Biologie du développement

Des femelles "réformées", déjà destinées à la mise à mort par l'animalerie, sont utilisées pour prélever les embryons qui servent à tester les stratégies d'édition génétique. 325 souris au total vont être utilisées, 125 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 200 un niveau modéré. Les donneuses reçoivent deux injections espacées de deux jours puis sont tuées pour qu'on prélève leurs embryons, et les porteuses subissent une chirurgie de réimplantation de dix minutes. Elles sont tuées après le sevrage de leurs petits, au motif qu'une femelle déjà opérée ne peut pas être réutilisée, tandis que les souriceaux génétiquement modifiés partent vers le projet du chercheur qui les a commandés.

Objectifs

Lorsque l’on veut étudier les mécanismes biologiques complexes qui régulent le développement et le fonctionnement des mammifères, la souris est un modèle privilégié, autant pour sa facilité d'élevage que pour sa proximité génétique avec l'homme. Les recherches scientifiques en biologie s'appuient depuis de nombreuses années sur les souris modifiées génétiquement. La technique que nous utilisons consiste à délivrer un ciseau moléculaire (CRISPR/Cas9) dans un embryon de souris au stade 1 cellule, ce qui va introduire une modification génétique spécifique dans le génome. Les souriceaux issus de la réimplantation dans une mère porteuse sont testés pour détecter la modification génétique. Les animaux porteur de la modification sont ensuite accouplés pour établir une lignée génétiquement modifiée. Par rapport aux techniques précédentes (transgénèse par cellules souches embryonnaires notamment), la technique de CRISPR/Cas9 permet de produire des modèles expérimentaux plus rapidement, en utilisant moins d’animaux. Notre Institut a mis en place un plateau commun pour développer ces modèles de souris transgéniques. La mise à disposition de ce plateau équipé et de personnels expérimentés permet d’augmenter de façon importante les taux de réussite et donc à la fois de réduire le nombre d’animaux utilisés et de raffiner la mise en œuvre des procédures.

Bénéfices attendus

La souris est un modèle privilégié pour la recherche fondamentale en biologie, notamment lorsqu'il faut étudier les mécanismes complexes du développement, de la neurogénèse, etc... Les modèles transgéniques murins que nous réalisons sont indispensables pour mieux comprendre ces mécanismes. Les bénéfices attendus de ce projet sont de maintenir un niveau de compétence élevé du plateau commun, tant sur le plan matériel qu’humain, grâce à la prise en charge régulière de projets d’obtention de lignées transgéniques.

Procédures

Les animaux seront soit soumis à 2 injections d’une durée de 10 secondes chacune (espacées de 46-48 heures), soit soumis à une unique chirurgie d’un maximum de 10 minutes.

Impact sur les animaux

La réimplantation est une procédure chirurgicale qui peut entrainer des douleurs, des infections et du stress. Les signes de douleurs ne sont plus normalement présents le lendemain de la chirurgie. Les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 10 secondes. Ces injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum. Les animaux génétiquement modifiés peuvent éventuellement présenter un phénotype dommageable.

Devenir

Toutes les femelles donneuses seront mises à mort afin de pouvoir obtenir les embryons zygotes. Toutes les femelles porteuses seront mises à mort lorsque leurs petits auront été sevrés. En effet, nous ne pouvons pas réutiliser une femelle qui a déjà subi une chirurgie. Les animaux générés par le plateau technique seront transférés dans le projet du chercheur qui les utilisera.

Remplacement

Le modèle souris est un modèle d’étude indispensable pour les recherches qui sont menées dans notre institut, notamment pour les thématiques de biologie du développement. Même si des modèles in vitro de remplacement sont largement utilisés (modèles in silico, cultures cellulaires 2D, cultures de neurosphères, d’organoides), seuls les modèles animaux (la souris dans notre cas) permettent des études intégrées, reflétant la complexité d’un organisme entier. Les possibilités de remplacement seront aussi évaluées en amont par chaque responsable de projet accepté par la plateforme.

