Système endocrinien
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de la tumorigenèse hépatique à l’aide de modèles murins: 2/3
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
2 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un génotypage par biopsie de la queue, des injections de virus et d'anticorps, une moyenne de huit échographies hépatiques sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier deux types de tumeurs du foie et leur résistance à l'immunothérapie. Le porteur indique qu'une encéphalopathie peut toucher jusqu'à un quart des animaux et qu'une partie est tuée faute du génotype recherché. Il décrit développer en parallèle des cultures en trois dimensions présentées comme un moyen de limiter le nombre de souris.
Objectifs
«Notre équipe s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais 70% des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques dans nos modèles murins. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie. Ce projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
En aidant à la compréhension des mécanismes associés au développement et à la réponse aux traitements des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements ciblant le système immunitaire émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.
Procédures
1) identification des animaux par tatouage ou puces et biopsie de queue pour génotypage des souris sur animaux vigiles en 1minute (EU0050 et EU0140) 2) Injection intrapéritonéale unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles en 30s (EU0140), 3) Injection intraveineuse unique de virus sous anesthésie générale en 30s (EU0140), 4) traitement par anticorps tous les 3 jours par injection intrapéritonéale sur animaux vigiles en 30s pendant 2 mois maximum(EU0053), 5) échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne /souris- EU0053), 6) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s (EU0053)
Impact sur les animaux
une encéphalopathie peut être observée au maximum chez 25% des animaux selon les expériences trois semaines après modification génique . Au cours des expériences, la mise à mort des animaux ayant atteint les points limites peut conduire à des animaux isolés dans les cages pouvant engendrer du stress. Les injections rétrorbitaires et prélèvements sanguins au cours du traitement ciblant le système immunitaire ou au moment de la mise à mort sont des actes stressants. La numérotation et le génotypage des souris induit stress et douleur légère. Le transport des animaux entre centres pourra induire un stress aux animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet est mis à mort pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs. Une partie des animaux sont euthanasiés car sans génotype d'intérêt pour le projet.
Remplacement
Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. Notre projet vise à développer des cultures cellulaires en trois dimensions limitant le nombre de souris utilisées pour tester de nouvelles pistes thérapeutiques.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. Nous suivons le développement des tumeurs pour l'ensemble des animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Les tests statistiques utilisés sont des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise et limité grâce au suivi échographique des animaux. Nous souhaitons aussi réaliser des cultures in vitro de tumeurs en trois dimensions qui nous permettront à terme de tester de nouveaux médicaments.
Raffinement
Nous suivons le développement des tumeurs sous anesthésie générale dans un centre d’échographies expert, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral et évite la souffrance due à un développement tumoral important. Nous connaissons les phases où un phénotype dommageable peut apparaitre, et les expériences se déroulent avec une surveillance accrue à ce moment-là. Les injections stressantes, les prélèvements sanguins et les échographies sont réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues. Nous avons mis en place une grille de score avec des points limites, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Le transfert des animaux entre les établissements utilisateurs les plus distants est fait dans une boite de transfert contenant leurs nids et de l'hydrogel. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.
Choix des espèces
Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié à la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de tumeurs nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux-trois mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.
Création et maintien de lignées pour comprendre les liens entre vieillissement et métabolisme
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
800 souris vont être utilisées dans la création et le maintien de lignées de vieillissement prématuré, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux porteurs d'une seule copie de la mutation sont transférés vivants vers un autre site avant six mois, ceux qui en portent deux copies sont tués avant l'âge de deux mois. Le porteur indique que la mutation entraîne à terme perte de poids, dos voûté et atteintes cardiaques, et fixe un point limite fondé sur des tests de réflexe de retournement et de préhension. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces mécanismes et qu'une étude sur "l'organisme entier" est "nécessaire".
Objectifs
Les objectifs du projet sont d’évaluer chez l'animal comment le vieillissement, et plus spécifiquement l’induction du vieillissement au niveau de la cellule, perturbe les fonctions métaboliques, et en particulier le contrôle du métabolisme glucidique ainsi que les adaptations métaboliques du foie liées au jeûne alimentaire. Au regard d’autres études préalables menées sur le modèle de veillissement prématuré utilisé dans cette étude, les phénotypes dommageables envisagés ici sont de classe modérée. Néanmoins, pour limiter l’impact de ces phénotypes au moment des analyses prévues dans le projet, ainsi que leur survenue trop précoce, seuls les animaux porteurs de la mutation d'intérêt à l’état hétérozygote (une seule copie du gène muté) seront maintenus en élevage et transférées dans des zones d’expérimentation dédiées avant l’âge de 6 mois. Des études précédentes indiquent que ces animaux présentent un poids et une fertilité normale jusqu’à l’âge de 8 mois et une survie moyenne de 15 mois. Les analyses du métabolisme seront réalisées sur des animaux agés de 6 mois.
Bénéfices attendus
Le projet devrait permettre de générer des connaissances permettant d’ouvrir de nouvelles pistes pour la prévention et le traitement des maladies associées au vieillissement. Cette étude aidera à mieux comprendre les changements biologiques qui accompagnent le vieillissement et à éviter les déficiences métaboliques des tissus des personnes âgées tel que le diabète de type 2.
Procédures
Aucune procédure invasive n’est prévue dans le cadre de l’élevage de ces animaux, en dehors des actes à des fins d'élevage, de la biopsie prélevée pour le génotypage, ainsi que des actes nécessaires à la prise en charge d'un vieillissement prématuré.
Impact sur les animaux
Les souris seront élevées jusqu’à l’âge de 6 mois, moment où les phénotypes dommageables envisagés ne sont pas détectables selon les données déjà publiées. Les phénotypes plus tardifs (au-delà de 8 mois) liés à cette altération génétique incluent de nombreux signes de vieillissement prématurés, incluant une perte de poids, des perturbations métaboliques, un dos voûté, des problèmes de pigmentation du pelage, des atteintes cardiaques, etc... Aucune procédure invasive n’est prévue dans le cadre de l’élevage de ces animaux.
Devenir
Les individus seront produits uniquement à des fins d'élevage afin de générer des cohortes qui seront transférées dans le cadre d'une utilisation continue sur un autre site. Les animaux présentant l’altération génétique en deux copies (homozygotes), associé à la survenue très précoce des phénotypes liés à l'âge, seront euthanasiés avant l'âge de 2 mois.
Remplacement
Les analyses que nous allons réaliser nécessitent l'utilisation d'animaux puisqu'à l'heure actuelle, aucun modèle in vitro ne permet de récapituler la complexité des mécanismes physiopathologiques (et notamment ceux liés à la perturbation du métabolisme) associés au vieillissement. Aussi, dans le cadre de ce projet, une étude sur l’organisme entier est nécessaire.
Réduction
Le total d'animaux a été définis d'après des analyses statistiques comme nécessaires et suffisants (ni trop, ni trop peu) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs qui nous permettront de conclure. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, 2 tests métaboliques différents seront réalisés à 48h d’intervalle sur les mêmes animaux en suivant une approche de randomisation des animaux pour ne pas introduire de biais expérimental. Par ailleurs, les animaux utilisés pour les tests en cages métaboliques seront également utilisés pour des analyses tissulaires et moléculaires. Du fait de différences possibles liées au sexe décrites dans la littérature, il est nécessaire de constituer des groupes de mâles et de femelles. Le nombre d'animaux par groupe expérimental est fixé à 10 pour les tests métaboliques choisis et les analyses en cages métaboliques, et à 5 pour les études moléculaires et tissulaires.
Raffinement
Cette lignée présente des caractéristiques phénotypiques spécifiques de vieillissement accéléré dont il faudra tenir compte mais qui ne devraient pas être limitants à l’âge auquel les animaux seront élevés puis transférés vers les zones d’expérimentation (l’espérance de vie moyenne est de 15 mois pour les animaux portant l’altération génétique en une seul copie (hétérozygotes)). De fait, la principale stratégie de raffinement consistera à utiliser des animaux de moins de 6 mois, âge au-delà duquel certains phénotypes de vieillissement pourraient apparaître. Les animaux feront néanmoins l’objet d’un suivi quotidien pour détecter et renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux de la douleur ou d’éventuelles anomalies (isolement, absence de mobilité, perte d’appétit, hérissement des poils, dos voûté…). L’état de santé général sera évalué par le test de réflexe du retournement et par la capacité d'agrippement qui constitueront un point limite entrainant la mise à mort de l’animal. Si les animaux sont stressés et ne se nourrissent pas convenablement, de la nourriture gélifiée sera placée dans la cage pour faciliter leur réhydratation et pour diminuer leur stress avant euthanasie. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (batonnets en coton, frisottis, cabane en carton ). Le change est fait de façon hebdomadaire.
Choix des espèces
Les génotypes complexes nécessaires à cette étude ne sont accessibles que chez la souris. Les souris utilisées seront des souris adultes, l'optique étant de favoriser l'émergence des caractéristiques phénotypiques du vieillissement.
