Biologie du développement

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, présentent du sang dans les selles ou restent voûtées en permanence sont mises à mort. 5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines reçoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant quatorze jours, d'autres un gavage à l'âge de deux semaines, une instillation intranasale sous anesthésie ou des prises de sang hebdomadaires, et une partie est rendue immunodéprimée avant une greffe de moelle osseuse. Le porteur cherche à comprendre comment le microbiote intestinal du nouveau-né éduque son système immunitaire, sans expliquer ce qui fixe l'effectif à 5 400 animaux au-delà de la variabilité du microbiote et des effets de portée et de cage.

Objectifs

L’objectif global de ce projet est de comprendre comment le microbiote intestinal, par la production de métabolites, éduque le système immunitaire pendant la période néonatale et permet de maintenir un état symbiotique. Pour se faire, le projet visera à : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, produits bactériens et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour diminuer la susceptibilité de développer des pathologies inflammatoires ; (ii) comprendre par quels mécanismes les métabolites microbiens participent à la persistance des effets bénéfiques de la période néonatale jusqu’à l’âge adulte. Répondre à ces deux objectifs permettrait d’identifier de nouveaux traitements comme des pro/pre/post-biotiques, ainsi que de nouveaux biomarqueurs au début de la vie afin de diminuer la prévalence aux maladies inflammatoires.

Bénéfices attendus

Le projet devrait faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire.

Procédures

- Prélèvement sanguin 1 ou 2 fois maximum par procédure ou 1 fois par semaine pendant trois semaines et terminal sous anesthésie. Quelques secondes à chaque fois - Injection par voie intrapéritonéale une fois tous les deux jours, par animal, pendant 14 jours ou 1 ou 6 fois maximum par procédure. Durée : quelques secondes - une instillation intranasale. Durée : 2 min sur souris anesthésiée - Gavage 1 fois à l’âge de 2 semaines. Durée : quelques secondes - Injection intraveineuse 1 fois à l’âge adulte. Durée : quelques secondes sur souris anesthésiées

Impact sur les animaux

L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage de substances, effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer inconfort de courte durée. Certains traitements entraînent une pathologie intestinale avec diarrhée transitoire et une perte de poids qui peut varier de 10 à 20%. Un traitement peut entraîner une perte de poids au jour 4 chez certains individus (

Devenir

Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules dans les tissus intestinaux et d'autres organes. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.

Remplacement

Aucune alternative non-animale n’est disponible pour accomplir ce projet. L’interaction complexe que représentent les milliards de bactéries du microbiote intestinal et son hôte ne peut être reproduite in vitro. Les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels ne peuvent pas représenter la grande variété de cellules immunitaires dans l’intestin ainsi que le recrutement de ces dernières, ou encore mimer les différents signaux produits par notre système nerveux central, qui joue un rôle prépondérant dans l’éducation du système immunitaire. De ce fait, pour répondre aux questions de ce projet, il est toujours essentiel et nécessaire d’utiliser des modèles animaux.

Réduction

D'après la littérature et nos résultats antérieurs, les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et étant donné que le projet inclut des effets portée et cage. Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. De plus, les expériences ont été conçues afin d’utiliser un maximum d’organes de la même souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons utilisé une aide statistique pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles ajustés sur plusieurs facteurs (âge, sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.

Raffinement

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences entrainant une maladie inflammatoire, dont la sévérité peut être précisément suivie par une perte de poids, l’aspect général et un marqueur d’inflammation présents dans les fèces. De cette façon, l’expérimentateur peut estimer la douleur. Au cours de procédures comportant des maladies inflammatoires l’état des souris sera monitoré chaque jour visuellement et tous les 2 jours par une pesée, un contrôle de l’aspect général et l’inspection des selles. Lors de procédures comportant des maladies inflammatoires, l'utilisation de gel hydrique ou/et une réhydratation sous-cutanée sera pratiquée en cas de besoin. Si la perte de poids excède 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou qu’une présence de sang dans les selles est observée, l’expérience sera interrompue et les souris présentant un ou plusieurs de ces symptômes seront mises à mort. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée.