Réduction

La technique d’édition du génome CRISPR/Cas9 est très efficace. Grâce aux performants outils de bio-informatique disponible, il est possible d’optimiser les résultats, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour générer les souris fondatrices modifiées génétiquement. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences nécessaires, nous avons mis en place une expérience test in vitro pour vérifier/comparer les stratégies d’édition et ainsi choisir les outils les plus performants. Pour cette expérience, nous utilisons des femelles donneuses d’embryons issus de notre animalerie et qui sont réformées (et donc normalement destinées à la mise à mort). En sélectionnant la meilleure stratégie d’édition, nous pouvons limiter le nombre de femelles à réimplanter.

Raffinement

Pour la réimplantation, les souris porteuses reçoivent une injection d’analgésique 30 min avant d’être anesthésié. En fin de chirurgie, les souris reçoivent une injection d’analgésique. Après la chirurgie, la surveillance renforcée permettra une vigilance accrue en cours d’expérimentation et la détection de l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris, modèle mammifère dans lequel il est possible d’introduire des mutations génétiques ciblées ou des transgènes rapporteurs de l’expression d’un gène d’intérêt. C’est aussi le modèle génétique le plus proche de l’Homme. Dans ce contexte, les résultats obtenus à la suite des expériences proposées pourront potentiellement trouver une application dans des études d’intérêt thérapeutique chez l’Homme. Les femelles donneuses seront utilisées entre 4 et 7 semaines car c’est à cet âge qu’on obtient le plus grand nombre d'embryons au stade 1 cellule. Les femelles porteuses réimplantées seront mises à mort après le sevrage de leurs petits (on ne peut pas réutiliser un animal ayant déjà subi une chirurgie).

Parce que la rétine des souris porteuses de la mutation Loa n'a jamais été examinée, 1 359 souris vont être utilisées, 1 313 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 46 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus. Chaque animal de la lignée subit dans sa première semaine de vie une coupe de la queue pour génotypage, que le porteur réalise sans analgésie tout en indiquant ailleurs qu'elle peut provoquer une douleur aiguë. S'y ajoutent des électrorétinogrammes et des examens du fond de l'œil sous anesthésie générale, des injections dans l'œil d'embryons encore dans l'utérus de femelles gestantes, des injections sous-rétiniennes chez des souriceaux et un transport de moins de trente minutes entre deux établissements. Les souris Loa développent un déficit locomoteur progressif des membres postérieurs, et celles chez qui la douleur devient manifeste sont mises à mort.

Objectifs

La mutation d’un gène de protéine de transport dans l’œil de souris et du poisson-zèbre perturbe le fonctionnement de la rétine, notamment en entraînant la perte de cellules photosensibles appelées les photorécepteurs. Ces données suggèrent l’importance de ce gène dans l’intégrité de la rétine. Chez l'homme, des mutations de ce gène sont responsables d’une maladie appelée dynéinopathie qui se caractérise par un déficit dans le développement du système nerveux, soit au niveau des membres inférieurs (déficits locomoteurs), soit du cerveau. Environ 30% des patients présentent également des déficits visuels dont certains sont liés à des anomalies de la rétine. Une mutation spontanée de ce gène a été décrite chez la souris (nommée Loa). Cette mutation est similaire à celle retrouvée chez l'homme. Les souris Loa manifestent des déficits au niveau des membres (sans impacter sa capacité à se reproduire, s’alimenter…), qui sont similaires à ceux observés chez les patients. Chez ces souris, d'autres anomalies ont été également rapportées dans le cerveau. Cependant, l'œil, notamment la rétine, de ces souris n'a jamais été étudié. L'objectif du projet, qui se déroulera dans 2 établissements distincts, est divisé en 3 parties : 1/ amplifier et maintenir une lignée de souris Loa, 2/ étudier aux niveaux cellulaire et fonctionnel les rétines de souris Loa, et 3/étudier le rôle de ce gène à différents stades de développement de la rétine de souris sauvage à l’aide d’un traitement pharmacologique contre la protéine de transport. La comparaison des résultats entre les différentes souris fournira les premières données sur l’intégrité de la rétine des souris Loa et une meilleure compréhension du rôle de ce gène dans la régulation des fonctions rétiniennes.

