Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Création d’un modèle de greffe de neurones de cervelet de primates dans le cervelet de souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Légèrement immunodéficientes pour tolérer des neurones d'une autre espèce, les souris de ce projet reçoivent des greffes de neurones de cervelet humains, de primates non-humains et de souris. 985 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par chirurgie terminale sous anesthésie pour prélever leur cerveau. La greffe se fait soit in utero, la mère gestante étant opérée sous anesthésie générale pendant moins de quinze minutes avec injection dans le cerveau des fœtus, soit par injection dans le ventricule cérébral du souriceau nouveau-né. Le porteur revendique une approche qui évite l'expérimentation sur des primates non-humains et sur des humains, et annonce 985 animaux au maximum sans détailler le calcul qui aboutit à ce chiffre.
Objectifs
Le développement des neurones du cervelet des espèces de primates, dont l’espèce humaine, reste largement inexploré, malgré l’implication du cervelet dans des troubles cognitifs (autisme), du langage (dyslexie), et moteurs (ataxies). En particulier, se pose la question de propriétés propres aux neurones humains et de primates comparés aux autres espèces animales, dont la souris. Pour répondre à cette question, des protocoles de différentiation in vitro de cellules souches humaines en neurones du cervelet ont été publiés. Cependant, ces approches ne récapitulent pas le développement et l’anatomie normales du cervelet (mauvaise organisation ou absence de certaines structures anatomiques, croissance des neurones limitée, absence de stimulations sensorielles). C’est pourquoi nous proposons de créer un modèle de greffe de ces neurones humains, primates et de souris dans le cervelet de souris. Cette approche permettra d’étudier les propriétés propres aux neurones de cervelet de ces différentes espèces, sans expérimentation sur des individus humains et primates non-humains. Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre de parenté entre espèces. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les propriétés propres aux neurones cérébélleux humains. Le développement de notre modèle de greffe permettra d’étudier in vivo des neurones d'espèces variées dont de primates non-humains et humains dans un contexte pathologique (spectre autistique, ataxie cérébelleuse, dyslexie). Il pourrait ainsi ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces troubles. La greffe elle-même pourrait aussi être envisagé comme approche thérapeutique pour les troubles du cervelet humain et des autres espèces de Mammifères.
Procédures
Procédure 1: greffe in utero sous anesthésie générale de la mère suivie d'injection cérébrale sur foetus (
Impact sur les animaux
La greffe in utero est une technique chirurgicale qui peut entrainer une douleur et un stress modérés pendant l’opération (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et utilisés dans les procédures décrites pour analyses histologiques.
Remplacement
Les modèles in vitro différentiés à partir de cellules souches humaines sont encore trop immatures, manquent certaines structures anatomiques, et de stimulation sensorielle, ce qui ne sera pas le cas in vivo. De plus, notre étude in vivo pourrait permettre d’augmenter nos connaissances pour améliorer les protocoles de différentiation in vitro.
Réduction
Ce projet nécessitera au maximum 985 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. De plus, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans des cages ventilées d'une surface adéquate, dans un environnement enrichi, et changés sous flux d'air. Soins spécifiques apportés à la mère gestante. La greffe in utero est effectuée dans une pièce dédiée, après désinfection de la mère, sous analgésie locale et générale, et anesthésie, en température contrôlée (
Choix des espèces
Notre approche permet d’étudier les propriétés propres aux neurones du cervelet d’espèces de primates non-humains et humains sans avoir recours à l’expérimentation sur des animaux primates. Une option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait l’utilisation d’une autre espèce de Vertébré telle que le poisson zèbre, qui possède également un cervelet. Cependant l’organisation et le développement du cervelet chez les Vertébrés non-mammifères est trop divergente comparé aux Mammifères pour pouvoir interpréter nos expériences et envisager une bonne intégration dans des réseaux différents de ceux des Mammifères. Les animaux seront utilisés au stade embryonnaire et au stade postnatals critiques dans le développement des neurones du cervelet de souris et humain.
Prélèvement de tissu pour identification de souris génétiquement modifiées destinées à l’exploration du développement cérébral
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour l'étude du développement du cortex cérébral, 46 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les nouveau-nés sont contenus une minute pour une biopsie de queue prélevée entre le septième et le dixième jour de vie, geste dont le porteur indique qu'il provoque un stress et une légère souffrance. L'effectif tient à l'objet même du projet, qui consiste à génotyper des portées entières pour trier les animaux selon leur mutation. Les souriceaux dont le génotype ne correspond pas à celui attendu sont tués dès la lecture du résultat, les autres partent vers d'autres projets scientifiques ou vers la reproduction.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent la formation du cerveau dans le contexte physiologique mais aussi pathologique. L’utilisation de souris génétiquement modifiéess nous aident à mieux caractériser notamment les mécanismes de la génération, la migration et de la mise en place de l’identité cellulaire des différents types neuronaux.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’augmenter la connaissance scientifique sur la formation du cerveau en condition physiologique ou pathologique.
Procédures
Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue sera prélevée.
Impact sur les animaux
La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress et une légère souffrance chez l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure si leur génotype n'est pas celui attendu ou après accouplement, les autres seront utilisés dans des projets scientifiques.
Remplacement
Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées que sur des cerveaux prélevés sur des embryons ou des animaux adultes. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les stratégies d’accouplements sont basées sur des expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux afin de réaliser au mieux les expériences et maintenir les lignées.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure1. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum pour leur tatouage et sont surveillés après l’intervention pour vérifier qu’ils sont bien acceptés par leur mère.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le developpement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. La biopsie caudale à lieu entre les jours 7 et 10 des nouveaux-nés quand les animaux sont suffisamment grand pour subir le geste technique et suffisamment tot pour avoir le temps de déterminer leur génotypes et pouvoir les regrouper selon le résultat au moment du sevrage.
Développement et physiopathologie de l’appareil neuromusculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
580 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour des gestes qui durent chacun quelques secondes, cinq pour la biopsie du bout de la queue, trente pour une injection intrapéritonéale. Toutes sont tuées afin de prélever leurs organes, et les femelles adultes le sont pour que soient récupérés leurs embryons à quatorze, seize et dix-huit jours de développement. Le but déclaré est de comprendre comment les nerfs moteurs et les muscles s'apparient chez l'embryon. Les retombées annoncées pour l'être humain, mieux comprendre la dégénérescence musculaire du vieillissement et des myopathies, restent au conditionnel, quand la mise à mort des mères et de leurs embryons est déjà programmée.
Objectifs
Le système neuromusculaire nous permet de respirer, marcher, manger, sourire. Les muscles squelettiques et les neurones moteurs permettant le mouvement dégénèrent au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans nombreuses myopathies d’origine génétique. Dans ce dernier cas les fibres musculaires sont en perpétuel renouvellement grâce à l’activation des cellules souches du muscle qui sont recrutées pour tenter de réparer la fibre. Lors d’exercices intenses les fibres musculaires peuvent augmenter de volume ou se casser, et là aussi, les cellules souches du muscle réparent les fibres endommagées ou permettent l’augmentation de leur taille. La compréhension des mécanismes qui président à la formation des muscles et de leurs cellules souches associées chez l’embryon, à l’appariement correct des neurones moteurs sur les fibres en croissance. L’objectif principal de cette étude sera de caractériser les interactions nerf moteur-muscle, d’identifier les mécanismes mis en jeu dans la mise en place et le maintien de ce dialogue qui peuvent être perturbés.
Bénéfices attendus
L’étude porte sur la mise en place des interactions entre les nerfs moteurs et les muscles chez l’embryon. Nos études devraient permettre de mieux comprendre cette mise en place et son maitien qui peut être observée au cours du vieillissement chez l’homme et au cours de pathologies du muscle ou du motoneurone moteur. Les études menées amélioreront nos connaissances sur les interactions muscle-nerf moteur en prenant en compte le neurone permettant le mouvement et le muscle.
Procédures
Sur animaux vigiles : Le prélèvement unique d’une biopsie de l’extrémité de la queue pour génotypage (5 secondes). Une injection unique en intrapéritonéal (30 secondes par souris).
Impact sur les animaux
Une douleur légère et de courte durée est occasionnée lors de la biopsie de l'extrémité de la queue des animaux en vue de leur génotypage. Une douleur légère et de courte durée et un stress passager sont occasionnés lors de l’injection en intrapéritonéal des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.
Remplacement
Nous utilisons un modèle de souris car il mime la mise en place des différents muscles squelettiques et des neurones moteurs qui les innervent au cours du développement embryonnaire, et nous renseigne de manière unique sur le dialogue et les propriétés de l’interaction nerf muscle en physiologie et en physiopathologie. Les modèles cellulaires ne permettent pas à ce jour de comprendre la diversité de ce dialogue et ne permettent pas de reconstituer la diversité des types de neurones moteurs permettant le mouvement et des fibres musculaires associées.
Réduction
Nous prélèverons le maximum de tissus sur les animaux mis à morts, pour éviter l’utilisation ultérieure de nouveaux lots d’animaux. Nous veillerons enfin à utiliser au maximum les mêmes lots d’animaux contrôle quand cela est possible, pour éviter d’avoir à élever et mettre à mort des animaux surnuméraires.
Raffinement
Le milieu d’hébergement est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maison en carton. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience, et le lendemain de l’injection d'un anti-oestrogène afin de déceler des signes de douleur. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. Des points limites ont été définis entrainant la mise à mort anticipée ou l'administration d'un analgésique si nécessaire.
