Système endocrinien
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Maintien d’une lignée à phénotype dommageable à visée de recherche sur la thématique des rôles physiopathologiques de Slc20a2/PiT2 chez la souris et caractérisation par génotypage invasif.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour entretenir une lignée génétiquement modifiée et la génotyper par prélèvement d'un morceau de queue. La modification génétique tue environ la moitié des souriceaux mutants à la naissance, pour des raisons que le porteur déclare mal connues, et les adultes présentent un retard de croissance, une altération de la mémoire spatiale et des calcifications des vaisseaux du cerveau. Le porteur affirme malgré tout que leur état général n'est pas altéré et qu'elles vivent normalement. Aucune souris n'est tuée au terme de ce projet, les hétérozygotes renouvelant les reproducteurs tous les six à huit mois et les autres partant vers des procédures expérimentales, et le porteur indique qu'étudier la régulation du phosphate et du calcium "nécessite" de travailler sur l'"organisme entier".
Objectifs
L’objectif est de maintenir l’élevage de notre lignée de souris génétiquement modifiée à phénotype dommeable et de caractériser génétiquement cette dernière via une méthode de génotypage invasif. La production de ces animaux est nécessaire pour nos projets de recherche la compréhension des rôles et des mécanismes d’action d'une protéine dans des pathologies associées à des défauts de régulation des lipides (obésité, par exemple) ou des anomalies de calcifications des vaisseaux.
Bénéfices attendus
Cette lignée permet d’obtenir une lignée unique qui a déjà permis de révéler des rôles non soupçonnés de notre protéine d'intérêt dans différents tissus. Les bénéfices du projet sont attendus à la fois dans le domaine de la recherche fondamentale et dans le domaine médical. Nos projets utilisant cette lignée de souris génétiquement modifiées permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette protéine en physiopathologie, et permettra ainsi de proposer cette protéine comme cible potentielle pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le génotypage quant à lui, permet la caractérisation génétique de la lignée pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques.
Procédures
Une biopsie de queue est réalisée une fois dans la vie de l’animal pour déterminer son génotype.
Impact sur les animaux
A cause de la modification génétique, un taux de mortalité d’environ 50% des souriceaux mutants est observé au moment de la naissance. Les raisons de la mort des souriceaux sont mal connues. Les souris mutantes adultes présentent un retard de croissance, une altération de la mémoire spatiale et des calcifications vasculaires cérébrales. Cependant, leur état général (respiration, pelage et locomotion non modifiés, pas de tremblements, pas de prostration, prise de nourriture et de boisson normale) n'est pas altéré et ces souris vivent normalement. Pour le génotypage, la biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal.
Devenir
Les souris hétérozygotes seront gardées pour renouveler les reproducteurs. Les souris mutantes et souris non génétiquement modifiées sont gardées pour les procédures expérimentales. Les reproducteurs sont renouvelés tous les 6-8 mois.
Remplacement
Nos projets de recherche visent à comprendre le rôle d’une protéine multifonctionnelle, notamment connue pour transporter du phosphate du milieu extracellulaire vers l’intérieur de la cellule. La régulation de l’homéostasie phosphocalcique est une composante importante pour notre problématique ce qui nécessite de travailler sur l’organisme entier.
Réduction
La production des animaux est en lien avec le nombre d'animaux prévu au sein de chaque projet. Le schéma d'accouplement en trio permet l'obtention d'animaux en continu, il est adapté aux besoins afin de limiter la génération de souriceaux non inclus. L'utilisation de tous les animaux sans distinction de sexe permet de limiter les animaux non utilisés et augmenter les reproductions.
Raffinement
La biopsie de queue est réalisée lors du baguage sous anesthésie générale brève. Cette méthode est approuvée, précise, rapide et standardisée, ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur. Le phénotype dommageable est pris en charge par un suivi clinique accrue de la naissance au sevrage des animaux.
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques associés à des défaut du métabolisme des lipides ou à l’apparition de calcifications dans les vaisseaux. Nos projets de recherche sont basés sur l'étude de souris génétiquement modifiées. Les animaux sont utilisés pour le maintien de l’élevage et pour générer des lots expérimentaux. Nous utilisons des animaux mâles et femelles sexuellement matures (entre 6-8 semaines).
Dosages biologiques de gonadotropines humaine (hFSH) et équine (eCG) chez la ratte
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Injectées une fois puis tuées trois jours plus tard pour peser leurs ovaires et leur utérus, 1 200 jeunes rattes de vingt à vingt-trois jours sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ce dosage biologique suit les protocoles des pharmacopées, que le projet dit précisément vouloir remplacer par un test sur lignée cellulaire, ce qui n'empêche pas de programmer vingt expérimentations de soixante animaux sur quatre ans. Le porteur indique que les rattes arrivent juste après le sevrage, sans semaine d'habituation, parce qu'elles produiraient sinon leurs propres gonadotropines et deviendraient inutilisables pour le dosage. Il compte parmi les bénéfices attendus l'arrêt des prélèvements de grands volumes de sang sur des juments gestantes, qu'il qualifie d'"évident bénéfice éthique".
Objectifs
Dans les deux projets , nous sommes amenés à réaliser des dosages biologiques des gonadotropines équines et humaines. Un but commun dans ces deux programmes est de remplacer les dosages in vivo de la pharmacopée par des dosages biologiques in-vitro, extrèmement sensibles et spécifiques, sur une lignée cellulaire établie, bien décrite et facilement disponible.
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu est de réduire, voire éventuellement de remplacer, les dosages in vivo sur rattes des gonadotropines eCG/PMSG et FSH par des dosages biologiques in vitro sur une lignée cellulaire. Le second bénéfice, par le développement de eCG recombinantes monocaténaires originales (produites en cultures de cellules) est de diminuer ou même de cesser les prélèvements de grands volumes de sang sur des juments gestantes (évident bénéfice éthique). En outre, la production de gonadotropines recombinantes, permettra d’améliorer leurs propriétés physicochimiques et biologiques, plus faciles à exprimer efficacement et à purifier .Ces bénéfices seront donc d’abord éthiques par la réduction, puis éventuellement le remplacement, des dosages in vivo des gonadotropines par des dosages sur lignées cellulaires. Ces bénéfices seront aussi financiers si l’on considère les coûts 1/ des tests in vivo sur rattes par rapport à ceux sur lignées cellulaires et ceux 2/ de la purification en une seule étape des gonadotropines recombinantes par rapport à celles des gonadotropines naturelles provenant des juments gestantes. Ces bénéfices , enfin, seront aussi techniques grâce aux propriétés mieux choisies et mieux contrôlables des hormones recombinantes par rapport aux gonadotropines naturelles.
Procédures
Dans la grande majorité de nos dosages (gonadotropines à longue demi-vie dans la circulation sanguine), il n’y aura qu’une seule injection à J1 puis l’euthanasie / nécropsie à J4. Aucune intervention ni prélèvement dans l’intervalle. Très exceptionnellement, nous pourrions être amenés à tester une gonadotropine à courte demi-vie et devoir pratiquer deux injections supplémentaires à J2 et J3. Chaque injection ne dure que quelques secondes entre la prise de l’animal et son retour dans la cage avec ses congénères
Impact sur les animaux
Les injections en sous cutanée peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection ainsi qu’un éventuel œdème et la ou les différentes contentions peuvent entrainer du stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après la stimulation gonadotrope à fin de nécropsie pour prélever les ovaires et utérus qui seront pesés et, occasionnellement, caractérisés plus finement en microscopie.
Remplacement
Le but du premier projet est justement , à terme, de pouvoir remplacer les rattes utilisées dans les protocoles recommandés par les pharmacopées (internationale et européenne) par le dosage in vitro sur lignées cellulaires. A cette fin, un certain nombre d'expérimentations en parallèle sont indispensables pour corréler les deux dosages entre eux en introduisant le facteur d'encombrement moléculaire des hormones qui détermine leur demi-vie dans la circulation sanguine.
