Biologie du développement
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Etude de l’effet de gènes spécifiquement humains sur le développement des neurones et circuits neuronaux du cervelet aux échelles moléculaires et cellulaires
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Le ventre de souris gestantes est ouvert sous anesthésie pour injecter un gène humain dans le cerveau de leurs fœtus, suivi d'une électroporation de moins de quinze minutes. 910 souris vont être utilisées, mères, fœtus et nouveau-nés confondus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par une chirurgie terminale destinée à prélever le cerveau. L'objet est de savoir si treize gènes propres à l'espèce humaine modifient la forme et les connexions des neurones du cervelet, un protocole d'organoïdes cérébelleux humains existant depuis cette année mais restant, selon le porteur, à optimiser. Chez les mères, il décrit des douleurs après l'opération, une infection possible de la plaie et une rupture des points de suture qui constituerait un point limite, chez les fœtus une rare interruption de gestation, et chez les souriceaux une simple "gêne légère et momentanée".
Objectifs
L’espèce humaine présente des caractéristiques cognitives supérieures qui ont été en partie liées à l’évolution du cortex cérébral. Mais l’implication des autres régions du cerveau, comme le cervelet, reste largement inexplorée malgré son association avec les fonctions cognitives supérieures (comme le langage) et les troubles cognitifs (comme l’autisme et la dyslexie). De plus, le cervelet humain présente des caractéristiques divergentes par rapport à d’autres espèces, aux niveaux anatomique, fonctionnel et comportemental, dont les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents sont inconnus. Les mécanismes moléculaires qui participent à l’évolution des neurones et circuits neuronaux reposent en partie sur des gènes dupliqués spécifiquement humains (absents des génomes d’autres espèces) ou des gènes spécifiquement exprimés chez l’humain (expression absente chez les autres espèces). Le rôle de cette étude est d’étudier l’effet de ces innovations moléculaires sur le développement des neurones et circuits du cervelet. Nous avons une liste de 13 gènes candidats basés sur des données publiques d'expression de gènes au cours du développement dans le cervelet humain et non chez la souris et l’opossum. Pour étudier un effet fonctionnel de ces gènes, nous devons faire des expériences de gain-de-fonction dans un cervelet de Mammifère, c'est-à-dire exprimer artificiellement un gène humain pour mimer son action . Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement (=dans l'arbre des espèces animales). De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les objectifs de cette études sont : 1) d’étudier, parmi les gènes d’intérêts, lesquels sont suffisants chez la souris pour altérer la morphologie des neurones du cervelet, leur connectivité neuronale ainsi que sur la vitesse de maturation des neurones, 2) d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents pour les 3 gènes candidats dont l’effet sera le plus flagrant.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les effets de gènes spécifiquement humains dans le développement du cervelet de Mammifère. Cela permettra d’ouvrir un nouveau champ de l’évolution du système nerveux humain, en dehors du cortex cérébral. A plus long terme, les résultats pourraient mettre en évidence une sensibilité propre à notre espèce à certains troubles cognitifs (spectre autistique), moteurs (ataxie cérébelleuse) ou encore la dyslexie. Ils pourraient aussi ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces troubles.
Procédures
Procédure 1: laparotomie sous anesthésie générale de la mère suivie d'injection ventriculaire cérébrale sur foetus suivie d'une électroporation (
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux sont : - chez la mère : de rares problèmes post-opératoires comme des douleurs (associées à une perte de poids ou un état de prostration), l’infection de la plaie, ou une rupture des points de suture, qui constituraient un point limite. - chez le fœtus : une rare interruption de la gestation. - chez le souriceau : une gène légère et momentanée au point d'injection.
Devenir
Tous les animaux seront utilisés pour les procédures décrites.
