Système endocrinien

1 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements de sang répétés, des chirurgies d'ablation ou de greffe de tissu adipeux, des expositions au froid à 4°C ou à 30°C et des tests de comportement, pour étudier le rôle des tissus adipeux bruns dans le vieillissement. Le porteur signale comme nuisances la douleur post-chirurgicale, le stress des températures d'hébergement et de l'isolement, et fixe une mise à mort à 20 % de perte de poids. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. L'objectif actuel est de promouvoir le vieillissement en bonne santé en déterminant des paramètres biologiques permettant de mesurer et de prédire son évolution. Le métabolisme énergétique est un régulateur clé de la longévité et de l’allongement de la vie en bonne santé. Les tissus adipeux (TA) jouent un rôle très important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de l’organisme et leur dysfonctionnement pourrait contribuer à l’altération des fonctions de l’organisme au cours de l’âge. Alors que les TA blancs sont spécialisés dans le stockage et la libération de l’énergie, les TA bruns et beiges (ces derniers résultant de la transformation de certains dépôts de TA blancs en TA de type brun lors de différents stress comme l’exposition au froid) dissipent l’énergie sous forme de chaleur. Alors que leur activité est associée à la santé cardio-métabolique chez l’homme, les mécanismes par lesquels les TA bruns et beiges protègent l’organisme des désordres métaboliques associés au vieillissement restent encore mal compris. Le métabolisme redox correspond à l’ensemble des réactions de transfert d’électrons et constitue ainsi le socle du métabolisme énergétique. Plusieurs travaux ont montré que les adipocytes bruns et beiges sont activés suite à une l'altération de l'état redox cellulaire. Nous posons l’hypothèse selon laquelle les TA bruns et beiges permettraient de gérer des stress redox à l’échelle systémique et ainsi de protéger l’organisme contre les désordres métaboliques associés au vieillissement. Nous utiliserons le modèle murin chez lequel les TA bruns et beiges ont été très étudiés. Nous mesurerons la réponse des souris présentant des TA bruns et beiges activés ou inactivés à des stress redox systémiques en mesurant l’état redox plasmatique en cinétique au cours du stress. Les stress redox seront induits par des injections de métabolites ayant un impact fort sur l’équilibre redox (lactate, pyruvate et glucose). Par ailleurs, le rôle des TA bruns et beiges sur la trajectoire de vieillissement des animaux sera étudié. Le syndrome de fragilité et la perte de fonctions cognitives, indicateurs cliniques d’un vieillissement en mauvaise santé, seront étudiés à l’aide de tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier le rôle des TA bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique au cours de l’âge. Ces données permettront de mieux comprendre les processus médiés par les TA bruns/beiges qui contribuent à la perte de l’homéostasie énergétique de l’organisme au cours de l’âge et de mettre en évidence des biomarqueurs et/ou des cibles thérapeutiques d’intérêt pour restaurer l’homéostasie énergétique.

Procédures

Dans certaines procédures, des prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles, au maximum 10 prélèvements pendant une heure, juste avant la mise à mort. Dans certaines procédures, une injection sera réalisée sur souris vigiles : soit une seule injection (≤15 secondes par souris), soit une injection par jour pendant 5 jours consécutifs suivi d’une dernière injection 7 jours après. Dans certaines procédures, des procédures chirurgicales (ablation ou greffe de tissu adipeux) seront réalisées sous anesthésie générale, avec deux injections (≤15 secondes par souris) le jour de la chirurgie (analgésique avant et anti-inflammatoire après la chirurgie), puis une injection (≤15 secondes par souris) par jour pendant les deux jours suivant la chirurgie d’un anti-inflammatoire. Dans certaines procédures, les souris seront soumises à des tests comportementaux. Les tests pourront durer de quelques minutes à 45 minutes, la durée dépendra des capacités de l’animal ou sera de 5 à 8 minutes selon les tests.

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - des problèmes liés à l’anesthésie, - une perte de poids et une douleur à court terme suite à la chirurgie (ablation de tissu adipeux et transplantation), - le stress lié à l’isolement et à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux températures d’hébergement de 30°C ou de 4°C - le stress lié à la contention nécessaire pour les injections dans la cavité intra-péritonéale. Les souris invalidées génétiquement ne présentent pas de phénotype dommageable dans les conditions standard ainsi que dans les conditions d’hébergement utilisées dans cette étude.