Réduction
Nous avons prévu, au cours des quatre ans des deux projets, 20 expérimentations de 60 animaux chacun. De manière générale, les 60 animaux par expérimentation se décomposent de la manière suivante: 3 produits x 4 doses x 5 réplicats/dose. Pour réduire le nombre d'animaux, nous dosons au moins deux produits ensemble contre une même gamme de référence et utilisons seulement 5 réplicats / dose au lieu de 7 dans les pharmacopées. Nous suivons ce protocole depuis des années et les calculs d'activités par parallel line assay (PLA) sont statistiquement solides dans ces conditions. Le second projet porte sur le design et la production de nouvelles gonadotropines recombinantes originales dont l’activité biologique in vivo doit être définie avant transfert chez les animaux de rente (saisine complémentaire chez la brebis). Ces 20 expérimentations sur 4 ans sont vraiment un minimum que nous ne dépasserons pas pour l’ensemble des deux projets. D’autant plus que le premier a précisément pour but de ne plus requérir à l’avenir ces dosages in vivo. Par ailleurs, le second projet bénéficiera des avancées du premier et permettra en cas de réussite, de remplacer l’hormone naturelle par des copies recombinantes obtenues en cultures de cellules et ainsi ne plus saigner de juments gravides. Ces 20 expérimentations sur 4 ans sont vraiment un minimum que nous ne dépasserons pas pour l’ensemble des deux projets sachant que le premier a, en outre, pour but de se passer à l’avenir de ces dosages in vivo.
Raffinement
Les animaux ne séjournent que quatre jours (mardi à vendredi) dans l'animalerie et bénéficient d'un environnement enrichi. Néanmoins, comme lors de nos précédentes demandes, nous ne pouvons pas avoir une semaine d'habituation avant expérimentation. En effet, les rattes doivent être sevrées et encore immatures (20-23 jours) . Or la puberté intervient vers 28-30 jours. Comme les animaux nous sont livrés juste après sevrage, les rattes produiraient leurs gonadotropines endogènes pendant cette période et seraient inutilisables pour nos dosages. L'acquisition de portées avec leur mère conduirait à sacrifier inutilement les mères ainsi que les mâles de la portée (ce qui, évidemment, va à l'encontre de notre but de sacrifier un nombre le plus réduit possible d'animaux). Concernant le stress/angoisse des animaux, nous avons l’habitude de les manipuler avec douceur et ils ne manifestent aucun signe de peur. Le milieu est enrichi et permet aux jeunes rattes de s’entasser dans leur nid (tube carton).
Choix des espèces
Les rattes immatures de 20-23 jours sont les animaux tests de la pharmacopée pour les dosages des gonadotropines car les ovaires de ces animaux y sont sensibles mais les animaux ne produisent pas encore de gonadotropines endogènes (seulement à J28-30 environ).
Impact de l’exposition aux nanoparticules de plastiques et adjuvants phtalates sur les troubles du comportement alimentaire et la perception sensorielle et nociception chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
Exposées de façon prolongée à des nanoparticules de polystyrène et à des phtalates, 3 336 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le protocole prévoit 72 heures en cage métabolique individuelle, 48 heures en cage d'observation, des tests d'anxiété en espace ouvert éclairé et sur surface surélevée, des mesures de seuils de sensibilité par stimulations thermiques chaudes ou froides et par stimulations mécaniques, une injection de carragénine dans la patte pour provoquer une inflammation cutanée, et pour certaines une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur attend chez les groupes exposés des troubles du comportement alimentaire, de l'anxiété et des hyperalgies de type fibromyalgie, et ouvre la même rubrique par la phrase "ce projet obéit à la règle des 3R". Il précise retenir des polluants "dont les effets sont avérés" sur la santé humaine et animale, ce qui situe l'apport attendu du côté des mécanismes plutôt que de la démonstration du danger.
Objectifs
Les matières plastiques sont omniprésentes dans notre environnement. Quand ils ne sont pas éliminés ou recyclés correctement, les plastiques perdurent dans l’environnement pendant des années car ils ne sont pas biodégradables. Ils se décomposent alors en particules de micro et nanoplastiques (respectivement inférieures à 5 et 0,1 µm) qui sont des sources de pollution environnementale. Cette forme de pollution a atteint un niveau record en Méditerranée où la concentration de plastique y est quatre fois plus élevée que dans "l'île de plastique" du Pacifique Nord. La Méditerranée représente 1% des eaux marines du globe mais abrite 7% de tous les microplastiques. Par ailleurs, les plastiques libèrent des additifs plastifiants (bisphénol A, phtalates, etc.) dans l'environnement dont les effets nocifs pour les animaux et les humains sont bien documentés. Les mesures récentes réalisées pour Santé Public France montrent que ces polluants sont présents dans l’organisme de l’ensemble des adultes et des enfants, avec des niveaux d’imprégnation plus élevés chez les enfants. Les phtalates sont des perturbateurs endocriniens et métaboliques, et des reprotoxiques, pour lesquels des effets néfastes sur l'asthme chez l'enfant, l'obésité juvénile et le diabète de type 2, les TDAH, et chez l'adulte sur l'endométriose, l'infertilité, ainsi que sur le développement neurologique ont été documentés. Les enquêtes épidémiologiques montrent une forte incidence de neuropathologies centrales, périphériques ou autonomes, chez les professionnels exposées. Si le diagnostique est clair, les mécanismes neurobiologiques impliqués sont inconnus. Il a été montré que les nanoplastiques traversent la barrière hématoencéphalique et provoquent un stress oxydatif dans le système nerveux. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en évidence que l’exposition prolongée aux nano et microplastiques et adjuvants phtalates affecte les profils inflammatoires systémiques et induit une neuroinflammation dans les régions du système nerveux central impliquées dans la réponse au stress, l’anxiété et la prise alimentaire (hypothalamus, amygdale et hippocampe), et le système nerveux périphérique impliqué dans la nociception et la réponse autonome (ganglion sensoriels de la corne dorsale de la moelle épinière et ganglions autonomes), et que cette réponse neuroinflammatoire impacte le comportement animal en comparaison à des animaux sains non exposés.
Bénéfices attendus
Cette étude présente un intérêt translationnelle car il est clairement démontré que l’exposition aux particules de plastiques et aux adjuvants de phtalates, polluants environnementaux d'origine anthropique, affectent la santé humaine. L'étude apportera des connaissances sur l'impact de ces polluants sur la santé mentale et les comorbidités neuronales. Elle permettra de comprendre les mécanismes neurobiologiques fondamentaux responsables des effets toxiques de ces polluants. A ce titre, les connaissances acquises sur les animaux seront applicables pour les études sur la santé humaine et éclaireront les agences responsables de la définition des normes environnementales et industrielles pour la santé humaine.
Procédures
Le métabolisme des souris est mesuré dans des cages métaboliques individuelles pendant 72heures. L’activité spontanée des souris est mesurée dans des cages d'observation individuelles pendant 48heures. La mesure est répétée pour 3 stades de développement après la naissance. La répartition des masses grasses et maigres tissulaires est mesurée sous anesthésie générale gazeuse, pendant 5 minutes. Pour les souris engagées dans l’étude de l’anxiété, 3 tests sont réalisées d’une durée respective de 20, 20 et 30 minutes. Chaque souris subie ces 3 tests à 3 périodes de développement après la naissance. Pour l’étude de la sensibilité au toucher des souris, le seuil de sensibilité mécanique cutanée est mesuré par 2 tests réalisés dans des boxes individuels en plexiglas transparent d’une durée totale approximative d’1h. Le seuil de la sensibilité cutanée à la température est mesuré par des tests d’exposition à des stimulations thermiques chaudes ou froides. Les stimuli sont calibrés pour un délai moyen de réponse de l’animal de 10 secondes. Le temps maximum d’exposition au stimulus de température est de 30 secondes. Pour certains tests, les souris subissent une période d'habituation de 4 jours. Les souris qui subissent la perfusion intracardiaque sont sous anesthésie générale avec un anesthésique et un antalgique injectable. Elles sont perfusées par la circulation générale avec le tampon de rinçage et le fixateur pendant environs 30 min.
Impact sur les animaux
Ce projet obéit à la rège des 3R. Toutefois, il est attendu que lors de l'exposition prolongée aux nanoparticules de plastiques de polystyrène et phtalates, les animaux des groupes tests pourraient développer des troubles métaboliques et du comportement (troubles du comportement alimentaire, perturbation du métabolisme glucidique, stress et anxiété, hyperalgie nociceptives et inflammatoires, hyperalgies généralisées de type fibromyalgie), en comparaison aux groupes témoins. Les effets indésirables sont évalués par des tests de comportements qui visent à en observer l’apparition et en mesurer l’intensité : Stress-anxiété : exposition à des situations anxiogènes, à savoir, déplacement dans un espace ouvert éclairé ou sur une surface surélevée. Hyperalgie nociceptives : mesure des seuils de sensibilité thermique et mécanique par l’exposition à des stimuli thermiques chauds ou froids ou mécaniques jusqu’au seuil de réponse des animaux. Hyperalgie inflammatoire : la nuisance est une réaction inflammatoire cutanée (œdème et chaleur) au niveau de la patte après injection de carragénine. Métabolisme glucidique : hypo- ou hyperglycémie transitoire provoquée par l’injection d’insuline ou de glucose.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses biologiques.