Bénéfices attendus

L’implantation, sur site (EU1), d’une lignée de souris atteinte de déficits dans le développement du système nerveux, telle que la lignée Loa, permettra aux équipes de chercheurs de caractériser pour la première fois, les effets, spécifiquement in vivo, d’une mutation du gène de cette protéine de transport dans les processus du développement de la rétine. De la même manière, l’administration d’un traitement pharmacologique contre cette protéine directement dans la rétine de souris permettra d'étudier pour la première fois les effets, spécifiquement in vivo, de l'inhibition de cette protéine à différents stades de développement de la rétine. La comparaison des résultats entre les différentes souris et conditions de traitement devrait donc contribuer à une meilleure compréhension du rôle de cette protéine dans la régulation des fonctions rétiniennes, et à plus long terme au développement de nouvelles thérapies pour les patients souffrant d’anomalies de l'œil, notamment de la rétine.

Procédures

Ce projet comprend 5 procédures expérimentales. Pour les souris de la lignée Loa, la mutation du gène sera vérifiée en analysant l’ADN à partir d’un prélèvement de queue (< 1mm) effectué sur chaque animal dans sa première semaine de vie. Un suivi ophtalmologique des souris Loa sera réalisé à l'aide de trois méthodes non invasives: l'électrorétinogramme (ERG), l'observation du fond d'œil (FO) et la tomographie par cohérence optique (OCT), les deux dernières étant réalisées dans l'EU2. Ces techniques sont identiques à celles utilisées chez l’homme lors d’une évaluation ophtalmologique. Elles n'impliquent aucune intervention chirurgicale. Toutefois, nous précisons que les animaux sont placés sous anesthésie générale afin d'obtenir leur immobilité (durée

Impact sur les animaux

Dans la première semaine de vie, le génotypage des souris Loa/+ sera fait suite à une caudectomie (prélèvement de queue

Devenir

A la fin du projet tous les animaux auront été mis à mort afin de prélever les tissus qui seront utilisés pour réaliser les analyses cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Pour cette étude, l’animal ne peut être substitué par aucun modèle in vitro existant à ce jour. En effet, les modèles actuels ne permettent pas de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles. Néanmoins, l'effet d’une inhibition pharmacologique de notre protéine d'intérêta été étudié in vitro sur des cultures de cellules rétiniennes murines. Nos résultats montrent une altération du transport des lysosomes après 24h de traitement.

Réduction

Pour cette étude exploratoire, nous utiliserons au maximum 1359 animaux. Cet effectif a été estimé à l'aide d'analyses statistiques. Ce nombre pourra être réduit de deux manières : d’une part via une approche d’inclusion progressive dans le suivi ophtalmologique, et d’autre part via des études pilotes visant à mettre en évidence des déficits potentiels de la rétine. Par ailleurs, la période de gestation chez la souris est courte et le nombre d’embryons important, ce qui permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. De plus, nous pouvons comparer les animaux mutants avec leurs conspécifiques (+/+) issus des mêmes portées. L'avantage de la technique d'injection dans un organe pair tel que l'œil permet de réduire de moitié le nombre d'animaux. De plus, le nombre d'animaux est considérablement réduit grâce à la réalisation d'examens ophtalmologiques non invasifs permettant un suivi longitudinal sur le même animal. Enfin, le nombre d'animaux pourra être réduit si les résultats des études pilotes ne montrent pas de déficits rétiniens.