Choix des espèces
Les muscles et les nerfs moteurs humains sont bien conservés chez la souris, qui est de ce fait un bon modèle. Le modèle de souris permet d’accéder à tous les acteurs qui contrôlent la formation des muscles et des nerfs moteurs associés, sa diversité et sa physiopathologie. Les femelles adultes et leurs embryons à 14, 16 et 18 jours de développement sont utilisés pour mieux comprendre la mise en place et les conséquences du dialogue entre le muscle en croissance, son innervation et ses propriétés de contraction.
Mécanismes cellulaires régissant le développement normal et pathologique des circuits sensoriels et moteurs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
9 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue : 992 femelles gestantes, 3 325 nouveau-nés âgés de 2 à 15 jours et 4 387 embryons prélevés au dix-huitième jour de gestation. Les femelles subissent une ouverture de l'abdomen de trente minutes pour une injection d'ADN dans le cerveau ou l'œil de leurs embryons, geste dont le porteur indique qu'il peut rompre le sac embryonnaire et conduire à la mort in utero ou à la naissance d'un petit non viable. Les nouveau-nés reçoivent une injection de marqueur dans les deux yeux, ou sont anesthésiés par le froid et opérés sans réveil. 8 960 de ces animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour un travail de recherche fondamentale sur la formation des circuits visuels et moteurs.
Objectifs
Notre système nerveux est un réseau complexe au sein duquel une connectivité précise entre les neurones est essentielle au bon fonctionnement du système. Cette connectivité neuronale est établie au cours du développement embryonnaire par une succession de processus incluant : (i) la migration neuronale, une étape qui détermine la position des neurones dans le système nerveux, (ii) le guidage axonal, un processus permettant aux axones en croissance d'atteindre les cibles avec lesquelles ils doivent établir des connections, et enfin une dernière étape permettant l’élimination des connexions surnuméraires ou inappropriées. Le dysfonctionnement d’une ou plusieurs de ces étapes est à l’origine d’un spectre de maladies neurodéveloppementales allant des malformations cérébrales aux maladies psychiatriques et est à l’origine de certaines maladies neurodégénératives. Au cours du développement embryonnaire, le comportement des neurones et de leur axone en croissance est dicté par un environnement très complexe incluant des signaux chimiques (molécules de guidage), physiques (cellules et axones voisins, vaisseaux sanguins) et mécaniques (rigidité du tissu). Si de nos jours, ces signaux environnementaux sont pour la plupart connus, les mécanismes intracellulaires qui adaptent le comportement des axones en croissance à ces signaux restent largement ignorés. Notre projet vise à décrypter ces mécanismes en se concentrant sur deux acteurs cellulaires essentiels au développement neuronal: les molécules de signalisation et le squelette neuronal. Pour cela, nous utilisons une approche expérimentale combinant (i) le développement d'outils innovants pour moduler ces signaux et régulateurs du squelette neuronal, (ii) l'utilisation de systèmes biologiques complémentaires (systèmes acellulaire, cultures cellulaires et modèles murins) ainsi que (iii) des techniques de chirurgie (électroporation in utero) et d’histologie permettant étudier les conséquences sur le développement des circuits neuronaux d’une modulation de ces signaux et régulateurs du squelette. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux mécanismes essentiels à l’établissement des connectivités neuronales, d’apporter un éclairage nouveau sur l’origine de certaines pathologies visuelles (Ambliopie) et neurologiques et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour préserver ou rétablir une connectivité fonctionnelle dans certaines conditions pathologiques (glaucome).
Bénéfices attendus
En décryptant les mécanismes cellulaires qui dictent les changements morphologiques et comportementaux des neurones en développement, notre projet apportera un éclairage nouveau sur les mécanismes fondamentaux régissantla formation des circuits visuels et moteurs au cours du développement embryonnaire ainsi que sur l’origine de certaines pathologies visuelles (albinisme, Ambliopie) et neurologiques (maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives). Il devrait également fournir de nouveaux outils et nouvelles cibles thérapeutiques pour pour prévenir/freiner la dégénérescence axonale et/ou rétablir des connectivités neuronales fonctionnelles dans certaines conditions pathologiques (ex : glaucome).
Procédures
Au cours de notre projet les animaux seront soumis à différentes interventions. Parmi elles : (I) une injection unique de marqueurs neuronaux dans les deux yeux sous anesthésie et analgésie. Cette intervention concerne des nouveau-nés âgés de 3 ou 15 jours et sa durée est de 20 minutes. (II) Une Injection in utero d’une solution d’ADN dans le cerveau ou l’œil d’embryons à 18 jours de gestation. Cette injection nécessite une chirurgie abdominale (laparotomie) sur des femelles gestantes préalablement analgésiées et anesthésiés. La procédure dure 30 min. (III) Une étape de chirurgie sans réveil pour l’animal sur des souriceaux âgés de 2 à 15 jours analgésiés et anesthésiés. Cette procédure a une durée inférieure à 30 min.
Impact sur les animaux
L’anesthésie par le froid des nouveaux nés peut entrainer un stress thermique. Il existe un très léger risque de réaction inflammatoire de courte durée (48 h) suite à l’injection intraoculaire des molécules permettant de marquer les axones rétiniens. Un faible risque de détresse respiratoire et de mortalité est également associé à l’anesthésie générale. Lors de la procédure d’électroporation in utéro, la rupture du sac embryonnaire entourant l’embryon peut conduire à la naissance d’un embryon sous développé et non viable en période postnatal voir même à sa mort in utero. De plus, dans le cadre de l’électroporation in utero, la femelle gestante pourrait éprouver une gêne, des douleurs et/ou du stress suite à la chirurgie abdominale. De plus, des problèmes au niveau de la mise bas pourrait survenir du fait de la manipulation des embryons lors de la procédure.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire et adaptée à l’âge de l’animal et ce afin de réaliser des analyses histologiques sur les embryons et nouveau-nés.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons chaque fois qu’il le sera possible des modèles cellulaires pour remplacer ou minimiser l’utilisation des modèles animaux. Notamment, nous effectuerons toutes les expériences de préselection des molécules d’interêt de notre étude sur différents modèles de cellules en culture. Seules les molécules les plus prometteuses seront ensuite analysées in vivo. Cette approche in vivo reste indispensable à la validation de l’importance des molécules étudiées pour le façonnage des connections neuronales et/ou de leur potentiel thérapeutique, les modèles in vitro ne pouvant pas récapituler la complexité des signaux chimiques (molécules de guidage), physiques (cellules et axones voisins, vaisseaux sanguins) et mécanique (rigité du tissu nerveux) guidant les axones en développement.
Réduction
La dissection des mécanismes cellulaires régissant l’établissement des réseaux neuronaux est complexe et requière grand nombre de conditions expérimentales. Afin de réduire au maximum les approches in vivo chez l’animal, nous utilisons des approches in vitro basées sur différents modèles cellulaires pour faire une pré-sélection de molécules ou gènes candidats. Sur la base de ce crible, nous avons pu réduire au maximum le nombre de lots expérimentaux nécessaires pour valider la pertinence de ces candidats pour la formation des circuits neuronaux in vivo. Ainsi, le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet sera de 9128. Ce nombre inclus 992 femelles gestantes, 3325 nouveau-nés âgés de 2 à 15 jours et 4387 embryons à 18 jours de gestation. Cette estimation se base sur des études précédentes de l’équipe utilisant des approches expérimentales équivalentes et des tests statistiques prédictifs. Ces analyses, nous permettent de réduire et d’estimer à 10 le nombre d’animaux par condition expérimentale requit pour obtenir des résultats statistiquement robustes compte-tenu de la variabilité inter-individus. L’analyse de nos données sera faite à l’aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Pour les animaux provenant de l’extérieur 5 jours d’acclimatation seront respectés avant expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées avec enrichissement selon les conditions respectant la règlementation en vigueur. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. La température (entre 20 et 24 degrés), l’hygrométrie (entre 45 et 55 pourcents) et l’éclairage sont contrôlés et conformes à la règlementation. La Structure Chargée du Bien-être Animal et le personnel qualifié de l’animalerie veillent au respect des règles et assurent une surveillance quotidienne des animaux. Les chirurgies sont réalisées par des personnels titulaires des formations adéquates et sont réalisées sous analgésie pré et post-opératoire et anesthésie générale. Pendant la chirurgie, les animaux sont maintenus sur coussin chauffant pour éviter toute hypothermie. Leurs yeux sont protégés par un gel lubrifiant pour prévenir la sécheresse oculaire. Le réveil se fait dans une chambre thermostatée à 30 degrés sous surveillance, avant le retour dans leur cage initiale. Après réveil, les animaux sont surveillés une fois par heure pendant 2 heures, puis tous les jours par les expérimentateurs ou le personnel de l'animalerie pour détecter d’éventuelles complications post-chirurgicales ( points limites) et réaliser les gestes nécessaires et adaptés (soin ou euthanasie). Une surveillance quotidienne des nouveau-nés sera également faite dès la naissance. En cas de détection de signes de souffrance, de rejet par la mère ou d’absence de lait dans l’estomac les petits seront euthanasiés. Après l’électroporation in utero, les femelles ayant subi une chirurgie au niveau de l’abdomen s’occupent moins bien de leur portée. Ainsi, des femelles gestantes sur lesquelles aucune procédure ne sera réalisée seront utilisées comme mères adoptives afin d’augmenter les chances de survie des petits électroporés. Enfin, afin de réduire le nombre d’animaux exclus des analyses statistiques pour électroporation non-optimale, une femelle gestante sauvage sera dédiée au raffinement de l’électroporation dans certains lots expérimentaux pour optimiser le ciblage des neurones d’intérêt.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’Homme génétiquement, anatomiquement et physiologiquement. De plus, l'organisation des circuits visuels et des circuits moteurs contrôlant la motricité volontaire est bien conservée entre la souris et l'humain, contrairement à d'autres vertébrés (zebrafish, poulet). La souris est aussi un modèle utilisé de longue date pour l’étude du système nerveux et visuel. De nombreuses données sont donc disponibles dans la littérature sur lesquelles notre étude peut se reposer. Encore, la souris reste le modèle de choix pour la génération d’animaux transgéniques (permettant l’étude de la fonction d’un gène dans un tissu d’intérêt ou à l’échelle de l’organisme entier) ou de modèles de pathologies humaines (visuelles, neurologiques) comme celles étudiées dans notre projet. Pour l’étude du système visuel comme pour le système moteur, nous nous intéresserons principalement aux stades embryonnaires et post-nataux afin d’étudier comment la connectivité neuronale entre la rétine et le cerveau ou le cerveau et la moelle épinière se met en place pendant le développement embryonnaire et se raffine en période post-natale. Nos études seront donc menées sur des embryons au 18ème jour de gestation et sur des nouveau-nés âgés de 2, 3, 8 ou 15 jours. Cette analyse temporelle, nous permettra d’identifier à quelle étape de ces processus développementaux la formation de ces circuits neuronaux, nos molécules de signalisation ou gènes d’intérêts jouent un rôle déterminant.
