Biologie du développement

Injectées avec des vecteurs viraux dans les jours suivant leur naissance ou à quatre semaines, puis soumises à un régime spécifique et à deux gavages, 136 souris subissent la destruction chimique d'un muscle de la patte par injection de chlorure de baryum sous anesthésie. La régénération dure trente jours. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur indique que la lésion peut être douloureuse pendant cette phase. L'objectif déclaré est de valider une méthode qui permettrait ensuite de cibler n'importe quel gène sans créer une nouvelle lignée de souris, et toutes sont tuées pour prélever leurs cellules souches musculaires.

Objectifs

Le muscle possède une remarquable capacité de régénération, due en grande partie à la fonction des cellules souches musculaires, également connues sous le nom de cellules satellites. En réponse à une lésion musculaire ou à une maladie affectant le tissu musculaire, les cellules satellites s'activent et génèrent de nouvelles cellules musculaires pour réparer les dommages. Pour maintenir leur capacité de régénération, les cellules satellites doivent rester dans leur niche appropriée, qui leur fournit des éléments optimaux tels que des nutriments, des signaux chimiques et un soutien physique. Lorsqu'elles sont retirées de cette niche spécialisée, les cellules satellites perdent leur capacité de régénération. L'un des principaux défis de la recherche biomédicale est d'identifier les facteurs qui composent cette niche spécialisée, car cette connaissance pourrait aider à préserver les propriétés régénératrices des cellules satellites et éventuellement à les exploiter à des fins thérapeutiques. La matrice extracellulaire, un réseau complexe de protéines comme les collagènes, joue un rôle crucial dans la niche des cellules satellites. Nous avons identifié plusieurs facteurs candidats de la matrice extracellulaire et nous souhaitons étudier leurs fonctions à l'aide de modèles de souris génétiquement modifiées. Ce projet devrait nous permettre de développer une nouvelle méthode pour générer rapidement des souris génétiquement modifiées afin d'étudier le rôle de différents facteurs de la niche dans la fonction des cellules satellites.

Bénéfices attendus

Bénéfice à court terme (scientifique) : La matrice extracellulaire est un environnement riche et dense composé de nombreuses protéines différentes spécialisées en fonction du tissu. Ce projet nous permettra de cribler l'importance des différents composants de la matrice extracellulaire exprimés par les cellules souches musculaires pour leur activité lors de lésions musculaires. Bénéfice à long terme (scientifique + réduction du nombre d'animaux) : Ce projet nous permettra de confirmer la stratégie de ciblage de differentes gènes d’intérêt en utilisant une seul model. Par conséquent, dans une perspective à long terme, la validation de cette stratégie nous permettra, ainsi qu'à d'autres chercheurs-euses, d'utiliser ce protocole comme un modèle rapide et robuste pour cibler n'importe quel gène d'intérêt dans les cellules souches musculaires directement in vivo sans avoir besoin de développer de nouvelles model de souris pour chaque gène d'intérêt. Cela réduira considérablement le nombre de souris utilisées par projet.

Procédures

Les souris incluses dans ce projet recevront en une injection des vecteurs viraux, en un seul geste (rapide (moins d'une minute)) soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. Une fois adultes, les souris seront soumises à un régime alimentaire spécifique en granules pendant deux semaines suivi par deux gavages (pendant deux jours consictifs, un par jour, en un seul geste, ce qui prend moins d'une minute). Deux semaines après, un seul muscle d'une seule jambe sera blessé par injection intramusculaire (rapide (moins d'une minute)) sous anesthésie générale. Le processus de régénération musculaire dure 30 jours chez la souris.

Impact sur les animaux

Concernant l'injection des vecteurs viraux chez les souriceaux après la naissance ou chez les souris adultes, ils seront realisées rapidement et à l'aide d'une aiguille adaptée et fine afin de minimiser la douleur chez l'animal. La douleur est donc considérée comme faible. Le gavage est effectué par des chercheurs formés et expérimentés en un seul geste, rapidement, à l'aide de sondes adaptées. La douleur est minimale et l'inconfort pour l'animal est très faible. Enfin, concernant l'induction de lésions musculaires par injection de BaCl2 dans le muscle tibialis antérieur (TA), l'injection est réalisée rapidement, sous anesthésie, en un seul geste et à l'aide d'aiguilles fines adaptées pour minimiser la douleur. Cependant, étant donné que l'induction de la lésion elle-même peut être douloureuse pour les souris pendant la régénération musculaire, des analgésiques ainsi que des adaptations de l'environnement et de la nourriture des animaux dans la cage ont été envisagés et décrites dans les sections adaptées.

Devenir

Toutes les animaux inclut dans ce projet seront utilisées pour effectuer des prélèvements musculaire afin d'avoir accès aux cellules souches musculaire.

Remplacement

Dans ce projet, nous nous intéressons aux cellules souches musculaires et à la structure de leur matrix extra cellulaire in vivo. Bien que plusieurs systèmes de culture cellulaire se soient développés, le comportement de ces cellules change lors de leur mise en culture. Par conséquent, la simulation complète de la matrice extra cellulaire physiologique des cellules souches musculaire n’est pas encore possible in vitro, ce qui nous oblige à passer par des modèles in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, tous les tests in vitro possibles ont été réalisés. Cependant, pour confirmer notre stratégie de travail nous aurions besoin de 36 souris avant de commencer les expériences principales. Ensuite, pour la phase expérimentale, nous avons décidé de réduire le nombre d'animaux en induisant une lésion musculaire dans un seul muscle d'une seule patte par souris, ce qui nous permettra de comparer le comportement des cellules souches musculaires au repos (muscle controlatéral non lésé = témoin) ou après régénération musculaire. Ainsi, 100 animaux (10 lots de 10 souris, pour avoir par lot, 5 souris controles et 5 souris expérimentales) sont prévus pour la phase expérimentale. Ces groupes représentent le minimum nécessaire pour pouvoir effectuer une analyse statistique et conclure les résultats expérimentaux.