Remplacement
L'étude et la veille bibliographiques permanente de la littérature scientifique abondante sur le sujet nous permettent de choisir les polluants dont les effets sont avérés sur les organismes pour la santé humaine et animale. En parallèle, les études préliminaires sur des cultures cellulaires in vitro, menées dans un laboratoire du consortium européen Horizon Europe-MSCA-Staff Exchange-2022 Psycomed (cité précédemment) et en collaboration avec les équipes du projet PLASTICHEAL financé par l’union européen, sont réalisées pour définir le choix et les quantités des matériaux plastiques et phtalates qui seront utilisées sur les animaux. L’étude de l’impact des polluants micro-nanoplastiques et adjuvant phtalate sur la santé et le comportement (prise alimentaire, proprioception et nociception), impliquant possiblement des effets pro-inflammatoires et de perturbateurs endocriniens, affecte simultanément plusieurs organes (les organes périphériques : foie, tissus adipeux, tube digestif, pancréas, tissus lymphoïdes, les glandes endocrines, la peau) et les systèmes nerveux centraux et périphériques responsables des comportements de prise alimentaire, proprioception, nociception et réponses autonomes. De plus, l'effet des polluants dépend de leurs voies de pénétration dans l'organisme (per os ou volatil). Il est par conséquent impossible aujourd'hui de pouvoir réaliser notre étude d'impact des polluants autrement que dans un contexte in vivo global. Le développement des effets sur la santé psychique et neurologique (stress-anxiété, prise alimentaire, proprioception, nociception et autonome) fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car il n'est pas modélisable in vitro pour l'instant.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables (basé sur nos expériences et un calcul statistique pour trouver un effet significatif). Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu’elle soit normale ou non. En cas de distribution normale, nous utiliserons des tests paramétriques. En cas de distribution non normale, nous utiliserons des tests non-paramétriques, même si ceux-ci sont moins sensibles. Un nombre minimum d'animaux sera utilisé dans nos procédures expérimentales en respectant strictement ces différents points: (i) Utilisation d’un groupe de souris contrôles commun pour plusieurs séries d'études chaque fois que cela est possible. (ii) multi-prélèvements et création d’une base d’échantillons (cerveau et sang après sacrifice).
Raffinement
Les animaux, en provenance d’élevages accrédités, seront hébergés dans une animalerie certifiée, dans des cages sur portoirs, avec nourriture et boisson ad libitum, dans le respect des règles d’hébergement en vigueurs (respect du nombre d’animaux par cage, condition de vie dans les cages…). Avant expérimentation, les souris seront acclimatées pendant plus d’une semaine durant lesquelles les expérimentateurs les habitueront à être manipulées, pour réduire toutes formes de stress au cours des expérimentations. Les souris sont suivies quotidiennement. A partir du début de l’expérience, les animaux seront pesés 2 fois par semaine afin de suivre leur prise de poids. Les expérimentateurs évalueront aussi l’état général des souris quotidiennement afin de déterminer la présence ou non de signes de souffrances excessives (comportement d’isolement, attitude soumise, dos voûté, respiration difficile, extrémités pâles, démarche anormale, diarrhée, vocalises, agressivité…). En cas de souffrance, les animaux seront traités selon la sévérité du comportement observé et en cas où les signes de souffrance persisteraient, les animaux seront euthanasiés. Une fiche d'observation longitudinale et une grille d'évaluation de l'état de nos souris ont été établies. Nous utiliserons des souris mâles et femelles. Notre étude présente un intérêt translationnelle, étant donné que l’exposition aux plastiques polluants environnementaux affecte les humains, il est donc nécessaire de mesurer les effets des molécules étudiées sur les deux sexes. Par ailleurs, il est bien documenté que mâles et femelles peuvent avoir des différences notables dans la réponse inflammatoire et leur sensibilité aux polluants environnementaux
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études précliniques et en recherche fondamentale pour analyser la relation entre l'exposition à des substances potentiellement toxiques et les effets sur le métabolisme, les états inflammatoires et le comportement des animaux. La proche similitude du patrimoine génétique de la souris avec l'homme nous permet dans la mesure du possible de tirer des conclusions extrapolables pour la santé humaine, dans une étude au potentiel translationnel important.
Rôle de PAR2 dans la régulation du métabolisme du fer lors d’un stress érythroïde
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales sur animal vigile en contention, une prise de sang sous anesthésie, une irradiation, et pour certaines l'ablation de la rate, afin d'explorer le rôle d'un récepteur nommé PAR2 dans la régulation du fer lors d'une anémie. Le porteur affirme qu'aucune méthode informatique ni aucune expérience en laboratoire ne peut imiter l'équilibre du fer dans l'organisme, et conclut qu'il est "nécessaire" de recourir à l'expérimentation animale. Il énumère par ailleurs les "cinq libertés fondamentales" de l'Organisation mondiale de la santé animale, dont celle d'exprimer les comportements naturels, dans un protocole qui prévoit irradiation et ablation de la rate.
Objectifs
Le fer est un élément essentiel pour notre santé, présent notamment dans nos globules rouges sous forme d'hémoglobine. Lorsque nous avons besoin de produire plus de globules rouges, comme en cas d'anémie, il est crucial d'apporter rapidement du fer supplémentaire à notre corps. Un mécanisme de régulation, contrôlé par une hormone appelée hepcidine, joue un rôle important dans cette gestion du fer dans notre organisme. Toutefois, certains aspects de cette régulation ne sont pas encore bien compris, notamment lorsque l'anémie persiste au-delà des premières 24 heures ou en cas d'anémie chronique. C'est là que notre projet de recherche intervient. Nous avons remarqué, chez des souris, que l'absence d'un récepteur nommé PAR2 (Protease-Activated Receptor-2) semble empêcher la diminution de l'hepcidine en cas d'anémie. Le récepteur PAR2 est un acteur clé dans la communication entre les cellules en réponse à différents stimuli, et il joue un rôle dans la régulation de divers processus physiologiques, dont l'inflammation, la douleur et la coagulation. Notre objectif est donc d'explorer un nouveau rôle potentiel de ce récepteur dans la régulation du fer pendant une anémie. Pour atteindre notre but, nous cherchons à identifier les types de cellules spécifiques responsables de cette régulation et à comprendre les mécanismes de signalisation impliqués. En résumé, notre projet de recherche vise à mieux comprendre comment le fer est régulé pendant une anémie en étudiant le rôle potentiel du récepteur PAR2. En identifiant les cellules et les voies de signalisation impliquées, nous espérons contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation du fer, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les troubles liés à son métabolisme.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait représenter une avancée majeure en démontrant, pour la première fois, un rôle de PAR2 dans la régulation de l'hepcidine et du métabolisme du fer. En clair, il aiderait à comprendre comment le corps contrôle la production d'une protéine appelée hepcidine quand la production de globules rouges est altérée par des facteurs génétiques ou environnementaux. Si le projet réussit, il ouvrirait la voie à de nouvelles stratégies de traitement pour des maladies chroniques et ceci répondrait à un besoin crucial en santé publique, car de nouvelles options thérapeutiques sont nécessaires pour ces maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions selon les procédures : - injection intra-péritonéale de molécules ou véhicules sur des animaux vigiles en contention manuelle (durée du geste 30 secondes/souris). - prélèvement sanguin unique sous anesthésie gazeuse (durée du geste 1 min/souris). - irradiation (durée du geste 3 min d’irradiation + 5 minutes de préparation). - ablation de la rate sous anesthésie (durée maximale du geste 20 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les souris utilisées pour ce projet sont connues comme étant viables et fertiles, et elles ne présentent généralement pas d'effets indésirables en conditions normales. Toutefois, il est important de noter que toute manipulation expérimentale, les prélèvements sanguins, l'administration de substances ainsi que l'anesthésie, peut entraîner des effets temporaires ou transitoires sur les animaux. Ces procédures peuvent causer du stress et une légère douleur, ce qui peut altérer le comportement des souris. Lors des chirurgies, une attention particulière sera accordée à la réduction de la douleur post-chirurgicale chez les souris. L'utilisation d'analgésiques dont l'efficacité et la toxicité ont été évaluées grâce à des données expérimentales sera privilégiée. Tout au long de l'étude, des précautions seront prises pour minimiser tout inconfort ou détresse pouvant être associé à ces procédures. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux grâce à un entrainement pour les rendre à l'aise avec les gestes techniques, les supports de contention ou les appareils utilisés pendant l'expérience.