Choix des espèces

Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. De plus, les traitements antibiotiques ont déjà été validés dans cette espèce. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences sur le système immunitaire et le microbiote intestinal, bien connus dans cette espèce. Les souris que nous utiliserons seront des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), des souris adultes (8-15 semaines) et des souris âgées (plus de 6 mois). Ce projet étudie l'influence du microbiote au début de la vie sur les résultats de l’inflammation de différents organes à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 15 semaines et à un âge avancé.

Un bout de queue coupé à cinq ou six jours pour lire leur génotype, puis un gavage quotidien pendant un mois, douze heures en cage métabolique, deux anesthésies gazeuses pour poser et retirer un capteur de fluorescence sur le dos, 1 400 souris atteintes de polykystose rénale enchaînent ces étapes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que le gavage peut irriter la gorge et provoquer des fausses routes, et que l'anesthésie peut entraîner une détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire. Si le saignement de la queue dure plus d'une heure, la souris est tuée. Toutes le sont à la fin, y compris celles qui n'ont pas le génotype recherché, tuées sans qu'on leur prélève quoi que ce soit.

Objectifs

L'impact de l'insuffisance rénale chronique en Santé Publique est majeur puisque cette maladie touche des millions d'individus dans le monde. Malgré les efforts de recherche considérables, il existe toujours très peu d'options thérapeutiques. Nous nous intéressons dans ce projet à une insuffisance rénale particulière d’origine génétique : la polykystose rénale humaine. Cette maladie génétique correspond à dix pour cent des patients en insuffisance terminale en France. Il n'existe pas jusqu'à présent de traitement préventif ou curatif efficace en dehors d’un médicament dont l'efficacité est limitée et la tolérance, médiocre. Ce projet vise à étudier l’effet bénéfique potentiel dublocage de deux gènes impliqués dans le développement de cette maladie. Nous allons tester l'efficacité de deux nouvelles molécules sur le développement de cette maladie en les testant sur une lignée de souris qui développent spontanément la maladie kystique rénale.

Bénéfices attendus

Les traitements proposés aujourd'hui pour la prise en charge de la maladie rénale kystique ne sont pas efficaces et ne parviennet pas à freiner l'évolution de la maladie. Les stratégies thérapeutiques envisagées dans ce projet permettront de tester si nos deux inhibiteurs sont de bonnes options thérapeutiques pour la prise en charge de la maladie, en combiné ou séparément. Ces traitements pourraient avoir un impact de manière plus générale sur l'insuffisance rénale chronique et aboutir à un essai clinique chez l'homme.

Procédures

1) Dans le cadre du génotypage de ces animaux, les souris seront soumises au prélèvement d'une petite partie distale de la queue. Ce prélèvement ne dure que quelques secondes sur des souris vigiles. (2) Une partie des animaux recevront un traitement ou un placebo par administration orale quotidienne pendant un mois. Cette étape est très rapide, environ dix secondes par animal et elle est effectuée sur animal vigile. (3) Les animaux seront placés pendant douze heures dans une cage métabolique pour le recueil urinaire, elles seront hydratées et nourries normalement dans une pièce dédiée de l’animalerie sous la surveillance du personnel. (4) Les souris seront soumises à la mesure de leur fonction rénale par une nouvelle technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure ne sera effectuée qu’une fois en fin de protocole. Pendant la mesure non invasive de la fonction rénale, les animaux sont placés dans des cages individuelles pour ne pas risquer d’abimer le matériel de mesure. Les animaux retournent dans leurs cages initiales deux heures après. (5) En fin de protocole, le sang est prélevé sous anesthésie et analgésie (trente secondes environ), sur un plateau thermostaté ; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés pour ces procédures sont des souris mutées. L’accumulation de kystes entraîne le développement d’une insuffisance rénale à 6 mois. Cependant, les animaux seront utilisés à partir de 4 ou 8 semaines. Les protocoles durant 4 semaines, les souris n'auront pas encore développé ce phénotype dommageable survenant après 6 mois. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible ainsi qu'une éventuelle infection au niveau du site de prélèvement. Toutes manipulations quotidiennes de l'animal peuvent induire un stress chez ce dernier, mais en particulier le recueil d’urine en cage métabolique et le gavage. Le gavage oral peut être source d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris, de même qu'il peut occasionner des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes. La douleur liée à l'administration de traceur pendant la mesure de la fonction rénale sera de courte durée. Ces administrations peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. Les complications liées à l'anesthésie au moment de la mesure transcutanée de la fonction rénale et le prélèvement de sang : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt pour le projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire sans réalisation de prélèvement. Les animaux disposant du génotype d’intérêt seront euthanasiés sous anesthésie générale et analgésie par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements nécessaires postmortem pour les analyses.