Devenir

Au terme de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la régulation du métabolisme redox systémique par les tissus adipeux bruns et beiges. Bien que des modèles d’organoïdes de différents tissus soient actuellement développés, étudier les interactions métaboliques in vitro entre différents organoïdes présente encore beaucoup de limites. La réalisation de notre projet nécessite un modèle intégré permettant une étude à l’échelle de l’organisme entier, impliquant des échanges entre différents tissus ayant des spécificités bien distinctes. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie, compte tenu de la variabilité interindividuelle observée dans le contexte de vieillissement et de la variabilité de certaines mesures que nous effectuerons, des groupes de 10 souris par condition seront formés afin de mettre en évidence des différences statistiques. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit au minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisant pour réaliser les tests statistiques et avoir des données fiables. Mettre moins d’animaux dans chaque groupe serait prendre le risque de devoir refaire ces expériences pour pouvoir obtenir des différences significatives entre les différents groupes. Pour comparer deux groupes, des tests paramétriques ou non paramétriques en séries non-appariées seront réalisés ; pour des comparaisons multiples, des tests appropriés avec post-tests seront utilisés. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour les analyses métaboliques (par spectrométrie de masse et résonnance magnétique nucléaire) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques (mesures d’activités enzymatiques par exemple). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation et pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Par ailleurs, chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et de partager les prélèvements le cas échéant.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …), ainsi que surveillées et pesées une fois par semaine par une personne impliquée dans le projet. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle pour minimiser toute douleur. Les chirurgies seront réalisées par le personnel compétent et un suivi post-opératoire sera réalisé une à deux fois par jour. Les points limites sont : perte de poids (20% par rapport au poids initial), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique jugé par le zootechnicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance. Une grille de score comprenant les différents points limites a été établie et dès lors que le score atteindra une valeur de 9 sur 12, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et du vieillissement et dans lequel la biologie des tissus adipeux bruns et beiges a été particulièrement bien étudiée. De plus, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients et des défauts d’utilisation de certains métabolites dans les tissus adipeux. Enfin, la cinétique du vieillissement est bien décrite chez la souris, et cette espèce permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (2 à 3 ans) que celle du rat (2 à 3.5 ans) ou encore du cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris contrôles et présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients à différents âges (2, 5, 12 et 24 mois) afin de caractériser le rôle des tissus adipeux bruns et beiges dans le métabolisme et dans la mise en place de la fragilité et du déclin cognitif au cours de l’âge. Ces âges ont été sélectionnés grâce à des données qui montrent des changements progressifs et spécifiques à chacun de ces temps dans différents organes. La réponse des souris présentant des défauts d’utilisation de certains métabolites sera évaluée chez des souris jeunes âgées de 2 mois. L’exposition à 30°C sera réalisée chez des souris de 2 mois, soit pendant 2 mois (temps efficace pour inactiver les tissus adipeux bruns et beiges), soit pendant 16 mois (pour étudier les conséquences à long terme sur la fragilité et le déclin cognitif des animaux). L’exposition à 4°C sera réalisée chez des souris âgées de 4 ou 18 mois, afin de déterminer si l’âge impacte la capacité de réponse des animaux au froid. L’ablation du tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 2 mois tandis que la greffe de tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 18 mois (du tissu adipeux brun de souris âgées de 2 mois sera greffé).

1 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un changement de régime alimentaire pendant quatre semaines et des prélèvements de sang par incision de la queue, pour étudier le rôle de l'inflammation dans une maladie du foie liée au diabète et à l'obésité. Le porteur indique que 880 souris de bon génotype sont gardées vivantes pour la reproduction et que les 840 autres sont tuées en fin de procédure pour prélever le foie. Il décrit les modèles in vivo comme "indispensables" et affirme qu'ils "ne peuvent pas être substitués".