Role de la testostérone dans le recrutement de macrophages tumoricides et recherche de cibles thérapeutiques alternatives pour le traitement du corticosurrénalome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
992 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des implants de testostérone, des injections intrapéritonéales tous les deux jours pendant deux semaines, et pour 576 nouveau-nés l'amputation d'une phalange pour identification et génotypage. Le projet vise à démontrer un rôle antitumoral de la testostérone dans trois modèles de carcinome corticosurrénalien, un cancer rare au pronostic sombre. Le porteur affirme que les cultures in vitro ne reproduisent pas la complexité du développement tumoral et conclut à la "nécessité" de recourir à l'animal.
Objectifs
Avec un dimorphisme sexuel présentant un ratio femmes/homme de 1.5 à 2.5 :1, et une incidence annuelle de seulement 0,5 à 2,0 cas par million d'individus, le carcinome corticosurrénalien est considéré comme un cancer agressif, environ 35 % des patients présentant des métastases lors du diagnostic initial. Le mauvais pronostic du carcinome corticosurrénalien peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients de carcinome corticosurrénalien à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Par conséquent, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, n’ont pratiquement aucune chance de survie à long terme.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer le rôle tumoricide de la testostérone dans trois modèles murins de carcinome corticosurrénalien avancé, cliniquement pertinents. De même, l’identification des facteurs en aval de la testostérone et l’évolution de leur potentiel antitumoral, soutiendra le rôle de ces facteurs comme molécules thérapeutiques potentielles dans le contexte de carcinome corticosurrénalien. De plus, nous espérons identifier tous les types de cellules qui répondent directement et/ou indirectement à la testostérone et identifier les principales voies de signalisation associées à cette réponse. Dans l’ensemble, ce projet devrait permettre d’ouvrir des pistes thérapeutiques reposant sur la testostérone et ses cibles, afin d’améliorer le pronostic du carcinome corticosurrénalien.
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - Traitement avec des implants de testostérone : 128 souris, mâles et femelles confondus, âgés entre 6 et 18 mois selon le moment d’apparition des signes de malignité, seront implantés avec des pellets de placebo ou testostérone pendant 2 mois. Les implants utilisés ont été designés pour libérer une dose jounalière physiologique de testosterone. Le geste sera realisé une seule fois au début de la procédure et durera 5 minutes maximum. - Injections intrapéritoneales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 288 souris (mâles et femelles confondus, âgées de 4 semaines), seront injectées tous les deux jours pendant 2 semaines avec des potentielles cibles thérapeutiques (pour étudier son rôle dans le recrutement des macrophages tumoricides). Le geste sera réalisé une fois tous les deux jours et ne durera que quelques secondes. -Identification par phalangectomie : une phalange distale des souris nouveaux-nées sera coupée entre les premiers 7 et 10 jours de vie afin de permettre l’identification et le génotypage des individus. 576 animaux, mâles et femelles confondus, seront soumis à ce geste technique. Le geste sera realisé une seule fois au cours de la vie de l’animal et ne durera que quelques secondes. Les animaux issus de la procédure 3 ne sont pas utilisés dans les autres procédures.
Impact sur les animaux
L’implantation des pellets, peut engendrer une douleur modérée et de courte durée au site d’implantation. De même, bien que de courte durée (quelques secondes), la contention et les injections intrapéritoneales peuvent induire un stress et une douleur de faible intensité. Finalement, la délétion du récepteur aux androgènes chez les souris spécifiquement dans les cellules stéroïdogènes, ne devrait pas induire de phénotype dommageable ou d’effets indésirables chez la souris.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses ciblant le rôle de la testosterone comme nouveau approche thérapeutique dans le traitement de corticosurrénalomes métastatiques.
Remplacement
Afin d’eviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés ayant un potentiel comme agent antitumoral. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
Réduction
Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour une extraction d’ARN pour une analyse de quantitative et l’autre pour des analyses d’imagerie cellulaire. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimun nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux implantés ou injectées avec les protéines recombinantes ou les anticorps neutralisants pour les cibles d’intérêt, ainsi que les souris des lignées nouvellement développées, seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, jusqu’à leur euthanasie. Les points limites de nos expériences sont déterminés en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Ainsi, les expériences seront arrêtées suite à la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Pour tous les signes indicateurs de douleurs (activité réduite, perte de poids, automutilation…) nous suivrons une échelle de points limites stricte. En cas des signes de douleur, des analgésiques seront administrés afin de supprimer ou atténuer la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes (CCS). La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Nous avons montré récemment qu’un traitement avec de la testostérone conduisait à une régréssion tumorale dans les permières étapes d’évolution du cancer. Cependant, le rôle antitumoral de la testostérone à des stades tardifs associés à une dissémination métastatique n’a pas encore été étudié. Afin d’évaluer le potentiel tumoricide de la testostérone, nous utiliserons 3 modèles murins tumoraux à 4, 6 ou 16 mois, en fonction de l’apparition des premiers signes de malignité. De même, afin de trouver des cibles alternatives à la testostérone, des souris de 4 semaines, coïncidant avec les premières étapes d’évolution du cancer et au moment où la testostérone s’est avérée éfficace comme traitement, seront traitées avec des protéines recombinantes ou anticorps neutralisant pour les molécules identifiées par des approaches d’analyses transcriptomiques comme candidates potentielles. Si ces approaches valident l’implication des molécules dans la régression de la tumeur, nous évaluerons alors leur potentiel antitumoral sur les modèles de développement aggressif de CCS aux âges indiqués auparavant. Finalement, l’identification des cellules répondant à la testostérone sera réalisée sur des souris âgées entre 4 et 12 semaines, coïncidant avec la mise en place de la puberté et la production d’androgènes.
Effet de l’activation du système ocytocinergique sur les consequences d’une alcoolisation intermittente de rats mâles et femelles, stressés en période périnatale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
328 rats vont être utilisés, dont 308 tués à l'issue et 20 femelles reproductrices gardées pour réutilisation, dans des procédures classées en souffrance modérée à sévère. Dix femelles gestantes subissent un stress prénatal, et la descendance est soumise à des alcoolisations répétées de l'adolescence à la vieillesse, à des injections quotidiennes et, pour 72 animaux, à une chirurgie d'implantation pour enregistrement du sommeil. Le porteur teste un agoniste de l'ocytocine, la carbétocine, sur les conséquences de l'alcoolisation, en présentant la modélisation animale comme "indispensable". Il décrit ce modèle de rat stressé en période périnatale comme documenté depuis 1995 par l'équipe.
Objectifs
L’alcoolisation est un problème de santé publique majeur et un symptôme majeur et dramatique de l'alcoolisation est représenté par l’altération chronique de la qualité du sommeil, indicateur principal du bien-être d'une personne. A l’heure actuelle, les thérapies pharmacologiques approuvées dans les soins médicaux de l’alcoolisation présentent des nombreux effets secondaires ainsi qu’une efficacité limitée. Pour cette raison, le besoin d'interventions supplémentaires et innovantes à action bio-pharmacologique et donc avec effets secondaires réduit, est très important. Dans ce cadre le ciblage de l'ocytocine qui avec le glutamate, est le neurotransmetteur majeur intervenant dans la régulation de la sensibilité aux addictions et troubles du sommeil, a gagné un intérêt considérable au cours des dernières années en tant que nouveau traitement potentiel de l'alcoolisme. Ce projet se propose d'utiliser un modèle animal translationnel tel que le rat stressé périnatalement (rat PRS) qui présente des troubles du sommeil et une vulnérabilité accrue aux drogues et de developper par des approches interdisciplinaires, de nouvelles interventions thérapeutiques vis-vis de l’alcoolisation ayant une action commune sur le système anti-stress de l’ocytocine. En particulier, nous allons prendre en compte l’efficacité d’une biomolécule comme la carbétocine puissant agoniste de l’ocytocine et ayant comme molécule de référence l’ocytocine. Les objectifs spécifiques du projet sont les suivants : 1) déterminer l'efficacité de la correction par la carbétocine sur l’alcoolisation, et 2) d'explorer la récupération du sommeil et l'augmentation de la résilience en prenant en compte les différences sexuelles dans un modèle de programmation précoce des maladies de l’adulte comme le rat PRS.
Bénéfices attendus
Comprehension de l'impact à long terme de l'alcool et son intéraction avec le système ocytocinergique, le stress précoce et les différences sexuelles.