Devenir
À la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélever divers organes. Ceci vise à approfondir notre compréhension sur la régulation du fer et de l'hepcidine lorsqu'il y a une altération dans la production de globules rouges due à des facteurs génétiques ou environnementaux. L'étude se concentrera particulièrement sur le rôle potentiel du récepteur PAR2.
Remplacement
À l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode informatique, aucune expérience en laboratoire, ni aucune simulation qui puisse vraiment imiter tous les détails de maintien de l’équilibre du fer dans notre corps. Ces méthodes ne peuvent pas représenter de manière correcte ce qui se passe quand les cellules rouges du sang subissent des contraintes, en tenant compte de la façon dont différents organes interagissent et des nombreuses substances chimiques impliquées. À cause de ces limites, il est nécessaire de recourir à l'expérimentation animale pour évaluer l'efficacité de nouveaux médicaments.
Réduction
Nous avons optimisé nos procédures pour réduire le nombre d'animaux nécessaires dans nos expériences, tout en tenant compte de la variabilité interindividuelle des animaux. Pour garantir une validité statistique, nous employons un outil de calcul de la taille d'échantillon pour dimensionner nos groupes de manière à obtenir des résultats significatifs. De plus, dans le but de minimiser le nombre d'animaux utilisés, nous prévoyons de prélever un maximum de tissus qui seront stockés de deux manières différentes. Tout d'abord, certains échantillons seront conservés à une température de -80°C, ce qui permettra de préserver leur intégrité pour des analyses ultérieures de biologie moléculaire. D'autres échantillons seront préparés spécialement pour des analyses microscopiques. Cette approche nous permettra d'effectuer des analyses supplémentaires sans avoir besoin de répéter les expériences in vivo, contribuant ainsi à réduire le nombre d'animaux nécessaires pour la recherche. Ces stratégies sont mises en place pour optimiser l'utilisation des animaux, tout en respectant les exigences expérimentales et éthiques, afin de progresser dans la recherche tout en veillant au bien-être des animaux utilisés.
Raffinement
Dans le souci de respecter la directive européenne 2010/63/UE, nous avons mis en œuvre des mesures d'enrichissement destinées à améliorer le bien-être des animaux. Ces mesures comprennent la fourniture de matériaux tels que des bûchettes de bois, du coton et des igloos, favorisant ainsi leur comportement naturel de rongeur et de nidification. À la fin de chaque expérience, une étude rétrospective sera réalisée pour évaluer les possibilités de réduire le nombre d'animaux utilisés et/ou d'améliorer les procédures afin de minimiser la souffrance animale. Pendant toute la durée de l'expérimentation, l'état général des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être. Des indicateurs physiques et comportementaux prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal, comportements stéréotypés) seront évalués et renseignés dans une grille d'évaluation des points limites. Si un animal atteint l'un des points limites, la procédure sera arrêtée afin de prévenir toute détresse supplémentaire et l’animal sera mis à mort. Les personnes responsables du projet ont reçu une formation spécifique à l'utilisation des animaux à des fins scientifiques. Elles assurent la formation et l'encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L'apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont consignés dans les livrets de compétences des personnes concernées, garantissant ainsi une utilisation responsable et éthique des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal couramment utilisé dans la recherche, car elle permet de reproduire différentes pathologies humaines, y compris les problèmes liés au métabolisme du fer. Elle présente de nombreux avantages pratiques, tels que des coûts relativement faibles, un cycle de reproduction court et une facilité de manipulation, de transport et de logement dans des installations dédiées à la recherche. Dans notre projet, nous utilisons des souris génétiquement modifiées qui sont essentielles pour atteindre nos objectifs spécifiques. Aucune autre espèce animale ne présente les caractéristiques génétiques nécessaires pour mener à bien nos expériences. L'utilisation de la souris nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de régulation du fer et d'évaluer de nouvelles approches thérapeutiques dans ce domaine. Dans notre projet de recherche, nous avons choisi d'utiliser des souris âgées de 8 à 16 semaines. Nous nous assurons ainsi d'avoir des animaux dans leur "âge adulte" avec un développement physique et des niveaux hormonaux équilibrés. Cela nous permet de minimiser les variations individuelles et les influences liées à l'âge, et d'obtenir des résultats plus fiables, cohérents et significatifs pour nos études.
Evaluation de phénotype dommageable lors de la création par croisement ou de la réception de lignées de souris sur le plateau d’élevage. Elevage de lignées de souris génétiquement modifiées.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
122 000 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage de lignées génétiquement modifiées, 12 000 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'activité déclarée tient en une biopsie d'oreille pour génotypage et en la surveillance des lignées dont la modification génétique altère la santé, par exemple par une susceptibilité accrue aux tumeurs. Environ 107 800 souris seront tuées, 12 200 gardées pour la reproduction et 2 000 réutilisées, le porteur indiquant que les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort quand aucun autre projet ne peut les prendre. Sur les 122 000 déclarées, la très grande majorité n'existe donc que pour faire naître les quelques individus porteurs du bon génotype.
Objectifs
Il s'agit de définir et de détecter des lignées de souris pouvant altérer leur bien-être dans un élevage de souris génétiquement modifiées et de produire des souris génétiquement modifiées nécessitant une caractérisation génétique.
Bénéfices attendus
Ceci permet de produire et de maintenir des lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à des projets de recherche en raffinant les techniques d'élevage de ces lignées. Ceci permet à la fois de détecter et de prendre en charge l'apparition de caractères dommageables. Ce projet permet d'anticiper la prise en charge des signes nécessitant des soins et de permettre une réaction immédiate en cas d'apparition de ces signes.
Procédures
Identification et prélèvements pour caractérisation des souris (moins d'une minute). Biopsie pour génotypage qui concerne les souris du projet. Conditions d'élevage spécifique des modèles adaptés en fonction de l'évaluation de l'impact du modèle sur le bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés au caractère dommageable des lignées entretenues : par exemple, une susceptibilité plus grande à l'apparition de tumeurs... La biopsie pour génotypage qui sera faite à l’oreille.
Devenir
Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures expérimentales dans d'autres établissements utilisateurs ou peuvent servir en tant que reproducteur. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux sont soit utilisés pour d’autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs quand c’est possible, soit euthanasiés s’il n’y a pas de possibilité de les utiliser dans d’autres procédures.
Remplacement
Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques).
Réduction
La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire (d'une part pour l'évaluation du phénotype dommageable et d'autre part la production de lots expérimentaux). La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc).
Raffinement
Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des signes attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (frisottis, batonnet de coton, maison en carton si besoin, mise à disposition si besoin de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière, etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions sanitairess sont élevées afin de réduire le risque de caractère dommageable lié au statut sanitaire. La biopsie pour le génotypage se fait à l'oreille.
Choix des espèces
Souris, car on peut facilement créer et produire de nouveaux modèles pour répondre à une question scientifique. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.
Rôle des sous-populations de macrophages dans l’homéostasie et l’adaptation métabolique du tissu adipeux brun chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Soumises à des séries de gavages, d'injections dans l'abdomen, de jeûnes de douze heures et d'expositions au froid, 5 240 souris seront toutes tuées pour prélever leur tissu adipeux brun, dont 2 160 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Certains protocoles cumulent sur le même animal douze semaines de régime gras, vingt-six gavages, deux injections et vingt prélèvements sanguins. Le porteur indique que l'insuline peut provoquer une hypoglycémie et le froid une hypothermie allant jusqu'à la perte du réflexe de redressement et la prostration. Il affirme qu'aucune autre espèce ne peut être utilisée, la souris permettant d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses.
Objectifs
Il existe deux types de graisse corporelle (tissu adipeux) chez les mammifères : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun, dont les rôles sont différents. Le tissu adipeux blanc stocke les calories en excès sous forme de graisses et constitue la principale réserve d’énergie de l’organisme. Le tissu adipeux brun, au contraire, est spécialisé dans la dépense énergétique : il brûle les graisses et le sucre en produisant de la chaleur. Ce phénomène permet ainsi de maintenir la température corporelle lors de l’exposition au froid mais aussi de réguler la quantité de graisses et de sucre dans l’organisme. L’activation du tissu adipeux brun a donc émergé comme une stratégie thérapeutique pour lutter contre les maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète. En plus des cellules adipeuses, le tissu adipeux contient aussi de nombreuses cellules immunitaires, dont certaines s’appellent macrophages. Alors que le rôle des macrophages dans le tissu adipeux blanc est largement étudié, leur rôle dans le tissu adipeux brun est mal connu. Ce projet a pour objectif de comprendre le rôle des différentes populations de macrophages présentes dans le tissu adipeux brun dans la régulation de son activité métabolique et le développement de l’obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre comment les macrophages du tissu adipeux brun régulent le métabolisme énergétique. Cela pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour brûler les graisses et le sucre et lutter contre les maladies métaboliques comme l'obésité et le diabète.
