elles peuvent en plus provoquer une perturbation de la séquence de tétée (latence de saisie de la tétine, intensité et durée de la tétée) sachant que les animaux sont euthanasié 2-3 heures après l’injection.

Devenir

L’ensemble des souriceaux utilisés dans ce projet (procédure 1-2-3) seront euthanasiés car des prélèvements post-mortem seront réalisés pour le génotypage et la conservation d’organes potentiellement impliqués dans les mécanismes d’action de l’ocytocine. Les 40 femelles allaitantes servant de support à l’étude du comportement de tétée des souriceaux seront euthanasiés dans la mesure ou elles auront environ 8 mois en fin d’étude et auront eu déjà 5 portées.

Remplacement

Nous travaillons sur la physiologie et la physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW). Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur des modèles humains dans un cadre thérapeutique et des modèles souris (Magel2) en fonction des questions posées (faisabilité expérimentale) afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients atteints de ces troubles précoces de la succion.

Réduction

L'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance ou à P2. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour ces tests depuis plus de 10 ans, appuyée par des tests de Puissance montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe pour valider la démarche statistique, en particulier pour les variables analysées à l’aide de test paramétrique ou non paramétriques en fonction de la normalité de distribution des données. Une réduction du nombre d’animaux expérimentés sera dépendante des résultats que nous obtiendrons et qui conditionneront l’intérêt ou non de pratiquer les expériences proposées en procédure 3 avec injection l’OT. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée entre P0 et P2) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Le bien-être et la bonne santé des animaux adultes est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (poil hirsute, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation, ou déplacement la pointe des pattes). Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie seront isolés de leur mère pendant 4h (afin de standardiser leur motivation à téter). Pendant les 4 heures de séparation de leur mère les 4 souriceaux seront déposés dans un bac approprié, avec une partie de la litière et du nid de la cage maternelle (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Sachant que seul 4 petits par portée seront testés, la mère reste dans la cage avec n-4 souriceaux (n étant le nombre de nouveau-nés), ce qui permet de diminuer le stress éventuel de la mère. Lors des injections sur les souriceaux à P0 et P2 et lors du tatouage des animaux de la procédure 1 à P6, un antalgique local sera appliquée sur la peau 5 minutes avant le test pour diminuer la sensation de douleur.

Choix des espèces

Cette étude sur les mécanismes neurophysiologiques du comportement de tétée, nécessite d’évaluer des paramètres de comportement de tétée ainsi que des paramètres neuroanatomiques, donc d’étudier des mammifères, mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles d’animaux modèles de maladies rares chez l’homme (ici souris Magel 2 modèle du syndrome Prader-willi chez l’homme). A ce jour, les rongeurs sont les animaux les plus adaptés à ce type d’étude. Nous étudions l’activité de succion des souriceaux le jour de la naissance (P0) avant et après la première tétée pour mesurer d’éventuels troubles de ce comportement chez les animaux mutants, ainsi qu’à P2 puisqu’il a été montré qu’à ce stade, ces animaux sont les plus discriminants et les plus sensibles au contexte sensoriel (ici l’apport d’OT sur les muqueuses faciales) au cours de la tétée. Nous suivons également un lot de souriceaux durant les premiers 10 jours de vie (observation et prise de poids).

Lavages vaginaux quotidiens pendant huit à vingt jours, que le porteur reconnaît "désagréables pour les femelles", inoculations intravaginales sous anesthésie, six prélèvements de sang à la queue, pose d'une puce sous la peau et tests de comportement sexuel répétés jusqu'à huit fois : 6 227 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 3 427 d'entre elles et modéré pour 2 800. 5 227 sont tuées, notamment les femelles dont il faut examiner les ovaires, les embryons et les organes génitaux, et 1 000 mâles sont gardés vivants pour être réutilisés d'un fragment d'anticorps à l'autre. Le projet teste des fragments d'anticorps de camélidés censés contrôler la reproduction sans toucher au comportement sexuel. Le porteur le présente comme mené "à des fins strictement scientifiques", tout en visant des alternatives à la contraception hormonale et des méthodes de synchronisation et de superovulation pour les animaux d'élevage.