Procédures
Parmi les 20 femelles reproductrices, 10 d'entr'elles seront soumis au stress gestationnel pendant les 10 derniers jours de gestation.Tous les animaux expérimentaux issus de la réproduction seront exposés au protocole d'alcoolisation et de traitement pharmacologique , soit 288 animaux repartis comme suit : 144 rats PRS, dont 72 mâles et 72 femelles, et 144 rats non- PRS, dont 72 mâles et 72 femelles. Durée alcoolisation -3 alcoolisations : l'alcoolisation aura lieu à l'adolescence, âge adulte et au vieillissement de manière intermittente, 1 jour sur deux pendant 4 heures pour une durée de 3 semaines pour chaque période ; durée traitement pharmacologiques : 3 semaines d'injections i.p 1 fois/jour; temps d'injection prevu 3 minutes ; Un groupe d'animaux sera soumis à des prelevements sanguins par la queue afin de mesurer les hormones dans le sang et à une procédure de chirurgie implantaire pour l'enregistrement polysomnographique. Il s'agit de 72 animaux repartis comme suit : 36 rats PRS, dont 18 mâles et 18 femelles 36 rat non- PRS, dont 18 mâles et 18 femelles. Durée prelevements sanguins par la queue : la procédure entière de stress-retour à la cage dure 2heures pour 4 prelevements à T0-T30-T75-T120; le geste technique du prélévement par la queue ne prends pas plus que 3 minutes ; durée de la chirurgie : 2 heures; Tous les animaux seront soumis a des test comportementaux non invasifs (durée entre 5 et 15 minutes)
Impact sur les animaux
Au niveau des mères gestantes: Le protocole rallentit l'evolution pondérale au cours de la gestation et reduit la qualité du comportement maternel. Au niveau des descendants : Pour les 72 animaux qui subissent la procédure sevère de chirurgie implantive, la douleur potentielle sera évitée en réalisant l'acte chirurgical sous anesthesie génénérale et en réalisant des injections sous-coutanées d'antalgique Meloxicam (METACAM, 0.2 mg/kg) 1 heure avant l'incision chirurgicale, ainsi que dans les 12 apres l'opération. Pour les autres animaux, pas d'effets indésirables attendus.
Devenir
308 animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes/tissus et 20 animaux seront gardés en vie pour réutilisation.
Remplacement
La modélisation animale est indispensable pour recréer les conditions exposées ci-dessus, car il s’agit de mesurer des éléments intégrés de la molecule au comportement chez l'animal in vivo, en associant stress périnatal et exposition à l’alcool à l’adolescence, à l’âge adulte et au cours du vieillissement. Aucune méthode alternative in vitro ou de substitution permet de predire les réponses comportementales et biochimiques que nous souhaitons explorer chez l'animal in vivo.
Réduction
24 rats/groupe/sexe/traitement pharmacologique sont nécessaires pour étudier la variabilité interindividuelle des réponses au traitements à l’alcool et ensuite la réponse au traitement pharmacologique. Les résultats seront groupés par sexe afin de déterminer les différents effets d’une part du stress/non stress et d’autre part de la prise chronique d’alcool. Une comparaison également suivant le sexe sera effectuée. L’analyse statistique de type ANoVA multi-factorielle, ainsi que les comparaisons multiples en post-hoc tiendront compte des effets du stress/sexe/alcool.
Raffinement
Les animaux seront nourris ad libitum avec accès libre à l’eau de boisson. L'enrichissement de cages, consiste en un melange en partie égales de sciure de bois et cellulose et l'ajout d'un batonnet de bois à grignoter toutes les semaines. Les rats, que ce soit lors de la période de reproduction ou lors des traitements, seront surveillés tous les jours jours afin d'évaluer l'état général (peau, poil, muqueuses, yeux), le comportement et le poids (pesée 1/semaine). Pour les 72 animaux qui subissent la procédure sevère de chirurgie implantive, la douleur potentielle sera évitée en réalisant l'acte chirurgical sous anesthesie génénérale et en réalisant des injections sous-coutanées d'antalgique Méloxicam (METACAM) 1 heure avant l'incision chirurgicale, ainsi que dans les 12h apres l'opération. Pour tous les animaux, la présence de signes cliniques sera évaluée regulierement au moment du contrôle et/ou de la manipulation quotidienne, à l'aide d'une grille de scoring precedemment établie en annexe de la saisine. Les points limites seront differenciés selon la gravité par un code couleur. L'exclusion du protocole se fera en presence d'un seul signe clinique " rouge" (prostrations, tremblements, saignements, désydratations averée, perte de poids > 10% du poids corporel ..); en presence de 2 points limites" orange" (lésion superficielle, troubles moteurs, gonflement abdominal, reduction ou absence de prise de boisson et prise alimentaire..) et de 4 points limites "bleu" (agitation, aggression, poils herissé, vocalisations ..) . Dans ce dernier cas, l'animal sera d'abord isolé et surveillé, et si aucune amélioration n'est observée suit à la mise en place de mesures correctives , celui-ci sera mis à mort. L' euthanasie se fera par une augmentation progressive de la concentration en CO2. Enfin, seul le personnel habilité en expérimentation animale réalisera l’ensemble du projet.
Choix des espèces
L'étude des effets comportementaux et neurochimiques de l’alcool ou lors d’un stress au sein d'un organisme entier n'est possible que sur un modèle physiologique intégré. Il est nécessaire de disposer de modèles animaux correspondants aux paramètres et aux symptômes qu'on souhaite étudier. C'est bien ici que repose l'intérêt du modèle de rat PRS présentant par rapport aux animaux témoins une exacerbation des comportements de type émotionnel, vulnérabilité aux drogues et déficits mnésiques et d’apprentissage. Ce type de protocole expérimental permet à la fois d'évaluer la spécificité du traitement à l’alcool sur les symptômes comportementaux et biologiques ciblés. Par ailleurs, il s'agit d'un modèle bien décrit et documenté, développé depuis 1995 par l'équipe.Le comportement d'alcoolisation sera étudié pendant l'adolescence, période critique au cours du quel le processus de maturation n'est pas terminé et donc les effets de l'alcool sont très perturbateurs, à l'âge adulte pour etudier en quel mesure une consommation d'lacool pendant le developpement peut predire le degrée de consommation d'alcool à l'âge adulte ainsi que au vieillissement pour étudier les conséquences à long terme.
fourniture de produits biologiques de primates non humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Macaques à longue queue : 800
Macaques rhésus : 40
Singes vervets : 10
Prélèvements de moelle osseuse, de liquide céphalo-rachidien et d'humeurs de l'œil, biopsies de peau ou de muscle, lavages broncho-alvéolaires, collecte de sperme et de lait : 1 000 primates non-humains, dont 800 macaques à longue queue, 150 ouistitis et tamarins, 40 macaques rhésus et 10 singes vervets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Dirigés vers un tunnel de capture puis immobilisés dans un sabot de contention, ils sont anesthésiés pour la plupart des actes, la prise de sang pouvant se faire sur un singe éveillé à la demande de l'utilisateur. Pour le lait, les petits sont séparés de leur mère jusqu'à six heures, avec une peluche à laquelle s'agripper s'ils sont seuls, et les mâles sont isolés de leur groupe jusqu'à 24 heures avant la collecte de sperme. Le porteur affirme que ces interventions "diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain" et que la démarche "suit donc parfaitement la règle des 3R". Tous restent en vie à l'issue, en hébergement standard ou réutilisés dans d'autres projets, les échantillons étant fournis sur demande de chercheurs clients.
Objectifs
L’accès à des échantillons biologiques de primates non humains (PNH) est un élément clé dans le développement préclinique. Ils permettent de valider in vitro différentes hypothèses scientifiques et de tester l’efficacité ou la toxicité de candidats médicaments. Autrement dit, utiliser des échantillons de PNH 1) permet de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire en les remplaçant par l’utilisation in vitro de cellules (plusieurs produits testés avec les cellules d’un seul animal) ; 2) rend le développement d’un médicament plus fiable, grâce à une sélection objective de l’espèce animale la plus proche de l’homme. Les prélèvements sont réalisés sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. De plus, un hébergement spacieux en groupe sociaux et un enrichissement du milieu adapté sont fournis à ces animaux. Anesthésie, analgésie, hébergement en groupe sociaux et enrichissement participent ainsi au principe de raffinement. La réalisation de prélèvements biologiques suit donc parfaitement la règle des 3R, tant dans son concept que dans sa réalisation. Pour les besoins de la recherche scientifique , l'objectif de ce projet est de proposer et fournir à la communauté scientifique la fourniture d’échantillons biologiques (sang et dérivés sanguins, cellules, tissus, fluides…). Le besoin en prélèvements biologiques/cellules de PNH est dépendant de projets extérieurs à la plateforme
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, les prélèvements de sang, moelle osseuse, liquide céphalo-rachidien, urine, humeur aqueuse, humeur vitrée, sperme, biopsies cutanées, biopsies musculaires, lait et liquide bronco-alvéolaire peuvent avoir de nombreuses utilisations. On peut notamment citer parmi les utilisations faites par les utilisateurs de ces prélèvements : (i) des recherches sur les cellules primaires pour développer de nouvelles molécules de biothérapie en oncologie ou contre les maladies inflammatoires ; (ii) des pré études de sécurité pour mettre en place avec les doses adaptées les futures études de toxicologie sur les primates non humains ; (iii) des comparaisons avec le sang humain afin d’étudier la compatibilité des résultats obtenus sur les primates non humains lors de leur application chez l’Homme (iv) des études de bioanalyses pour le développement de médicaments ; (v) des recherches pour découvrir de nouvelles molécules pour inhiber l’immunité innée pour le traitement des maladies à médiation immunitaire.