Procédures
Les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : - 2 gavages + 1 prélèvement sanguin - régime spécial pendant 2 semaines + 1 prélèvement sanguin - 2 injections intrapéritonéales + 1 prélèvement sanguin - 2 gavages + 2 injections intrapéritonéales + 1 prélèvement sanguin - régime spécial pendant maximum 3 semaines + 2 injections intrapéritonéales + 1 prélèvement sanguin - 3 injections intrapéritonéales + exposition de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 3 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 2 gavages + 3 injections intrapéritonéales + exposition de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin ou régime spécial pendant 2 semaines + 6 injections intrapéritonéales + exposition de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 2 gavages + 3 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin ou régime spécial pendant 2 semaines + 6 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 1 semaine de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 12 semaines de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 2 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h + 20 prélèvements sanguins - 1 semaine de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 4 gavages + 1 prélèvement sanguin - 12 semaines de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 26 gavages + 2 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h + 20 prélèvements sanguins - 12 semaines de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 17 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h + 20 prélèvements sanguins - 12 semaines de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 10 gavages + 2 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h + 20 prélèvements sanguins
Impact sur les animaux
La contention pour effectuer les injections intrapéritonéales, gavages et prélèvements sanguins peut entraîner un stress. Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales répétées et une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. L’utilisation d’un régime spécial peut entrainer une perte de poids transitoire. La mise à jeun entraine une perte de poids. Le régime riche en graisses entraîne une prise de poids. L’injection d’insuline peut provoquer une hypoglycémie. L’exposition au froid peut entrainer une hypothermie. Une hypothermie sévère peut s’accompagner d’une perte du réflexe de redressement, d’une prostration ou d’une léthargie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le tissu adipeux brun dans le but de l'analyser in vitro pour répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Pour comprendre la diversité, l’origine et les fonctions des macrophages du tissu adipeux brun, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux brun.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons pour les élevages des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. De plus, nous utiliserons indifféremment les souris mâles et femelles dans certaines procédures. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous utiliserons des aiguilles très fines et nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement l’aspect des sites d’injections. Le suivi sanitaire quotidien assuré par le personnel de l’animalerie et les visites régulières par les personnes participant au projet (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et la déplétion spécifique des différentes populations de macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. L’ensemble des procédures se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 7 semaines).
Impact de l’imprégnation oestrogénique sur le système endocrinien chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Cathétérisés à l'oreille sur animal vigile puis tués par surdose d'anesthésique, 100 lapins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, leurs organes prélevés après la mort. Ils appartiennent à une lignée génétiquement modifiée privée d'oestrogènes, entretenue pour mesurer l'effet de ces hormones sur l'hypophyse, la thyroïde et les surrénales. Le porteur écrit qu'aucune habituation à la boîte de contention n'est prévue puisque la procédure n'a lieu qu'une seule fois, et attribue la douleur à la pose du cathéter sur animal éveillé. Il affirme qu'aucune stratégie de remplacement n'est possible, aucun système de culture ne reproduisant selon lui l'équilibre hormonal d'un mammifère.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer l’impact des œstrogènes sur le système de sécrétion interne d’hormones dans sa globalité (hormones produites par l’hypophyse, la thyroïde, et les surrénales). Cet objectif est rendu possible grâce à l’existence d’une lignée de lapin génétiquement modifiée déjà établie pour laquelle les animaux génétiquement modifiés sont dépourvus d’œstrogènes
Bénéfices attendus
Il est connu que les œstrogènes (hormones sexuelles) ont un effet global sur de nombreux paramètres physiologiques chez la femme (humeur, comportement, métabolisme, solidité osseuse, santé…etc). La majorité de ces effets fait penser à un dérèglement hormonal général, n’impliquant pas seulement les ovaires mais également les sécrétions hormonales d’autres glandes. Les attendus espérés du projet sont de mieux évaluer le rôle des œstrogènes sur la fonction endocrine globale de l’individu.
Procédures
Tous les lapins auront la pose d’un cathéter veineux auriculaire (1 seule fois, le temps de pose du cathéter est compris entre 30 secondes et 1 minute maximum) afin de leur injecter un anticoagulant (animaux vigiles) (1 seule fois, temps d’injection 10 secondes). Ils seront ensuite sédatés (1 seule fois, temps d’injection 10 secondes) avant d’être euthanasiés par surdose d’anesthésique (1 seule fois, temps d’injection compris entre 20 à 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés principalement à la pose du cathéter veineux (douleur liée à la pose du cathéter en vigile), au léger stress lié au transport entre l’élevage et le bâtiment où est pratiqué la pose du cathéter, et au positionnement de l’animal dans la boîte de contention. Dans une moindre mesure, ils peuvent résulter des injections (via le cathéter veineux) des produits vétérinaires pour éviter la coagulation et tranquilliser l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organes/tissus.
Remplacement
Aucune stratégie de remplacement n’est possible sur ce projet. En effet, à notre connaissance il n’existe aucun système de culture de différents organes complexes, comme les glandes productrices d’hormones, susceptible de reproduire in vitro l’équilibre hormonal d’un mammifère.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Cependant, le nombre d’animaux impliqués sera revu à la baisse tout au long de l’acquisition des résultats. Si, lors d’une première expérience impliquant une vingtaine d’animaux, nous ne voyions pas d’effet de l’absence des hormones sexuelles sur les autres glandes productrices d’hormones, les investigations seront arrêtées. Dans le cas contraire, 20 animaux sont requis par année supplémentaire afin d’analyser les glandes endocrines de 4 groupes de lapins. Cinq animaux par génotype et par sexe sont requis pour obtenir des résultats robustes.
Raffinement
Une injection de tranquillisant sera réalisée avant l’euthanasie afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance ou l’angoisse. Par ailleurs, les animaux sont hébergés dans la lapinerie où les conditions d’élevage sont optimisées (boisson et nourriture à volonté, enrichissement du milieu). Aucune procédure d’habituation des animaux au placement en boîte de contention n’est envisagée étant donné que la procédure expérimentale n’aura lieu qu’une seule fois. Des points limites adaptés seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le lapin car d’une part, nous avons montré que le lapin représente un meilleur modèle que les rongeurs en ce qui concerne la production de ces hormones et d’autre part, nous possédons une lignée de lapin dépourvus d’œstrogènes qui est à la base de ce projet. Les animaux choisis pour l'étude seront des adultes âgés de 6 mois à 2 ans, car le projet se concentre sur l'imprégnation hormonale post-pubertaire.
Evaluation des effets comportementaux de perturbateurs endocriniens chez le poisson-zèbre.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 860 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 500 d'entre eux et modéré pour 360. Le résumé annonce une série de sept tests comportementaux et un test de nage spontanée sans nommer lesquels, et prévoit un isolement en bac individuel pendant cinq jours pour conserver l'identité de chaque poisson. Les 360 individus exposés à un perturbateur endocrinien entre le quatorzième et le vingt-huitième jour de vie sont tués parce que le traitement chimique interdit de les réemployer, les autres pour des analyses moléculaires. Le porteur affirme qu'aucun effet délétère n'est attendu sur la survie ou la croissance, tout en reconnaissant que la molécule testée pourrait entraîner des effets modérés encore non décrits sur leur bien-être.
Objectifs
Le projet vise à 1) évaluer les conséquences à court et long-terme d’une exposition précoce à divers perturbateurs endocriniens et à 2) élucider le rôle de la perturbation d'une protéine impliquée dans la synthèse des oestrogènes dans le cerveau (l’aromatase cérébrale) dans ces effets. L’ambition globale du projet est d’apporter des connaissances essentielles au développement d’une stratégie permettant l’évaluation systématique et efficace du risque posé par les perturbateurs endocriniens neurotoxiques.
Bénéfices attendus
L’ambition globale du projet est d’apporter des connaissances essentielles au développement d’une stratégie permettant l’évaluation systématique et efficace du risque posé par les perturbateurs endocriniens neurotoxiques.