Objectifs

Les maladies comme le diabète et l'obésité sont généralement associées à une accumulation excessive de lipides dans le foie. Cette accumulation anormale de lipides va induire le développement de la maladie du foie, qui pourrait évoluer vers complications ou même cancer du foie. Il est bien établi aujourd'hui que les cellules immunitaires jouent un rôle important dans la mise en place de cette pathologie. Cependant, les mécanismes sont moins bien connus. Ce projet de recherche fondamentale vise à déchiffrer les mécanismes de ces cellules dans le foie en utilisant un modèle de souris afin de déterminer le spectre des conséquences associées au diabète et à l'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de déchiffrer les rôles des cellules immunitaires dans les altérations du foie associées au diabète et à l'obésité. Il permettra une meilleure compréhension des mécanismes gouvernant l’inflammation du foie et pourrait définir une nouvelle approche thérapeutique dans l’obésité et ses complications.

Procédures

Changement de régime alimentaire pour l'induction de la maladie du foie, 4 semaines par animal. Microcoupure de l'extrémité de la queue, 10 secondes, 1 fois par animal. Prélèvement sanguin par incision de l'extrémité de la queue, 10 secondes, 3 fois par animal.

Impact sur les animaux

Régime alimentaire induisant une perte de poids. Coupure au bout de la queue qui peut entraîner une douleur légère.

Devenir

Les animaux non utilisés (femelles et/ou de mauvais génotype) sont mis a mort. Des animaux femelles et males avec le bon génotype sont gardés en vie pour la reproduction. L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer les tissus d'intérêt, notamment le foie pour analyse ultérieures.

Remplacement

Pour étudier le métabolisme systémique et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables et ne peuvent pas être substitués.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris générera donc de nombreuses informations. Nous avons calculé le nombre minimal de souris à utiliser dans cette étude pour obtenir le nombre de cellules suffisantes pour réaliser les différentes analyses à la fin de l’étude.

Raffinement

Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. La grille de score a donc été adaptée de façon à veiller au bien-être des animaux sans mettre en péril les résultats et sa fréquence sera portée à 2 fois par semaine. C'est le poids des animaux qui déterminera la durée de la procédure du groupe et n'excédera jamais 4 semaines. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un accès à l'eau et à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le milieu est enrichi avec une maison et du coton compacté de façon à faire leur nid.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l’étude de l’obésité et du diabète. Les gènes impliqués dans ces conditions jusqu’à présent identifiés chez l’Homme sont conservés chez la souris. La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont adaptées à ce projet. Les souris seront génotypées à 10 jours. Les souris utilisées auront 16 - 18 semaines au début de la procédure, ce qui correspond à la maturité sexuelle des souris soit la stabilisation hormonale. A la fin de la procédure, les souris seront âgées de 20 à 22 semaines. Il s’agit de souris adultes.

2 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génotypées entre 5 et 12 jours de vie par la coupe de 2 mm de queue et marquées par micro-tatouage des orteils, des gestes qui provoquent selon le porteur un "état de stress et de douleur", elles passent des tests de reconnaissance d'objets nouveaux ou de localisation d'objets, et reçoivent jusqu'à deux injections de corticostérone ou d'autres molécules. Elles peuvent aussi subir une chirurgie d'une heure et demie, scalp ouvert, pour l'implantation d'une canule, d'une fibre optique ou d'un dispositif d'enregistrement. Les traitements des troubles de la mémoire liés au stress viennent plus tard : le projet en "ouvrira ensuite la voie", écrit le porteur. Il juge les cultures cellulaires et les simulations informatiques trop limitées, et affirme qu'il "n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale".

Objectifs

Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui régulent les effets cognitifs du stress, via la sécrétion d’une hormone (la corticostérone), et d'établir (et à long terme d'exploiter) les propriétés thérapeutiques potentielles des substances cannabinoïdes dans les troubles liés au stress. On sait qu'une interaction entre les corticostéroïdes et le système endocannabinoïde intervient dans la régulation des processus cellulaires impliqués dans les troubles de la mémoire. Ceci est exclusivement connu pour les animaux mâles. C'est pourquoi, dans ce projet, un premier objectif est d'étudier si les mécanismes d'altération de la mémoire induits par la corticostérone sont les mêmes chez les animaux femelles. Des preuves suggèrent également l'implication d'une autre sous-population de récepteurs cannabinoïdes dans l'altération de l'effet du stress et de la corticostérone sur les processus de mémoire spatiale. Nous souhaitons répondre aux questions suivantes : (i) quel est le mécanisme par lequel la corticostérone altère la mémoire, (ii) comment la corticostérone engage-t-elle le système endocannabinoïde dans les processus de mémoire affectés, et (iii) quel est le rôle de calcium dans cet effet ? Ce projet ouvrira ensuite la voie au développement de stratégies thérapeutiques efficaces pour les troubles de la mémoire liés au stress.