Objectifs

Les méthodes actuelles de contrôle de la reproduction (traitements hormonaux, stéroïdes) sont associées à de nombreux effets secondaires, et les molécules utilisées s’accumulent dans l’environnement où elles agissent comme des perturbateurs endocriniens. Par ailleurs, aucune solution thérapeutique n’existe pour la prise en charge des troubles du comportement social, et les contraceptifs peuvent être associés à une diminution de la libido. La prise en charge des patients souffrant de troubles de la reproduction et du comportement, ainsi que la maîtrise de la reproduction des animaux d’élevage, bénéficieraient donc du développement de nouveaux traitements pharmacologiques. Les anticorps monoclonaux représentent une des meilleures promesses thérapeutiques dans le domaine de la reproduction. Les fragments d’anticorps de camélidés (VHH) présentent des caractéristiques uniques : ils ont une durée de vie courte dans le sang, sont dégradables et capables de moduler l’activité des récepteurs, et sont donc une alternative majeure aux composés chimiques et hormones stéroïdiennes. Nous caractérisons in vitro des VHH capables d’activer ou inhiber l’activité de cibles impliquées dans le contrôle de la reproduction et/ou du comportement sexuel localisées dans les gonades : récepteur de l’hormone folliculo-stimulante (FSHR), récepteur de l’hormone lutéinisante (LHR), récepteur des oestrogènes couplé aux protéines G 1 (GPER). Les VHH les plus prometteurs doivent désormais être développés pour un usage in vivo, afin de déterminer leur potentiel thérapeutique. Le projet proposé a pour objet i) de déterminer la pharmacocinétique et pharmacodynamique in vivo de ces fragments d’anticorps, ii) le cas échéant de procéder à une ingénierie de leurs séquences pour leur utilisation in vivo, iii) de déterminer les effets fonctionnels sur la reproduction et le comportement chez la souris de ces nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes, le tout à des fins strictement scientifiques. Le projet a ainsi pour objectif de démontrer la faisabilité de l’utilisation in vivo de VHH pour contrôler et moduler la fonction de reproduction sans affecter le comportement sexuel dans le cadre i) du développement d’alternatives aux méthodes actuelles de contraception, ii) du traitement de troubles de la reproduction, ou iii) du développement d’alternatives aux méthodes de contrôle de la reproduction (synchronisation, induction de l’ovulation, …) utilisées en élevage.

Bénéfices attendus

En cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des troubles de la reproduction, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables, ii) le développement de méthodes de contraception non hormonales qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels, tout en préservant l’environnement de l’accumulation de perturbateurs endocriniens à très longues demi-vies, iii) le développement de nouvelles méthodes non hormonales pour la synchronisation et l’induction de superovulation chez les animaux de rente.

Procédures

- Test d’interaction sociale réciproque : le test d’une durée de 10 minutes sera réalisé à faible intensité lumineuse avec des animaux vigiles. Chaque animal sera soumis 1 fois au test. - Test des trois chambres : le test sera réalisé à faible intensité lumineuse avec des animaux vigiles. Chaque animal sera soumis à 1 session de 10 minutes à J-2, 1 session de 10 minutes à J-1, et 2 sessions de 10 minutes à J0. - Test de comportement sexuel : le test sera réalisé avec des animaux vigiles et aura une durée maximale d’une heure. Selon les animaux, ceux-ci pourront être soumis : i) 3 fois au test à 4 jours d’intervalle, ii) 2 fois au test à 2 semaines d’intervalle, iii) 8 fois au test, ou iv) 1 fois au test. - Pesée : la procédure sera réalisée avec des animaux vigiles et dure moins de 5 minutes par animal. Chaque animal sera soumis à la procédure 1 fois par jour pendant environ 25 jours. - Puçage : la procédure sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, et une injection sous-cutanée d’anesthésique sera réalisée pour réduire la douleur liée à l’incision. Chaque animal sera soumis une seule fois à la procédure. - Lavages vaginaux : la procédure sera réalisée sur animaux vigiles et dure moins de 5 minutes. Chaque animal sera soumis à la procédure 1 fois par jour. Selon les animaux, ceux-ci pourront être soumis à la procédure pendant 16-20 jours ou pendant 8-10 jours. - Injection intrapéritonéale : la procédure sera réalisée sur animaux vigiles et dure moins de 5 minutes. Chaque animal sera soumis 1 fois à la procédure. - Prélèvements sanguins par la queue : la procédure dure moins de 5 minutes et sera réalisée sur animal vigile avec une anesthésie locale. Chaque animal sera soumis 6 fois à la procédure, à 1h, 12h, 2 jours, 5 jours et 7 jours d’intervalle du premier prélèvement. - Inoculation intravaginale : la procédure dure moins de 5 minutes et sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée d’environ 30 minutes. Chaque animal sera soumis 1 fois à la procédure.