Raffinement

Tout au long du projet, le comportement et le poids des souris seront surveillés par le même manipulateur afin de détecter tout signe de douleur ou d'inconfort chez les souris. Toutefois, l'induction de la blessure musculaire provoque des lésions musculaires et une régénération. De la nourriture et de l’hydrogel seront mis à disposition dans la cage les trois premiers jours au cas où les animaux ne parviendraient pas à atteindre la grille pour se nourrir. Également, des anti-douleurs sont prévus pour réduire la douleur des souris. Un tableau d'évaluation des animaux et des points limites a été préparé, adapté à chaque intervention, et sera consulté tout au long du projet pour évaluer l'état de chaque souris incluse dans chaque procédure

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples : 1. La souris est un mammifère et la structure de son muscle squelettique est très similaire à celle du muscle squelettique humain. 2. La courte durée de gestation et la maturité post natale chez la souris sont compatibles avec la durée de nos expériences. 3. La petite taille des souriceaux nous permet de cibler toutes les cellules avec une petite quantité des vecteurs viraux. 4. Des études similaires sur la délivrance de gènes par des vecteurs viraux chez la souris ont servi de base à la conception de l'expérience. 5. Notre laboratoire possède une expertise dans la manipulation des souris. pour l'injection des vecteurs viraux, les souris seront injectées soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. L'objectif est de cibler le plus grand nombre de cellules souches musculaire par l'intermédiaire des vecteurs viraux. Par la suite, les tests de régénération musculaire seront effectués chez des souris adultes, soit à 11-15 semaines d'âge, pour étudier le comportement et la capacité des cellules souches musculaires pendant la régénération des muscles squelettiques.

Les souris qui perdent 20 % de leur poids maximum, ou dont le score sur la grille de douleur atteint 10 à 12, sont mises à mort. 4 233 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 4 113 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse, des injections mimant une infection, et pour certaines une destruction de la moelle osseuse par rayons X suivie d'une greffe de cellules, avec fatigue, hypothermie et perte de poids pendant une quinzaine de jours. Le porteur cherche à établir le rôle d'un facteur de transcription dans la fabrication des globules blancs, et indique que les animaux issus de l'élevage passent d'une procédure à la suivante, les reproducteurs mis à part, avant d'être tués.

Objectifs

L'objectif de notre projet est d'explorer les mécanismes moléculaires permettant la différenciation des cellules souches sanguines, appelées cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment vers la différentiation en globules blancs. Les CSH, résidant dans la moelle osseuse, sont des cellules à longue durée de vie dotées d'une capacité d'auto-renouvellement, nécessaire pour renouveler les différentes cellules composant le sang. En raison de ces caractéristiques, les CSH doivent relever le défi de maintenir un équilibre délicat entre auto-renouvellement et différentiation extensive pour reconstituer les cellules sanguines épuisées. Cet équilibre délicat est crucial pour maintenir l'homéostasie et répondre aux demandes évolutives de l’organisme. Les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs ne sont pas totalement compris. De par nos résultats antérieurs, le facteur de transcription MafB pourrait jouer un rôle dans cette différenciation. Nous avons montré que les CSH possèdent la capacité de conserver une mémoire des signaux infectieux précédents. Cette mémoire, caractérisée par un ensemble de modifications épigénétiques, a été appelée "immunité entraînée". Ce phénomène a des implications significatives dans la mise en place d’une seconde réponse adaptée à la suite d’un même stimulus. Nos résultats suggèrent que le facteur MafB 1/ joue un rôle dans la différenciation des CSHs en condition homéostatique et inflammatoire (notamment en favorisant la production des cellules myéloïdes (hématies, polynucléaires, monocytes et plaquettes en urgence), 2/ serait impliqué dans la mécanistique de mise en place de la mémoire entrainée des CSH. Alors que MafB est une protéine qui intéragit avec elle-même, dans certains contextes inflammatoires, elle peut former un complexe avec un autre facteur Fos qui pourra potentiellement impacter la différenciation des CSHs et la mise en place mise en place de la mémoire entraînée. Notre projet aura donc pour objectifs: 1/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions homéostatiques ; 2/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions inflammatoires de type myélopoïèse d'urgence et dans l’immunité entrainée au niveau des modifications épigénétiques induites par la primostimulation, 3/ la capacité des CSHs à reconstituer totalement une moelle osseuse en absence de MafB ou en présence du complexe MafB/Fos

Bénéfices attendus

L’étude de la différenciation des CSHs présente de nombreux bénéfices potentiels, tant pour la recherche fondamentale que pour les applications cliniques. Sur le plan scientifique, elle permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent la transformation des CSH en différents types de cellules sanguines, notamment les hématies, les polynucléaires, les monocytes et les plaquettes. Cette connaissance approfondie pourrait aider à identifier des dysfonctionnements immunitaires responsables comme par exemple des formes graves du SARS-Cov2 ouvrant ainsi la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques modulant l’activité de ces cellules. En clinique, une meilleure maîtrise de la différenciation des CSH pourrait améliorer les thérapies cellulaires, notamment les greffes de moelle osseuse, et favoriser le développement de traitements régénératifs pour réparer les tissus endommagés. En outre, ces avancées pourraient contribuer à la création de thérapies personnalisées, en optimisant l'utilisation des cellules souches pour répondre aux besoins spécifiques des patients. Finalement l’immunité entrainée représente un concept novateur et sa modulation une alternative thérapeutique en tant que solution de remplacement aux antibiotiques en favorisant la création de vaccins à large spectre.