Bénéfices attendus

Le stress est associé à plusieurs états pathologiques, dont les déficits cognitifs. Les actions des corticostéroïdes dans le cerveau peuvent provoquer des effets aigus et chroniques dans plusieurs zones du cerveau qui sont associées à la mémoire. Ce projet contribuera à donner un nouvel éclairage sur la modulation de la mémoire par les corticostéroïdes. Bien que l'effet du stress et des corticostéroïdes sur la mémoire ait été bien décrit dans diverses études humaines et animales et que le rôle du système endocannabinoïde dans ces effets ait commencé à attirer l'attention, les détails de cette interaction corticostéroïde-endocannabinoïde affectant la mémoire sont largement inconnus. Ce projet a pour but de caractériser les processus moléculaires induits par les corticostéroïdes et liés à l'apparition des déficits de mémoire. À cet égard, ce projet aidera à disséquer l'interaction des corticostéroïdes avec le système endocannabinoïde impliquée dans les différents processus de mémoire. En contribuant à disséquer davantage les déficits cognitifs liés au stress, ce projet débouchera sur de nouvelles stratégies de traitement des troubles associés.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les souris seront soumises à des tests comportementaux pour évaluer leur capacité de mémoire (test de reconnaissance d'objets nouveaux ou test de mémoire de localisation d'objets). Ces tests consistent en 3 essais sur 3 jours consécutifs, chacun durant 9 ou 10 minutes, respectivement. Dans le cadre de ces tests de mémoire, l'animal subira des injections de différentes molécules afin de tester l'implication de différentes protéines dans l'effet du stress sur la mémoire. Les animaux recevront au maximum 2 injections de molécules différentes (à au moins 30 minutes d'intervalle), dont une sous-cutanée et une intrapéritonéale. De plus, les souris subissent également une procédure chirurgicale comprenant l'injection d'une molécule ainsi que l'implantation d’un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement. Ces interventions chirurgicales durent typiquement 1,5h.

Impact sur les animaux

Les différentes procédures décrites dans ce projet varient en fonction de leurs effets sur les souris. En fonction des résultats obtenus, la nécessité d'effectuer des expériences supplémentaires conformes aux procédures sera évaluée. Les lignes suivantes décrivent ce que les animaux subiront au maximum. En fonction des retours expérimentaux, certains animaux pourraient ne pas subir l’intégralité de la procédure. Comme nous utilisons des lignées de souris mutantes, chaque procédure comprend le génotypage, qui se fait en coupant 0,2 cm de l'extrémité de la queue des souris à l'âge de p5-p12 et, pour une identification future, les orteils des pattes seront tatoués par micro-tatouage. Cela provoque un état de stress et de douleur chez l'animal. Nous utiliserons des tests de mémoire. Pour tester l'effet des corticostéroïdes sur les performances de la mémoire, les souris recevront une injection des molécules qui interagit avec le system du stress. Un animal ne recevra pas plus de deux injections et ces deux injections seront espacées d'au moins 30 minutes. Ces manipulations conduisent à un état de stress chez les souris. Les niveaux élevés de corticostérone dans le sang, déclenchés par une injection directe de corticostérone, se normalisent en 1 à 2 heures. De même, les autres composés injectés n'agissent pas plus de quelques heures sur l'animal. De plus, les animaux subissent une intervention chirurgicale. Les animaux seront manipulés et soumis à une anesthésie générale [induction à l'isoflurane 5,0 % - entretien à 2,0 %]. Il a 3 phases d’anesthésie lors de la procédure. L’animal peut ressentir du stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boite à induction) et de réveil. Au cours de ces opérations, le scalp des animaux est ouvert, ce qui peut entraîner un risque d'infection et un inconfort après l'opération. Par ailleurs, l’animal peut présenter un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant l’opération. Pour les procédures 3 et 4, l'implantation d'une fibre optique ou d'une canule représente un risque supplémentaire d'infection. De plus, ces implants augmentent le temps d'inconfort après la chirurgie car l'animal doit s'adapter.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'utiliser les cerveaux pour des analyses biochimiques ou électrophysiologiques ou, en cas de manipulation préalable (injection de molécules ou d'implants), pour l'histologie qui permettra de vérifier la présence des molécules et la et l'implantation correcte.