Raffinement

Les animaux en accouplement sont en trio continu ou une nuit, puis séparés si un accouplement est avéré. Les femelles gestantes et leurs portées ont une alimentation enrichie de la lactation au sevrage. La caudectomie réalisée dans la 1ère semaine de vie ne nécessite pas d'analgésie. Le stress et l'hypothermie sont diminué par un retour rapide à la mère et une lampe chauffante, respectivement. Zootechniciens et expérimentateurs font un suivi hebdomadaire pour alerter des premiers signes de dégradation du bien-être en portant attention à l'état général et comportemental. En cas de changements, des aliments humides sont mis dans la cage. En cas de douleur manifeste, l’animal est mis à mort. L'intervention sur femelles gestantes se fait sur tapis chauffant pour limiter l'hypothermie et sous anesthésie gazeuse et locale associée à une analgésie per- et post-opératoire. L’injection sous-rétinienne se fait sur animal placé sous anesthésie gazeuse et locale et sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Pour le transport entre les 2 EU (

Choix des espèces

Les souris Loa sont atteintes d'une mutation identique à une mutation décrite chez l'homme et qui mime parfaitement le déficit locomoteur, symptôme caractéristique. Ce modèle animal est reconnu comme modèle idéal permettant d'étudier les effets de la mutation humaine. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de fondateurs. Etant donné que la rétine n'a jamais été étudiée chez les souris Loa, nous analyserons plusieurs stades: embryonnaire (photorécepteurs immatures), postnatal (quand les photorécepteurs sont matures et fonctionnels), 1 mois (jeune), 2 mois (maturité sexuelle), 4 mois (jeune adulte), 6 mois (adulte) et 12 mois (âgé).

Superovulées par deux injections d'hormones, ou opérées sous anesthésie pour recevoir des embryons dans l'utérus, 300 souris femelles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 210 d'entre elles et modéré pour 90. Toutes sont tuées pour que les embryons soient collectés. Le projet consiste à bloquer l'inactivation du chromosome X chez des embryons de souris et à observer les conséquences sur leur développement, arrêté avant les deux tiers du terme. Le porteur affirme que le protocole retenu divise par cinq le nombre d'animaux utilisés par rapport à une approche classique, et que ses méthodes in vitro réduisent le recours à la souris sans pouvoir encore le remplacer.

Objectifs

Chez les mammifères femelles, un des deux chromosomes X est rendu silencieux, c’est-à-dire que la majorité des gènes ont une expression « éteinte ». On dit alors que le chromosome X est inactivé. Ce phénomène permet d’éviter que l’ensemble des gènes présents sur le chromosome X soient deux fois plus exprimés chez les mammifères femelles par rapport aux individus mâles qui n’ont qu’un seul chromosome X. A l’heure actuelle, il devient clair que l’échappement à l’inactivation du chromosome X contribue à la différence physiologique entre les sexes ainsi qu’à la susceptibilité à de très nombreuses maladies. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de régulation d’inactivation du chromosome X afin de mieux aborder les différences de pathologies entre hommes et femmes et leurs traitements. L’objectif du projet est d’évaluer chez la souris l’impact de la perte de l’inactivation du chromosome X dans le développement embryonnaire de femelles. Nous génèrerons des embryons où cette inactivation est bloquée et leur analyse permettra de comprendre quels sont les gènes du chromosomes X qui doivent être rendus silencieux afin d’avoir un niveau d’expression équivalent dans des embryons mâles. Nous souhaitons notamment comprendre si ce processus est nécessaire au développement de certains ou de tous les types de cellules d’un embryon. Ces analyses permettront d’appréhender l’importance du dosage de ces mêmes gènes dans l’espèce humaine, en conditions normales comme pathologiques.

Bénéfices attendus

Chez l’être humain, un défaut d’inactivation du chromosome X peut être associée à certaines pathologies tel que des maladies auto-immunes, des cancers du sein et de l’ovaire ou des troubles psychiatriques. De plus, chez la souris, des études ont montré que l’absence d’inactivation du chromosome X peut induire des malformations au niveau du système nerveux ou induire une inflammation. Notre projet vise à bloquer le processus d’inactivation du chromosome X dans la totalité d’un embryon de souris et d’en analyser son impact au cours du développement embryonnaire. Nous souhaitons comprendre si ce processus est nécessaire au développement de certains ou de tous les types de cellules d’un embryon. A court terme, cette étude nous permettra également d'identifier les gènes du chromosome X dont le niveau d’expression doit être impérativement régulé en comparant les résultats de cette étude avec ceux obtenus lors d'expériences réalisées in vitro. L’identification des gènes dont le niveau est modifié par l’absence d’inactivation du chromosome X permettra de comprendre à plus long terme les causes de pathologies liées au chromosome X.