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux dans ce projets diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain. De plus, contrairement à ce qui est fait chez l'Homme, ces procédures sont ici réalisées sur animaux anesthésiés et analgésiés. Pour les prélèvements de sang, un prélèvement vigil pourra être effectué dans le seul cas où l'anesthésique affecteraits les analyses ou les expériences menées par le chercheur. L'ensemble de interventions sont des prélèvement biologiques : prise de sang, prélèvement de LCR, moelle osseuse, urine, lait, sperme et humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lavage broncho-alvéolaire. Le nombre des interventions dépend des demande des utilisateurs mais sont toujours réalisées en respectant les procédures définissant des intervalles de prélèvements et de volume maximaux afin de préserver la bonne santé et le bien être de l'animal.
Impact sur les animaux
La réalisation des prélèvements biologiques nécessite au minimum la capture et la contention des animaux. Ces deux actes sont stressants car réalisés de manière contrainte. La capture consiste à diriger les animaux vers un tunnel de capture installé dans chaque animalerie. Une fois dans le tunnel de capture, les animaux peuvent être triés et dirigés vers le sabot de contention au bout du tunnel équipé d’un fond de contention. Le fond de contention permet de manière sécurisée (i) d’attraper le bras de l’animal afin de pouvoir le tenir et le sortir en vigil du tunnel à l’aide de gants de contention, ou (ii) d’accèder à sa cuisse afin de pouvoir effectuer une injection intra-musculaire du produit anesthésiant. A noter que l’habituation des animaux ainsi que le renforcement positif permet de réduire la durée et l’intensité du stress de capture. Ces méthodes de raffinement sont appliquées le plus souvent possible. Les effets post-prélèvements peuvent également représenter une nuisance en termes de récupération physiologique et/ou physique des animaux. Il s’agira au maximum des effets secondaires liés à l’anesthésie (somnolence, nausée). Toutes les nuisances sont considérées comme légères. De plus, des mesures de raffinement sont mises en place propres à chaque type de prélèvements. A noter que -pour le prélèvement de lait, les petits sont séparés de leur mère pour une durée de 6h maximum engendrant un stress de séparation. Cette séparation sera la plus courte possible et n’entraine pas d’effet à long terme sur le petit. Des mesures particulières sont mises en place afin de limiter le stress immédiat des petits due à cette séparation comme la présence d’une peluche pour s’agripper si le petit est seul ou la mise en groupe des petits s’ils sont plusieurs. - pour le prélèvement de sperme, le mâle est séparé de son groupe la veille pour obtenir le meilleur prélèvement possible. Cette séparation engendre un stress chez l’animal. Afin de réduire au maximum ce stress, le temps de séparation est limité à 24h maximum et le mâle est relâché dans son groupe dès que possible. Le contact visuel avec le groupe est maintenu si possible.
Devenir
Les procédures de prélèvements biologiques étant des procédures très légères, les animaux sont gardés en hébergement standard ou pourront être réutilisé pour d'autres projets scientifiques.
Remplacement
Dans la mesure où les produits de synthèses ne permettent pas encore de reproduire toutes les réactions des différentes cellules visées dans ce projet, l’utilisation d’animaux en tant que donneurs non terminaux reste indispensable. Les prélèvements biologiques réalisés sur animaux vivants proposés dans ce projet permettent justement de remplacer l’utilisation d’animaux vivants « entiers » par des produits biologiques issus de ces animaux permettant ainsi d’éviter l’injection de composants en tests à ces animaux et de multiplier les essais réalisés sur les produits biologiques testés sans multiplier le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
L’utilisation de produits biologiques à la place d’animaux entiers permet en soi de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques puisqu’un même animal peut être réutilisé pour le prélèvement de plusieurs produits biologiques, dans la limite des volumes et de la fréquence maximale permettant à l’animal de retrouver son état de santé et de bien-être général entre chaque prélèvement. Concernant les prélèvements biologiques eux-mêmes, ceux-ci sont réalisés après une demande spécifique validée d’un demandeur (en général client chercheurs). Les animaux ne sont pas prélevés systématiquement s’il n’y a pas de demande pour la fourniture de produits biologiques qui ne seraient pas utilisés. Dans la mesure du possible, toutes les demandes sont couplées afin de limiter le nombre d’interventions pour un même groupe d’animaux hébergés ensemble et réduire le stress lié à la capture dans une même animalerie. Ainsi tout est fait pour prélever un minimum d’animaux pour satisfaire les demandes des chercheurs.
Raffinement
La plupart des prélèvements est réalisée sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations de prélèvement correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. Dans les rares cas où l’anesthésie n’est pas réalisée (pour les prélèvements sanguins uniquement : demande spécifique de l'utilisateur : interraction de l’anesthésique avec leur recherche), il est jugé que le dommage engendré par la réalisation du prélèvement en vigil ne diffère pas de celui engendré par l’anesthésie (douleur de la piqure d’une aiguille + stress d’un prélèvement vigil vs douleur de la piqure d’une aiguille + réveil, respectivement). De plus, tous les animaux disposent d’un hébergement répondant à la règlementation en vigueur, avec accès extérieur (volume supplémentaire par rapport à la réglementation) le cas échéant et en groupes sociaux. Les animaleries intérieures et extérieures sont équipées d’enrichissements du milieu adaptés à chaque espèce (au minimum perchoirs, reposoirs, barrières visuelles, matériaux variés, jouets, litière). En ce qui concerne les méthodes de prélèvements des produits biologiques, des mesures de raffinement spécifique (dont analgésie si nécessaire) sont mises en place pour chaque procédure.
Choix des espèces
De nombreuses thématiques de recherche sont menées sur les PNH et peuvent nécessiter l’utilisation de produits biologiques (ici sang et dérivés, LCR, moelle osseuse, urine, humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lait, liquide broncho-alvéolaire, sperme) soit pour des études préliminaires soit comme témoin négatif en comparaison aux produits récoltés lors de l’expérimentation. Les espèces PNH choisies sont celles utilisées le plus couramment en recherche biomédicale et pour lesquelles la communauté scientifique dispose du plus de données bibliographiques et de connaissances (Macaques cynomolgus, rhésus, singes verts et ouistitis). L’espèce prélevée est choisie sur demande du chercheur. Animaux de tous âges en fonction des demandes des utilisateurs. Les volumes prélevables sont ajustés en fonction de l’âge et du poids de l’animal.
Insulinorésistance associée à la dépression : une étude expérimentale sur un modèle murin de stress chronique léger imprédictible.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le protocole repose sur l'induction d'un état dépressif par stress chronique léger imprévisible, avec quatorze mesures de glycémie par animal, des jeûnes et des tests comportementaux, le porteur admettant que perte d'appétit, apathie, déshydratation et perte de poids sont probables. Il reconnaît que "le raffinement sera limité du fait de l'objectif du projet", l'induction d'une symptomatologie dépressive. L'étude vise à explorer le lien entre dépression et résistance à l'insuline, les pistes de traitement étant annoncées comme potentielles.