Mécanismes génétiques de la formation du système musculosquelettique cervical chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Nées de croisements de lignées transgéniques entretenues au laboratoire, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 160 d'entre elles et léger pour 80. Sur les animaux vivants, le seul geste décrit est une biopsie de l'oreille au sevrage pour lire le génotype, le reste du projet portant sur des embryons et des fœtus mutants récupérés après la mise à mort des mères gestantes, à cinq stades de gestation. Le porteur reconnaît que ces embryons portent des malformations du crâne et du cou, et affirme qu'elles ne provoquent ni détresse ni douleur pendant la gestation. Une partie des souris de génotype recherché est gardée en vie pour renouveler le stock de reproducteurs, l'ensemble étant tué à la fin du projet, et les individus non analysés seront selon ses mots "traités, stockés et exploités pour l'optimisation des protocoles".
Objectifs
Chez l’humain, certaines malformations de naissance touchent spécifiquement le système musculosquelettique cervical, comme dans les syndromes de Klippel-Feil et de Loeys-Dietz, pathologies rares mais sévères. Du point de vue génétique, il a été montré que des acteurs d'une voie de signalisation étaient mutés chez les patients, mais l’origine des malformations est encore inconnue. Une voie de signalisation est une séquence d'étapes impliquant plusieurs gènes qui fonctionnent ensemble pour contrôler les fonctions cellulaires. Afin de comprendre pourquoi la région cervicale est affectée dans ces pathologies, il est primordial d’élucider la fonction de la voie de signalisation TGF-beta au cours du développement embryonnaire sur des modèles animaux proches de l’humain sur l’échelle évolutive. Notre objectif est de générer de nouveaux modèles de souris mutées pour l’un des récepteurs à la TGF-beta permettant ainsi d’inactiver sa fonction et d’étudier les répercussions sur le développement du système musculosquelettique cervical chez les mammifères. Nos recherches ont précédemment mis en évidence que les précurseurs du tissu conjonctif qui orchestrent le développement musculaire ont différentes origines embryonnaires au niveau du cou. Afin de déterminer la contribution relative de la voie TGF-beta dans les différentes populations cellulaires produisant le tissu conjoinctif cervical, nous allons utiliser les outils génétiques disponibles chez la souris qui permettent d’inactiver les gènes specifiquement dans certains groupes de cellules au cours du développement. Ces expérimentations permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires à l’origine des malformations musculosquelettiques cervicales caractérisant les pathologies touchant le tissu conjonctif comme chez les patients atteints des syndromes de Klippel-Feil ou de Loeys-Dietz.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet de recherche fondamentale produira des connaissances nouvelles pour la compréhension du rôle de la voie TGF-beta et des précurseurs du tissu conjonctif dans la formation du système musculosquelettique qui est affecté dans de nombreuses pathologies de naissance ou dégénératives humaines, mais aussi dans certaines formes de cancers. Nos données permettront d’établir au mieux le diagnostique, la prise en charge et le suivi clinique personnalisé essentiel à l’amélioration de la qualité de vie des patients après la naissance.
Procédures
Seule une rapide biopsie d'oreille pour caractériser le génotype des individus sera effectuée sur animaux vivants au moment du sevrage avant les mises en accouplement après atteinte de la maturité sexuelle.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de notre projet, les animaux adultes ne présenteront pas de nuissances dûes à l’alteration de leur génome. Cependant, un suivi journalier sera fait de façon à assurer leur bien être. Les embryons et fœtus mutants inactivés pour la voie TGF-beta issus des croisements des lignées d’intérêt porteront des malformations au niveau cranio-cervical qui ne généreront ni détresse ou douleurs pendant la gestation, et seront récupérés avant leur naissance, en majorité avant le dernier tier de gestation après la mise à mort de la mère dans le respect du bien-être animal de manière non douloureuse.
Devenir
Certains animaux de génotype d'intérêt seront gardés en vie pour renouveler le stock des reproducteurs à la fin de la procédure 1. L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin du projet car ne seront pas réutilisés.
Remplacement
La dynamique de développement embryonnaire implique des processus cellulaires et moléculaires complexes qui ne peuvent ni être modélisés, ni reproduits in vitro ce qui rend inévitable de réaliser ces expériences chez l’animal. L’étude in vivo est la plus adaptée pour étudier la formation du système musculosquelettique cervical. Plus particulièrement, effectuer ces observations chez la souris permet une approche génétique nécessaire à l’étude de la formation musculosquelettique sur un modèle de mammifère phylogénétiquement proche de l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour s’assurer de la reproductibilité et pénétrance des phénotypes et pour permettre une interprétation pertinente des résultats tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle (n=3/conditions si résultats reproductibles). Pour chaque accouplement, nous considérons un nombre moyen de 8 embryons/portée. Selon les règles mendéliennes, 1/4 de la portée sera du génotype délétère d'intérêt et 3/4 de la portée de génotype contrôle. Afin de valider la redondance et la pénétrance des résultats, un minimum de 3 invidividus mutants (et 2 contrôles) sont nécéssaires. Nous évaluons donc 2 portées issues de ces croisements, et ce pour chacun des 5 stades développementaux d’intérêt (à 10.5, 11.5, 12.5, 14.5 et 16.5 jours post-fertilisation). Les individus non utilisés pour l’analyse seront traités, stockés et exploités pour l’optimisation des protocoles.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, les individus seront surveillés de manière journalière afin de vérifier la prise alimentaire et d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Tout au long des expériences, les animaux seront maintenus en groupes sociaux d’au moins deux individus et le milieu sera enrichi avec du matériel n'interférant pas avec l'analyse. L’atteinte des points limites entraînera la mise à mort des individus concernés.
Choix des espèces
Pour réaliser ce projet, notre modèle biologique est la souris (Mus Musculus), choix dicté par plusieurs raisons : - La souris est l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale et dans les recherches biomédicales. La proximité phylogénétique des souris et de l’humain permet d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. - Les connaissances accumulées sur cet organisme modèle ont permis d’identifier de nombreux mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire. - Cet animal de petite taille, est facile à maintenir en animalerie, possède un fort taux de reproduction et offre une panoplie d’outils génétiques. - Nos précédents protocoles ont été optimisés pour ce modèle, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Le projet implique seulement des croisements entre individus adultes sexuellement matures pour obtenir les reproducteurs d’intérêt (entre 6 semaines et 6 mois pour les femelles et 8 semaines et 12 mois pour les mâles). Les reproducteurs sexuellement matures seront croisés entre eux pour générer des embryons et fœtus d'intérêt qui seront analysés aux stades clés du développement du système musculosquelettique.
Imagerie cérébrale du cerveau entier et comportement chez Danionella cerebrum
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Immobilisés jusqu'à huit heures dans un gel, parfois paralysés par un bain chimique, 2 600 Danionella cerebrum âgés de une à six semaines vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance légère, tous tués à l'issue. Chaque poisson peut enchaîner trois sessions par jour pendant cinq jours, de trente minutes à deux heures chacune, tête fixée sous un microscope. Le porteur présente pourtant ce projet comme une contribution aux 3R, l'espèce devant "remplacer au moins partiellement" les mammifères en neurosciences. La mise à mort tient au statut sanitaire de l'élevage, aucun animal sorti de l'animalerie n'y étant réintroduit, et le porteur ajoute qu'en milieu naturel une infime proportion seulement atteindrait l'âge adulte.
Objectifs
Comprendre les mécanismes fondamentaux qui contrôlent le développement neuronal ou l'apprentissage, permettant l'acquisition ou l'adaptation du comportement à des changements environementaux ou physiologiques, est un enjeu fondamental des neurosciences. Étudier ces processus nécessite de pouvoir enregistrer de manière simultanée l’activité neuronale à l’échelle cellulaire dans une large portion du cerveau, à différents stades de développement, ce qui est difficile, voire impossible, chez les mammifères en raison de la taille et de l’opacité de leur cerveau. Ce projet se propose d'exploiter les atouts uniques de Danionella cerebrum, un petit poisson d'eau douce originaire de Birmanie, dont la petite taille et la transparence du cerveau permettent de réaliser des enregistrement par imagerie fonctionnelle tout au long du développement. En combinant approches comportementales, réalité virtuelle, imagerie calcique et modélisation numérique, nous espérons mieux comprendre les mécanismes de maturation cérébrale qui accompagnent l’apparition ou le raffinement de comportements sensorimoteurs et d’apprentissage chez le vertébré.