Remplacement
Une première alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait l’utilisation d’une autre espèce de Vertébré tel que le poisson zèbre, qui possède également un cervelet. Cependant l’organisation et le développement du cervelet chez les Vertébrés non-Mammifères sont trop divergentes comparé aux Mammifères pour pouvoir interpréter nos expériences de gain de fonction. Une autre option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait la culture in vitro de cellules souches de souris ou humaines, suivie d’une différentiation en organoïde cérébelleux. C’est une approche qui va être établie en parallèle dans notre laboratoire, pour laquelle un protocole existe depuis cette année pour les cellules humaines mais qui reste à être optimisé. En effet, ce type de culture ne permet pas à ce jour de récapituler l’ensemble des aspects anatomiques observés dans un cervelet in vivo (connectivité neuronale). De plus, ces approches ne permettent pas d’étudier des réseaux neuronaux dans un cervelet qui est intégré à un organisme in vivo, avec des stimulations sensorielles et un contrôle moteur, qui sont clefs dans la maturation neuronale cérébelleuse. De plus, ces approches in vitro manquent d'une composante critique que sont les fibres grimpantes qui proviennent d’une autre région du tronc cérébral, l’olive inférieure.
Réduction
Ce projet nécessitera au maximum 910 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Dans nos différentes approches, nous voulons connaître l'effets de gènes humains sur le développement des neurones. Nous commencerons pour chaque gène candidat par 2 portées. Pour les gènes montrant des résultats flagrant, nous reproduirons nos résultats pour les confirmer et les consolider statistiquement. Cette approche permet de ne pas utiliser le nombre maximal de portées pour les gènes sans effet sur le développement neuronal (résultat négatif). Pour diminuer le nombre d'animaux, nous epxrimerons à chaque fois le gène di'intérêt dans la moitié des animaux de la portée, et une condition contrôle dans l'autre moitié. Ainsi, le nombre d’animaux a été estimé au plus juste de façon à répondre aux exigences pratiques et statistiques. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, avec un nombre maximal de 5 individus par cage, dans un environnement enrichi. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages quotidien. Soins spécifiques apportés à la mère gestante pendant la chirurgie : stéréllisation du champ opératoire, analgésie sous-cutanée et anesthésie locale avant l’opération suivies par une anesthésie par inhalation. Des analgésiques sont administrés en sous-cutané les jours qui suivent l'opération et la mère gestante est hébergée seule dans une cage enrichie jusqu'à la mise bas. La température des animaux est gardée constante grâce à un tapis chauffant jusqu’au réveil. La mère gestante ne retourne sur son portoir qu’une fois réveillé. Un suivi post-opératoire rapproché est effectué pendant les premières heures suivant l'opération puis le lendemain. Soins spécifiques apportés aux souriceaux pendant leur injection : le souriceau est anesthésié. puis est réchauffé avant de retrouver sa mère. Précautions pour l'injection intraventriculaire du foetus ou souriceau : une micropipette ultra mince est utilisée pour l’injection. Chaque procédure se termine par une chirurgie terminale sous anesthésie en vue du prélèvement du cerveau.
Choix des espèces
Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les animaux seront utilisés au stade embryonnaire et aux stades postnatals, aux étapes critiques du développement des neurones et des circuits.