Remplacement

Nos travaux préliminaires sur lignées cellulaires prouvent un rôle fonctionnel des deux gènes étudiés dans ce projet au cours du développement de la maladie, pré-requis indispensable à un test thérapeutique in vivo. En raison de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pouranalyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet thérapeutique des deux inhibiteurs est l'amélioration de la fonction rénale, qui est mesurée soit par dosage de la concentration plasmatique de créatinine ou d'urée ou l'évaluation du débit de filtration glomérulaire, par mesure transcutanée.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 1400 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En cas de saignemment lors de la biopsie un point de compréssion sera effectué sur le bout de la queue .Si le saignement persiste au delà d'une heure (problème de coagulation) l'animal sera euthanasié .Le rejet de la mère sera vérifié en regardant le lendemain s' il y a bien une poche de lait visible sur le nouveau né et éventuellement une adoption sera sera envisagée si possibilité . En dehors d'une courte période en cage individuel limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée hebdomadaire pendant tous les différents protocoles (et tous les deux jours pendant les périodes de gavage). Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, la prostration, l'hérissement du pelage. Il existe aussi un risque de saignement causé par les injections avant la mesure de la fonction rénale. Il peut survenir aussi des complications liées à l'anesthésie gazeuse (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique)

Choix des espèces

Le modèle de souris génétiquement modifié utilisé dans ce projet est un modèle reconnu dans la littérature comme modèle pertinent de la maladie kystique rénale chez l’homme. C'est donc le meilleur modèle pour une expérimentation à visée mécanistique et thérapeutique. Les animaux (mâles et femelles) seront utilisés entre 1 et 6 mois. Ils ne seront pas gardés au-delà du stade terminal de la maladie (6 mois). Les interventions thérapeutiques seront effectuées dans un groupe précoce de souris âgées d'1mois (Groupe préventif) et un sous-groupe plus tardif de souris âgées de 2 mois considéré comme âge adulte (Groupe curatif) : elles visent à diminuer la gravité de la maladie et à améliorer la survie des animaux. Le stade de 2 mois est choisi car les souris présentent déjà des kystes rénaux à cet âge. L'identification génétique est réalisée très précocement (5-6 jours) pour limiter la douleur.

Gavées à deux et trois jours de vie, amputées d'un fragment de queue entre le cinquième et le onzième jour, puis soumises adultes à une injection et à six prélèvements sanguins, 1 968 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 240 d'entre elles et modéré pour 1 728. Toutes sont tuées à la fin pour analyse. Le porteur précise que seule l'injection sous-cutanée se fait sous anesthésie, les autres gestes étant pratiqués sur animal vigile parce qu'ils sont courts et maîtrisés par l'opérateur. Il justifie l'effectif par la seule affirmation d'avoir retenu le minimum permettant des résultats statistiquement significatifs, sans donner ni calcul ni taille de groupe.

Objectifs

La production d’anticorps protège contre des pathogènes mais provoque aussi l’autoimmunité, comme la maladie de Sjögren ou l’arthrite rhumatoïde. La production d’anticorps implique un type de cellule particulier, appelé cellules dendritique folliculaire, qui se retrouve dans les ganglions lymphatiques et la rate. L’origine de ces cellules et leur mécanisme de différenciation ne sont pas bien connus, ce qui empêche la découverte de nouveaux médicaments contre ces maladies autoimmunes. Ce projet vise à mieux comprendre l’origine de cette cellule et à étudier l’implication d’un récepteur, qui pourrait alors être ciblé par de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur le développement du système immunitaire et la réponse immune. Etant donné que la protéine étudiée est actuellement ciblée en thérapie contre la sclérose en plaque, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité.

Procédures

Des souris nouveau-nés sont soumises à un gavage à jour 2 et à jour 3 (durée < 1 min). Les juvéniles (entre jour 5 et jour 11 après naissance) sont soumis à une biopsie de queue pour déterminer une mutation génétique (durée < 1 min). Les souris adultes sont soumises à une injection (durée < 1 min) et à 6 prélèvements de sang (durée du prélèvement < 2 min). L’injection par voie sous-cutanée s’effectue sur animal anesthésié. Les autres interventions se feront sur animal vigile car il s'agit de gestes courtes et qui sont parfaitement maitrisés par l'opérateur.