Bénéfices attendus
Les bénéfices scientifiques attendus de ce projet sont multiples : 1) Avancées fondamentales sur le fonctionnement cérébral : En étudiant les mécanismes essentiels du développement et de la plasticité neuronale, ce projet contribuera à une meilleure compréhension des dynamiques cérébrales à l'échelle des réseaux neuronaux et de leur implication dans les comportements complexes. 2) Applications pour la modélisation théorique et computationnelle : Les données produites, rendues accessibles librement, fourniront une base précieuse pour tester et affiner les modèles théoriques et computationnels des réseaux neuronaux biologiques. Ces résultats pourront également nourrir des recherches en intelligence artificielle inspirées du fonctionnement cérébral. 3) Validation d’un nouveau modèle vertébré : Ce projet participera à l’établissement de Danionella cerebrum comme un modèle vertébré de référence en neurosciences intégratives et développementales. Sa simplicité structurelle et son accessibilité permettront de répondre à des questions complexes tout en réduisant la dépendance aux modèles mammifères traditionnels. 4) Impact sur la recherche éthique : En promouvant l'utilisation de Danionella cerebrum, ce projet contribuera au remplacement, à la réduction et au raffinement (3R) des études sur les mammifères dans le cadre des neurosciences, réduisant ainsi l'impact éthique et pratique de ces recherches.
Procédures
Certaines expériences ont lieu en milieu ouvert : les poissons sont libres de nager dans une cuve et leur mouvement est suivi au moyen d'une caméra, et soumis à un stimulus visuel (écran sous la cuve). Chaque session dure jusqu'à 2h. Les animaux peuvent effectuer jusqu'à 3 sessions par jour, pendant un maximum de 5 jours. Pour les autres procédures, les animaux sont partiellement immobilisés dans un gel aqueux qui permet de maintenir leur tête fixe. Nous observons leur comportement (le mouvement de la queue) avec une caméra. Chaque session dure entre 30 minutes et 2h. Les animaux peuvent effectuer jusqu'à 3 sessions par jour, pendant un maximum de 5 jours. Après 3 sessions (espacées d'une heure), les animaux sont libérés du gel et peuvent nager librement dans une boite de Petri, jusqu'à la session suivante. Dans un nombre limité d'expériences, et afin de réduire les mouvements des animaux, ceux-ci sont exposés à une solution de paralysant. Lors de ces expériences tête fixée, nous enregistrons l'activité cérébrale de l'animal de façon non-invasive via des méthodes optiques. Par ailleurs, dans certaines de ces expériences, nous activons et/ou inactivons certaines populations de neurones au moyen d'une lumière infrarouge.
Impact sur les animaux
Pour les expériences en nage libre, les animaux sont isolés, ce qui peut engendrer de la peur. Pour les expériences en réalité virtuelle et d'imagerie cérébrales, les poissons sont partiellement immobilisées dans un gel aqueux pendant une période de 8h maximum. Cette opération de fixation dans le gel se fait sous anesthesie, donc il n'y a pas de douleur impliquée mais cette immobilisation peut causer du stress et de la peur. Certains animaux sont également paralysés au moyen d'un bain dans une solution contenant un agent paralysant, avant d'être montés dans le gel. Cette paralysie peut induire du stress et une douleur légère. Enfin, durant les expériences d'optogénétique, certains neurones sont activés ou désactivés de façon non invasive avec de la lumière, ce qui peut également générer du stress chez les poissons.
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérience. En effet, afin de préserver le statut sanitaire du système d'élevage et protéger les colonies adultes contre toute infection, il est impératif de ne pas réintroduire les animaux une fois qu'ils ont quitté l'animalerie. Il est important de noter qu'en milieu naturel, seule une infime proportion des individus atteint l'âge adulte. Dans un environnement d'élevage, si le nombre d'individus n'était pas artificiellement limité, la population augmenterait de manière exponentielle. Par conséquent, seule une petite proportion des embryons produits est utilisée pour renouveler la population d'adultes.
Remplacement
Nos études visent à comprendre comment les capacités computationnelles émergent de l'organisation à toutes les échelles du cerveau chez le vertébré lors de son développement. Compte-tenu de la complexité structurelle et fonctionnelle du système nerveux, une telle recherche ne peut être menée sur des modèle in vitro ou in silico. La morphogénèse d'un système nerveux central complet et pleinement fonctionnel ne peut pas être reproduite in vitro, ce qui nécessite de recourir à des organismes modèles animaux pour de telles études. Nos travaux permettrons à terme de définir des paramètres pour une meilleure modélisation in silico afin d'élaborer des hypothèse préalables à la phase expérimentale ce qui permettra de réduire le nombre des animaux utilisés en expérimentation.
Réduction
Afin d’appliquer le principe de réduction, nous suivons les méthodes suivantes : (1) Le nombre d’animaux utilisés est limité au strict minimum permettant de produire des résultats statistiquement significatifs et robustes. Des tests statistiques, adaptés à chaque expérience, seront utilisés pour permettre de limiter ce nombre. Au total, ce projet utilisera 2600 Danionella cerebrum (larves et juvéniles), agés entre 1 et 6 semaines. (2) Nous utilisons des protocoles séquentiels pour éviter de mobiliser des animaux inutiles en cas d’échec technique. (3) L’utilisation de modèles numériques issus des expériences permettra de réduire à terme le recours à de nouveaux animaux pour des tests exploratoires.
Raffinement
Nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse des animaux. Dans toutes les expériences menées, afin de déceler une éventuelle souffrance de l’animal, nous suivons systématiquement plusieurs paramètres physiologiques et comportementaux : apparence des animaux, position dans l'eau, cinétique de nage, circulation sanguine, rythme cardiaque, etc. En cas d'anomalie sur l'un de ces paramètres, nous considérerons l’animal en souffrance auquel cas nous interrompons immédiatement l’expérience et procédons à une euthanasie. Concernant l’élevage, nous surveillons les conditions d’hébergement des animaux et leur état de santé (établissement des points limites). Les poissons trop vieux pour la ponte ou présentant des signes de maladie sont euthanasiés afin d’éviter tout risque de souffrance. Les conditions salines et de température de l’eau sont contrôlées en permanence et quotidiennement reportées sur un registre. En cas d’anomalie, les conditions sont modifiées pour revenir à la normale. Les teneurs en ammoniaque, nitrates et nitrites sont vérifiées hebdomadairement. Une filtration de l’eau et un renouvellement quotidien de un dixième de l’eau sont réalisés pour maintenir des conditions d’hébergement stables et adéquates. Un enrichissement est réalisé, en nourrissant quotidiennement les animaux avec de la nourriture vivante (artémias). Pour les expériences d’imagerie, les poissons sont anesthésiés avant de les immobiliser dans un gel d'agarose pour limiter stress et douleur. L’anesthésie est confirmée par l’absence de mouvements. L’imagerie utilise une lumière relativement intense : nous réalisons donc un cache qui protège les yeux de l’animal de toute exposition directe à la lumière, prévenant ainsi tout stress supplémentaire.
Choix des espèces
Danionella cerebrum est actuellement le seul vertébré connu dont les caractéristiques de taille et de transparence du cerveau sont compatibles avec les méthodes d'enregistrement et de perturbations optiques pendant tout le développement cérébral. Sa proximité génétique et morphologique avec le poisson zèbre permet un transfert rapide des méthodes (transgénèse, imagerie) de l'un à l'autre. L'utilisation de ce modèle permettra de remplacer au moins partiellement l’expérimentation sur des mammifères. Toutes les expériences seront réalisées avec des animaux âgés de 1 à 6 semaines, le projet ayant pour objectif d’étudier les mécanismes de maturation cérébrale associés à cette période de développement.
Étude de la régulation des divisions méiotiques de l’ovocyte de Xenopus laevis
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Sorties de leur aquarium, anesthésiées, posées sur un champ glacé, 107 xénopes femelles subissent le prélèvement d'une partie d'un ovaire, opération de quatre à dix minutes répétée jusqu'à trois fois dans leur vie, à six mois d'intervalle au moins. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et le projet en prévoit 43 par an. Elles vivent ensuite un à trois ans dans l'animalerie, tant que leurs ovaires reconstituent leur stock d'ovocytes. Sur les 107 animaux, 72 seront tuées parce que leurs ovaires ne régénèrent plus, et 35 seront réutilisées.
Objectifs
Le projet vise à comprendre les divisions méiotiques de l'ovocyte. Tous les êtres vivants se développent grâce aux divisions de leurs cellules : la cellule duplique son génome puis en redistribue une copie dans chacune des deux cellules filles. La méiose est un mode de division spécialisé spécifique aux cellules reproductrices. Chez les femelles, dans les ovaires, les ovocytes sont bloqués en début de méiose. Cet arrêt permet à l’ovocyte d’accumuler les composants nécessaires au développement du futur embryon. Lors de l’ovulation, un signal hormonal lève le blocage et l’ovocyte réalise les divisions de méiose. Notre équipe s’intéresse aux mécanismes moléculaires déclenchés par l’hormone qui conduisent à la division. Ces mécanismes sont encore inconnus et leur étude est très importante pour comprendre la formation de la cellule reproductrice femelle, qui est à la base de la reproduction des individus. Notre étude renseigne aussi sur la division des cellules, qui assure le développement et le maintien de l’intégrité des organismes vivants. Chez l’amphibien Xénope qui est utilisé dans ce projet, la progestérone déclenche dans l’ovocyte l’activation en cascade de différentes protéines, ce qui aboutit à la reprise de la méiose. Sur le plan moléculaire, le blocage de l’ovocyte dépend d’une enzyme qui phosphoryle les protéines. La progestérone induit une diminution de son activité. Ceci provoque la synthèse de nouvelles protéines qui conduisent aux divisions de méiose. Le projet vise à identifier les cibles de l’enzyme et à élucider le mécanisme par lequel elles déclenchent la division. Ce projet a des retombées importantes dans deux domaines : celui du cancer, qui résulte d’une dérégulation de la prolifération cellulaire, et celui de l’infertilité humaine, qui repose en grande partie sur la dérégulation des divisions de l’ovocyte.