Administration d’un agoniste de l’hormone de libération de l’hormone lutéinisante (LHRHa) pour la synchronisation de l’oestrus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Toute femelle dont l'inconfort ne pourra pas être soulagé rapidement sera mise à mort, le point limite est posé d'emblée. 40 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour la moitié et modéré pour l'autre, 20 tuées à l'issue et 20 réutilisées après quinze jours de repos. Elles reçoivent deux injections hormonales à 24 heures d'intervalle pour synchroniser leur cycle, et 20 d'entre elles subissent une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes sous anesthésie. Les souriceaux qui naîtront de ces transferts seront tués à dix jours, le porteur indiquant ne pas pouvoir s'en servir. La finalité est logistique : valider une méthode qui diviserait par sept ou huit le nombre de femelles gardées en stock pour les activités de service de l'animalerie.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de tester une nouvelle méthode, appelée synchronisation, afin de générer des femelles souris en pseudogestation. Nous avons besoin de femelles en pseudogestation pour effectuer des transferts d'embryons. Cette technologie de reproduction est essentielle pour la production de nouvelles souches animales et le maintien des ressources génétiques. Le transfert d'embryons est couramment utilisé dans nos laboratoires et animaleries dans diverses applications : redérivation de souches de souris, revitalisation d'embryons congelés et de spermatozoïdes congelés par fécondation in vitro (FIV). Pour générer ces futures mères-porteuses, l'accouplement des femelles est possible uniquement dans la phase d'acceptation du mâle, une phase bien précise du cycle de reproduction de la souris. Il faut donc pouvoir identifier cette période. Actuellement, la technique utilisée pour générer de futures mères-porteuses c'est le tri visuel. Elle est très connue, mais chronophage et nécessite l'utilisation de nombreux animaux. On regarde chaque souris individuellement pour déterminer la période de son cycle et ainsi déterminer les femelles prêtes à s'accoupler. Tous les centres de recherche utilisent cette technique pour obtenir des mères-porteuses. La nouvelle technique que nous souhaitons tester consiste à injecter aux souris femelles une hormone pour synchroniser leur cycle. Ainsi, quatre jours après l'injection, toutes les femelles seront en phase d'acceptation du mâle, propice à l'accouplement. Ces femelles seront accouplées avec des mâles vasectomisés pour générer des femelles en pseudogestation. On souhaite valider cette technique afin de la mettre en application en routine dans notre laboratoire, ce qui nous permettrait sans altérer la qualité de nos prestations de réduire drastiquement le nombre d'animaux en stock.
Bénéfices attendus
Nos objectifs sont d'évaluer la technique de synchronisation dans un lot de souris femelles, en déterminant l'efficacité de celle-ci dans nos procédures de routine par rapport au tri manuel et visuel des femelles dans un grand groupe de femelles. On cherche à valider cette technique dans notre laboratoire pour considérablement réduire le nombre de femelles nécessaires en stock (de l'ordre de 7-8 fois moins). De plus, le nombre de mâles vasectomisés nécessaire sera aussi,considérablement réduit car les rendements attendus seront meilleurs. La technique contribue donc aux 3R en réduisant le nombre d'animaux et en affinant la technique d'obtention de pseudo-gestantes.
Procédures
Les souris recevront 2 injections sous contention rapides de 5 secondes, à 24h d'intervalle, visant la synchronisation. Puis certaines, (maximum 20) auront une chirurgie de transfert d'embryons (5 minutes) sous anesthésie et analgésie. Ces dernières recevront 3 injections pour induire l'anesthésie/analgésie, dont 2 sous contention rapide de 5 secondes et une lorsqu'elle dormiront encore afin de limiter le stress de l'animal.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter un léger stress de courte durée lors de la contention pour pratiquer les injections. Une petite douleur peut être ressentie par l'animal lors des injections (hormone de synchronisation, antalgique et anesthésique). Les points de surveillance pour les injections sont les suivants (cas très rares) : rougeur, gonflement, traces de griffures si l’animal se gratte au site d'injection. Les animaux opérés pour le transfert d'embryons (acte chirurgical), sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique efficace pour limiter au maximum les nuisances. Les points de surveillance pour ce type de chirurgie sont l'apparence de l'animal (état du poil, mimiques faciales...), son comportement (mobilité, éveil...), l'aspect du site de chirurgie (rougeur, gonflement, écoulement, automutilation...). Ce sont, là encore, des cas très rares, car nous avons une grande expérience de ce type de procédures.