Objectifs
Les personnes qui souffrent de dépression majeure présentent un risque plus important de maladies cardiovasculaires, d’obésité, et de diabète de type 2. La principale hypothèse expliquant ce risque plus élevé est la perturbation de l’action périphérique de l’une des hormones qui régule l’équilibre du glucose (sucre) dans le sang, à savoir l’insuline. On parle alors de résistance à l’insuline ou insulino-résistance. Cette résistance à l’insuline est fréquente chez les personnes qui souffrent de dépression. Comme autre hypothèse, certains scientifiques ont évoqué le rôle d’un système spécifique impliqué dans la modulation de l’activité des neurones : le système endocannabinoïde (SEC). Le SEC est constitué de molécules appelés ligands (on parle de cannabinoïdes), qui se fixent sur des récepteurs (CB1R et C2BR) et qui peuvent être (les ligands) détruites par d’autres molécules appelées enzymes spécifiques. Certains travaux de recherche ont montré qu’avec l’activation du SEC, on observe les mêmes perturbations (troubles) du métabolisme que l’on rencontre chez les personnes souffrant d’obésité et/ou de diabète. Par contre, les études qui ont évalué le SEC chez les personnes avec dépression (pour savoir s’il était hyperactivé ou l’inverse), ne sont pas tombées sur des conclusions similaires, même si la tendance penche vers une faible activité des récepteurs CB1R dans le cerveau des personnes avec dépression sévère. Au vu des éléments évoqués plus haut, étudier le SEC dans la dépression semble avoir un intérêt, pour déterminer si le SEC ne constitue pas une explication du risque plus élevé de maladies cardiovasculaires / métaboliques en cas de dépression majeure. Une étude de ce type nécessite de pouvoir induire une dépression chez des animaux de laboratoire, notamment des rongeurs, et l’une des méthodes validées dans ce sens est le stress chronique léger imprédictible (SCLI). Ainsi, nous envisageons un travail ayant pour objectif de d’induire une dépression chez des souris (par SCLI), et d’explorer les paramètres métaboliques en lien avec la résistance à l’insuline. Nous pourrons ensuite étudier et modifier l’activité du SEC chez les souris avec symptomatologie dépressive et résistance à l’insuline, tout en évaluant si cette modification du SEC a un effet bénéfique sur le plan métabolique. L’idée est de savoir si en situation de dépression avec troubles cardiométaboliques, une action sur le SEC peut avoir des bénéfices sur la santé cardiovasculaire
Bénéfices attendus
La dépression majeure (encore appelée dépression caractérisée), constitue un problème mondial de santé publique à travers sa morbidité (et le handicap psychique qu’il occasionne), mais également sa mortalité. Cette dernière est relative au suicide mais également aux évènements cardiovasculaires, eux-mêmes liés à des altérations cardiométaboliques ayant comme clé mécanistique la résistance à l’insuline. A l’heure actuelle, les éléments de physiopathologie qui associent l’insulino-résistance à la dépression ne sont pas totalement connus, ce qui pourrait expliquer l’absence de marqueurs biologiques spécifiques à l’association dépression – insulino-résistance. De plus, les axes actuels de prise en soin (pharmacologiques ou non) des perturbations cardiométaboliques (obésité, diabète, dyslipidémie, hypertension artérielle) chez les patients avec dépression majeure semblent insuffisants. L’exploration du SEC sur un modèle murin de dépression, l’analyse de l’association entre les modifications du SEC et la résistance à l’insuline, ainsi que la modulation de ce système, pourraient contribuer à renforcer les connaissances actuelles sur le sujet. Un travail de cet ordre permettrait potentiellement de compléter les notions sur les mécanismes de l’insulino-résistance dans la dépression, mais également d’ouvrir des pistes de traitements pharmacologiques destinés à réduire le fardeau des pathologies cardiométaboliques. Ces traitements seraient des inhibiteurs de l’activité du SEC notamment en périphérie (bloqueurs sélectifs du CB1R) ou alors des activateurs du SEC (agonistes CB1R ou inhibiteurs des enzymes de dégradation du SEC), en fonction des perturbations du SEC qui seront retrouvées.
Procédures
Pour chaque test de glycémie, un prélèvement sanguin sera effectué afin de doser la glycémie à l’aide d’un glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle). Pour ces tests faisant intervenir une mesure de glycémie, un hébergement individuel de 6h préalable sera nécessaire pour effectuer un jeun. Les tests en eux-même dure 2h, l’hébergement individuel total sera de 8h. Pour les tests comportementaux, ceux-ci sont indispensable afin de pouvoir évaluer l’induction du syndrome dépressif. Aucun prélèvement ne sera effectué, la nuisance principale de ces tests étant l’isolement (30 minutes à 2h en fonction du test). Chaque test n’aura lieu qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Le présent travail a pour base l’induction d’une symptomatologie dépressive, à travers des stress répétés, d’intensité légère, de survenue aléatoire pour les animaux. Il est de ce fait possible voire probable que les animaux que nous enrôlerons présentent des manifestations comportementales telles qu’une perte d’envie, une diminution de l’appétit, une baisse d’énergie, une apathie, une diminution de l’élan vital. Dans le même sens, il subsiste un risque de déshydratation et de perte pondérale. Ainsi, l’état général des souris sera surveillé quotidiennement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
La dépression et les maladies cardiométaboliques auxquelles elle peut être associée, peuvent être vues dans une approche systémique, avec des conséquences négatives sur de nombreux tissus et organes. Afin d’explorer au mieux cette dimension multi-systémique, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
Pour réaliser ce travail, nous avons choisis la souche de souris la plus utilisée dans la littérature (dans d’autres travaux de recherche) dans le sens du SCLI. Aussi, les paramètres morphologiques et l’âge des souris, tout comme les stresseurs et la durée totale du SCLI, sont définis dans notre travail sur la base des études antérieurement publiées. Toutes ces précautions ont pour but de contribuer à réduire au maximum le nombre de souris que nous aurons à utiliser.
Raffinement
Avant la mise en application des épreuves constitutives du SCLI (mise en œuvre de la procédure de stress), et ce pendant deux semaines, les animaux seront placés par groupes de cinq dans des cages avec contrôle de la température et de l’humidité, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, et des alternances lumières/obscurité de 12h. Cependant, le raffinement sera limité du fait de l’objectif du projet, en l’occurrence l’induction d’une symptomatologie dépressive. Toutefois, nous avons mis en place une échelle de points limites adaptés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées dans la littérature scientifique, notamment en ce qui concerne les maladies mentales (dont la dépression et la schizophrénie), ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction de la symptomatologie dépressive par stress chronique léger imprédictible sera réalisée chez des souris de douze semaines. Ce stade correspond à des souris jeunes adultes et est idéal pour induire tout type de conditionnement chez la souris puisque d’après la littérature, ce type d’expérimentation montre son efficacité maximale chez des animaux âgés de 12 à 20 semaines. Considérant une durée de stress de six semaines, les souris CUMS et non-CUMS seront âgées de 18 semaines à la fin de la procédure de SCLI. Les tests comportementaux inhérents à la vérification de la validité du modèle seront réalisés dans les deux semaines après chez toutes les souris, et les prélèvements finals à 20 semaines de vie. De façon pratique, nous travaillerons de façon successive sur des lots de quatre souris. En résumé (pour chaque lot de souris) > Souris sélectionnées à 10 semaines > Phase pré-SCLI de deux semaines > Souris âgées de 12 semaines au début du SCLI > Souris âgées de 18 semaines à la fin du SCLI et au début des tests comportementaux pour tous les animaux > Souris âgées de 20 semaines à la fin des tests comportementaux et mise à mort
Etude des effets d’un facteur de croissance sur le métabolisme et le muscle de la souris obèse.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
45 souris obèses et diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des probiotiques dans l'eau de boisson pendant quatre semaines, subissent deux jeûnes de six heures et une incision au bout de la queue pour mesurer la glycémie, puis une anesthésie et un prélèvement sanguin avant la mise à mort. Le porteur teste une nouvelle voie d'administration d'un analogue d'un facteur de croissance contre la fonte musculaire, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible et que cette lignée génétiquement modifiée est la seule à combiner trouble du métabolisme et fonte musculaire.
Objectifs
Le facteur que nous étudions sera appelé facteur X dans cette demande de projet. Le facteur X est un facteur de croissance décrit pour son rôle dans le métabolisme et reconnu pour son abilité à lutter contre la sarcopénie. La sarcopénie est une perte progressive de la masse et de la force musculaires liée au vieillissement et/ou à la maladie. C’est un facteur de risque pour la santé des sujets puisque le degré de la sarcopénie est lié à la mortalité. Il n’existe actuellement aucun traitement efficace. Dans ce contexte, le facteur X apparaît comme une solution prometteuse. Cependant, deux inconvénients sont liés à son utilisation : (i) sur le long terme, il favorise le développement de tumeurs du foie et (ii) il requiert d’être administré par injections. Ces deux inconvénients altèrent son potentiel comme outil thérapeutique. Récemment, un analogue du facteur X a été développé. Celui-ce ne favorise plus le développement de tumeurs, conserve les propriétés de régulation du métabolisme et est capable d’augmenter la taille des cellules musculaires dans des modèles en culture. Cependant, à ce jour, aucune équipe n’a encore vérifié sa capacité à lutter contre la sarcopénie ni trouvé d’alternative à l’administration par injections. Les objectifs de ce projet sont : -de valider une nouvelle méthode d’administration de l’analogue du facteur X. Pour cela, des bactéries probiotiques (bactéries non pathogènes) contenant la séquence ADN de l’analogue du facteur X ont été préparées. Elles seront données par voie orale (dans l’eau du biberon) aux souris afin que les cellules de leur intestin produisent elles-mêmes l’analogue. -de démontrer que cet analogue du facteur X produit dans l’intestin des animaux est produit en quantités suffisantes pour réguler le métabolisme et augmenter la taille des muscles et ce dans un modèle de souris obèses, diabétiques et sarcopéniques (souris ob/ob).