Bénéfices attendus
Notre projet est lié à trois domaines d’enjeux majeurs en santé : infertilité, anomalies fœtales, cancer. La fréquence de l’infertilité n’a cessé d’augmenter ces 20 dernières années. La compréhension de ses causes est l’un des axes prioritaires de la stratégie européenne de recherche. Chez la femme, elle est souvent associée à des défauts de formation de l’ovocyte. C’est pourquoi il est important de comprendre les étapes de formation de l’ovocyte, qui est l’objectif de ce projet. Il est impossible de mener des expériences sur les ovocytes humains. Le modèle murin est assez inadapté car le contrôle de la différenciation de l’ovocyte présente des différences importantes avec les autres vertébrés. Le projet utilise les ovocytes de l’amphibien Xénope, très utilisé pour sa ressemblance génétique avec l'homme. Il permettra d’identifier des gènes importants impliqués dans les infertilités. Ce projet permettra aussi l’identification des protéines de l’ovocyte qui assurent le bon développement de l’embryon. Leur connaissance contribue à comprendre les défauts de l’embryon qui sont à l'origine d'interruptions de grossesses ou d'anomalies congénitales. Enfin, le projet s’inscrit au cœur de la cancérologie. La méiose utilise en effet les mêmes gènes que ceux de la division cellulaire, et le génome du Xénope est très proche de celui de l'espèce humaine. Ces études révèlent donc de nouvelles protéines qui, quand elles sont dérégulées, entraînent la tumorigenèse. L’atout majeur de l’utilisation du Xénope dans ce domaine a d’ailleurs été à l’origine de l’attribution du Prix Nobel en 2001.
Procédures
Les interventions consistent en un prélèvement d’une partie d’un ovaire, effectué sur un animal anesthésié en conditions stériles et placé sur un champ froid qui supprime la douleur. L’opération dure 4 à 10 min. Seules les extrémités des ovaires sont prélevées pour éviter tout saignement. L’ouverture est suturée sans contraindre les tissus ce qui évite les risques d’hématomes et d’abcès. Le réveil s’effectue en 20 à 30 min, et l’animal est ensuite surveillé pour vérifier la bonne cicatrisation cutanée. Puis il regagne son aquarium. Le projet requiert 43 opérations par an. Chaque femelle est opérée au maximum 3 fois pendant sa vie, chaque opération étant espacée d'au moins 6 mois.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus en post-opératoire portent sur la douleur, le stress et des risques de complication dûs à l’opération. Le stress peut être provoqué par le prélèvement de l’animal dans l’aquarium et l’opération chirurgicale. À noter que le stress thermique potentiellement lié à l’anesthésie, le stress social qui serait engendré par l’isolement post-opératoire et le stress du jeûne pré-opératoire de 5 heures ne sont pas applicables : animal poïkilotherme « à sang froid », à vie solitaire, et nourri tous les 3 jours en conditions normales. La douleur peut être induite par la chirurgie. Les risques de complication sont de légers saignements temporaires de la cicatrice.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie tant qu’ils régénèrent leurs ovocytes suite aux opérations (maximum de 3 opérations par animal, aucun animal n’est opéré plus de 3 fois). Ils demeurent en vie dans l’animalerie entre 1 et 3 années. Ils sont euthanasiés par une méthode réglementaire de façon à lui éviter toute douleur. L’euthanasie est justifiée quand, après une seconde ou une 3ème ovariectomie partielle, les ovaires ne régénèrent plus leur contenu. Le projet reposant intégralement sur l’étude des ovocytes, les animaux ne produisant plus d’ovocytes ne sont donc plus utilisables pour le projet. À l’issue des 5 années du projet, 72 des 107 animaux du projet auront été euthanasiés. 35 seront encore en vie, après avoir subi une ou deux opérations. Ils seront ré-utilisés.
Remplacement
Notre objet d'étude est l’ovocyte, la cellule reproductrice femelle. Cette cellule est extrêmement spécialisée. Son organisation interne très complexe lui permet de réaliser les divisions qui vont lui permettre d’être fécondé par un spermatozoïde. Ces divisions particulières sont également importantes pour les premières étapes de la vie de l’embryon qui sera issu de la fécondation. L’ovocyte n’est donc comparable à aucune autre cellule, et ne peut être reproduit ou « créé » artificiellement par synthèse ou par des cellules souches ou par une modélisation virtuelle. C’est pourquoi nous sommes dans l'obligation d'utiliser des ovocytes intacts issus d’animaux, dans notre cas les Xénopes (des amphibiens), pour les étudier ensuite en laboratoire. Le modèle Xénope lui-même s’inscrit dans une stratégie de remplacement. L’autre modèle utilisé dans les laboratoires pour l’étude du même sujet, la formation de l’ovocyte, est la souris (ou le rat). Les ovaires de Xénope contiennent chacun jusqu’à 6000 ovocytes (contre une vingtaine chez la souris) et ont la capacité de régénérer (ce qui n’existe pas chez la souris). Utiliser le Xénope au lieu de la souris permet donc de limiter énormément le nombre d’animaux utilisés en laboratoire. Enfin, en parallèle à l’utilisation expérimentale des ovocytes, nous utilisons des outils bioinformatiques très récents (moins de cinq ans), basés sur l'intelligence artificielle, en amont des expériences. Ils permettent de guider et cibler les expériences au lieu de travailler de manière exploratoire comme par le passé. Cela permet de limiter le nombre de cellules utilisées, et donc d'animaux.
Réduction
Les expériences de l’ensemble des membres de l’équipe sont planifiées, coordonnées et synchronisées de façon à n’opérer qu’un minimum d’animaux. Les besoins en ovocytes pour les expériences d’une semaine de travail sont précisément estimés, et oscillent entre 1000 et 2000 ovocytes. En conséquence, une seule femelle est opérée chaque semaine. Les 1000 à 2000 ovocytes requis correspondent à un à deux tiers du contenu d’un ovaire. Le contenu de l’ovaire n’est jamais vidé entièrement de façon à préserver les cellules souches qui vont assurer la régénération. En outre, les Xénopes ont la capacité de renouveler leur stock d’ovocytes au bout d’une période minimale de 6 mois : nos statistiques indiquent que 81 pour cent des animaux régénèrent après une opération, et 57 pour cent d’entre eux après une seconde. Ces capacités régénératives nous permettent de ré-utiliser une même femelle jusqu’à trois fois, limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de femelles utilisées par le projet est de 107. Enfin, des outils statistiques et des modèles prédictifs sont utilisés en amont des expériences et permettent d’orienter les expériences nécessaires à réaliser, au lieu de travailler de manière exploratoire en multipliant les expériences comme par le passé. Ainsi, la propriété de régénération du Xénope, la synchronisation des demandes d’ovocytes de tous les membres de l’équipe et les nouveaux outils bioinformatiques disponibles réduisent considérablement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en aquarium de 25 L d’eau déchlorée, filtrée, oxygénée, à 20 degrés. Au-delà de 25 degrés, l’animal entre en léthargie. Des sondes surveillent en temps réel température, acidité et conductivité. Les aquariums sont enrichis par des tubes PVC où certains animaux aiment à se cacher, bien que le comportement préféré soit de rester allongé sur le fond de l’aquarium. La nourriture non consommée et les fèces sont éliminées quotidiennement. Un nettoyage des parois des aquariums avec une brosse ou une lingette est effectué tous les 15 jours. 6 à 12 animaux sont regroupés par aquarium. Dépasser 12 peut induire un stress. Aucun stress n’est relevé si le groupe est réduit ou l’individu isolé, car les individus sont solitaires chez cette espèce. À leur arrivée, les animaux sont mis en quarantaine pendant 4 semaines. Ils sont ensuite acclimatés en aquarium pendant au moins 2 semaines avant d’être intégrés à un protocole expérimental. Ils sont nourris à satiété 2 fois par semaine (vers de vase, cœur de bœuf et granulés de poisson). Ils sont prélevés à la main ou avec une épuisette, en évitant tout mouvement brusque afin de ne pas les stresser. Une grille de cotation répertorie toute anomalie et lui attribue un chiffre, de 1 à 3 : 1, surveillance attentive ; 2, surveillance accrue, isolement de l’animal pendant une semaine et soins éventuels, puis réévaluation de l’état de l’animal ; 3, point limite, euthanasie. À un niveau 2, des soins portant sur les affections cutanées peuvent être apportés. L’anesthésie, le prélèvement et l’euthanasie sont pratiqués dans une pièce isolée afin de ne pas stresser les autres animaux. La durée de la chirurgie est minimisée (4 à 10 min). Les opérations sont pratiquées sous anesthésie. L’animal est placé sur le dos sur un champ glacé, ce qui a un effet analgésique. Une surveillance post-opératoire est effectuée pendant 2 semaines.