Remplacement

Pour comprendre les mécanismes complexes de la mémoire, qui dépendent du comportement actif du rongeur, nous ne pouvons malheureusement pas utiliser des méthodes alternatives plus simples (cultures cellulaires in vitro, modèles informatiques in silico) car celles-ci fournissent des informations trop limitées et ne peuvent reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. La réponse au stress et aux niveaux élevés de corticostéroïdes dans le cerveau est immensément complexe et peut influencer le comportement des souris et de tout autre organisme de manière cruciale. L'effet des corticostéroïdes sur différentes cellules du cerveau a déjà été décrit. Dans une prochaine étape, l’observation des effets des corticostéroïdes au comportement est cruciale pour mieux comprendre les conséquences cognitives du stress. En ce qui concerne l'effet de la corticostérone sur le calcium, nous utilisons un modèle in vitro complexe d'une région cérébrale majeure impliquée dans les processus de mémoire. Pour relier les résultats obtenus à partir de ces expériences ex vivo aux processus de mémoire, nous nous appuyons malheureusement sur les performances comportementales actives des souris afin de garantir la transposition à une situation in vivo.

Réduction

Pour le R de réduire, en effectuant un petit nombre d'expériences pilotes au début de ce projet, nous pouvons réduire considérablement le nombre d'expériences ultérieures (et donc le nombre d'animaux) nécessaires pour tirer des conclusions. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour dégager une conclusion statistique solide à partir de cette population. La réalisation de l'ensemble de ce projet nécessite l'utilisation d'un maximum de 2856 souris sur une période de 5 ans. Ce nombre est justifié par l'utilisation de différentes approches comportementales et pharmacologiques dans plusieurs lignées de souris avec différentes modifications des protéines que nous souhaitons étudier. Pour les études incluant le comportement et l’analyse moléculaire, les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne dépasseront pas le chiffre de 12. Ce nombre de souris est le minimum requis pour avoir une signification statistique et est conforme aux études antérieures utilisant des méthodologies similaires. Cependant, si nos premières expériences montrent qu'il est possible de réduire le nombre de souris, ce nombre sera réduit en conséquence.

Raffinement

Lorsque les animaux arrivent, ils sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et l'environnement d'élevage des souris est enrichi (matériel de nidification). Les animaux sont logés dans des cages collectives et pas dans des cages individuelles, avec un environnement enrichi (matériel de nidification) et un accès libre à l'eau et à la nourriture. Nous attendons au moins 1 semaine (7 jours) pour permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 20% sur deux jours consécutifs, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Cette évaluation est basée sur un gille de score qui comprend des aspects comportementaux et physiques et des mesures seront prises en fonction des scores obtenus. Ainsi, si le score est supérieur à ce qui est décrit sur la grille de score, l'animal sera euthanasié après consultation de la vétérinaire référente. Si le score ne passe pas ce seuil fixe, des mesures conservatoires seront mises en place. Ces mesures comprennent la mise en place de matériel d'enrichissement supplémentaire comme des tunnels ou des grésillements en cas de comportement agressif, des soins adéquats en cas de blessures cutanées, l'application de médicaments analgésiques en cas de signes de douleur, injection de sérum physiologique chaud, hébergement temporaire en enceinte thermostatée et maintien du régime à base de la nourriture humide. En cas de chirurgie, nous procédons à une anesthésie générale des animaux et pendant la procédure chirurgicale, toute hypothermie sera prévenue à l'aide d'un tapis chauffant. Le dessèchement oculaire sera prévenu par administration de gel ophtalmique. Une analgésie de la zone de chirurgie et aussi une analgésie générale sera appliquée. Dans la période postopératoire un analgésique sera administré systématiquement pour éviter la douleur et répétée une fois par jour pour 2 jours. De plus, le poids des souris sera enregistré quotidiennement pendant 5 jours en post-chirurgie. La mise en place des points limites chez l'animal repose sur une évaluation comportementale (voir ci-dessus) et le suivi de leur courbe de poids (réduction de plus de 20% de son poids sur 2 jours consécutifs).