Procédures

Des souris femelles vigiles recevront deux injections d'hormones pour induire une superovulation afin de collecter des embryons. D’autres souris, analgésiées et anesthésiées recevront une chirurgie pour implanter des embryons.

Impact sur les animaux

Un stress léger lié à la contention et à l’introduction d’une aiguille pendant moins de 5 secondes pourra être engendré sur les animaux. Des douleurs d’intensité modérée d’une durée de 24 heures en lien avec la chirurgie pourront également être observées.

Devenir

Toutes les souris seront mises-à-mort afin de collecter les embryons.

Remplacement

Les méthodes alternatives in vitro disponibles ne permettent pas de répondre à toutes les questions posées par ce projet. En effet, ces approches ne permettent pas d’étudier le rôle de l’inactivation du chromosome X dans tous les types de cellules d’un embryon, ou tout au long de son développement. De plus, elles ne récapitulent pas non plus les effets sur l’ensemble d’un organisme. Bien que nos méthodes in vitro ne permettent pas encore de remplacer totalement l’utilisation de la souris, elles en réduisent son utilisation. Ces méthodes sont donc complémentaires

Réduction

Pour notre étude, nous utiliserons un protocole permettant de modifier des embryons sans établir des lignées de souris transgéniques Le nombre de souris nécessaires et subissant un acte invasif sera donc réduit. Plusieurs études ont montré que l’utilisation de ce protocole permettait de réduire d’un facteur 5 l’utilisation d’animaux par rapport à une approche traditionnelle. De plus, afin de limiter leur nombre, nous avons déterminé le nombre minimal d’animaux à utiliser sur la base d’une analyse bibliographique d’études similaires. Enfin, nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour comparer les différents échantillons.

Raffinement

Les souris donneuse d’embryons ou les souris porteuses seront sélectionnées sur la base d’un scoring de leur état de santé. La chirurgie permettant l’implantation des embryons sera réalisée par un personnel expérimenté ayant une formation en chirurgie. La durée d’isolement de l’animal au moment du réveil sera réduite à un maximum d’une heure. La douleur de l’animal sera prise en compte et atténuée par un traitement analgésique au cours de la procédure et sera adapté en post-opératoire en fonction d’un scoring. Les souris ayant atteint un point limite seront mises-à-mort. Le protocole sera arrêté avant les 2/3 du développement embryonnaire permettant de limiter les effets dommageables induits par la mutation.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en recherche biomédicale pour comprendre les mécanismes régulant le développement embryonnaire. En effet, l’embryon de souris présente une organisation similaire à celui de l’homme et les mécanismes régulant sa formation sont proches. De plus, la souris donne accès à une grande variété d’outils génétiques et à des lignées de cellules souches embryonnaires cultivées en laboratoire qui permettent de remplacer partiellement l’utilisation d’animaux. Enfin, l’utilisation de la souris permet d’analyser également l’impact d’une modification génétique sur l’ensemble d’un organisme. Au cours de ce projet, nous étudierons le rôle de l’inactivation du chromosome X, un processus spécifique aux mammifères, au cours du développement embryonnaire. La souris est donc l’espèce mammifère la plus adaptée pour réaliser notre étude. Nous utiliserons d’une part des souris femelles prépubères de 4 à 6 semaines pour collecter des embryons et d’autre part, nous utiliserons des souris femelles de 8 à 20 semaines comme mères porteuses. Les embryons collectés et analysés ne dépasseront pas 12 jours de développement.