Choix des espèces
L’ovocyte de Xénope (une espèce de crapaud) est un modèle très adapté pour l’étude de la division des cellules, en particulier les cellules reproductrices femelles (appelées ovocytes). Comprendre la formation de ces cellules est important pour trouver des thérapies soignant l’infertilité humaine et le cancer. Chaque ovaire de Xénope contient des milliers d’ovocytes de très grande taille et très riches en molécules. Ceci permet des approches au niveau des cellules mais aussi des molécules qui sont impossibles chez les espèces mammaliennes. Le Xénope est donc la seule espèce de laboratoire permettant d'étudier la cellule reproductrice femelle en combinant ces deux puissantes approches. Une autre originalité propre au Xénope est que ses ovaires sont capables de régénérer leur stock d'ovocytes, ce qui limite le nombre d'animaux utilisés. Enfin, l’ovocyte de Xénope est plus proche de l'ovocyte humain que ne l'est celui de la souris en ce qui concerne les mécanismes de la division, ce qui le rend incontournable pour la découverte de nouveaux gènes impliqués dans les défauts de fertilité chez la femme. Les animaux utilisés sont des femelles adultes parce qu’elles ont des ovaires pourvus en ovocytes, les cellules que nous étudions. Les embryons et les têtards en sont dépourvus. Les femelles achetées chez un fournisseur agréé ont entre 2 et 3 ans, âge de la maturité sexuelle chez le Xénope.
Etude de l’impact du Phosphate dans le contexte d’une pathologie osseuse grâce à l’utilisation d’un modèle de poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Tous tués pour que leurs tissus osseux soient analysés, 2 640 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit un prélèvement de nageoire caudale sous anesthésie, deux séances d'imagerie sous anesthésie et un mois et demi de régime pauvre ou riche en phosphate. Une partie d'entre eux porte une mutation responsable d'une pathologie osseuse, et le porteur range les malformations squelettiques attendues parmi les nuisances, au même rang que le stress de l'anesthésie. Il présente pourtant le poisson comme une espèce permettant "des approches largement non-invasives sans nécessité d'intervention chirurgicale".
Objectifs
Des malformations du crâne sont retrouvées dans des maladies associées à un métabolisme du phosphate défectueux. Le but de ce projet est d’étudier, les effets d'un régime pauvre ou riche en phosphate sur la formation du crâne et des sutures crâniennes chez des poissons exprimant une mutation génétique responsable de pathologie osseuse. Les mécanismes cellulaires impliqués seront observés grâce à des techniques d'imagerie non invasives en temps réel, tandis que des analyses post-mortem permettront d'étudier la structure du crâne et la minéralisation des os.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle du phosphate au cours de la formation du crâne dans des conditions normales et pathologiques. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défauts du squelette craniofacial. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
- Prélevement nageoire caudale sous anesthésie: 1 fois,
Impact sur les animaux
- Prélevement nageoire caudale : douleur légère - Isolement : stress - Anesthésie : stress - Malformations squelettiques : douleur légère
Devenir
L'ensemble des poissons de ce projet sera mis à mort pour prelevements et analyses des tissus osseux
Remplacement
Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différents types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencés par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l'utilisation du poisson comme espèce modèle permet des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet et effectuer les tests statisques nécessaires à l'analyses des données.
Raffinement
Les poissons sont élevés dans des conditions optimales où la qualité de l’eau, la température et l’éclairage sont vérifiés régulièrement. Nous serons attentifs au comportement des animaux face à la nourriture qui sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les zootechniciens. D’autre part, l’apparition de symptômes comportementaux (immobilité, nage anormale) sera suivie et les poissons seront scorés deux fois par semaine par le chercheur en charge du projet durant la mise sous régime des animaux. Les poissons seront génotypés sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésique pendant 48h. L’acquisition d'images sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette . Le squelette présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de poissons exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d’observer par microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse sera réalisée de 1,5 mois post fécondation à 3 mois post fécondation, période de formation de la voûte crânienne.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 30000
Créées sur place ou reçues d'autres établissements, des lignées de souris et de rats génétiquement modifiés sont élevées, tatouées et biopsiées pour vérifier qu'elles portent bien la mutation commandée. 320 000 souris et 30 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, ceux qui ne partent pas vers un autre projet d'expérimentation étant tués, sans placement possible puisqu'ils appartiennent au scientifique commanditaire. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et quatre prélèvements sanguins par jour, et exprimer du seul fait de sa mutation un phénotype douloureux tel qu'une arthrite. Le porteur ajoute que la mise à mort peut être programmée à un âge précis pour éviter que l'animal n'exprime ce phénotype, et que les scientifiques "s'engagent par écrit" à ce qu'il n'existe pas de solution de remplacement à leur lignée.
Objectifs
Ce projet a pour premier objectif le maintien de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des modifications/symptômes physiques ou cliniques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes, et l’évaluation de l’impact de ces caractéristiques sur leur bien être ; comme deuxième objectif la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée génétiquement modifiées, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Ce test est important car dans l’élevage de lignée génétiquement modifiées, tous les animaux nés ne sont pas porteurs de la mutation, il est donc primordiale de le vérifier pour pouvoir utiliser les animaux d’interet uniquement et donner des résultats fiables. Enfin, certaines mutations génétiques ne font effet qu’après l’injection d’une hormone ou d’un antibiotique. Pour induire cette mutation d’interet et que l’animal exprime physiologiquement cette mutation, une injection de l’hormone pourra ainsi également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 350 000 animaux (ajout de 15% dû à l’augmentation de l’utilisation de ces modèles) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement modifiés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait du être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptée à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement modifiées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le bon modèle pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : - A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute - A des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite). Dans de rare cas, l’administration de ligands peuvent être fait via des injections en intrapéritonéale ou en gavage (durée : moins de 5 minutes, fréquence peut varier d’une expérimentation à une autre, mais n’excédant pas une fois par jour pendant 7 jours, en cas de protocole nécessitant de dépasser ces limites, cela devra au préalable être valider par la SBEA) (durée et fréquences décrites dans la procédure 4, et recommandées par la littérature).
Impact sur les animaux
EExpression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité inatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dûs à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit en utilisation continue dans des projets d’expérimentation, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, ne sont utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypag. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européenes (au moins 7 animaux de chaque sexes et génotypes, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Dans le cas de lignées pouvant présenter un phénotype dommageable, si le phénotype le requiére, des observations cliniques plus fréquentes et plus spécifiques avec des points limites et des raffinements précis seront mise en place. Afin de limiter la douleur pour l’animal, une euthanasie pourrait être demandé en automatique à un point limite ou âge précis afin d’éviter que l’animal n’exprime le phénotype. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5jours après la fécondation.
Caractérisation de proteines d’intérêt dans le développement embryonnaire tardif chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Au sevrage, chaque souris subit l'ablation de 1 à 2 mm de queue pour son génotypage, puis certaines reçoivent une injection rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse ou trois injections intrapéritonéales en trois jours. 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier deux protéines dont la délétion provoque des troubles cardiovasculaires chez l'embryon. Le porteur annonce une étude du développement à 13, 15 et 18 jours après fécondation, sans nommer les substances injectées ni dire comment les embryons sont obtenus sur les femelles gestantes. Toutes les souris sont mises à mort pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Étudier le développement embryonnaire est un enjeu scientifique majeur tant pour prévenir les pathologies congénitales que pour comprendre les mécanismes physiologiques impliqués dans la différentiation et la construction des tissus biologiques. Les cardiopathies congénitales sont estimées responsables d’environ 35% des morts infantiles, cependant leurs causes précises restent à élucider. Il a été observé que la délétion génétique de deux protéines d’intérêt a pour conséquences des complications cardio-vasculaires chez l'embryon. L’objectif de ce projet est donc de découvrir le rôle essentiel de ces protéines d’intérêt dans le développement de l’embryon afin de mieux comprendre la survenue de maladies congénitales et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies adultes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier directement le rôle encore trop peu connu de 2 protéines d’intérêt dans l’organogenèse tardive chez l’embryon de souris et ainsi de nouvelles perspectives dans la compréhension de la survenue des maladies cardiaques congénitales.
Procédures
Certaines souris seront soumises à des injections par intra veineuse sous anesthésie gazeuse (une seule injection de quelques secondes) ainsi qu'à des injections intra péritonéales (une par jour pendant 3 jours). Tous les animaux subiront un prélèvement de queue (1 à 2 mm) lors du sevrage pour génotypage.
Impact sur les animaux
Toutes les souris subiront un prélèvement de biopsie de queue (1-2 mm), pouvant également occasionner une douleur et un stress de courte durée, afin de les génotyper. Certaines souris subiront également une injection en intra péritonéal par jour pendant 3 jours ou une injection retro orbitale sous anesthésie gazeuse pouvant générer du stress ainsi qu’une douleur légère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyses complémentaires.
Remplacement
L’objet de cette étude est de comprendre l’implication de protéines d’intérêt dans le développement du système cardiovasculaire étant un système physiologique complexe. Par conséquent, les études de culture cellulaire ou d’organoïdes sont insuffisantes pour reproduire la complexité des interactions physiologiques entre nos organes d’intérêt.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les effectifs des groupes ont été élaboré afin d’avoir le nombre minimum d’animaux tout en produisant des résultats scientifiques statistiquement interprétables et pertinents.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, les expérimentations se dérouleront avec une surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie et le porteur du projet. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec contrôle de la température ainsi que de l’hydrométrie. Des points limites ont été établis dans ce projet entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Afin d’appréhender le rôle de protéines d’intérêt dans le développement cardiovasculaire il nous ait essentiel d’avoir un modèle in vivo qui récapitule cette complexité physiologique et dont il est possible de réaliser des manipulations génétiques afin d’isoler l’implication de certains compartiments physiologiques dans notre phénotype. Le modèle murin est aujourd’hui le modèle animal dont le génome et les manipulations génétiques sont les plus accessibles, efficaces et documentés dans la communauté scientifique. C’est donc le modèle le plus adapté à notre étude. Les souris seront étudiées à 13 jours post-fécondation (E13), E15 et E18 étant trois stade couvrant la fin de gestation chez la souris.