Impact sur les animaux

Le gavage, l’injection des produits et le prélèvement sanguin peuvent être source de stress et de l’anxiété pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation peut conduire à une inflammation au site d’injection.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Les point limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour connaitre l’origine des cellules dendritiques folliculaires et tester la fonction d’un récepteur dans leur formation. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des organes lymphoïdes, les ganglions et la rate, où se trouvent ces cellules. Chez la souris, les structures des ganglions et de la rate sont bien connues et en plus sont identiques à l’homme. De plus, la souris étant bien étudiée du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux qui reposent sur des modifications génétiques. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement le du système immunitaire impliquant la formation des cellules folliculaires dendritiques.

Une césarienne de quarante-cinq à soixante minutes est pratiquée sur des femelles à 12,5 jours de gestation pour électroporer un gène dans le cerveau de leurs embryons. 2 547 souris vont être utilisées, 2 196 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 351 un niveau modéré. Le porteur indique que les femelles opérées peuvent ressentir une douleur modérée limitant leur mobilité pendant sept à dix jours, et que les souris porteuses de deux copies de la mutation étudiée meurent une dizaine de jours après la naissance. Tous les animaux électroporés sont tués pour analyse de leurs tissus, les femelles césarisées le sont au moment où l'on récupère leurs embryons ou leurs souriceaux, et seuls les mâles reproducteurs peuvent servir à d'autres accouplements.

Objectifs

Le Syndrome d’Atrophie Optique de Bosch-Boonstra-Schaaf (BBSOAS) est une maladie génétique qui affecte le développement du cerveau. Elle est causée par des mutations au niveau d’un gène particulier, qui est essentiel pour la formation et l'organisation des cellules du cerveau. Nous utilisons des souris génétiquement modifiées, qui vont porter des mutations retrouvées chez les patients, pour étudier cette maladie. Nos recherches montrent que certaines mutations provoquent une réduction de la taille d'une partie du cerveau appelée septum qui joue un rôle important dans la motivation, la mémoire ou encore l’apprentissage. En parallèle, les cellules immunitaires du cerveau, appelées microglie, ne semblent pas se déplacer correctement. La microglie est cruciale pour le développement normal du cerveau, aidant à la croissance des cellules nerveuses et à la formation de leurs connexions. Très tôt au cours du développement embryonnaire, des cellules précurseurs se déplacent et se développent pour former le septum. Au même moment, la microglie est recrutée dans le cerveau. Nous pensons que les cellules précurseurs, qui donnent naissance aux cellules du septum, jouent aussi un rôle dans le recrutement précoce de la microglie. Dans notre projet, nous utilisons une technique appelée électroporation in utero, qui permet d’introduire des gènes dans les cellules d’un embryon. Nous ciblerons les cellules précurseurs que nous pourrons suivre grâce à un marqueur fluorescent. Cela nous permettra d'étudier leur développement et de tester des molécules qui pourraient corriger les défauts observés chez les souris atteintes de BBSOAS. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie et d'identifier des cibles potentielles pour des traitements futurs.

Bénéfices attendus

L'étude de modèle de souris mimant le BBSOAS a révélé des anomalies dans le cerveau, comme une réduction de la taille d'une partie appelée septum et un problème de recrutement des cellules immunitaires du cerveau. Ces différences dépendent des mutations portées et nous permettent de mieux comprendre leur implication dans le développement du cerveau. À moyen terme, en reliant les symptômes des patients atteints de BBSOAS à la mutation qu’ils portent, nous pourrons améliorer le diagnostic précoce et les soins, ce qui améliorera la qualité de vie des patients. À long terme, nous espérons identifier des cibles pour des traitements qui pourraient contrer les effets négatifs de ces mutations sur le développement du système nerveux.