Amputées de l'extrémité de la queue dans leur première semaine de vie et sans analgésie, génotypées, puis suivies par électrorétinogramme, fond d'œil et tomographie sous anesthésie, les souris de la lignée Loa sont transportées jusqu'à neuf fois entre deux établissements. D'autres subissent une laparotomie sur femelle gestante pour injecter l'œil des embryons dans l'utérus, avec un risque d'avortement, de saignements et d'infection de la plaie, ou une injection sous la rétine au stade nouveau-né. 1 359 souris vont être utilisées, dont 46 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et les autres en souffrance légère. Les souris Loa portent une mutation qui provoque une ataxie des pattes arrière et un poids inférieur de 10 à 20 % à celui des témoins, et toutes sont tuées en fin de projet pour prélever les tissus de la rétine, jamais étudiée jusqu'ici chez cette lignée.

Objectifs

La mutation d’un gène de protéine de transport dans l’œil de souris et du poisson-zèbre perturbe le fonctionnement de la rétine, notamment en entraînant la perte de cellules photosensibles appelées les photorécepteurs. Ces données suggèrent l’importance de ce gène dans l’intégrité de la rétine. Chez l'homme, des mutations de ce gène sont responsables d’une maladie appelée dynéinopathie qui se caractérise par un déficit dans le développement du système nerveux, soit au niveau des membres inférieurs (déficits locomoteurs), soit du cerveau. Environ 30% des patients présentent également des déficits visuels dont certains sont liés à des anomalies de la rétine. Une mutation spontanée de ce gène a été décrite chez la souris (nommée Loa). Cette mutation est similaire à celle retrouvée chez l'homme. Les souris Loa manifestent des déficits au niveau des membres (sans impacter sa capacité à se reproduire, s’alimenter…), qui sont similaires à ceux observés chez les patients. Chez ces souris, d'autres anomalies ont été également rapportées dans le cerveau. Cependant, l'œil, notamment la rétine, de ces souris n'a jamais été étudié. L'objectif du projet, qui se déroulera dans 2 établissements distincts, est divisé en 3 parties : 1/ amplifier et maintenir une lignée de souris Loa, 2/ étudier aux niveaux cellulaire et fonctionnel les rétines de souris Loa, et 3/étudier le rôle de ce gène à différents stades de développement de la rétine de souris sauvage à l’aide d’un traitement pharmacologique contre la protéine de transport. La comparaison des résultats entre les différentes souris fournira les premières données sur l’intégrité de la rétine des souris Loa et une meilleure compréhension du rôle de ce gène dans la régulation des fonctions rétiniennes.

Bénéfices attendus

L’implantation, sur site (EU1), d’une lignée de souris atteinte de déficits dans le développement du système nerveux, telle que la lignée Loa, permettra aux équipes de chercheurs de caractériser pour la première fois, les effets, spécifiquement in vivo, d’une mutation du gène de cette protéine de transport dans les processus du développement de la rétine. De la même manière, l’administration d’un traitement pharmacologique contre cette protéine directement dans la rétine de souris permettra d'étudier pour la première fois les effets, spécifiquement in vivo, de l'inhibition de cette protéine à différents stades de développement de la rétine. La comparaison des résultats entre les différentes souris et conditions de traitement devrait donc contribuer à une meilleure compréhension du rôle de cette protéine dans la régulation des fonctions rétiniennes, et à plus long terme au développement de nouvelles thérapies pour les patients souffrant d’anomalies de l'œil, notamment de la rétine.

Procédures

Pour les souris de la lignée Loa, la mutation du gène sera vérifiée en analysant l’ADN à partir d’un prélèvement de tissu effectué sur chaque animal vigil dans sa première semaine de vie. Un suivi ophtalmologique des souris Loa sera réalisé sur animaux anesthésiés à l'aide de trois méthodes non invasives: l'électrorétinogramme (ERG), l'observation du fond d'œil (FO ) et la tomographie par cohérence optique (OCT, durée ), les deux dernières étant réalisées dans l'EU2. Ces techniques sont identiques à celles utilisées chez l’homme lors d’une évaluation ophtalmologique. Elles n'impliquent aucune intervention chirurgicale et durent entre 15 et 60 minutes. Pour réaliser les injections dans l'œil des embryons en place dans l’utérus (technique appelée injection in utero), des femelles gestantes de souris sauvages sont placées sous anesthésie générale et locale (durée