Procédures
Les individus inclus dans la procédure 1 subiront des tests comportementaux non-invasifs. Trois (3) lots distincts de poissons subiront à 3 mois, 12 mois ou 24 mois une série de 7 tests comportementaux non-invasifs. Quatre (4) lots d'individus différents subiront un test comportemental de nage spontanée (non-invasif) à 2, 3, 4 ou 5 mois (pour un total de 144 individus). Lors de la procédure 2, une partie de l'effectif (soit 360 individus) est soumise à une exposition à un produit chimique pouvant entraîner des modification de l'activité de nage et du stress. Ces expositions sont restreintes dans le temps (entre 14 jours et 28 jours de vie). Ensuite, l'ensemble de l'effectif (soit 960 poissons) est soumis à un test comportemental de nage spontanée (non-invasif).
Impact sur les animaux
Aucun effet délétère n'est attendu sur la survie ou la croissance des animaux. Des effets pourront être observés concernant les aptitudes comportementales (e.g. niveau d'activité de nage, capacités d'apprentissage) des individus. Une partie des poissons (360 individus) seront exposés à une molécule connue pour interférer avec la différenciation sexuelle du poisson-zèbre à forte concentration. La concentration testée est relativement faible et sélectionnée sur la base d’effets non-léthaux. Cependant, il est possible qu’elle entraîne des effets modérés encore non-décrits sur le bien-être des poissons, qui sera quotidiennement surveillé afin d’anticiper toute souffrance qui entraînera l’arrêt de l’expérimentation.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les individus sont euthanasiés pour prélèvements et analyses moléculaires ultérieures. A l'issue de la procédure 2, les individus sont euthanasiés. En effet ils ne peuvent être réemployés dans la mesure où ils ont été soumis à un traitement chimique.
Remplacement
La substitution par des modèles non-animaux et/ou des stades non-protégés n’est pas envisageable dans la mesure où nous faisons des analyses comportementales complexes seulement caractérisables chez l’adulte.
Réduction
Les effectifs ont été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour assurer une puissance de détection suffisante des effets escomptés (15 traitements différents au plus). Le sexe des individus sera intégré aux analyses et celles-ci requièrent 15 mâles et 15 femelles par traitement pour les tests comportementaux, excepté pour l’analyse du comportement de groupe qui requiert un total de 54 poissons (18 poissons par réplicat) et ainsi conditionne le nombre maximal de poissons utilisés. En estimant un risque de perte avant la fin de manipulation autour de 10%, nous allons donc utiliser au plus 900 poissons-zèbres pour la procédure 1. Suivant un raisonnement similaire, les expériences de la procédure 2 utiliseront 960 poissons-zèbres. L’analyse des résultats se fera grâce à des tests statistiques appropriés pour mettre en évidence des effets biologiques des traitements testés. D’une façon générale, un soin a été apporté afin d’utiliser les mêmes individus pour l’étude des différents traits comportementaux ainsi que pour les prélèvements à fins d’analyses moléculaires.
Raffinement
Les individus, élevés en groupe dans des structures adaptées à l’espèce, sont observés trois fois par jour lors du nourrissage, ainsi l’atteinte d’un des points limites fixés est identifié de manière précoce. Le poisson est ensuite immédiatement isolé en bac individuel. Si son état ne s’améliore pas dans un délai de 24 h, l’individu est euthanasié à l’aide d’une surdose d’anesthésiant par balnéation. Pendant les expériences menées pour l’étude des aptitudes comportementales, les individus sont gardés en bacs individuels pendant 5 jours afin de pouvoir conserver leur identité. Le stress qui pourrait être provoqué par l’isolement est réduit par la mise en place d’un contact visuel de proximité entre les poissons.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre, un modèle en écotoxicologie et à la base de plusieurs lignes directrices européennes en matière d’évaluation du risque environnemental lié aux polluants, est caractérisé par une reproduction non-saisonnière, une bonne fécondité et par des cycles de vie courts (3-4 mois) qui permettent d’aborder aisément la question des effets à long-terme après exposition embryonnaire. Les différents traits de son comportement ont été également bien caractérisés. Les expériences seront menées à différents stades de développement (larves, juvéniles, jeunes et vieux adultes) afin de pouvoir suivre l'évolution des différences comportementales selon l'âge de l'individu dans la mesure où des résultats préliminaires nous suggèrent une forte dépendance de ces différences en fonction du développement.
Développement d’une méthode de quantification d’acides gras par spectrométrie de masse chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tués avant tout réveil après un prélèvement de liquide céphalorachidien sous anesthésie, 70 rats servent à mettre au point une méthode de dosage des acides gras par spectrométrie de masse. Le projet ne teste aucun traitement et ne porte sur aucune maladie, il cale une technique analytique sur des organes et des fluides prélevés après la mort, foie, colon, sang, cerveau, urines et fèces. Le porteur indique que la même méthode pourra ensuite être appliquée à des prélèvements humains, et retient comme seule nuisance déclarée le stress du transport vers la salle de chirurgie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace "l'animal entier" et conclut que le recours aux rats est "indispensable".
Objectifs
Le projet présenté est un projet de développement technologique qui permet de quantifier des petites molécules dans n’importe quel type de prélèvement. L’objectif est de développer une méthode de quantification des acides gras (courte, moyenne et longues chaînes) dans plusieurs organes ou tissus du rat afin de réaliser une cartographie de ces derniers et permettre de visualiser les échanges en acides gras entre ces tissus. La méthode sera utilisée pour la différentiation de rats sains et pathologiques ou la recherche de biomarqueurs. Les acides gras sont impliqués dans de nombreux métabolismes mais aussi dans de nombreuses pathologies : (i) inflammatoires, particulièrement du système digestif ; (ii) des maladies neurodégénératives, telle que Alzheimer ; (iii) des troubles du spectre de l’autisme. La principale source d’acides gras est l’alimentation. Du système digestif, les acides gras passent par la veine cave pour être distribués aux différents compartiments biologiques tels que le foie, le sang, les muscles, le cerveau. Les acides gras à courte chaîne réagissent avec des récepteurs et sont impliqués dans la communication entre intestin (microbiote intestinal) et cerveau. Les acides gras sont déjà très étudiés mais les études se cantonnent à quelques tissus. La plus-value de ce projet est d’apporter une méthode de quantification des acides gras dans les fèces, l’urine, le foie, le colon, le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le cerveau avec une unique gamme de calibration, permettant des analyses sur différents tissus au cours d’un même examen. La méthode d’extraction des acides gras sera optimisée et spécifique à chaque tissu. L’objet de ce document est de formaliser le prélèvement des différents tissus.
Bénéfices attendus
L’objectif est de visualiser et quantifier les acides gras dans l’ensemble du corps, de leurs productions jusqu’à leurs transformations. Une fois cette méthodologie testée sur des rats, elle pourra être appliquée dans des modèles animaux pour mieux comprendre le rôle des acides gras dans la physiopathologie de maladies notamment cérébrales. La même méthodologie pourra aussi être appliquée sur des prélèvements humains pour explorer le rôle potentiel d’acides gras en tant que biomarqueurs de maladies (diagnostic, évolution, effets de thérapeutiques…).
Procédures
Prélèvement du Liquide céphalo rachidien sous anesthésie gazeuse : 1 fois pendant 3 min.
Impact sur les animaux
Nous ne pouvons pas exclure que les animaux présentent un stress lors du transport vers la salle de chirurgie et du temps de latence avant induction de l’anesthésie, même si l’habituation est censée minimiser tout stress dans ce contexte.
Devenir
Tous les animaux seront euthaniasiés à l'issue du projet. Les organes seront prélevés afin de réaliser des études in-vitro.
Remplacement
Chez l’humain, aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, et ne permet d’étudier la biodistribution des acides gras dans tous les organes d'un individu. De plus, les échantillons humains disponibles de manière non-invasive sont limités aux fèces, à l’urine et de manière invasive au sérum et au LCR. Dans ce contexte, le recours à l'animal est indispensable.
Réduction
L’objectif de ce travail est notamment de pouvoir comparer les quantités des différents métabolites dans les matrices explorées, ainsi que la comparaison des concentrations de chaque métabolite en fonction du sexe par matrice. Les données seront donc analysées par des stastitiques . La mise au point de la quantification sur les différentes matrices nécessite de travailler sur des pools d’animaux pour appliquer différentes méthodes sur un même échantillon. Selon les quantités nécessaires dépendant de chaque matrice, un groupe additionnel de n=10 animaux par sexe sera utilisé. L’effectif global pour ce projet est de n=35 par groupe soit 70 animaux.