Impact sur les animaux

Les injections en intrapéritonéale, en intraveineuse et en sous-cutané ainsi que les prises de sang à la veine caudale peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site. La pose d’une puce RFID sous anesthésie générale peut engendrer une légère douleur au niveau du site de l’incision lors du réveil de l’animal. La contention des animaux génère du stress. Les tests d’interaction sociale peuvent entrainer une certaine agressivité entre les animaux et ces tests comportementaux peuvent être anxiogènes lié à l’environnement nouveau. Les lavages vaginaux sont des actes désagréables pour les femelles.

Devenir

Pour le génotypage et phénotypage des animaux transgéniques, les femelles doivent être euthanasiées pour pouvoir étudier les paramètres embryonnaires ainsi que les gonades et organes accessoires. Les mâles seront également euthanasiés car aucuns animaux de ces génotypes ne seront utilisés par la suite, et nous ne pouvons pas envisager de les replacer étant donné que nous ne connaissons pas à l’avance leur phénotype. Pour la mise au point de l’analyse automatisée des tests de comportement sexuel, les femelles ovariectomisées seront euthanasiées à l’issue de la procédure car elles ne seront pas réutilisées par la suite. Tous les autres animaux seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps (VHH) sur la cyclicité et le comportement sexuel des femelles, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure afin de déterminer si l’oestrus est ovulatoire ou anovulatoire, et pour pouvoir étudier les ovaires (marquage VHH, nombre et taille des follicules, …). Les mâles seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps (VHH) sur la fertilité des femelles, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure afin d’étudier les paramètres embryonnaires, et pour pouvoir peser et étudier les organes accessoires et les ovaires (marquage VHH, nombre et taille des follicules, …). Les mâles seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps sur la mobilité spermatique, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure pour pouvoir étudier les paramètres embryonnaires. Toutefois, si aucune gestation n’est constatée, les femelles seront gardées en vie pour être réutilisées.

Remplacement

Tous les VHH utilisés ont été entièrement développés et caractérisés in vitro, mais aucune étude de reproduction ou de comportement ne peut se réaliser par des approches in vitro, ex vivo ou de modélisation. Ce projet étudie les régulations entre plusieurs fonctions physiologiques et/ou comportementales, qui sont impossibles à reproduire par des méthodes alternatives. La gestation ne peut être mimée in vitro, et l’activité neuronale à l’origine des comportements socio-sexuels est dépendante de l’interconnectivité des neurones, ces phénomènes ne peuvent donc être étudiés que sur des animaux entiers. De plus, la pharmacocinétique (demi-vie dans la circulation sanguine ou temps de résidence dans les organes cibles), la pharmacodynamique (effets des substances injectées sur leur cible), les effets secondaires éventuels et les effets fonctionnels des VHH sur la reproduction ou les comportements ne peuvent être évalués que chez l’animal. Compte tenu de l’ensemble de ces paramètres et de l’absence de méthodes de remplacement in vitro, il est indispensable de recourir à une expérimentation in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé afin de ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. Un effectif de 16 animaux par groupe est ainsi nécessaire. Toutefois, il est indispensable de prendre en compte un certain nombre de facteurs de variabilité pouvant conduire à l’élimination de certains animaux de l’expérience. Ainsi, afin d’assurer un effectif exploitable de 16 animaux par groupe en fin d’expérience, nous avons besoin d’un nombre total de 20 animaux expérimentaux par groupe. De plus, nous avons fait le choix de regrouper certains tests dans une même expérimentation, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour étudier ces paramètres. Enfin, les effectifs décrits correspondent aux effectifs maximaux qui pourraient être utilisés. En effet, dès que cela sera possible, plusieurs aménagements nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les expériences : i) pour les tests de comportement sexuel, les mâles pucés pourront être réutilisés pour les expériences avec différents VHH, ii) pour les femelles ayant reçu une administration intravaginale de VHH, si aucune gestation n’est constatée au bout de 20 jours après mise en présence du mâle, celles-ci seront gardées en vie et réutilisées pour tester d’autres VHH, iii) dès que cela sera possible, plusieurs fragments d’anticorps candidats seront testés en parallèle avec un seul groupe contrôle commun, ce qui permettra de réduire les effectifs totaux des animaux contrôles utilisés. Enfin, concernant les animaux exprimant le transgène FSHR humain, si ceux-ci ne présentaient pas de restauration de la fertilité, aucune expérience ultérieure avec ces animaux ne serait réalisée.