Procédures

La césarienne est effectuée sur des femelle à 12.5 jours de gestation. Elle dure entre 45 et 60 minutes en fonction du nombre d'embryons portés à électroporer. Le poinçonnage au niveau des oreilles pour identification et génotypage des animaux servant aux accouplements se fera en une seule fois sur animal vigile sous contention et durera moins de 30 secondes par animal. La chirurgie terminale sera réalisée sur animaux ayant reçu une dose léthale d'anesthésique en une seule injection. Cette injection se fera sur animal vigile sous contention et durera moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes ayant subi une cesarienne pour l’électroporation de leurs embryons pourront présenter une douleur ou une gêne de niveau modéré au niveau de l’incision pouvant réduire leur mobilité. Cette gêne est temporaire et devrait disparaitre après cicatrisation, entre 7 à 10 jours. Les souris porteuses d’une seule copie de nos mutations ne présentent aucun phénotype dommageable. Les souris porteuses de deux copies mutées meurent environ 10 jours après la naissance. Les mutations étudiées n’induisent donc pas effets indésirables avant la naissance, les embryons étant de taille comparable aux sauvages. Pour cette procédure nous prélèverons systématiquement avant la naissance les portées pouvant comporter des embryons présentant deux copies mutées évitant ainsi l’apparition de tout problème de santé sur nos souris. Chaque souris arrivant à terme ne sera porteuse que d’une seule mutation.

Devenir

L’ensemble des animaux électroporés sera mis à mort pour récupération et analyse des tissus post mortem. Les femelles gestantes ayant subi une césarienne ne pourront être réutilisées dans aucune autre procédure et seront donc mises à mort systématiquement au moment de la récupération de leurs embryons ou au moment de la mise à mort de leurs souriceaux. Les males ayant servi pour les accouplements pourront servir à d'autres accouplements.

Remplacement

Nous utilisons des cultures cellulaires in vitro, notamment des organoides de tissus cérébraux afin de remplacer autant que possible les expériences sur animaux vivants. Cependant, étudier le développement du système nerveux requiert un système biologique dynamique intégré tel qu’un organisme vivant. En effet, la microglie ne se forme pas dans le cerveau : elle tire son origine d’une structure extra-embryonnaire et colonise le cerveau en développement grâce au développement parallèle du système sanguin et à la vascularisation. Ainsi des facteurs spatiaux et temporels sont indispensables au bon développement du cerveau et impossibles à recréer à l’identique in vitro. C’est pourquoi le recours à un modèle animal reste indispensable pour comprendre les mécanismes qui mènent aux symptômes variés et complexes observés chez les patients.

Réduction

Nous avons estimé avec un outil statistique prédictif le nombre de souris nécessaire par groupe (9 souris) pour obtenir des résultats avec une puissance statistique suffisante (>80%) en se basant sur les analyses de nos précédents résultats. En considérant une perte potentielle de 10% d'animaux, incompressible et classique dans le cadre d'une chirurgie, 10 échantillons de chaque mutation étudiée seront analysés pour chaque lot expérimental. Pour obtenir cette taille d'effectif de 10 échantillons, il nous faudra 4 portées pour chaque stade de développement étudié. Les échantillons seront analysés au fil de l'eau et si le bon effectif d’embryons/souriceaux est obtenu avant d’atteindre le nombre de portées prévues, nous ne génèrerons pas de portée supplémentaire. Enfin, nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés que nous analyserons en parallèle.

Raffinement

Les conditions de réalisation de la chirurgie ont été optimisées afin de réduire au maximum la souffrance des animaux ; tapis chauffant avec sonde rectale pour maintien précis de la température, application d’anesthésique local, cage de réveil chauffée, traitements antalgiques et antiinflammatoire (pendant et après la chirurgie). Chaque femelle gestante ayant subi une césarienne sera suivie avec une évaluation de leur état réalisée selon une grille de score qui prévoit des critères d’arrêt précoce et des points limites adaptés. Pour la collecte d’animaux après la naissance, nous prévoyons d'utiliser des stratégies de croisement nous assurant de ne générer aucun animal porteur de deux copies de nos mutations. Chaque souris ne sera porteuse que d'un seul type de mutation. Les animaux électroporés seront tous génotypés post mortem.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de sa grande similarité génétique avec l'homme. De plus, le développement d’un embryon de souris est très similaire à celui d’un embryon humain et les mécanismes neurodeveloppementaux que nous souhaitons étudier sont les mêmes. Enfin, il existe déjà des lignées de souris transgéniques portant des mutations retrouvées chez les patients BBSOAS que nous possédons déjà au laboratoire et qui sont d’excellents modèles validés de cette maladie génétique. Pour cela, nous électroporerons les précurseurs neuronaux à 12,5 jours de gestation embryonnaire qui est un stade précoce où ces cellules précurseurs vont commencer à se différencier et à migrer pour aller former le futur septum. Le pic de recrutement des cellules immunitaires commence au même moment. Pour laisser le temps aux cellules électroporées de migrer et au gène électroporé de s’exprimer, nous analyserons les cerveaux embryonnaires 2, 4 ou 6 jours post électroporation ainsi qu'après la naissance.