Procédures

Cette procédure a pour but de produire les animaux d’intérêt utiles au projet à savoir des souris issues des lignées MafB flox CSF1R Cre, MafB flox Vav1 Cre, MafB Flox Vav1 Cre PU1 KI GFP et MafB Flox/MafB E269R Vav1 Cre. D'après nos études précédentes, nous considérons qu'environ 3% des animaux necessiteront un second génotypage fait par prélèvment caudal (--28 jours et sera effectué sous anesthésie gazeuse isofluorane 4%. Le génotypage du modèle PU1 KI GFP se fait de par l’analyse de la protéine PU1 KI GFP présente dans les souris issues de la lignée MafB Flox Vav1 CRE PU1 KI GFP par analyse sanguine en cytométrie en flux. Pour cela, un prélèvement sanguin d'un volume de 100µL effectué en retro-orbital sera effectué sur des souris âgées de 5-7 semaines. . Certaines souris pourront subir en vigile injection intra-veineuse qui entraine une légère douleur de courte durée pour l’injection d’un traceur avant mise à mort, Certaines souris recevront une stimulation inflammatoire soit en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse soit en injection intrepéritonéale sur animaux vigiles. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’une semaine) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Pour les stimulations inflammatoires, cela varie de 1 à 3 jour en fonction du type de stimulation. Certaines souris subiront une myéloablation par irradiation aux rayons X sur animaux vigiles (quelques 5 min) puis une transplantation en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse d’une suspension de cellules de moelles osseuses. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’un mois) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Les injections ou prélèvements entrainent une légère douleur de courte durée (quelques minutes) localisée au niveau de la zone d’injection ou de prélèvements.

Impact sur les animaux

La myéloablation peut rendre les animaux plus susceptibles aux risques infectieux. La répétition des gestes techniques et l’inconfort que peut ressentir l’animal après une injection mimant une infection ou après une myéloablation pourront engendrer une souffrance modérée. Les souris pourront présenter une fatigue, une légère hypothermie et une perte de poids pendant 2 jours (injection mimant une infection) ou 15 jours (transplantation suivant une myéloablation). Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur contention

Devenir

Animaux conservés pour la suite des procédures après la procédure 1 (excepté pour les réproducteurs) et mise à mort pour les autres procédures.

Remplacement

Afin d'étudier le potentielle rôle du gène MafB dans la régulation de la différenciation des cellules souches hématopoiétques, nous ne pouvons pas remplacer le modele murin. En effet, les cellules souches hematopoiétiques étant particulièrment régulées par leur environement, d'un point de vue physique via des interactions directes cellules-cellules mais aussi de part l'ensemble des médiateurs chimiques régulant leur communication, l'utilisation de lignée cellulaire est impossible. Ne pouvant donc pas remplacer le modèle murin, nous réduirons autant que possible leur utilisation.

Réduction

Sur la base de nos données préliminaires, nous calculerons le nombre minimum de souris nécessaires pour chaque expérimentation permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif (calcul du n avec un test unilatéral pour une différence de 10%, un risque alpha de 5%, une puissance bêta de 80%). Nous avons également choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de même portée respectifs et non avec des souris de type sauvage.

Raffinement

Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'améliorer le bien être de l'animal pour obtenir des données fiables. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (prélèvement sanguin et transplantation). Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d'évaluation de la douleur. Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si le score de la grille de douleur atteint 10-12, soit le cas sévère, les animaux seront alors mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement est enrichi par des dômes en carton ou du coton.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Disponibilité de modèles génétiquement modifiés nécessaires aux études réalisées dans ce projet. Les animaux seront utilisés entre 8 semaines et 2 ans sachant qu’il n’est pas exclu que l’impact de la délétion de MafB évolue au cours du vieillissement.