Raffinement

Les expériences sont menées dans les plus courts délais possibles afin de minimiser l’inconfort et le stress des animaux et de les remettre dans leurs cages en présence de leurs congénères. Les animaux sont observés quotidiennement et leur état de bien-être déterminé sur la base de 3 critères : apparence, poids, comportement (critères décisionnels en annexe). Un enrichissement est mis en place dans l’arène utilisée pour les tests de comportement : cabane en plastique rouge, copeaux, biberon, gamelle de croquettes. Des phases d’habituation sont réalisées avant les tests de comportement, qui sont effectués à faible intensité lumineuse pour limiter l’anxiété des animaux. Ces derniers sont transférés dans une salle contigue à la salle de tests comportementaux 1h avant le début des procédures. Avant d’euthanasier des animaux, ceux-ci sont transférés un à un dans la salle dédiée, afin d’éviter une communication d’anxiété entre congénères. Les puces RFID sont insérées sous la peau au moins 1 semaine avant le début des expériences sous anesthésie gazeuse et une anesthésie locale est réalisée pour réduire la douleur liée à l’incision. Pour les tests de cyclicité, nous réalisons de simples lavages au liquide physiologique plutôt que des frottis vaginaux à proprement parler (qui nécessitent l’introduction de petits coton-tiges à l’intérieur du vagin), cette méthode étant suffisante à la réalisation des objectifs scientifiques tout en limitant l’inconfort des animaux. Une anesthésie locale est réalisée pour les prélèvements de sang ainsi qu’en cas d’injections répétées des fragments d’anticorps. Les administrations intravaginales d’anticorps seront réalisées sous anesthésie générale de courte durée et les animaux sont placés sur un tapis chauffant au cours de la procédure. Les animaux sont soigneusement examinés jusqu’à leur réveil total et contrôlés 2 fois par jour après l’opération pendant 15 jours, pour détecter tout signe de douleur ou d’infection. En cas de signes, le responsable du bien-être animal serait immédiatement informé et les animaux traités. Si le traitement ne fonctionnait pas dans les 24 heures, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. L’hébergement des femelles gestantes sera enrichi avec des cotons de ouate. Lors de l’introduction des mâles avec les femelles, nous surveillons l’absence de comportements agressifs pendant 1 heure puis quotidiennement. En cas d’agressivité du mâle envers les femelles, celui-ci serait remplacé.

Choix des espèces

La souris est une espèce sociale qui se reproduit bien et vite, dont la physiologie de la reproduction est bien caractérisée, et qui présente de façon innée des comportements socio-sexuels bien décrits. Cette espèce permet la génération d’animaux modèles transgéniques (souris « humanisées » pour une cible dans le cas présent), approches qui ne sont pas ou que peu possibles sur d’autres espèces. Par ailleurs, à l’heure actuelle seules des petites quantités de VHH sont produites au laboratoire, compatibles uniquement avec une utilisation in vivo chez la souris. Les études seront réalisées chez l’animal adulte (à partir de 7 semaines), les animaux devant avoir passé la puberté pour pouvoir étudier leurs paramètres reproducteurs et comportements sexuels.