Rôle des microglies dans la période critique chez la souris (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Pour savoir si la microglie participe à l'ouverture de la période critique du cerveau, 547 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La microglie est appauvrie pendant la vie intra-utérine par un traitement mêlé à la nourriture des mères, ou une inflammation prénatale est provoquée par une injection intrapéritonéale sur femelle gestante vigile. Après transfert vers un second établissement, la moitié des souriceaux de chaque groupe subit la suture d'une paupière sous anesthésie, puis une imagerie du cortex visuel d'environ deux heures, avant d'être mise à mort sans avoir été réveillée. L'effectif compte 67 mères, dont 40 ne sont utilisées que pour accompagner leurs petits pendant le transport.
Objectifs
La plasticité cérébrale décrit la capacité du cerveau à remodeler ses connexions en fonction de l'environnement et des expériences vécues par l'individu. Cette plasticité est élevée peu après la naissance et diminue chez l’adulte. Elle est maximale au cours d’une période limitée dans le temps, appelée « période critique », pendant laquelle les circuits neuronaux sont particulièrement susceptibles d’être remodelés en réponse à un changement de l’environnement. Ainsi, une pathologie touchant par exemple la vision pendant la période critique aura des impacts irréversibles sur la perception visuelle par le cerveau. Comprendre les mécanismes permettant la mise en place des périodes critiques est donc essentiel pour espérer un jour rouvrir chez l’adulte une forte plasticité et recouvrer, après un handicap ou un environnement inadéquat pendant leur mise en place, des réseaux neuronaux optimaux. Cependant, nos connaissances sur ces mécanismes restent profondément incomplètes, et le présent projet a pour objectif d’étudier si la microglie participe à l’établissement de la période critique. La microglie est en effet une population de cellules du cerveau dont le rôle est d’assurer la défense immunitaire grâce à ses capacités phagocytaires. Des données préliminaires ont montré qu’une altération du niveau de microglie chez l’embryon de souris induisait une modification profonde des circuits neuronaux après la naissance. En particulier, certains de ces circuits neuronaux sont connus pour être des régulateurs importants de l'ouverture de la période critique. Cela suggère donc un rôle majeur de la microglie dans l’établissement de la période critique. Le but de ce projet est maintenant de tester si des changements de plasticité ont lieu in vivo dans le but de confirmer ces résultats préliminaires et de caractériser ainsi les conséquences de modifications prénatales des microglies sur la période critique. Ce projet, qui est multisite, a déjà fait l’object d’une demande similaire, qui a été validée, avec le même nombre d’animaux. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, nos connaissances concernant le rôle de la microglie dans l’établissement des périodes critique est profondément incomplet. De plus, la compréhension des mécanismes qui sont impliqués ouvre donc des perspectives thérapeutiques de pouvoir réinstaller une plasticité neuronale chez l’adulte et rétablir des connexions corticales normales suite à une pathologie pendant l’enfance.
Procédures
Les animaux seront produits par accouplements contrôlés dans le premier établissement utilisateur (EU2/2), pour produire les 3 groupes d’animaux : 1) ceux dont lesquels la microglie aura été déplétée pendant le développement in utero (par traitement pharamacologique non dommageable présenté dans la nourriture), 2) ceux qui auront été exposé à une procédure mimant une inflammation prénatale (injection à un stade précis de la gestation- geste réalisé par des expérimentateurs entrainés (injection de quelques secondes réalisée sur animal vigile) et suivi intensifiés dans les 3 jours suivants (voir ci -dessous)), et 3) un groupe non manipulé d’animaux contrôle. Les animaux seront ensuite transférés dans un deuxième établissement utilisateur situé à proximité (EU1/2), dans des cages de transport scellés, avec des congénères de chaque portée, et ont une période d’acclimatation d’au moins une semaine après ce transport. Certains animaux devront être transporté avant sevrage pour leur laisser une semaine d’adaptation, et dans ce cas particulier, les mères seront également transportées. Dans le deuxième établissement utilisateur (EU1/2), nous procéderons à 3 actes sur les animaux. Pour la moitié des animaux de chaque groupe, nous réaliserons une fermeture transitoire de la paupière par suture chirurgicale, réalisée sous analgésie et anesthésie contrôlée (20 minutes environ pour l’entièreté de l’acte) et avec suivi post-opératoire pendant 3 jours. Après 3 jours, la plasticité induite par cette fermeture, ou l’absence de fermeture (autre moitié de chaque groupe), sera évaluée dans le cortex visuel par imagerie (environ 2h), réalisée sous analgésie et anesthésie contrôlée, et qui seront euthanasiés par méthodes règlementaires avant réveil.
Impact sur les animaux
L’induction des modèles d’étude se fera sur les mères et leurs embryons soit par l’alimentation sans contrainte autre que le changement de l’aliment, soit par une injection intrapéritonéale qui peut induire un stress lors de la contention une douleur de courte durée lors de l’injection au point de piqûre. Les animaux seront ensuite transportés dans un autre établissement ce qui pourra induire un léger stress. Dans le second établissement, la procédure chirurgicale mise en œuvre est rapide mais entraîne néanmoins un stress thermique et des risques liés à l’anesthésie générale. De plus, cela peut mener à un inconfort dans les jours suivants tels que grattages et petites plaies autour de l’œil. En fin de période de maintien, les animaux subiront une imagerie sous anesthésie (stress thermique/risques anesthésiques) puis seront euthanasiés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par méthodes règlementaires, ce qui permet de réaliser les analyses et prélèvements nécessaires.
Remplacement
Des données préliminaires obtenues in vitro par notre équipe indiquent que les circuits neuronaux impliqués dans la période critique sont modifiés suite à une altération de la microglie in utero. La prochaine étape consiste à tester directement cette hypothèse in vivo au sein d'un organisme complexe. Il n’est pas alors possible de remplacer les enregistrements du cerveau intact par des simulations ou par des cultures de cellules du cerveau.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, la taille de chaque lot a été optimisé pour pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé, mais pouvoir établir des conclusions scientifiquement et statistiquement fiables. Nous estimons à 10 animaux la taille optimale par lot, ce qui porte à 547 le nombre total d'animaux (480 animaux seront enregistrés, auxquels s'ajoutent 40 mères qui devront accompagner les animaux en plus bas âge au moment du transport et 27 mères ayant subies des traitements). Nous avons également choisi de réaliser un groupe contrôle unique pour les deux conditions expérimentales, afin de réduire le nombre total d’animaux.
Raffinement
Sur l’ensemble de la trajectoire de vie des animaux, et donc sur les deux établissments utilisateurs, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Suite à la manipulation des souris gestantes, nous aurons un suivi particulier de ces animaux et de leur descendance (grâce à des points limites définis, et protocoles analgésiques dédiés). Pour les mères un suivi sera effectué en même temps que leur progéniture pour déceler des changements dans leur comportement et leur apparence. Pour le transport, nous veillerons à maintenir les congénères de chaque portées et une semaine d’adaptation. Suite à la chirurgie de fermeture d’un oeil, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant 3 jours et une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte et présente une plaie autour de l’oeil. Dans ce cas, nous procéderons à une désinfection de la zone opérée et, à l’application d’un anesthésique local. Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris opérées pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté si besoin. Pour l'expérience d'imagerie, la procédure sera réalisée sous anesthésie et préparée par une injection analgisante. De plus, la technique d'imagerie utilisée pour l’enregistrement de l’activité cérébrale est minimalement invasive et ne nécessite pas de chirurgie lourde. Tous les animaux seront logés à plusieurs dans des cages enrichies à l'aide de coton pour faire leur nid et boisson et nourriture à volonté, dans les deux établisssments utilisateurs.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin qui est un modèle idéal puisque son développement est proche de celui de l’homme. La souris est l’espèce animale la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd’hui. Elle permettra une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison avec ceux publiés dans la littérature. De plus, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Ces animaux seront testés soit aux jours post-nataux 21, 28, 50 et 100. Ces âges constituent des âges remarquables pour la plasticité visuelle chez la souris car : - La période critique pour la dominance oculaire chez la souris est maximale vers le jour post-natal 28. - Au jour post-natal 21, la période critique commence à s’ouvrir. - Au jour post-natal 50, la plasticité est largement réduite - Au jour post-natal 100 la période critique est totalement fermée.
Evaluation des effets d’une supplémentation en graines de chia sur la descendance de rates obèses pendant la gestation et lactation.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 020 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 840 tués aux temps de prélèvement prévus et 180 rates non gestantes transférées vers d'autres protocoles de l'animalerie. La moitié des rates est rendue obèse par six semaines de régime gras et sucré avant la gestation, les fœtus sont tués au vingtième jour de gestation pour prélever placenta, cerveau, foie et cœur, et une partie de la descendance passe un mois de tests comportementaux, dont un test de reconnaissance d'objet nouveau, avec réduction de la ration alimentaire. L'étude porte sur l'effet d'une supplémentation en graines de chia, riches en oméga-3, pendant la gestation et la lactation de rates obèses. Le porteur écrit lui-même qu'aucune transposition directe des résultats ne pourra être faite chez la femme et que seule une étude clinique permettrait de le prouver.