Mesurer si des crues simulées modifient la morphologie et la nage des jeunes truites : 400 truites fario sont utilisées, 160 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 240 dans des procédures modérées, toutes tuées à l'issue. Chacune est marquée à l'élastomère coloré sous anesthésie, élevée trois mois en chenal expérimental, la moitié subissant des simulations de crue, puis capturée par pêche électrique et testée une heure en milieu contrôlé. Le porteur décrit la pêche électrique et le marquage comme stressants sans surmortalité constatée par le passé, et rappelle que les simulations restent d'une amplitude inférieure aux crues naturelles. La mise à mort sert à prélever les pièces sclérifiées situées près du cerveau et des nageoires pour identifier les familles, les résultats étant destinés à alimenter une réglementation sur la franchissabilité des obstacles qui ignore aujourd'hui les juvéniles.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer l’impact d’événements hydrologiques extrêmes sur le développement morphologique des poissons (Salmonidés), pouvant entrainer des modifications fonctionnelles tel que le comportement, les performances de nages et la prise alimentaire. Le changement climatique se traduit entre autres par l’augmentation de la fréquence, de l’imprévisibilité et de l’intensité d’événements hydrologiques affectant l’ensemble des écosystèmes de rivière (physico-chimique, nourriture disponible, habitat disponible, sédimentologie...). Au-delà des éventuelles réponses adaptatives, de telles variations de débits peuvent à court terme affecter précocement les patrons développementaux des jeunes Salmonidés, conditionnant ainsi leur morphologie. Etant donné les fortes contraintes morpho-fonctionnelles des organismes, un tel changement de morphologie est suspectée pouvoir modifier le comportement des individus, leurs performances locomotrices et de dispersion précoce, notamment en lien avec les pièges thermiques. À plus long terme, une survie différentielle peut conduire à la sélection de poissons présentant des morphotypes particuliers, des comportements et des performances spécifiques, affectant la trajectoire évolutive et la dynamique des populations, possiblement en lien avec leur capacité de résistance/persistance. Il est ainsi nécessaire de mieux comprendre ces mécanismes et leurs interactions dans la gestion des populations face au changement climatique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se rapportent à l’écologie et l’évolution des poissons juvéniles soumis à des événements extrêmes d’hydrologie dans une perspective de changement climatique. L’expérience permettra de quantifier 1) l’effet d’événements hydrologiques sur le développement (morphologie) et la dispersion des juvéniles. 2) Comment cette morphologie affectée par de tels évènements climatiques peut changer les aptitudes phénotypiques des poissons (dispersion, morphologie, comportements et capacités locomotrices). 3) Déterminer si ces aptitudes phénotypiques conditionnent les capacités de dispersion dans les cours d’eau, notamment en relation avec la franchissabilité d’obstacles. 4) Nous pourrons également mettre en évidence si les variations phénotypiques observées résultent d’un processus de plasticité phénotypique ou d’adaptation, permettant une meilleure mise en perspective des trajectoires évolutives des populations de poissons menacées face au changement climatique. 5) Enfin, les capacités des juvéniles à franchir des barrières naturelles ou artificielles de hauteurs (saut) vitesses (nage) variées pourront alimenter la réglementation concernant les Informations sur la Continuité Écologique (ICE) et plus particulièrement l’évaluation de la franchissabilité d’obstacle qui ne prends aucunement en compte les juvéniles dans l’évaluation.

Procédures

Les animaux seront soumis à un marquage individuel d’une durée de quelques secondes sous anesthésie, selon un mode opératoire ne durant pas plus de 5 minutes entre le début de l’anesthésie et le réveil. Ce marquage coloré sera conservé par le poisson durant toute l’expérimentation. Durant les 3 premiers mois de croissance en chenal expérimental, la moitié des poissons seront soumis à des simulations d’événement hydrologique d’une amplitude moindre que ceux naturellement subit dans des milieux naturels. Après cela, les individus seront collectés une seul fois à l’aide d’une pêche électrique dans le but d’étudier leurs comportements et leurs capacités locomotrices en milieu contrôlé (2 séquences de test ne durant pas plus d’une heure au total, subit une seule fois par individu).

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles pour les animaux concernent la capture/recapture au moyen d’une pêche électrique. Les individus se remettent généralement très rapidement de cette pêche conduite par une équipe technique expérimentée, sans séquelles ni effets indésirables. Le marquage individuel sous anesthésie par V.I.E est également stressant mais a souvent été réalisé par le passé sur ces jeunes stades, n’occasionnant pas de surmortalités. Les tests comportementaux prévus en milieu contrôlé (aquarium/auge) peuvent également induire au moment de la manipulation un stress modéré qui sera spécifiquement suivi afin de ne pas altérer les résultats. Enfin, les simulations d’événement hydrologique au sein du chenal sont d’une amplitude moindre que ceux naturellement subit dans les cours d’eau dont sont issus les poissons.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de l'expérience, afin de réaliser les prélèvements nécessaires pour le phénotypage. En plus des thématiques déjà présentées, l’analyse des pièces sclérifiées (situées dans des capsules otiques, près du cerveau) sera réalisé et nécessite la mise à mort des individus. De plus, des prélèvements de nageoires seront réalisés pour la détermination génétique des familles (géniteurs).

Remplacement

Ce projet s’intéresse aux interactions entre les individus vivants et leur environnement. Il est donc indispensable de travailler sur des organismes intégrés, entiers et en interaction (aucune possibilité de substitution par organoïdes ni approche in silico). Le modèle d’étude choisi est la truite fario Salmo trutta, espèce commune avec un statut de préoccupation mineure. Elle est abondante en France et possède un pouvoir invasif important dans certaines régions du monde. Afin de minimiser l'impact sur les populations naturelles, les poissons utilisés seront issus de pisciculture produisant des individus proches de ceux retrouvés à l’état sauvage.

Réduction

L’expérimentation présentée ici se divise en deux procédures dont chacune d’elle portera sur des individus ayant grandi dans des conditions hydrologiques contrastées (traitement avec hydrologie stable Vs. hydrologie variable). Les deux effectifs utilisés (240 pour la procédure 1 et 160 pour la procédure 2) correspondent à un strict minimum permettant de répondre aux attentes scientifiques (étude de la réponse morphologique, notamment par origine/géniteurs/biefs) tout en accommodant des contraintes techniques (méthode de morphométrie géométrique). De plus, les effectifs ont été définis de façon à ce que les analyses statistiques envisagées présentent une puissance suffisante.