Devenir
Les femelles pseudogestantes sur lesquelles sera pratiqué un transfert d'embryons par chirurgie seront mises à mort à l'issu des tests afin d'enregister les données nécessaires à l'analyse de cette étude. Les animaux nés issus des transferts d'embryons, seront mis à mort à 10 jours puisque nous ne pouvons pas nous en servir pour nos diverses activités de service. Les femelles pseudogestantes qui ne présentent pas de bouchon vaginal ou non utilisées en transfert d'embryons seront remises en stock afin de les utiliser pour d'autres activités de service après une période de repos de 15 jours.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour l'analyse de la synchronisation du cycle oestral sur le bon déroulement de la production de la pseudogestation, puis sur la chirurgie de transfert d'embryons, de la gestation et des naissnces de nouveaux-nés.
Réduction
La production de souris femelles pseudogestantes avec le tri manuel des femelles en proestrus et les transfert d'embryons sont des techniques bien connues. Il existe bon nombre de données témoins. Ainsi, nous avons uniquement besoin de faire des groupes expérimentaux pour la production de femelles pseudogestantes avec la synchonisation. Nous avons choisi un effectif de 40 femelles réparties en 4 lot de 10 femelles pour chaque expérience de synchronisation. Parmi ces 40 femelles, seulement 5 maximum par lot, soit 20 femelles au total seront anesthésiées et subiront un transfert d’embryons par chirurgie. Ces effectifs ont été calculés afin d'obtenir des résultats suffisamment robustes pour l'analyse de l'effet de la synchronisation.
Raffinement
Le personnel en charge de cette étude est habitué à ces gestes techniques car ils sont pratiqués en routine depuis des années dans notre laboratoire. Les femelles restent sous surveillance après leurs injections afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Lors de la chirurgie de transfert d'embryons, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à ce type de procédure. Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour pallier toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Une injection conjointe de sérum physiologique tiédi sera réalisée pour compenser les éventuelles pertes hydriques liées à la chirurgie et limiter la déperdition de chaleur. Cette compensation a pour objectif de permettre aux animaux une récupération idéale post chirurgie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme. Des enrichissements sont mis à disposition dans la cage des futures mères lors de leur convalescence et gestation (nids et croquettes). Les femelles en stock seront hébergées en groupe pour leur permettre de garder un lien social. Comme il s'agit ici d'un test de validation d'une technique, si une douleur ou un inconfort est détecté sans pouvoir la soulager rapidement et efficacement, la femelle sera mise à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Nous voulons générer des souris pseudo-gestantes pour être mères-porteuses. Il faut donc des femelles et qu'elles soient en âge de procréer soit entre 9 semaines et 6 mois. Pour chaque lot, les femelles auront un âge variable, comme lors de nos activités de service, sans incidence sur les expériences.
Etude de l’expression d’un gène impliqué dans la régulation de l’autophagie après induction d’une inflammation
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection unique de composé pro-inflammatoire, dès le huitième jour de vie pour une partie d'entre elles, ce qui suppose de les séparer de leur mère, et certaines subissent une chirurgie sous anesthésie sans jamais se réveiller. État fébrile passager, hypothermie légère et baisse de mobilité sont attendus. Le lien annoncé avec les troubles du spectre autistique reste lointain, le porteur renvoyant à de futurs tests précliniques l'évaluation de molécules modulant l'autophagie, et il affirme sur le remplacement que l'étude du comportement "ne peut se faire autrement" qu'in vivo.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions les conséquences d’une stimulation inflammatoire auquel l’individu serait exposé dans les premières semaines de vie, par la mise en place d’un protocole pro-inflammatoire classiquement décrit dans la littérature. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres l’expression d’un gène impliqué dans la régulation de l’autophagie et de l’inflammation. Notre projet est complémentaire du travail en cours et permettra d’obtenir des données originales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale (les troubles du spectre autistique concernent 1 enfant sur 36 aux USA en 2020, 1/44 en 2018, 1/69 en 2012). A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Une injection unique de composé pro-inflammatoire (durée du geste d’environ 10 secondes). Une chirurgie sans réveil (sous anesthésie et analgésie) de moins de 5 minutes sera réalisée sur une partie des animaux du projet.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress et de légère hypothermie sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, la réalisation de contention, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. L’injection de l’agent inflammatoire est classiquement utilisée pour induire un état inflammatoire, au-delà de la légère douleur provoquée par l’aiguille. Elle est donc susceptible d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Une détresse respiratoire et une hypothermie sont possibles lors de l’anesthésie liée à la chirurgie sans réveil.