Objectifs
L’obésité est un problème de santé publique majeur. En France, une femme sur 3 est en surpoids ou obèse. L’obésité maternelle peut augmenter le risque de pathologies de la grossesse, altérer la croissance du fœtus, et engendrer des retards psychomoteurs et des maladies métaboliques chez l’enfant et l’adulte. Ces altérations de la programmation du développement fœtal pourraient être dues à des défauts d’apport en nutriments au fœtus comme les acides gras oméga-3 aussi appelé lipides. Ces lipides jouent un rôle crucial dans le développement du cerveau du fœtus pendant la grossesse mais aussi dans son développement futur. Il existe plusieurs types d’acides gras oméga-3, une première catégorie d’oméga-3 essentiels qui doit être apportée par l’alimentation car elle n’est pas fabriquée par le corps humain et une deuxième catégorie, nécessaire pour le développement du cerveau fabriquée à partir de la première mais en quantité plus faible, insuffisante pour répondre au besoin de l’organisme. Ainsi, dans des situations vulnérables comme la grossesse ou l’allaitement, une couverture de ce besoin est vitale pour la mère comme pour le fœtus et les futures enfants. Quelques études ont montré des effets bénéfiques d’une supplémentation en acides gras oméga-3 essentiels sur la santé de l’enfant. Selon une étude, 75% des femmes enceintes sont en dessous des apports satisfaisants en acides gras oméga-3 essentiels qui sont de 2g/j. La graine de chia est connue pour être très riche en acides gras oméga-3 essentiels. Les résultats des études chez l’animal et des essais cliniques suggèrent que l’ajout des graines de chia dans l’alimentation de l’adulte augmente la concentration en ces deux catégories d’oméga 3. Cependant, aucune étude ne s’est intéressée au transfert des oméga-3 au foetus à travers le placenta après une supplémentation en graines de chia pendant la gestation et/ou la lactation et l’effet de cette supplémentation sur le développement neurologique ainsi que sur le développement de maladies cardiovasculaires chez la progéniture née de mères obèses. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une supplémentation en graines de chia riche en oméga-3 pendant la gestation et ou la lactation, 1) sur la santé des mères en situation d’obésité, en termes d’inflammation, comparée à des mères non obèses, 2) sur la santé de la descendance, à court terme et jusqu’à l’âge adulte, en termes de neurodéveloppement et de prévention de maladies cardiovasculaires.
Bénéfices attendus
L’effet de la supplémentation en graine de chia de la mère sera testé pendant la gestation et/ou la lactation de façon à étudier l’impact sur le statut inflammatoire de la mère et les conséquences sur le développement du fœtus et de la progéniture. Les bénéfices attendus de la supplémentation en chia sont une augmentation du stockage des acides gras oméga-3 dans le tissu adipeux maternel et de la transformation des oméga-3 essentiels en oméga-3 de deuxième catégorie dans le foie maternel résultant à une amélioration du rapport oméga-6/oméga-3 dans la circulation sanguine de la mère et du fœtus. Une supplémentation en graines de chia pendant la lactation permettrait une meilleure composition du laits maternels des rates. Les bienfaits attendus d’une supplémentation en graines de chia sont aussi une amélioration des altérations potentielles du développement cérébral avec pour objectif une meilleure capacité d’apprentissage et de mémoire des progénitures. Si les bénéfices en termes d’amélioration des oméga-3 sont positifs chez la rate, aucune transposition directe des résultats ne pourra être réalisée chez la femme et seule une étude clinique permettrait de le prouver. Supplémenter le régime alimentaire des femmes enceintes avec de la graine de chia, dès le début de la grossesse, serait envisageable puisque les doses utilisées chez la rate, sont celles déjà testées chez l’homme adulte, sans que des effets indésirables n’aient été observés. La prise en considération de la vulnérabilité accrue de la femme en période de grossesse serait évidemment à considérer. Les résultats de cette étude préclinique nous permettront de proposer une étude clinique avec supplémentation en graines de chia chez la femme enceinte et allaitante, dans le but de réduire les risques de pathologies obstétricale et fœtale et d’améliorer la santé de leurs enfants à plus long terme.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle pendant 6 semaines avant la gestation (régime gras et sucré « Western Diet ») (n=150) tandis que les autres rates seront sous régime « Contrôle » (n=150), puis durant la gestation (graine de chia) (20 jours) ou pendant la fin de lactation (J21), et à un seul prélèvement de sang (2 min/animal). Les progénitures réaliseront des tests comportementaux avec pour objectifs d’évaluer leur capacité d’apprentissage/ de mémoire/ de stress pendant une durée de 1 mois. Leur comportement alimentaire sera aussi évalué dans le but d’étudier leur préférence aux gouts ; pour cela une diminution de leur quantité de nourriture sera nécessaire.
Impact sur les animaux
Les rates pour la moitié seront soumises à une manipulation nutritionnelle pendant 6 semaines avant la gestation (régime gras et sucré « Western Diet »), qui peut engendrer une prise de poids modérée sans conséquence sur la posture et la mobilité de l'animal. Un léger stress de courte durée pourra être perçu lors du prélèvement de sang au niveau de la queue, intervention effectuée par une personne habilitée, avec un risque minimal d’infection. Au moment de l’accouplement, nous nous assurerons que la rate est en période d’ovulation avant de la mettre au contact du mâle pour éviter tout stress. Pour minimiser le risque d'infection vaginale lié aux traces d'urines, la zone sera nettoyée par des compresses stériles au moment du prélèvement. Les progénitures pourront être soumises à un stress au moment du prélèvement du lait chez leur mère au dixième jour de lactation du fait de leur éloignement (J10). Les rats pourront aussi être soumises à une diminution de quantité de nourriture pour certains tests comportementaux (comportement alimentaire) réalisés après sevrage. Pour terminer un test de reconnaissance « Novel Object Recognition » (NOR), sera réalisé chez les progénitures après sevrage et nécessitera des périodes d’habituation qui pourront provoquer un certain stress chez les rats.
Devenir
Si aucun évènement n’a justifié l’euthanasie prématurée des animaux, ils seront euthanasiés aux temps de prélèvements de tissus préalablement établis dans les procédures expérimentales. Les rates sont suivies jusqu’à un jour avant la naissance (G20) ou à la fin de leur période de lactation (J21), temps auquel elles sont euthanasiées, notamment pour un prélèvement de Sang, Lait maternel, Foie, Tissu adipeux et glande mammaire. Les fœtus seront euthanasiés soit à G20 pour prélever placenta, cerveau, foie et cœur. Les progénitures seront euthanasiées pour la moitié à la fin de la période de lactation (J21) ou à la fin de leur 3 mois de vie (3M) pour prélever sang, cerveau, foie et cœur. Les femelles non gestantes (180 rates) seront recyclés dans la mesure du possible, vers les autres protocoles de l’animalerie.
Remplacement
Il s’agit d’une étude in vivo visant à évaluer des stratégies nutritionnelles sur le transfert des lipides oméga-3 entre la mère, les fœtus et les progénitures. Il n’existe donc pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant le remplacement de l’étude animale. Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place de la lactation, pendant la phase de gestation.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 20 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 2 fœtus mâles et 2 fœtus/progénitures femelles par mère pour étudier l’effet sexe. Des tests statistiques seront réalisés pour tester l’effet de la supplémentation en chia sur la concentration en acide docosahexaénoïque (DHA) chez la mère et l’effet de la supplémentation, du sexe et de l’effet croisé des 2 sur la concentration de DHA chez les fœtus/progénitures. Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 10 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 2 fœtus mâles et 2 fœtus/progénitures femelles par mère pour étudier l’effet sexe.
Raffinement
Des mesures sont mises en place lors du seul prélèvement de sang au niveau de la queue, avec une analgésie locale qui sera appliquée 15 min avant l’incision. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel agréé et seront pesés 3 fois par semaine ce qui permettra de surveiller une éventuelle perte de poids et de vérifier leur état général. Les rats sont hébergés dans des portoirs ventilés avec différents enrichissements de milieu (frisottis, tunnels, morceau de bois) afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
L'avantage du modèle rat sur le modèle porcin utilisé dans certaines références bibliographiques est la petite taille des animaux (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures) et la rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Les mâles seront commandés à l’âge de 6 semaines et les femelles à l’âge de 4 semaines auprès du fournisseur. Les rates seront acclimatées pendant une dizaine de jours avant d’être mis sous régime gras et sucré « Western Diet » afin de les rendre obèses ; ou sous régime « Contrôle » pendant 6 semaines. Nous effectuerons ensuite des frottis vaginaux sur 4 jours afin de mettre uniquement les femelles en oestrus en accouplement. La supplémentation du régime alimentaire en graine de chia sera testée sur deux périodes : - Au 20ème jour de la gestation (G20) qui correspond à une période importante dans la croissance fœtale et particulièrement dans le développement du cerveau du fœtus - A la fin de la période de lactation (J21) qui est une période cruciale dans le développement des progénitures puisque le lait est rempli de nutriments indispensables pour la croissance du nouveau-né. Afin de déterminer l’impact de la supplémentation sur le métabolisme de la descendance, 2 fœtus mâles et 2 fœtus femelles par mère seront prélevés à G20 et 4 progénitures mâles et 4 progénitures femelles par mère seront prélevés à J21. A J21 une partie des petits (2 progénitures mâles et 2 progénitures femelles) seront sacrifiés tandis que l’autre moitié réalisera des tests comportementaux (2 fœtus mâles et 2 fœtus femelles) avant d’être sacrifiées à 3 mois de vie (3M).