Raffinement

La première phase de l’expérimentation aura lieu dans un chenal expérimental conçu pour la croissance des salmonidés. Les alevins avec vésicule vitelline seront enfouis dans le substrat afin de créer une émergence directement dans le chenal et de ne pas induire de stress supplémentaire par le changement de milieu au cours du début de la vie. Cela permet également aux individus de se nourrir naturellement à partir de la communauté d’invertébrés ayant naturellement colonisé le milieu environnant. Chaque groupe de 60 individus sera maintenu dans un bief du chenal pour une densité de 2,14 individus/m², similaire à celle observée en milieu naturel pour les truites 0+. Le chenal est alimenté par l'eau du ruisseau adjacent, avec la même qualité physico-chimique (jugée trés bonne) et la même densité en ressources alimentaires. Le marquage par injection d'élastomère et la biométrie seront effectués sous anesthésie, à l’aide de matériel adapté (micro-aiguille), par une équipe expérimentée, selon un mode opératoire ne durant pas plus de 5 minutes entre le début de l’anesthésie et le réveil. Durant cette période, leur peau sera maintenue humide grâce à l’utilisation d’un textile imbibé. Les individus seront gardés en observation dans un lieu de réveil afin de contrôler la bonne récupération suite à l’anesthésie. La capture par pêche électrique sera réalisée par une équipe expérimentée et habilitée avec un matériel et un champ électrique adapté aux juvéniles de salmonidae. Si plusieurs passages de pêche sont nécessaires pour capturer les poissons, ils seront espacés d’une demi-journée afin de ne pas créer des stress répétitifs proches dans le temps. La seconde phase de l’expérimentation en milieu contrôlé sera réalisée dans des aquariums alimentés par de l’eau du ruisseau adjacent avec la même qualité physico-chimique. Les principaux paramètres physico-chimiques seront cependant régulièrement suivis (plusieurs fois par jours) pour s’assurer de cela et l’eau sera continuellement oxygénée à l’aide de bulleurs. L’eau de chaque aquarium expérimental sera partiellement renouvelée entre le passage de chaque poisson. Durant cette étape, il n’est pas possible d’amener d’enrichissement dans les aquariums, faute de quoi le suivi vidéo des mouvements ne serait pas possible. La durée du test est cependant réduite au maximum (15 minutes) afin de limiter le stress induit.

Choix des espèces

La truite fario Salmo trutta est une espèce d’eau froide, faisant d’elle un modèle dans l’étude des réponses adaptative des populations aux changements climatiques. De plus, elle possède un fort intérêt culturel (pêche de loisir), économique (consommation, aquaculture) et écologique (trait d’histoire de vie, variabilité intra-spécifique et aire de répartition). C'est par ailleurs une espèce modèle en écologie évolutive, et l'interprétation des résultats obtenus dans ce projet bénéficiera de l'abondante bibliographie. Dans le cadre de cette étude, des mécanismes de plasticités phénotypiques de l’espèce ont déjà pu être observés. Enfin, la reproduction artificielle de cette espèce est bien maîtrisée, ce qui permet d'utiliser des individus issus de piscicultures, proches des populations sauvages, plutôt que d’affecter des stocks naturels. Les animaux utilisés seront des alevins au stade 0 + (en fin de résorption vitelline au début de l’expérimentation puis juvéniles en fin d’expérimentations 4 mois plus tard). Il s’agit du stade où les processus développementaux permettent la plus importante croissance relative, la plus à même de conduire à des remaniements phénotypiques structurels pérennes qui pourront affecter l’écologie des poissons sur le long terme.

Gavées deux fois par jour pendant les vingt et un jours de leur gestation avec des antiépileptiques de troisième génération, des souris gestantes passent aussi des échographies destinées à mesurer la viabilité de leurs fœtus. 1 376 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, 1 176 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 200 un niveau léger. Une partie des animaux reçoit un implant crânien d'électroencéphalographie sous anesthésie générale, suivi de séances d'enregistrement de six à huit heures, et les deux générations issues des mères traitées passent des tests comportementaux deux heures par jour pendant deux semaines. Ces tests ne sont pas nommés, seulement rattachés à "la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement", et les effets attendus sur les animaux tiennent en trois lignes : inconfort et douleur liés à l'implant, stress de l'isolement social, stress de la contention et du gavage.

Objectifs

L'administration de médicaments anticonvulsivants (ASM) pendant la grossesse représente un problème clinique majeur. Pour stopper les crises épileptiques, ces molécules sont disponibles avec des contre-indications variables. Notamment il existe des lacunes critiques sur les effets lors du développement des fœtus ou sur des trajectoires adverses neurologiques. Il existe des preuves que les anciens ASM, sont associés à des risques accrus de malformations fœtales. Dans le paysage des ASM disponibles, le choix des molécules à tester est crucial. Globalement, des études précliniques sur les risques neurodéveloppementaux de l'exposition pendant la grossesse existent pour les ASM de 1ère et 2ème génération, mais sont rares pour les ASM, les plus récents, de 3ème génération. C'est pourquoi nous examinerons les risques potentiels d'effets neurodéveloppementaux des ASM de 3e génération. Ces nouveaux ASM, aux mécanismes d'action diversifiés, pourraient élargir le choix thérapeutique afin d'améliorer la prise en charge des crises d'épilepsie pendant la grossesse.

Bénéfices attendus

Nous générerons des connaissances sur l'impact prénatal des ASM sélectionnées, en utilisant l'échographie 3D pour mesurer la viabilité et les changements anatomiques macroscopiques des fœtus et des placentas. Chez l'adulte, nous fournirons des données sur la présence de trouble de mémoire et d’anxiété en fonction de l’exposition prénatale d’ASM. L’ensemble de ses données fourniront des informations nouvelles sur des éventuels risques associés aux ASM de 3ème génération.