Choix des espèces

Pour évaluer l'implication du système endocannabinoïde dans la régulation des effets du stress et de la corticostérone et de ses conséquences sur l'apprentissage et la mémoire, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée. De plus, la grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de formation de la mémoire ainsi que l'étude du système endocannabinoïde ont été réalisées dans le modèle murin. Par ailleurs, l'utilisation de lignées de souris transgéniques est l'épine dorsale technologique de cette étude. Donc, la grande majorité des outils génétiques disponibles pour étudier la fonction de protéines spécifiques sont disponibles exclusivement dans le modèle murin. Enfin, les infrastructures sont équipées pour l'étude systématique de la souris et pour assurer le bien-être approprié requis. Les souris utilisées seront adultes (âgées de 8 à 14 semaines post natales). Cela se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence, impliquant notamment une fluctuation de l’abondance et de la répartition du récepteur CB1 lors de cette période. En outre, cela nous permet de rester cohérents avec la littérature, car la plus grande quantité de souris adultes utilisées pour des expériences comportementales est âgée de 8 à 14 semaines.

2 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des gavages ou injections quotidiens jusqu'à deux mois, sont isolées quarante-huit heures pour la calorimétrie, subissent des prélèvements sanguins et une série de tests moteurs (rotarod, marche, force de préhension, suspension, tapis roulant) et de tolérance au glucose, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur reconnaît le stress de l'isolement, des mises à jeun et des gavages répétés pouvant irriter l'œsophage. Il affirme que l'action systémique des métabolites ne peut être étudiée que "in vivo" et justifie des groupes de dix animaux par la variabilité liée au vieillissement.

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Or, il a récemment été montré que le vieillissement du tissu adipeux blanc (TA) pouvait avoir un impact délétaire sur la fonction musculaire, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, on retrouve les métabolites, de petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence un défaut de production de certains métabolites par le TA âgé qui corrèle avec une diminution de leur concentration circulante et intra-musculaire chez la souris âgée. Compte tenu de leur importance dans le maintien de l'intégrité musculaire, un défaut d’approvisionnement des métabolites du TA vers le muscle au cours du vieillissement pourrait participer au développement du processus sarcopénique ainsi qu’aux désordres métaboliques qui lui sont associés (intolérance au glucose, résistance à l’insuline). Ainsi, l'objectif de ce projet est 1. de tester si une carence en métabolites-cibles identifiés comme sous-produits par le TA avec l’âge participe à la faiblesse musculaire et aux désordres métaboliques qui lui sont associés. 2. de tester si supplémenter ces métabolites - individuellement ou en combinaison - chez la souris âgée (afin de restaurer leur disponibilité systémique) permet de prévenir/contrecarrer la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l'âge. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2), certains équipements nécessaires au phénotypage de nos animaux n’étant disponibles que dans l’EU1 ou que dans l’EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sarcopénie liée à l’âge en évaluant l’impact d’une carence en métabolites-cibles (précédemment identifiés comme étant déficitaires au cours du vieillissement) sur la mise en place des désordres musculaires et métaboliques associés à l’âge. Le potentiel thérapeutique de leur supplémentation chez la souris adulte/âgée devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir/contrecarrer le développement du processus sarcopénique ainsi que les désordres métaboliques qui lui sont associés.