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle de chirurgie pour diminuer le stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison et/ ou tube en plastique). Les rats seront observés une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort. L’induction d’anesthésie et le maintien sera réalisée en gazeux. L’animal sera maintenu sur un tapis chauffant durant toute l’expérimentation. Il recevra une préparation avant le prélèvement: rasage des poils, désinfection et nettoyage de la peau et protection oculaire. Nous assurons une surveillance accrue du rythme respiratoire et de la température corporelle.
Choix des espèces
L’objectif est de développer une méthode de quantification des acides gras afin de réaliser une cartographie et visualiser leurs évolutions pour être utilisé dans la recherche de biomarqueurs. Le rat est une espèce globalement très utilisée en recherche fondamentale et a effectivement déjà été utilisé dans ce contexte. Le choix du rat vs la souris est aussi motivé par leur différence de taille et l’accessibilité à des quantités d’échantillons par animal plus importante. Le rat est l’espèce la plus adaptée pour cette étude. Nous utiliserons des rats adultes pour réaliser les différentes dissections et prélever les fluides biologiques pour avoir suffisamment de données avant le dosage des acides gras.
Perception du goût sucré et régulation du métabolisme glucidique via le système gustatif et le cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont mises à jeun 12 à 15 heures avant chaque test pour être motivées à boire des solutions sucrées, reçoivent une solution sur la langue sous anesthésie générale, et pour un groupe une chirurgie stéréotaxique du cerveau suivie d'une semaine d'hébergement isolé. Le porteur détaille les tests, accès bref à sept solutions sucrées, consommation libre pendant vingt minutes, et test de tolérance au glucose avec cinq prélèvements de sang à la queue. Il rattache le projet à l'obésité et au diabète, tout en renvoyant les applications thérapeutiques à un "plus long terme".
Objectifs
Les informations sensorielles provenant de la bouche sont essentielles pour reconnaitre les sources de nutriments dans l’environnement et déclencher leur consommation. Or, la détection et la consommation de nourriture contenant du glucose est indispensable à la survie car ce nutriment est une source d’énergie primordiale pour le corps. Cependant, les mécanismes dans le système gustatif spécifiquement impliqués dans la détection du glucose et la différenciation avec les autres composants sucrés (fructose, autres sucres, …) ne sont pas encore compris. De plus, l’ingestion orale de glucose induit une production rapide d’insuline au début du repas, avant même que les taux de glucose sanguin augmente. Cette réponse anticipée est appelée phase céphalique de sécrétion d’insuline (PCSI), et permet une meilleure tolérance au glucose. Cette PCSI est médiée par le nerf gustatif depuis le système du goût, mais les mécanismes responsables de la PCSI dans le système du goût ne sont pas définis. L’information sucrée perçue dans le système gustatif est transmise dans les régions postérieures du cerveau, d’où le signal est ensuite distribué dans des circuits cérébraux spécifiques qui déterminent la perception du goût, la motivation à consommer ou non l’aliment, et/ou les réflexes physiologiques nécessaires pour préparer le corps à l’arrivée de cet aliment. Or, comment l’information provenant de différents composants sucrés (le glucose, le fructose, …) est traitée dans le cerveau pour induire une réponse spécifique à chaque composant est mal compris. Le but de ce projet sera donc 1) de mieux comprendre les mécanismes impliqués spécifiquement dans la perception sensorielle du glucose et la régulation de la glycémie au niveau du système gustatif, et 2) comment l’information sucrée est traitée au niveau cérébral. De plus, des différences entre les mâles et les femelles en ce qui concerne la perception gustative, la motivation et la prise alimentaire, ont été observées dans la littérature. Par exemple, les femelles ont une sensibilité différente de celle des mâles à l’égard de certains goûts. Le dernier objectif de ce projet sera donc d’analyser 3) d’éventuels effets du sexe sur les résultats obtenus.
Bénéfices attendus
Le glucose est un nutriment important pour l’être humain. A court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment ce dernier est spécifiquement détecté et sa consommation régulée au niveau du système du goût, et comment l’information est traitée au niveau du cerveau. Il permettra également de mieux comprendre les différences entre les mâles et les femelles dans les comportements ingestifs. De plus, l’évolution rapide de nos sociétés modernes vers un accès facilité à des aliments transformés riches en sucres ajoutés est l’un des déterminants majeurs de l’émergence dans le monde de l’obésité et du diabète. Ces résultats sont donc importants pour permettre sur un plus long terme le développement de moyens thérapeutiques plus ciblés et plus efficaces contre l’obésité/diabète, ayant moins d’effets indésirables. Ils sont également importants pour les décisions sociétales et politiques concernant l’utilisation des sucres ajoutés dans l’alimentation et leurs effets indésirables sur la santé humaine.
Procédures
1er groupe de souris (durée maximale 5 semaines) : Protocole diminuant l’expression d’une protéine d’intérêt dans le système du goût (mise à jeun alimentaire/hydrique d’1 heure, anesthésie générale, application sans incision d’une solution sur la langue à l’aide d’une pipette) puis souris soumises deux fois (différents stimuli) à un des trois tests comportementaux (A : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures pour motiver l’animal à consommer les solutions, 4 fois pour l’entrainement ; 2 fois pour les tests puis accès bref à 7 solutions sucrées, 10 secondes par solution, pendant 20 minutes ; B : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures, 2 fois pour l’entrainement ; 2 fois pour les tests puis accès à une solution sucrée pendant 20 minutes ; C : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures, 3 fois pour l’entrainement ; mise à jeun alimentaire de 6 heures, 2 fois pour les tests de tolérance au glucose : consommation de glucose 5 minutes puis prélèvements de sang à la queue 5 fois une minute) puis souris mise à mort par injection d’euthanasiant chimique. 2ème groupe (durée maximale 2 semaines) : Prélèvement des cerveaux après consommation de solutions sucrées : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures pour motiver l’animal à consommer les solutions (2 fois pour l’entrainement ; 1 fois pour le test), mises à jeun hydrique/alimentaire d’1 heure (1 fois avant le protocole de diminution d’expression linguale décrit groupe 1, 1 fois après le test), mise à mort par perfusion intracardiaque sur animal profondément anesthésié. 3ème groupe (durée maximale 12 semaines) : Chirurgie stéréotaxique (1 heure par animal), surveillance post-opératoire d’une semaine avec hébergement individuel et injections d’analgésique, puis souris soumises deux fois à chacun des trois tests comportementaux (même interventions que précédemment décrites groupe 1), puis mise à mort dérogatoire par perfusion intracardiaque sur animal profondément anesthésié.
Impact sur les animaux
Les effets sur les animaux seront : - un stress (maximum une journée) au réveil de l’anesthésie générale effectuée pour l’application sur la langue de la solution induisant une diminution d’expression de la molécule d’intérêt, - une douleur locale et passagère (maximum 5 minutes) lors des injections systémiques ainsi que lors de prélèvements sanguins, - un stress et une douleur locale post-opératoire (en moyenne trois jours) après l’anesthésie générale et la procédure chirurgicale au niveau du cerveau, - un léger risque d’hémorragie ou d’infection du site chirurgical les jours suivants la chirurgie, - un stress chronique lors de l’hébergement individuel des animaux suite à la chirurgie stéréotaxique (maximum une semaine), - un stress chronique et une perte de poids à chaque mise à jeun alimentaire des animaux lors des tests comportementaux (maximum 15 heures chacune).
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort et les tissus et organes seront prélevés pour analyses histologiques ou moléculaires. En effet, suite au protocole d’infusion linguale ou d’injection au niveau cérébral, il est nécessaire de vérifier la localisation correcte et l’effet sur le tissu/l’organe, pour pouvoir les associer aux modifications comportementales observées. D’autres tissus/organes seront également prélevés pour analyser des variations potentielles dans l’expression de diverses molécules d’intérêt liées à la régulation du glucose ou de la prise alimentaire.
Remplacement
La vérification du rôle précis de la protéine d’intérêt présente dans le système gustatif dans la consommation alimentaire et le métabolisme glucidique, ainsi que l’analyse du traitement de l’information au niveau cérébral, ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants. La motivation à consommer des aliments ainsi que la régulation du métabolisme impliquent une communication entre différents organes. Il n’existe pas actuellement de modèle de substitution permettant d’étudier les dialogues inter-organes. Ce projet sera donc réalisé chez la souris, modèle de référence pour les études métaboliques et de physiologie alimentaire.
Réduction
Le nombre optimal d’animaux, c’est-à-dire nécessaire à l’obtention de résultats significatifs sans être trop élevé, est calculé grâce à des analyses de puissance statistique. Différents tests statistiques seront ensuite utilisés pour analyser les différences significatives entre les groupes expérimentaux. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux sont utilisés pour différents tests comportementaux après une période de repos et de récupération.