Procédures

Les femelles gestantes vont recevoir 2 fois par jour les médicaments anticonvulsivants par gavage (30 secondes par souris) pendant toutes la durée de la gestation (21 jours). Elles vont passer une échographie (20 min par souris), qui est un acte non invasif pour suivre l'évolution de la grossesse et déterminer la viabilité des foetus. Ensuite les souriceaux issus de ces mères ne seront plus exposés aux médicaments anticonvulsivants. Les tests comportementaux, qui seront utilisés sur les deux générations, sont basés sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement et se feront sur deux semaines à raison de 2 heures par jour. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale pour l'implantation du système d'électroencéphalographie (30 min). Enregistrements électroencéphalographiques, entre 6 et 8 heures pour chaque séance.

Impact sur les animaux

Inconfort et douleur dû à la pose d'un implant crânien. Stress due à l'isolement social temporaire. Stress causés par la contention et le gavage.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car il est nécessaire de récupérer les organes pour analyses.

Remplacement

Cette recherche nécessite un modèle murin car nous avons besoin d'étudier l'impact des médicaments antiépileptiques sur le placenta, le développement des fœtus, et la possibilité de trouble neuronal après exposition prénatal aux médicaments antiépileptiques.

Réduction

Nous avons minimisé le nombre d'animaux nécessaires dans chacune des procédures tout en nous assurant d'en avoir suffisamment pour faire l'analyse statistique de nos expériences. Dans toutes les procédures, nous utiliserons des femelles et des mâles issus des mêmes portées.

Raffinement

Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pour minimiser le stress des animaux, des dispositifs d'enrichissement (du coton, une buchette en bois et une maison igloo) sera disponible dans chaque cage.

Choix des espèces

Cette recherche nécessite l'utilisation de la souris car c'est un mammifère adéquat pour étudier les impacts pré et postnatal des médicaments. La souris est très utilisée dans les études précliniques pour le développement des médicaments antiépileptiques. Nous allons étudier l'impact des ASM à différents temps de développement allant du stade foetus au stade adulte. Certains ASM sont connus pour provoquer des malformations foetale. Certains ASM sont connus pour provoquer des malformations fœtales. Nous avons donc besoin de vérifier l’éventuelle présence de malformations fœtales après exposition des femelles gestantes aux ASM sélectionnés pour cette étude. Nous allons suivre les animaux exposés jusqu'au stade adulte pour étudier les éventuelles modifications cellulaires dans les générations F1 et F2.

Mettre au point la production d'embryons in vitro et le transfert entre espèces, sous couvert d'un programme de conservation de la biodiversité : 57 cervidés vont être utilisés, 52 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 un niveau léger. Les femelles donneuses sont soumises à des cycles de synchronisation puis à des prélèvements d'ovocytes par cœlioscopie sous anesthésie générale, jusqu'à quatre fois par an et huit fois sur quatre ans, chaque intervention pouvant durer deux heures de l'anesthésie au réveil. Les receveuses reçoivent un embryon par endoscopie une fois par an. Aucun animal n'est tué à l'issue, tous étant réutilisés puis susceptibles de rejoindre le groupe de reproduction, et les deux espèces employées, le cerf élaphe et le cerf sika du Japon, sont l'une comme l'autre communes, le porteur précisant que le sika "ne correspond pas à une espèce en voie de disparition".

Objectifs

Dans le cadre de ses missions de conservation de la biodiversité, notre laboratoire de recherche mène différents programmes de conservation ou d'amplification de la génétique d'espèces rares, basés sur l’utilisation de biotechnologies de la reproduction. Une stratégie pour augmenter le nombre de descendants à partir d'effectifs très limités de géniteurs, consiste à utiliser la production in vitro d'embryons pour l'espèce menacée couplée au transfert embryonnaire sur des femelles porteuses proches génétiquement (espèce ou sous espèce). Cette stratégie s'est déjà avérée concluante sur le plan conceptuel avec un premier succès mondial en 2006 (naissance d'un jeune cerf sika du Japon ou Cervus nippon nippon porté par une mère élaphe Cervus elaphus).

Bénéfices attendus

Les techniques modernes de procréation assistée telles que l’insémination artificielle, la fécondation in vitro, la gamétogenèse in vitro ou le transfert embryonnaire, sont autant d’outils qui permettront à l’avenir d'améliorer l'efficacité des programmes conservatoires ex situ. Le stockage patrimonial à long terme de la génétique des espèces les plus rares grâce à la cryo-conservation de semences, d’ovules, de tissus gonadiques et embryons dans l’azote liquide représente une stratégie complémentaire de conservation désormais applicable à la faune sauvage. Ces approches permettront, au-delà du stockage sur le long terme, un meilleur brassage génétique entre sites de conservation et une facilitation pour la réintroduction de cette génétique vers les sites in natura. En théorie, ces échantillons sont susceptibles d’être conservés plusieurs centaines d’années (le recul actuel montre que nous pouvons conserver ces échantillons à minimum à moyen terme 50 ans).