Devenir
L’ensemble des 864 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt pour traitement par biologie molécule ou histologie.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 864 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés plusieurs fois par semaine et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les paramètres environnementaux contrôlés comprennent une humidité de 50 plus ou moins 20 pour cent, une température constante (20-24 degrés celsius). L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification (Sizzle square et/ou coton) et d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant 12h, à l’aide d’une grille de suivi Si l’état général de l’animal atteint les points limites (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés immédiatement. Le stress induit par la séparation au moment de l’injection des animaux au 8ème ou 20ème jour de vie est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation avec la mère. Les données de la littérature indiquent que l’injection intrapéritonéale de molécules pro-inflammatoires n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les animaux seront particulièrement observés après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la réponse inflammatoire précoce sur l’expression du gène et sur d’autres marqueurs inflammatoires. Plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (injection à 8 jours de vie), jeune (injection à 20 jours de vie), adolescent (injection à 34 jours de vie) et adulte (injection à 89 jours de vie).
Etude de l’impact d’une exposition précoce et chronique à un agent anesthésique sur le développement du réseau vasculaire rétinien et cortical
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Des souriceaux âgés de 4 à 10 jours sont exposés de façon répétée à un anesthésique général, puis suivis jusqu'à l'âge adulte avec pose d'un cathéter intraveineux, IRM, échographie et incision de la peau du crâne pour glisser des électrodes sous-cutanées. 510 souris vont être utilisées, dont 210 anesthésiées puis tuées sans reprise de conscience, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour examiner la rétine et le tractus visuel. L'enjeu déclaré est de savoir si l'anesthésie générale pratiquée chez le jeune enfant laisse des traces durables sur le développement du système nerveux. Le porteur annonce quatre tests comportementaux de cinq minutes par animal sans préciser lesquels, et écrit ne pas pouvoir "souscrire au principe de remplacement".
Objectifs
L’incidence de l’anesthésie générale (AG) dans l’enfance est en constante augmentation. En effet, 1/7 enfant bénéficie avant l’âge de 3 ans d’une AG à des fins chirurgicales, diagnostiques ou pour l’administration de soins. S’il est désormais admis que l’AG pédiatrique est un acte sûr dont le risque de complications immédiates est faible, la communauté publique et scientifique s’intéresse depuis plusieurs années à ses effets indésirables neuro-développementaux. Au cours des 20 dernières années, il a été décrit que les principaux agents anesthésiques utilisés au bloc opératoire interféraient avec le développement du système nerveux central (SNC) qui débute in utero et se poursuit tout au long de la vie. Des études de haut niveau de preuve chez l’enfant indiquent que la mesure de l’intelligence générale n’est pas modifiée après une exposition courte et unique. Néanmoins, l’effet de cette exposition sur la structure cérébrale n’avait encore pas été étudié. De plus, il demeure impossible d’apporter une réponse univoque sur la question des effets indésirables neuro-développementaux à long terme. Au sein du SNC, la rétine, en miroir du cerveau, apparait comme particulièrement intéressante pour des études neuro-développementales. En effet, de multiples parallèles peuvent être réalisés entre la rétine et le cerveau : origine embryonnaire commune, établissement des réseaux neuronaux et vasculaires en parallèle et un statut immunitaire particulier notamment lié à l’existence de barrières physico-chimiques comme la barrière hémato-rétinienne au niveau de la rétine et la barrière hémato-encéphalique au niveau du cerveau. De plus, la rétinogenèse est régulée par de nombreux facteurs et présente des aspects communs à ceux retrouvés au