Ovariectomie ou orchidectomie, pose d'un implant hormonal sous la peau, jeûne de vingt-quatre heures et jusqu'à huit prélèvements de sang à la queue espacés de quinze à trente minutes : 1 298 souris subissent ces actes, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'objectif déclaré est de mesurer ce que le vieillissement, l'obésité et la carence en œstrogènes font aux cellules qui tapissent l'aorte et les vaisseaux du tissu adipeux. Les bénéfices annoncés glissent de la biologie vasculaire à la discrimination au travail, à la stigmatisation et à une "société plus solidaire et équitable pour les femmes". Le porteur conclut que l'expérimentation animale est "l'unique approche" possible, sans indiquer comment l'effectif de 1 298 a été établi ni combien de souris subissent chacune de ces interventions.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès à l'échelle mondiale, touchant aussi bien les hommes que les femmes, avec un risque accru chez ces dernières après la ménopause. Les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins situées à l’interface entre le sang et les tissus sont en première ligne face aux altérations métaboliques associées aux facteurs de risque cardiovasculaire : le vieillissement, l'obésité et la carence en œstrogènes (ménopause) chez la femme. Ce projet a pour objectifs de définir 1) les impacts des facteurs de risque cardiovasculaire sur l’endothélium, 2) le rôle des dysfonctions endothéliales dans l’étiologie des pathologies cardiovasculaires dans deux lits vasculaires : l’aorte et les vaisseaux du tissu adipeux.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de proposer la cellule endothéliale comme une cible précoce pour limiter le développement des maladies cardiovasculaires, en particulier chez la femme au moment de la ménopause. En plus d'améliorer la santé des femmes, notamment en ce qui concerne les risques cardiovasculaires, l'optimisation du traitement de la ménopause aura un impact positif sur les problèmes sociaux liés à cette période de transition. Actuellement, de nombreuses femmes n'optent pas pour une hormonothérapie en raison des préoccupations liées aux effets secondaires. Le développement d'un traitement plus sûr (présentant moins de risques cardiovasculaires et thromboemboliques) contribuera à alléger les contraintes physiques et émotionnelles, ainsi que les problèmes sociaux associés à la ménopause, tels que la discrimination au travail et la stigmatisation. Améliorer la qualité de vie des femmes en période de ménopause contribuera à une société plus solidaire et équitable pour les femmes.

Procédures

Certains animaux seront soumis à des interventions de classes légère à modérée. - Chirurgie de classe modérée : ovariectomie ou orchidectomie (incision de la peau et du péritoine) (10 à 20min) - Chirurgie de classe modérée : pose de pellet hormonal en sous cutanée (incision de la peau) (5 à 10min) - Prélèvements d’une goutte de sang à la veine caudale : maximum 1 fois 8 prélèvements espacés de 15 à 30 minutes (2 secondes par prélèvement) - Mise à jeûn, classe modérée (24h).

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives indolores (pesée, régime riche en lipides) ou de classe modérée (jeûne, ovariectomie, orchidectomie, pose de pellet). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Régime riche en lipides peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements - Prélèvement à la veine caudale peut générer du stress et une douleur légère - Mise à jeun peut entrainer du stress - Ovariectomie/Orchidectomie/pose de pellet peut générer une douleur mais qui sera traitée par un analgésique.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

L'utilisation du modèle murin nous permettra d'identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le système vasculaire qui surviennent avec le régime alimentaire et la prise de poids. Les prélèvements humains représentent un point fixe de l'état individuel et ne permettent pas de contrôler l'historique de perte et/ou gain de poids et ne permet pas une comparaison directe des cellules endothéliales et du tissus adipeux. Aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire des variations hormonales qu'auront à subir les cellules endothéliales et ceci d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires endothéliales « perdent » l’expression du récepteur des oestrogènes. De plus l'étude de l'effet du sexe (via la sécrétion d'hormones stéroïdiennes : œstrogène et testostérone) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant la réalisation de ce projet.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, plusieurs procédures expérimentales de classe légère puis modérée seront réalisées sur les mêmes groupes d’animaux dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général et dans la mesure où les procédures ne peuvent pas interférer entre elles.

Raffinement

Lors de leur arrivée en zone expérimentale les souris resteront en acclimatation pendant un minimum d'une semaine en présence d'enrichissement (de type sizzlenest, battons ou balle en bois) pour réduire le stress qui pourrait être causé par le transport. Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge par le personnel de la zootechnie compétent qui vérifiera leur état et bien-être. Les animaux issus de différentes cages de transport ne sont jamais mélangés dans les cages d’hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié par dislocation cervicale. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) seront surveillés permettant de mettre en application l’arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d’arrêt des souffrances. Pour l’ensemble des chirurgies, les animaux sont gardés sur plaque chauffante pendant toute la procédure jusqu'à leur réveil. Un analgésique (morphinique) sera administré. En post opératoire, les souris sont surveillées et pesées. En cas d'amaigrissement excessif (>20%) ou de signe de souffrance de l'animal (apathie, yeux fermés, absence de toilettage, prostration, blessure), l’animal sera sorti de la procédure et euthanasié.

Choix des espèces

Mus musculus . La souris est un modèle reconnu dans l’étude du métabolisme et de l’obésité. Nourrie en alimentation riche en gras, elle développe des anomalies similaires à celles associées au syndrome métabolique chez l’Homme. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisé après 8 semaines.