Des femelles gestantes reçoivent par gavage, quatre à cinq jours de suite, des molécules toxiques pour les canaux biliaires, et leurs petits sont injectés 48 puis 72 heures après la naissance. 452 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 292 un niveau modéré. Les nouveau-nés sont tués à quatorze jours, âge auquel ceux qui développent la maladie présentent une jaunisse et un retard de croissance, tandis que la mort embryonnaire et le saignement vaginal figurent parmi les effets attendus chez les mères. Le bénéfice annoncé tient en deux phrases, autour de la mise au point de nouveaux modèles toxicologiques de la malformation des voies biliaires.

Objectifs

l’objectif de ce projet est la création de nouveaux modèles environnementaux de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire en utilisant des molécules potentiellement toxiques pour les canaux bilaires. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra le développement de nouveaux modèles toxicologiques de la malformation des voies biliaires chez la souris. Ils permettront d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes de la maladie.

Procédures

Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. Gavages répétés (4-5 jours) de toxines chez la femelle gestante et le mâle adulte pendant quelques secondes. Injections répétées de toxines aux nouveaux nés 48h et 72h après la naissance pendant quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les composés pharmacologiques peuvent être toxiques pour les animaux et entrainer une mort embryonnaire prématuré : risque de saignement vaginal et perte de poids pour la femelle gestante. Lors des procédures le gavage est un mode d’administration entrainant une douleur modérée et passagère. l’injection entraine une douleur légère et passagère sur un nouveau-né. Dans le cas où les animaux développent la maladie les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés).

Devenir

Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 14 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer ces animaux bien que nous utilisions des modèles de cultures cellulaires issus de foie de patients. Les modèles cellulaire ne permettent pas de modéliser la fibrose et l’inflammation et ils ne permettent pas d’évaluer l’impact des composés pharmacologiques sur le développement et la maturation des canaux biliaires lors de l’embryogénèse.

Réduction

Dans un souci de réduction des animaux nous utiliserons les deux sexes car nos études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. Nous analyserons de multiples paramètres (moléculaires et histologiques) pour chaque souris. Afin de vérifier que nos résultats sont statistiquements significatifs nous utiliserons des tests adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Afin de limiter le stress des animaux seul l’expérimentateur du projet sera amené à manipuler les animaux durant les périodes de gestation et croissance des nouveaux nés. Les manipulations seront effectuées le plus rapidement et calmement possible. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une lampe chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. L’injection et le gavage ne nécessite pas d’anesthésiants ou d’analgésiques néanmoins des sondes et des aiguilles adaptées à la taille de l’animal seront utilisées. Pendant toutes nos procédures des points limites spécifiques et adaptés ont été établis. Notamment l’expérimentateur fait un suivi du poids des souris deux fois par semaine pendant la grossesse et un suivi journalier pour les nouveaux nés. Une perte de poids rapide (femelles et nouveaux nés) ou saignement vaginal (femelles gestantes), si prolongées, conduiront à une mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le choix de la souris est lié à la similarité du métabolisme et du développement du foie entre l'humain et la souris. En particulier, le développement des canaux biliaire est similaire entre les deux espèces. Par ailleurs, nous disposons également de nombreux outils spécifiques pour la souris. Les femelles enceintes seront gavés avec les différents composés pharmacologiques à différents âges de la gestation : 10 et 12 jours de gestation (développement du foie et formation de la vésicule biliaire et du canal biliaire extrahapétique) ainsi que 14 et 16 jours de gestation (maturation du canal biliaire extrahépatique et formations des canaux intrahépatiques). Les nouveaux nés développent les symptômes visibles de la maladie à la naissance comme chez l’Homme. Nous utiliserons donc les animaux entre 1 et 14 jours après la naissance pour évaluer le développement de la maladie.