Bénéfices attendus
Plusieurs bénéfices pourront être tirés de ce projet. Premièrement, aucune équipe à ce jour n’a vérifié que l’analogue possédait toujours la capacité d’augmenter la taille des muscles. Les résultats permettront donc de faire progresser la connaissance. De plus, s’il est mis en évidence que l’analogue est capable d’augmenter la taille des muscles cela permettra de faire émerger une nouvelle molécule candidate pour la prise en charge de la sarcopénie, avancée non négligeable puisqu’il n’existe à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique. Enfin, les résultats pourront également permettre de valider une nouvelle approche d’administration de l’analogue du facteur X via les bactéries probiotiques, méthode moins invasive et bien plus physiologique que les injections.
Procédures
Les 45 souris recevront des probiotiques dans leur biberon (durée= 4 semaines). A deux reprises (avec deux semaines d’intervalle), les 45 animaux seront mis à jeun (sans nourriture) pendant 6 heures (durée nécessaire pour obtenir des mesures fiables). Suite à ce jeûne, une petite incision sera réalisée à l’extrêmité de la queue et une goutte de sang prélevée pour mesurer le glucose. Ce geste sera réalisé sur animaux vigiles et sans besoin de contention (durée= moins de 30 sec). Avant la mise à mort, les 45 animaux seront à nouveau mis à jeun pendant 6 heures. Suite à ce jeûne, ils seront anesthésiés par une injection dans l’abdomen (durée=30 sec contention comprise/animal) pour effectuer un prélèvement sanguin (20 secondes). Toutes les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement (2 secondes).
Impact sur les animaux
Cette procédure entraînera des nuisances modérées sur les animaux. En effet, le modèle de souris obèses, diabétiques et sarcopéniques est un modèle génétiquement modifié associé à un phénotype qualifié de dommageable. La mutation génétique donne lieu à une obésité massive à l’origine de la sarcopénie. Cette obésité massive peut réduire la mobilité des animaux, créant ainsi stress et inconfort. A l’âge où les animaux seront utilisés (entre 5 et 10 semaines de vie), aucune altération de la mobilité n’est attendue. Le jeûne nécessaire avant les mesures de glycémies et avant la mise à mort peut entraîner un stress et un inconfort des animaux. La petite incision au bout de la queue pour récupérer du sang et mesurer le glucose peut générer du stress et une douleur chez l’animal. L’injection d’anesthésiques nécessaire pour le prélèvement de sang final peut générer une douleur et un stress chez l’animal. Aucun effet néfaste lié à l’ingestion des probiotiques est attendu.
Devenir
Les 45 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la capacité des probiotiques à transmettre les séquences ADN aux cellules de l’intestin des souris, puis la capacité de ces cellules à produire l’analogue, et enfin la capacité de celui-ci à agir sur les muscles et le métabolisme. Il s’agit d’une problématique complexe impliquant une cascade d’évènements et la communication entre plusieurs organes. Aucune alternative non animale n’est disponible pour répondre à une telle problématique. Ainsi ce projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Il est important de mentionner que l’analogue a été testé en amont sur des cellules de muscle en culture afin de valider ses propriétés. Le modèle de souris génétiquement modifié ne peut pas être remplacé par un autre modèle de souris car il est le seul à combiner une altération du métabolisme et une fonte musculaire.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Il est basé sur des études précédentes chez des souris injectées avec le facteur X. Pour observer une différence significative dans la taille des muscles, compte tenu de la variabilité et de la fragilité des muscles, il faut compter 15 souris/groupe. Cette procédure utilisera 45 animaux. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger ou pourront être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.
Raffinement
L’état général des animaux et leur comportement seront étroitement observés 3X/semaine. Les animaux seront pesés 2X/semaine. La prise alimentaire sera contrôlée 2X/semaine également. Les probiotiques seront administrés dans l’eau de boisson et non par gavage pour éviter manipulation quotidienne, stress et douleur liés au gavage. De la nourriture sera disposée dans les mangeoires mais aussi directement au fond de la cage pour palier aux difficultés de mobilité des animaux obèses. Les souris seront anesthésiées par injection pour permettre un prélèvement de sang avant la mise à mort. Surveillance des animaux, pesées, incisions du bout de la queue et injections seront réalisées par une personne expérimentée, si possible toujours la même, pour limiter le stress. Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier les effets des facteurs de croissance sur les muscles. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’Homme et permet d’étudier la production de l’analogue par les cellules de l’intestin ainsi que ses effets sur la taille des muscles et le métabolisme. Des souris âgées de 6 semaines seront utilisées. A ce stade, les souris obèses présentent les altérations du métabolisme et la sarcopénie qui sont les deux paramètres à améliorer grâce à l’action de l’analogue.
Amélioration de la greffe d’ilots par thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
65 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent un vecteur viral et des immunosuppresseurs, puis subissent une greffe de cellules pancréatiques dans le foie par voie portale, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires, pour tester une thérapie génique censée rendre le foie tolérant à la greffe. Le porteur indique un risque de saignement à l'injection dans la veine porte et une baisse d'immunité exposant aux infections. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'organisme receveur, tout en reconnaissant que le passage à l'humain supposerait d'abord un partenariat industriel et des validations chez le primate.
Objectifs
L'objectif du projet est de jeter les bases expérimentales d'une nouvelle approche de la greffe d'îlots de Langerhans en clinique humaine. Celle-ci s'effectue actuellement avec des îlots de donneur ou, dans les essais thérapeutiques en cours, avec des cellules pancréatiques issuées de cellules souches humaines. Dans les 2 cas, une immunosuppression importante est necessaire pour tolérer les cellules greffées. Comme les îlots greffés son transplantés dans le foie du receveur par voie portale, notre approche originale est de rendre le foie receveur tolérant aux cellules issues du donneurou cellules souches le cas échéant. Nous avons conçu une stratégie qui consiste à introduire dans les hépatocytes le gène d'une cytokine anti-inflammatoire (IL 10). Pour effectuer ce transfert, nous utiliserons un vecteur viral adéno-associé (AAV) employé actuelleent dans la grande majorité des thérapies géniques (+ de 200 essais de phase 1 ont utilisé/utilisent ces vecteurs pour véhiculer des gènes thérapeutiques). Le vecteur portant le gène de l'IL10 sera injecté au receveur avant la greffe d'îlots. Les cellules hépatiques capteront le vecteur et exprimeront le gène thérapeutiue dans les 2 semaines qui suivront. L'IL10 produite permettra de réduire, voire d'inhiber la réaction immunologique de rejet du greffon qui sera implanté un mois après l'administration du vecteur.
Bénéfices attendus
Après l’achèvement du projet chez le rat, nous aurons en cas de succès obtenu la preuve de concept d’un procédé permettant de rendre le foie d’un patient diabétique tolérant aux îlots (ou aux cellules souches qu’on lui greffera). Dans la mesure où la thérapie génique par vecteurs AAV étend actuellement ses applications à de nombreuses maladies humaines, la biodistribution et la tolérance de ces vecteurs ont été largement étudiées chez l’homme et ne représenteront aucune barrière inattendue dans notre projet clinique. On peut donc en cas de succès chez le rat anticiper une forte probabilité de transfert aux patients diabétiques de type 1, chez qui les greffes restent actuellement très restreintes du fait des limites et des complications de l’immunosuppression. Pour réaliser ce transfert, il faudra très probablement aborder un partenariat avec une société biotechnologique disposant des moyens financiers suffisants pour conduire des validations spécifiques chez le primate et aller vers l’homme.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirugicale, à savoir la greffe de cellules pancréatiques. De plus, les animaux recevront des administrations de médicaments immunosuppresseurs et d'adénovirus 4 semaine avant la greffe. Enfin, les animaux seront prélevés de sang de façon hebdomadaire (
Impact sur les animaux
La transplantation des ilots de Langerhans se faisant dans le systeme sanguin portal, cela peut engendrer des saignements +/- abondants localement. Ceux-ci seront controler par l'application d'eponge hemostatique au niveau du point d'instillation de la veine porte. Cependant, il est eventuellement possible qu'un leger signement persiste après suture et réveil de l'animal (peu probable). Egalement, du fait des traitements immunosuppresseurs, les animaux traités verront leur immunité diminuée. Ils pourraient être eventuellement plus sensible aux infections. Une vigilance accrue sera prévue.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.
Remplacement
Le projet a pour objectif général l'amélioration de la transplantation de cellules pancréatiques humaines. Il n'existe à ce jour aucune methode alternative efficace nous permettant de mimer l'organisme receveur. L'emploi d'animaux est essentielle dans un tel projet. Néanmoins, des manipulations in vitro préalables nous permettront de déterminer les meilleures concentrations cellules/virus.