Procédures

Les animaux de lots distincts seront soumis à des procédures chirurgicales (chirurgie mini invasive) pour permettre soit la collecte d'ovocytes dans le but de produire des embryons soit pour permettre le transfert d'embryons produits in vitro. Les femelles donneuses d'ovocytes seront soumises à des cycles de synchronisation/prélèvements de gamètes après anesthésie un maximum de 4 fois par an et au total 8 fois sur 4 ans. Les femelles receveuses d'embryons (transfert embryonnaire par endoscopie sur animaux anesthésiés) pourront être transférées sous anesthésie générale une fois par an. Les procédures chirurgicales n'excèdent pas deux heures du moment de l'anesthésie au réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La conduite des protocoles de procréation médicalement assistée chez les cervidés repose généralement sur des protocoles conduits sous anesthésie générale après manipulation des animaux. Les nuisances ou effets indésirables attendus sont celles et ceux associés à cette pratique (le risque anesthésique et notamment le risque de détresse respiratoire est considéré comme étant le plus probable dans nos procédures).

Devenir

Les animaux utilisés proviennent de l'élevage réalisé sur le site. Après utilisation dans le cadre des procédures expérimentales de ce projet, ces animaux pourront tout à fait rejoindre le groupe de reproduction naturelle. Par ailleurs, ces animaux feront l'objet d'études non invasives. Différentes études du comportement (reproduction, interactions sociales, expériences sur la communication acoustique ou comportement alimentaire) sont réalisées sur notre structure dans le cadre de protocoles hors-champ de l'expérimentation animale.

Remplacement

La mise au point des techniques de procréation assistée chez les mammifères nécessite l’utilisation d'animaux (cette étude ne peut être remplacée par des modélisations in silico). Le recours aux modèles in vitro sont déjà proposés dans l'étude permettant de minimiser le nombre d'interventions sur les animaux.

Réduction

Nos approches doivent permettre la collecte de gamètes en nombre suffisant (2 lots de 15 ovocytes) pour constituer des lots expérimentaux et comparer l'efficacité de 2 méthodologies de production in vitro (ovocytes fécondés par injection de spermatozoïdes vs. ovocytes fécondés par fécondation in vitro classique; ovocytes cryoconservés vs. ovocytes frais) sur la base de tests statistiques. La répétition de la procédure sur l'animal (5 à 6 ovocytes par femelle et par collecte) permet de réduire le nombre total d'animaux utilisés. La cryoconservation de semence permet de limiter les interventions sur le mâle. En effet, un même échantillon de semence cryoconservée peut être utilisé pour plusieurs inséminations ou fécondations in vitro (fractionnement de l’éjaculat avant cryoconservation) sur plusieurs années.

Raffinement

L'ensemble des procédures (élevage ou Procréation Médicalement Assistée) fait l'objet d'une bonne maîtrise technique par la structure. Afin de réduire le stress lié aux manipulations, un protocole d’habituation est appliqué par les soigneurs tout au long de l’année pour habituer les animaux aux procédures nécessaires au projet. Les animaux font l'objet d'une surveillance attentive par soigneurs et vétérinaires 7 jours sur 7. Dans le cas des procédures de coeliochirurgie sous anesthésie générale, des anesthésiques locaux seront administrés aux sites d’insertions des trocarts afin de minimiser la douleur au réveil de l’animal. Les traitements anti-inflammatoires non-stéroïdiens, définis avec le vétérinaire référent, permettent de réduire la douleur post opératoire. Ces procédures sont réalisées sur nos espèces modèles en coelioscopie avec des matériels pédiatriques permettant de réduire la taille des trocarts utilisés, de minimiser les douleurs post opératoires pour les animaux et d'accélérer la cicatrisation. Un suivi est réalisé sur l'ensemble des individus et une fiche de score ou scoring est établie pour permettre de diagnostiquer et évaluer la douleur chez les animaux (absente, légère, modérée ou sévère). En cas de diagnostic d'une douleur sévère, la procédure est stoppée pour l'individu. Pour les douleurs légères et modérées, un signalement est réalisé au responsable de l'établissement utilisateur ainsi qu'au vétérinaire référent pour avis et traitement. S'il n'est pas constaté d'amélioration dans les 48 heures (pas de disparition des symptômes ou aggravation de la douleur), la procédure expérimentale est stoppée pour l'individu. Une prise en charge intégrale pour soins vétérinaires est réalisée pour les animaux.

Choix des espèces

De par sa collection unique d’espèces de cervidés rares et en voie d’extinction, les programmes de recherche développés par notre structure visent des applications pour la conservation d'espèces cervidés. Deux espèces communes de cervidés seront ici utilisés : l’espèce élaphe (Cervus elaphus) et l’espèce sika (Cervus nippon). L’espèce élaphe, du fait de sa disponibilité (espèce commune en France), de son grand gabarit et de la bonne connaissance de sa physiologie est une espèce de choix comme espèce receveuse d’embryons. L’espèce Sika du Japon, donneuse d’embryons ne correspond pas à une espèce en voie de disparition, mais est utilisée pour mettre à l’épreuve la faisabilité des techniques de production in vitro et du transfert d'embryons interspécifiques. Des transpositions de nos recherches pourront être faites sur les sous espèces de cerfs sika menacées dans le milieu naturel (ex C.n.taiouanus, C.n.pseudaxis, C. eldii).

Comprendre comment se forment les cellules ciliées qui tapissent les cavités du cerveau, et l'origine de certaines maladies neurologiques : 2 037 souris vont y être utilisées. 1 987 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 un niveau léger, et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Des femelles gestantes sont gavées ou reçoivent un traceur sous la peau, leurs petits sont biopsiés à la queue le jour de la naissance, puis certains reçoivent une injection dans le cerveau suivie d'impulsions électriques, deux minutes par animal. Le porteur indique que le gavage peut léser l'œsophage et provoquer des mises bas prématurées ou difficiles, et que l'électroporation peut entraîner des microlésions du cerveau ou le rejet du souriceau par sa mère, tout en estimant à cinq ou dix animaux la taille optimale par stade d'analyse, pour un total de 2 037 souris.