Impact sur les animaux

Le prélèvement tissulaire nécessaire pour caractériser génétiqueme,nt les nouveaux-nés entraîne un inconfort/une douleur aigue légère. La laparotomie sur femelle gestante peut induire des douleurs abdominales et des complications post-opératoires (avortement, saignements vaginaux ou de la plaie, inflammation de la suture, infection de la plaie, plaie ouverte). L’injection in utero dans l’œil d’embryons n’engendre, en général, aucune lésion ni altération rétinienne. L’injection sous-rétinienne chez les souriceaux n’engendre aucune lésion ni altération de la rétine . Lors du transport vers l'EU2 (

Devenir

A la fin du projet tous les animaux auront été mis à mort afin de prélever les tissus qui seront utilisés pour réaliser les analyses cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Pour cette étude, l’animal ne peut être substitué par aucun modèle in vitro existant à ce jour. En effet, les modèles actuels ne permettent pas de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles. Néanmoins, l'effet d’une inhibition pharmacologique de Dync1h1 (et de son solvant) a été étudié in vitro sur des cultures de cellules rétiniennes murines. Nos résultats montrent une altération du transport des lysosomes après 24h de traitement avec l'inhibiteur.

Réduction

Pour cette étude exploratoire, nous utiliserons au maximum 1359 animaux. Cet effectif a été estimé à l'aide d'analyses statistiques. Ce nombre pourra être réduit de deux manières : d’une part via une approche d’inclusion progressive dans le suivi ophtalmologique, et d’autre part via des études pilotes visant à mettre en évidence des déficits potentiels de la rétine. Par ailleurs, la période de gestation chez la souris est courte et le nombre d’embryons important, ce qui permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. De plus, nous pouvons comparer les animaux mutants avec leurs conspécifiques (+/+) issus des mêmes portées. L'avantage de la technique d'injection dans un organe pair tel que l'œil permet de réduire de moitié le nombre d'animaux. De plus, le nombre d'animaux est considérablement réduit grâce à la réalisation d'examens ophtalmologiques non invasifs permettant un suivi longitudinal sur le même animal. Enfin, le nombre d'animaux pourra être réduit si les résultats des études pilotes ne montrent pas de déficits rétiniens.

Raffinement

Les animaux en accouplement sont en trio continu ou une nuit, puis séparés si un accouplement est avéré. Les femelles gestantes et leurs portées ont une alimentation enrichie de la lactation au sevrage. La caudectomie réalisée dans la 1ère semaine de vie ne nécessite pas d'analgésie. Le stress et l'hypothermie sont diminué par un retour rapide à la mère et une lampe chauffante, respectivement. Zootechniciens et expérimentateurs font un suivi hebdomadaire pour alerter des premiers signes de dégradation du bien-être en portant attention à l'état général et comportemental. En cas de changements, des aliments humides sont mis dans la cage. En cas de douleur manifeste, l’animal est mis à mort. L'intervention sur femelles gestantes se fait sur tapis chauffant pour limiter l'hypothermie et sous anesthésie gazeuse et locale associée à une analgésie per- et post-opératoire. L’injection sous-rétinienne se fait sur animal placé sous anesthésie gazeuse et locale et sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Pour le transport entre les 2 EU (

Choix des espèces

Les souris Loa sont atteintes d'une mutation identique à une mutation décrite chez l'homme et qui mime parfaitement le déficit locomoteur, symptôme caractéristique. Ce modèle animal est reconnu comme modèle idéal permettant d'étudier les effets de la mutation humaine. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de fondateurs. Etant donné que la rétine n'a jamais été étudiée chez les souris Loa, nous analyserons plusieurs stades: embryonnaire (photorécepteurs immatures), postnatal (quand les photorécepteurs sont matures et fonctionnels), 1 mois (jeune), 2 mois (maturité sexuelle), 4 mois (jeune adulte), 6 mois (adulte) et 12 mois (âgé).