Réduction
en fixant un niveau de confiance de 95%, une puissance statistique supérieure à 80%, il faut au minimum 4 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence statistique significative Le choix est donc orienté sur 5 animaux- receveurs par groupe pour pallier toute défaillance technique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Pour la transplantation faite sous anesthésie, un traitement anti-douleur local sera pratiquée, et pour des douleurs plus globales, un traitement systémique est prévu. Afin de suivre le moindre inconfort, nous avons élaborer un arbre décisionnel afin d'adopter les bons gestes et soins suivant les cas (Comportement, Plaie, perte de poids). Si toutefois, ces soins étaient insuffisants pour améliorer la santé de l'animal concerné, nous procéderons à l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le choix s'oriente chez le rat pour plusieurs : - Taille compatible avec un chirurgie (transplantation intra-hépatique aisée et moins dommageable que chez la souris) - Capacité d'hébergement adapté
Suivi fonctionnel et biologique de souris Apc pré-cachectiques et cachectiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation qui provoque un cancer de l'intestin et une fonte musculaire, avec sang dans les selles et prolapsus, subissent des tests fonctionnels et des prélèvements de tissus, pour étudier l'activation de l'axe hormonal du stress lors de la cachexie cancéreuse. Le porteur classe le maintien de cette lignée en gravité sévère à cause de la souffrance liée à l'avancée de la maladie et prévoit une mise à mort dès l'apparition de ces signes. Il affirme qu'un système in vitro ne reproduit pas la complexité de ce processus et que seul le modèle murin le permet, les stratégies thérapeutiques restant à proposer.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peut être observé dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Les travaux antérieurs conduits par notre équipe de recherche chez un modèle murin de cancer de l'intestin, ont mis en évidence une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien) associée à une augmentation de la concentration en glucocorticoïdes dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez ces souris.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope dans un modèle pré-clinique de cachexie associée au cancer.
Procédures
Les animaux subiront : 2 tests fonctionnels non invasifs et indolores d'environ 5 à 10 min chacun en fonction de la participation volontaire de l'animal, soit un prelèvement sous anesthésie gazeuse d'une durée de 5 min, soit 1 procédure invasive sous anesthésie générale et sans réveil d'une durée de 1h30; enfin les prélèvements tissulaires seront réalisés sous anesthésie chimique sans réveil.
Impact sur les animaux
Concernant les souris contrôles, aucune nuisance n'est attendue à l'exception du prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse. Concernant les souris spécifiques (s'agissant d'un génotype dommageable : suivi et entretien de la lignée), certaines nuisances peuvent apparaitre (sang dans les fèces, prolapsus). Compte tenu des risques de souffrance pouvant apparaitre en lien avec l'avancée de la maladie, le maintien et l'entretien de la lignée implose une classification de gravité sévère. Dans les cas où ces symptômes évocateurs d'une souffrance animale seraient atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole et une mise à mort éthique sera effectuée sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de procéder aux différentes analyses et prélèvements de tissus.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en oeuvre.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal : surface de section transversale des fibres musculaires qui permet d'apprécier l'ampleur de la perte de masse musculaire Après avoir intégré différents paramètres statistiques, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 14 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R et nous permettra d’évaluer les différences significatives pour l'analyse des données.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères : le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
L'essentiel des études expérimentales consacrées à la cachexie associée au cancer a été réalisé en utilisant des modèles souris de cancer. En travaillant sur le modèle souris nous pourront donc comparer nos données à celles de la littérature scientifique. Par ailleurs notre expertise scientifique et technique sur le modèle souris, nous permettra de réaliser ce projet sans étape de mise au point préalable. Afin d'étudier la régulation de l'axe corticotrope lors de la cachexie associée au cancer, les souris seront analysées à un stade pré-cachectique (absence de perte de masse musculaire) à l’âge de 11 semaines et à un stade cachectique (présence d'une perte de masse musculaire) à l'âge de 15 semaines. Nos travaux antérieurs ont permis de valider ces 2 points d'analyse. Des souris de type sauvage issues des mêmes portées que les souris mutées seront utilisées comme animaux contrôles.
Rôle du récepteur au LDL cholestérol dans les effets hypocholestérolémiants du bypass gastrique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit un génotypage par biopsie de la queue, une chirurgie de bypass gastrique ou une simple laparotomie sous anesthésie, des prélèvements sanguins hebdomadaires puis une mesure létale de l'absorption du cholestérol, pour étudier le rôle d'un récepteur intestinal dans les effets de la chirurgie bariatrique. Le porteur indique une mortalité postopératoire de 0 à 30 %, des douleurs sur cinq jours, un risque de désunion de la cicatrice et une dénutrition. Il affirme que ce système biologique intégré ne peut pas être "substitué" par des approches in vitro et ne retient que les expériences jugées "indispensables".
Objectifs
L’obésité, problème majeur de santé publique concernant actuellement plus d’un adulte sur 20 dans le monde, est associée de manière significative à de nombreuses complications métaboliques. La chirurgie bariatrique est le traitement de référence de l’obésité. L’objectif de ce projet est d’étudier la fonction intestinale d’un récepteur présent à la surface des cellules intestinales sur les effets hypocholestérolémiants de ces chirurgies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus d’un tel projet s’inscrivent dans la réflexion, d’actualité, autour des chirurgies métaboliques et de leur indication chez des patients obèses présentant des comorbidités variées. Les retombées attendues d’un tel projet seront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques du bypass gastrique. Ces données pourront permettre, à l’avenir, de mieux adapter le type de chirurgie au profil métabolique des patients, voire de développer des molécules pouvant cibler ces mécanismes pour le traitement des dyslipidémies.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie caudale à l'âge de 5-6 jour pour déterminer par PCR leur génotype. Les animaux subiront tous une chirurgie de type By-pass gastrique Roux en Y (RYGB) ou laparotomie seule (Sham) sous anesthésie générale et analgésie appropriée. Du sang sera prélevé à l’extrémité de la queue après anesthésie cutanée locale chez les animaux vigiles avant la chirurgie puis une fois par semaine. A J21 après la chirurgie, une mesure de la tolérance au glucose sera réalisée par gavage d’une solution glucosée. Du sang sera prélevé à la queue chez les animaux vigiles 0, 15, 30, 60 et 120 min après le gavage. Les animaux seront ensuite euthanasiés par ponction cardiaque (prélèvement de 1mL de sang) après mesure de l’absorption et de l’excrétion du cholestérol sous anesthésie générale et analgésie appropriée.
Impact sur les animaux
La biopsie caudale initiale de génotypage induit une douleur légère de courte durée. En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : - Une mortalité entre 0 et 30% après chirurgie - Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée - Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale - Une dénutrition qui nécessite une supplémentation ferrique et vitaminique quotidienne
Devenir
La mesure de l’absorption intestinale et de l’excrétion du cholestérol est une procédure létale.
Remplacement
Les conséquences physiologiques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Il n’existe pas malheureusement à l’heure actuelle de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Des protocole péri-opératoire et post-oératoire ont été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal, et palier aux risques d'anémie et de carences nutritionnelles. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse ( de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront placées en couveuse pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.
Choix des espèces
Les conséquences physiologiques et métaboliques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines et dans les pathologies hépatiques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. A ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale. A 8 semaines, les souris seront mises sous un régime hyperlipidique pour atteindre (après 12 à 16 semaines) un poids supérieur à 40g compatible avec une bonne tolérance aux chirurgies bariatriques
Entretien d’une lignée de souris portant une invalidation du gène de la SELENOT dans les neurones POMC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardées pour la reproduction ou tuées. Ce projet entretient une lignée invalidée pour le gène SELENOT dans certains neurones, le seul geste décrit étant une biopsie de la queue sous anesthésie pour génotypage. Les animaux de génotype inadéquat et les couples qui ne produisent plus de portées sont mis à mort. Le porteur justifie l'élevage par l'étude du rôle de cette protéine dans l'obésité, possible selon lui seulement sur un organisme intégré.
Objectifs
La SELENOT est impliquée dans le contrôle du stress cellulaire suggérant que cette protéine pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique et qu’un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités. Lors d'un régime riche en graisses (high fat diet, HFD) chronique, les neurones hypothalamiques développent un stress qui induit une résistance à la leptine et à l'insuline, et conduit à un gain de poids. Les données récentes ont permis d’établir que le développement des circuits hypothalamiques contrôlant l'homéostasie énergétique sont altérés par le stress qui est associé à l'obésité, entraînant une diminution de la production et de la sécrétion de l'hormone centrale de l'homéostasie énergétique. Ces observations suggèrent que les neurones hypothalamiques pourraient être avantageusement ciblés pour le traitement des dysfonctionnements des neurohormones causés par le stress associé à l'obésité.
Bénéfices attendus
L'obésité et le diabète de type 2 connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans de sorte que la pandémie de "diabesity" actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que l’hypothalamus de sujets obèses est soumis à un stress oxydatif et inflammatoire permanent, suggérant que des facteurs de contrôle de ce stress pourraient être impliqués dans l’homéostasie énergétique et constituer des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. La SELENOT que nous avons mise en évidence pour ses fonctions protectrices des cellules sécrétrices présente plusieurs avantages qui peuvent en faire une cible thérapeutique très intéressante pour combattre l'obésité et le diabète de type 2 qui lui est associé. En effet, la SELENOT réduit le stress cellulaire en général. Elle peut agir aussi bien au niveau du cerveau que dans d'autres organes impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique. Les études intégrées que nous projetons de réaliser avec les souris requièrent des analyses in vivo qui pourront déboucher sur des applications chez des patients atteints d'obésité et de diabète de type 2.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biopsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie.