Objectifs

Les objectifs de notre projet de recherche sont d'une part de comprendre comment les cellules souches se développent le long des parois des ventricules du cerveau pour former différents types de cellules gliales. D'autre part, nous cherchons à comprendre l'origine de pathologies humaines telles que les ciliopathies et les maladies psychiatriques. Nous souhaitons donc utiliser des souris génétiquement modifiées afin de mimer ces pathologies humaines et ainsi identifier l'origine développementale de ces pathologies. A plus long terme, ce projet permettra de mieux identifier l'origine des dysfonctionnements dans certaines pathologies neurologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier les cascades moléculaires complètes du développement des cellule multiciliées du cerveau, les épendymaires qui tapissent les murs ventriculaires et les cellules du plexus choroïde. Nous pourrons ainsi mieux comprendre les étapes qui dysfonctionnent dans des conditions pathologiques telles que les tumeurs cérébrales et les maladies neurologiques (220 000 nouveaux cas chaque année en France). A plus long terme, nous pouvons envisager de nouveaux traitements thérapeutiques pour améliorer les conditions de vie des patients.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques: 1- prélèvement caudal unique sur des souris vigiles le jour de la naissance de quelques secondes pour génotypage, 2- injection sous cutanée unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles d'un traceur afin de réaliser un marquage des cellules d’intérêt chez les embryons puis euthanasie réglementaire des animaux sous analgésie et anesthésie en quelques minutes à différents stades, 3- gavage unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles avec une solution permettant d’induire le modèle expérimental puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire en quelque secondes à différents stades, 4- injection unique au niveau cérébral sous analgésie et anesthésie, application d’impulsions électriques permettant l’introduction du traceur génétique chez les nouveaux-nés (environ 2 minutes par animal) puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire à différents stades.

Impact sur les animaux

Les injections effectuées afin de procéder à un marquage cellulaire, une analgésie ou une anesthésie seront réalisées par voie sous-cutanée et pourront induire un stress pendant la contention ainsi qu’une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille. La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire des lésions de l’œsophage ou de l’inflammation. L’électroporation à la naissance (injection au niveau du cerveau suivi de l’application de quelques impulsions électriques) peut entraîner des microlésions du cerveau et pourrait dans de rare cas entraîner un rejet par la mère ou un défaut de prise de poids. Concernant les anesthésies, les effets secondaires peuvent être les suivants : détresse respiratoire, réveil de l’animal et stress thermique. Dans le cadre de l'identification génétique des animaux, une biopsie caudale sera réalisée à la naissance. Les effets indésirables peuvent être le stress engendré par la contention/manipulation, la douleur légère et locale ainsi que la possibilité de saignement à la suite de la biopsie.

Devenir

L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Aucune technique ou outil biologique n'est actuellement disponible pour mimer correctement le développement des cellules multiciliées de cerveau de mammifères que nous étudions. En effet, nos résultats expérimentaux de cultures primaires démontrent que seuls certains aspects du développement épendymaire peuvent être étudiés in vitro. Certains mécanismes moléculaires semblent mal récapitulés dus, en partie, à la non-conservation de la structure tridimensionnelle de l'épithélium ventriculaire. De façon similaire, les résultats préliminaires obtenus sur des cultures d'organoïdes démontrent l'absence de cellules épendymaires dans ces modèles.

Réduction

Un total de 2037 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous utiliserons des mâles ou des femelles indifféremment pour réduire le nombre d'animaux et la taille de chaque stade d'analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Nous estimons à 5 ou 10 animaux la taille optimale par stade d'analyse en fonction de la procédure.

Raffinement

Trois catégories de mesures de raffinement seront mises en œuvre et concerneront les aspects liés aux procédures, l'établissement de points limites ainsi que l'hébergement et l'enrichissement de l'environnement des souris. Nous réduirons au maximum l'inconfort des souris car les procédures que nous mettrons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l'angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris ayant subi une procédure pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez les souris consécutivement, ou non, à la réalisation d'un acte et non conduiront à l'arrêt de la procédure en cours. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la règlementation en vigueur à savoir : l’hébergement en surpression, les portoirs avec des cages ventilées individuellement, le nombre d’animaux par cage), eau et nourriture à volonté, change litière et biberon hebdomadaire, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu (papier kraft, coton et maison en carton). L'ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

Le projet a pour objectif d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement des cellules multiciliées des mammifères. Nous utiliserons le modèle murin car la souris présente un développement proche de celui de l’homme. De plus la durée de gestation courte ainsi que la taille des portées permettent de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences et à partir de peu de parents. La disponibilité d’un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiées, qui permettent d'induire ou inhiber l'expression de certains gènes d'intérêt, fait du modèle murin un modèle de choix pour répondre aux questions scientifiques. Nous utiliserons des femelles adultes matures sexuellement qui seront rendues gestantes par accouplement contrôlé afin de connaître précisément le stade de gestation afin d’induire les modèles expérimentaux. Par la suite les animaux seront étudiés au cours du développement cérébral (entre le jour de la naissance et 20 jours postnatal) parce que nous avons établi que les cellules d’intérêt sont spécifiées avant le stade embryonnaire et entièrement différenciées et matures au 15ème jour postnatal et constitue donc notre fourchette d’analyses dans ce projet.