Raffinement
Dès la réception des animaux à l’animalerie, tout est mis en place pour réduire leur stress et inconfort. A leur arrivée, une semaine d’acclimatation au nouvel environnement et personnel, sans expérimentation, sera observée. Les animaux seront hébergés dans un environnement avec taux d’humidité et température contrôlés, en cycle jour-nuit 12h-12h. Ils seront élevés en environnement enrichi grâce à des dômes de nidation et carré de coton, et seront répartis à quatre par cage sauf lorsqu’un isolement sera nécessaire. Dans ce cas, pour réduire le stress les animaux bénéficieront d’un enrichissement supplémentaire dans leur cage d’hébergement. Un suivi quotidien par le personnel compétent sera effectué. Les animaux seront manipulés régulièrement par les expérimentateurs dans le but de réduire le stress. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés pour s’assurer de l’état de santé des animaux. Les différentes manipulations seront réalisées par du personnel compétent, conformément à la législation. Lors des prélèvements de sang, la douleur des animaux sera diminuée grâce à l’application locale d’un analgésique, suivi après le prélèvement d’une désinfection à la bétadine. Lors des interventions chirurgicales, une anesthésie générale et une analgésie appropriée seront fournies. Les souris seront gardées sur un coussin chauffant et surveillée jusqu’à leur réveil complet. Un suivi post-opératoire de minimum trois jours sera effectué, avec ajout d’analgésique chaque jour, et il sera prolongé jusqu’à une semaine si l’animal n’a pas atteint son état pré-opératoire. A la fin des expériences, les animaux seront mis à mort. Tout au long des expérimentations, si un animal présente un comportement anormal (perte de poids, prostration, piloérection, activité ralentie, …), il sera surveillé avec attention et retiré de l’étude. Si son état clinique ne s’améliore pas dans les 2 jours, il sera mis à mort.
Choix des espèces
Les résultats préliminaires obtenus ainsi que les données bibliographiques dans ce domaine d’étude sont pour la grande majorité réalisés avec le modèle souris. Afin d’éviter la duplication inutile de travaux déjà publiés, et de pouvoir effectuer des comparaisons avec les travaux précédents, il est important de continuer sur des modèles similaires. Des souris âgées de 9 semaines à leur arrivée à l’animalerie seront utilisées dans ce projet de recherche. Cela correspond au stade de l’état jeune adulte, la maturité sexuelle est atteinte par les deux sexes. Il n’y aura pas d’effet confondant sur les résultats dû au développement du système du goût ou du système nerveux central lors de la phase juvénile et adolescente de la souris.
Effet d’une molécule sur le poids corporel et la prise alimentaire de souris nourries avec un régime hyperlipidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes tuées pour prélèvement du foie, du coeur et des tissus gras, 84 souris rendues obèses par un régime hyperlipidique sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées tous les deux à cinq jours pendant quatre semaines, puis une imagerie de composition corporelle sous anesthésie. Le projet teste les doses d'une molécule censée réduire la prise alimentaire, en préparation d'un essai clinique. Le porteur note que l'efficacité de cette molécule a "déjà été validée" par ses collaborateurs américains, ce qui interroge la nécessité de cette série supplémentaire.
Objectifs
L'obésité morbide est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, des concentrations élevées en lipides dans le sang et les maladies hépatiques. Le développement de nouvelles molécules susceptibles de réguler la prise alimentaire est actuellement en plein essor. L’objectif de ce projet est de tester différentes doses et différentes fréquences d’administration d’une nouvelle molécule pharmaceutique d’intérêt.
Bénéfices attendus
Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets et le mode d’administration de nouvelles molécules affectant la prise alimentaire nous permettra de préparer la mise en place d’une étude clinique de phase 1 et à terme une meilleure prise en charge des patients obèses.
Procédures
Les souris vigiles recevront une injection sous cutanée tous les 2 ou 5 jours pendant 4 semaines. Les souris seront pesées chaque jour pendant 28 jours. A jour 28, une acquisition d’images d'une durée de 30 à 40 minutes sera réalisée sur animaux anesthésiés pour déterminer le pourcentage corporel en masse grasse et masse maigre.
Impact sur les animaux
Le protocole est modéré, il comporte des injections sous cutanées tous les 2 ou 5 jours, des prises de poids et une analyse non invasive terminale de mesure de composition corporelle. Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs néanmoins une surveillance appuyée des sites d'injections sera réalisé pour s'assurer de la bonne tolérance de la molécule.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de l'expérimentation afin de récolter le foie, le coeur et les tissus adipeux gonadaux et sous cutanées.
Remplacement
Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux. il est à noter que l'efficacité de la molécule a déja été validée par nos collaborateurs américains via une étude pilote réalisée in vitro et in vivo.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Le calcul d’effectif a été défini à l'aide d'un logiciel dédié.
Raffinement
Enfin, les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les animaux seront hébergés 4 par cage dans un environnement sain. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton. Afin de limiter les souffrances expérimentales, une surveillance attentive et quotidienne des animaux sera réalisée au cours de la procédure. Des signes cliniques définissant les points limites ont été fixés au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser de manière intégrée les mécanismes de régulation de l'homéostasie énergétique. Nous utiliserons des souris à l’âge adulte, le début du protocole se fera sur des souris âgées de 8 semaines. Nous maitrisons un modèle de souris sauvages rendues obèses par un régime hyperlipidique.
Etude de la tumorigenèse hépatique à l’aide de modèles murins: 1/3
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
2 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de queue, des injections d'anti-oestrogènes et de virus, un traitement par anticorps tous les trois jours pendant deux mois et des échographies répétées, pour étudier le développement de tumeurs du foie, une partie étant mise à mort faute de génotype d'intérêt. Le porteur indique qu'une encéphalopathie peut toucher jusqu'à 25 % des animaux et que le transport entre établissements est source de stress. Il affirme développer en parallèle des cultures en trois dimensions pour limiter le nombre d'animaux.
Objectifs
«Notre équipe s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais 70% des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques dans nos modèles murins. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie. Ce projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
En aidant à la compréhension des mécanismes associés au développement et à la réponse aux traitements des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements ciblant le système immunitaire émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.
Procédures
1) identification des animaux par tatouage ou puces et biopsie de queue pour génotypage des souris sur animaux vigiles en 1minute (EU1 et EU2) 2) Injection intrapéritonéale unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles en 30s (EU2), 3) Injection intraveineuse unique de virus sous anesthésie générale en 30s (EU2), 4) traitement par anticorps tous les 3 jours par injection intrapéritonéale sur animaux vigiles en 30s pendant 2 mois maximum (EU3), 5) échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne /souris-EU3), 6) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s (EU3)
Impact sur les animaux
une encéphalopathie peut être observée au maximum chez 25% des animaux selon les expériences trois semaines après modification génique . Au cours des expériences, la mise à mort des animaux ayant atteint les points limites peut conduire à des animaux isolés dans les cages pouvant engendrer du stress. Les injections rétrorbitaires et prélèvements sanguins au cours du traitement ciblant le système immunitaire ou au moment de la mise à mort sont des actes stressants. La numérotation et le génotypage des souris induit stress et douleur légère. Le transport des animaux entre centres pourra induire un stress aux animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet est mis à mort pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs. Une partie des animaux sont euthanasiés car sans génotype d'intérêt pour le projet.
Remplacement
Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. Notre projet vise à développer des cultures cellulaires en trois dimensions limitant le nombre de souris utilisées pour tester de nouvelles pistes thérapeutiques.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. Nous suivons le développement des tumeurs pour l'ensemble des animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Les tests statistiques utilisés sont des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise et limité grâce au suivi échographique des animaux. Nous souhaitons aussi réaliser des cultures in vitro de tumeurs en trois dimensions qui nous permettront à terme de tester de nouveaux médicaments.
Raffinement
Nous suivons le développement des tumeurs sous anesthésie générale dans un centre d’échographies expert, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral et évite la souffrance due à un développement tumoral important. Nous connaissons les phases où un phénotype dommageable peut apparaitre, et les expériences se déroulent avec une surveillance accrue à ce moment-là. Les injections stressantes, les prélèvements sanguins et les échographies sont réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues. Nous avons mis en place une grille de score avec des points limites, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Le transfert des animaux entre les établissements utilisateurs les plus distants est fait dans une boite de transfert contenant leurs nids et de l'hydrogel. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.
Choix des espèces
Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié à la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de tumeurs nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux-trois mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.