Impact sur les animaux
Une biopsie caudale est nécessaire pour génotyper les animaux; cette biopsie peut entrainer des douleurs chez l’animal. Ces douleurs seront évaluées et réduites/atténuées par l’utilisation d’analgésiques.
Devenir
L'ensemble des animaux générés dans ce projet sera destiné à la reproduction et à l'entretien d'une lignée de souris. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ou ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précédemment décrites. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Remplacement
Les études métaboliques y compris le contrôle de la prise de nourriture et de la glycémie ne sont possibles que dans un système intégré et nécessitent donc l’utilisation d’animaux modèles afin d’avoir une approche physiologique de l’implication de la SELENOT dans le contrôle de l'homéostasie énergétique.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant un génotype précis. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux qui sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes qui n’existent pas chez d’autres modèles mammifères. La reproduction des animaux est faite à partir de 8 semaines de vie pour étudier la physiologie adulte.
Modulation de l’immunité humorale induite contre l’AAV chez le lapin pour une ré-injection efficace du vecteur AAV.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
10 lapins mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque lapin reçoit deux à quatre injections intraveineuses et jusqu'à quinze prélèvements sanguins sur environ deux mois et demi, avant d'être tué pour analyser la répartition du produit dans ses tissus, dans le but de tester des stratégies limitant la réaction immunitaire aux vecteurs de thérapie génique. Le porteur indique n'attendre aucun effet indésirable notable au-delà d'un possible hématome à l'oreille. Il précise poursuivre des travaux déjà menés sur des primates non humains et des lapins, et écarte les méthodes in vitro comme incapables de reproduire ces conditions biologiques.
Objectifs
Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (AAV) sont actuellement les plus utilisés dans les thérapies par transfert de gènes in vivo pour le traitement des maladies génétiques. Ces vecteurs sont efficaces et bien tolérés. Cependant, leur utilisation en thérapie génique peut être limitée (i) soit en raison d’une immunité pré existante à l’AAV due à l'exposition naturelle de l'homme à certains virus AAV, (ii) soit à une réponse immunitaire déclenchée par l’administration d’un vecteur AAV thérapeutique. En conséquence, un grand nombre de personnes avec une immunité pré existante ne pourront pas bénéficier de la thérapie génique AAV. D’autre part, le traitement est souvent limité à une seule injection de par le déclenchement d’une réponse immunitaire. Dans des études précédentes, chez le primate non humain et chez le lapin, ayant une immunité pré existante pour l’AAV thérapeutique testé, nous avons démontré qu’une enzyme, une endopeptidase, était capable par son action spécifique, de diminuer cette immunité, et donc d’augmenter l’efficacité de l’AAV thérapeutique. Actuellement, l’utilisation d’endopeptidases est le traitement le plus prometteur pour pallier à une réponse immunitaire dans un contexte de thérapie génique. D’autre part, dans une étude récente sur le primate non humain avec une immunité pré existante à l’AAV, nous avons obtenu une première preuve de concept en ce qui concerne une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité : méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’AAV, nommé "AAV à capside vide" ne pouvant donc pas transférer de gène). L'objectif de cette étude est d'évaluer l'efficacité et la sécurité de ces différentes stratégies : (i)Comparaison entre une injection d'endopeptidase et la méthode de déplétion des anticorps (ii)Comparaison de chacun de ces traitements avec la combinaison des deux traitements
Bénéfices attendus
L'objectif de cette étude est d'évaluer l'efficacité et la sécurité de ces différentes stratégies : (i)Comparaison entre une injection d'endopeptidase et la méthode de déplétion des anticorps (ii)Comparaison de chacun de ces traitements avec la combinaison des deux traitements Ce traitement combiné pourrait être intéressant en thérapie génique, en particulier chez les patients avec une pré immunité forte ou lorsqu’une nouvelle administration du vecteur est nécessaire. Ces 2 stratégies permettraient de diminuer, voire d’annuler 1-soit une pré immunité, ainsi un plus grand nombre de patients pourront bénéficier de de la thérapie génique AAV 2-soit une réponse immune suite à l'administration du vecteur AAV thérapeutique, permettant ainsi la possibilité d'une deuxième injection thérapeutique
Procédures
Un total de 10 lapins sera inclus dans l’étude. Les 10 lapins seront répartis en 5 groupes, à raison de 2 lapins par groupe, et seront soumis aux interventions suivantes : (i)Selon leur groupe d’appartenance, les animaux vigiles auront de 2 à 4 maximum injections intraveineuses/animal au cours de l’étude. Durée de l’intervention : 15 minutes/injection (ii) Tout au long de l’étude, les animaux vigiles seront soumis à des prélèvements sanguins dont le nombre variera de 6 à 15/animal selon leur groupe d’appartenance. Durée de l’intervention : 5 minutes /prélèvement (iii)Selon leur groupe d’appartenance, les animaux seront suivis soit pendant 21 jours, soit 79±3 jours, avant mise à mort par injection intraveineuse, sous anesthésie générale après analgésie préalable. Durée de l’intervention : 10 minutes
Impact sur les animaux
Les différents gestes réalisés sur les animaux vigiles en boite de contention, seront des gestes classiquement appliqués chez le lapin et pas ou peu invasifs : injections par voie intraveineuse et prélèvements sanguins par ponction veineuse. Il n’est donc pas attendu d’effet indésirable. Suite à un prélèvement sanguin, réalisé à l’oreille, un hématome pourrait être éventuellement observé. Les différents produits injectés ont déjà été administrés lors d’études antérieures chez l’animal, et aucun effet secondaire ou indésirable particulier n’a été observé. Au cas où un animal montrerait des signes de stress lors des injections, une anesthésie légère de courte durée serait alors réalisée.
Devenir
Les 10 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant environ 2.5 mois après l’injection du vecteur testé puis mis à mort pour prélèvements de tissus post-mortem. La décision d'euthanasier les animaux à des fins d'analyse post-mortem est prise pour obtenir des échantillons de tissus pour des tests spécifiques, tels que des analyses de biodistribution (la répartition du médicament dans le corps) ou des examens histopathologiques (étude des tissus pour détecter d'éventuelles anomalies). Ces études sont cruciales pour évaluer la sécurité et l'efficacité d'une thérapie potentielle avant d'envisager des essais sur des êtres humains.
Remplacement
Dans une précédente étude chez le lapin avec une immunité pré existante au produit thérapeutique testé, nous avions déjà étudié l'activité de l’endopeptidase, enzyme capable par son action spécifique, de diminuer cette immunité pré existante, et donc d’augmenter l’efficacité du produit thérapeutique. Notre étude faisant suite à cette dernière, nos résultats viendront la compléter. Aussi, nous devons poursuivre avec le même modèle animal, et ne pouvons donc pas avoir recours à des méthodes substitutives, telles que les études in vitro. Par ailleurs, ces dernières ne peuvent pas fournir les informations nécessaires pour comprendre pleinement l'efficacité de cette enzyme dans des conditions biologiques plus complexes et plus proches de la réalité.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude (n=10) a été déterminé sur la base d’études précédentes en thérapie génique. Ce nombre est réduit à son minimum tout en assurant une exploitation possible des résultats. En effet, la constitution de 5 groupes différents permettra d'évaluer l'efficacité et la sécurité des injections d'IdeS par rapport aux injections de capsides vides d'AAV (méthode de déplétion des anticorps) et de les comparer à la combinaison des deux traitements, en présence de niveaux élevés d'anticorps neutralisants anti-AAV.
Raffinement
L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement (techniciens animaliers et vétérinaire). Les administrations expérimentales ainsi que les prélèvements sanguins se dérouleront sans anesthésie. Ces actes étant peu douloureux, aucun protocole analgésique ne sera mis en place d'emblée pour ces actes. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les lapins seront hébergés en groupe, en box sur résine avec copeaux, durant toute l'étude.
Choix des espèces
Dans une précédente étude chez le lapin avec une immunité pré existante au produit thérapeutique testé, nous avions déjà étudié l'activité de l’endopeptidase, enzyme capable par son action spécifique, de diminuer cette immunité pré existante, et donc d’augmenter l’efficacité du produit thérapeutique. Notre étude faisant suite à cette dernière, nos résultats viendront compléter ces premiers résultats prometteurs. C’est pourquoi nous utiliserons la même espèce, le lapin. 10 lapins (Lapin blanc de Nouvelle Zélande) mâles (4 mois, 3-4 kg) seront inclus dans l’étude. Il s'agit de jeunes adultes, matures sur le plan immunitaire notamment, stade essentiel à notre étude.