Procédures

Certains animaux recevront un traitement pharmacologique quotidien soit par gavage (moins de 15 secondes par souris), soit par injection intra-péritonéale ou sous-cutanée (moins de 15 secondes par souris) pour une durée maximale de 2 mois (EU1/2). D'autres animaux seront supplémentées avec les métabolites-cibles de façon non invasive pour une durée de 2 à 6 mois en intégrant ces molécules à leur eau de boisson ou à leur nourriture (EU1/2). Ces animaux pourront être soumis à des prises de sang à la veine de la queue (espacées d'au moins 6 semaines, durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris) (EU1/2). Leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système de résonance magnétique nucléaire (RMN) (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (isolement en cage individuelle pendant 48h) (EU2/2). Leur fonction musculaire pourra être évaluée à l'aide de différent tests non invasifs (mesure de l'équilibre avec le système Rotarod (durée: 5 minutes maximum, répétée 2 fois avec 15 minutes de repos entre 2 essais ; analyse de leur démarche lors d'une marche spontanée à l’aide d’un test de distribution pondérale cinétique (KWB) (durée approximative: 5 minutes), mesure de leur force musculaire grâce à un dynamomètre relié à une grille (durée totale approximative: 5 minutes, 3 mesures consécutives séparées par 1 min de repos, expérience répétée une fois après 15 min de repos), test de suspension sur une grille inversée (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques secondes à 30 minutes), course sur tapis roulant (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques minutes à 45 minutes) (EU1/2). Des tests de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) pourront également être réalisés (prélèvements de sang durant les GTT/ITT pour la mesure de la glycémie à 8 temps donnés espacés de 15 minutes minimum (8 x 5 secondes) suite à un gavage au glucose (moins de 15 secondes par souris) pour la GTT ou une injection intra-péritonéale d'insuline (moins de 15 secondes par souris) pour l'ITT (EU1/2). L'ensemble de ces tests pourront être répétés jusqu'à 4 fois dans la vie de l'animal, avec une période minimale de 6 semaines entre deux tests.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : 1. stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée); 2. L’isolement des souris pour la calorimétrie indirecte (48h au total, acclimatation puis mesure) est une source de stress. Les animaux gardent toutefois un contact visuel avec leurs congénères dans les cages voisines et sont rapidement remis dans leur cage d’origine ; 3. stress au moment des manipulations pour les tests de caractérisation de la fonction musculaire et métabolique (habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux); 4. Des gavages répétés quotidiennement peuvent induire une irritation de l'oesophage et des injections intra-péritonéales ou sous-cutanées répétées quotidiennement une douleur au niveau du point d'injection (les sites d'injection seront changés chaque jour) 5. la mise à jeun des animaux représente une source de stress (le temps de jeûne sera limité à 6 heures). 6. les prises de sang à la queue sont source d'inconfort (prélèvement d'un volume restreint de sang (80ul) espacé de 15 jours au minimum)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie de la sarcopénie liée à l'âge et des désordres métaboliques qui lui sont associés, ainsi que leur potentielle amélioration par des stratégies de supplémentation en métabolites-cibles. Ceci nécessite de prendre en compte l'action systémique des métabolites-cibles administrés, ainsi que la contribution relative des différents organes métaboliques au phénotype, ce qui ne peut être réalisé que par une approche intégrée in vivo. Lorsque possible, une partie de l’étude sera réalisée sur des lignées immortalisées de cellules musculaires humaines afin de répondre à des questions plus ciblées ne nécessitant pas une approche intégrée.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques actuelles et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet. Compte tenu de la variabilité des capacités physiques et des paramètres métaboliques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 10 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Ce nombre d’animaux est classiquement utilisé dans la littérature pour réaliser ce type d'études, en particulier dans un contexte de vieillissement, où la variabilité inter-individuelle tend à augmenter avec l'âge. Dans un souci de réduction, le projet a été designé de façon à réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes d'animaux dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. De plus, une veille bibliographique sera effectuée afin d'éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes de recherche sur les mêmes molécules. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour l’analyse du métabolome (par spectrométrie de masse) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Lors du transport des animaux, l’enrichissement de leur cage sera multiplié afin de les occuper pendant le trajet (coton salivaire et bouts de bois à ronger en plus du matériel de nidification). Les animaux seront protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil ou des écarts de température. Leur exposition au bruit et aux vibrations sera limitée au maximum et les souris ne seront jamais transférées en présence d’espèces différentes – hors rongeurs – dans le même véhicule. Lors de leur arrivée à la zootechnie, les animaux seront placés en pièce d'acclimatation. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres). Les cages seront passées en revue deux fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés au moins une fois par semaine. Les tests fonctionnels seront réalisés suite à une habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux utilisés, afin de réduire le stress engendré et améliorer la reproductibilité des résultats. De plus, en ce qui concerne la stratégie de supplémentation en métabolites-cibles, une approche physiologique non invasive via leur eau de boisson/nourriture sera privilégiée afin d'améliorer le bien être animal et réduire le stress lié aux expérimentations. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris de différents âges : 3-6 mois pour les souris « jeunes », 10-14 mois pour les souris adultes d'âge moyen et 18-24 mois pour les souris « âgées » afin de caractériser la contribution d'un déficit en métabolites-cibles dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques qui lui sont associés au cours du vieillissement.