cours du développement cérébral. Notre premier objectif sera donc de déterminer, suite à une AG précoce et répétée, la présence éventuelle d’atteintes développementales au niveau de la rétine, du tractus visuel et de la vision ; et de les caractériser. Notre second objectif sera de s’intéresser aux atteintes structurelles et fonctionnelles du tractus visuel ainsi qu’à leur potentiel caractère prédictif d’altérations cérébrales, responsables de troubles à long terme. Nous nous intéresserons en particulier à l’intégrité anatomo-fonctionnelle du compartiment vasculaire. L’ensemble de cette caractérisation n’est à ce jour pas encore décrite dans la littérature soulignant ainsi l’originalité et la nécessité d’un tel projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter des arguments supplémentaires dans le débat sur l’effet neuro-développemental de l’AG, en particulier à long terme. Nos travaux seront appelés à modifier les pratiques cliniques si nos hypothèses se vérifient. Par conséquent, ils inciteront les professionnels de santé à différer les AG pour chirurgies non urgentes, à utiliser de nouveaux médicaments d’anesthésie moins à risque de toxicité cérébrale, à surseoir le plus possible à l’AG quand cela est possible (e.g. anesthésie loco-régionale, hypnose, etc.) et à adapter la prise en charge et le suivi d’enfants ayant eu une AG. Notre projet aura un bénéfice en clinique mais également en préclinique en mettant l’accent sur un effet de l’AG sur le neuro-développement conduisant à adapter les protocoles expérimentaux associant des questions neuro-développementales et l’utilisation d’agents anesthésiques au cours des protocoles de recherche. De plus, cette étude permettra d’explorer de nouveaux outils diagnostics non-invasifs basés sur l’étude de la rétine et de la fonction visuelle en miroir du cerveau afin de mettre en évidence des atteintes du SNC.
Procédures
1. Tests comportementaux (5 minutes par test, 4 tests seront réalisés pour chaque animal), 2. Pose d'un cathéter intraveineux pour injection de molécules fluorescentes ou traceurs (30 minutes, acte réalisé une seule fois sur l'animal), 3. Protocole d'imagerie par IRM (20 minutes à 1h30 selon les séquences, acquisitions réalisées une seule fois par animal), 4. Protocole d'imagerie par imagerie à ultrasons (45 min par animal, acquisition réalisée en une seule fois) 5.Incision de la peau du crâne et pose d’électrodes sous-cutanées pour prise de mesure de potentiels évoqués visuellement (5min/animal, acté réalisé une seule fois par animal)ou incision de la peau du crâne pourl'acquisition par imagerie à ultrasons (5min/animal, acté réalisé une seule fois par animal).
Impact sur les animaux
Selon la procédure, des nuisances ou effets indésirables sont à prévoir sur les animaux. Toutes les douleurs liées à des lésions de la peau des animaux (incision, perforation) seront empêchées par l’utilisation d'un anesthésique local avant le geste. Ces douleurs seront temporaires et se résorbent sous 48h. Pour les procédures pour lesquelles la douleur est plus importante, nous utiliserons des agents anesthésiants dont la nature et la posologie seront adaptées à la sévérité du geste sous forme d’une injection unique. Les procédures relatives aux évaluations comportementales ou d’imagerie sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, dû soit à un nouvel environnement soit à l’isolement social. Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet fera l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification de traceurs injectés afin d’évaluer l'intégrité anatomique et vasculaire de la rétine d'une part et du tractus visuel d'autre part.
Remplacement
Nous ne pouvons souscrire au principe de remplacement dans ce protocole. En effet, il est nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de notre protocole. De plus, ce projet fait suite à une première étude au sein du laboratoire au cours de laquelle un protocole d’exposition précoce et répété des souris à une AG a été mis en place. Ces premiers résultats ont permis une première caractérisation s’intéressant à l’impact structurel et fonctionnel, au niveau cérébral, d’une telle procédure. L’étude a été menée chez une cohorte d’enfants ayant eu une exposition précoce à l’AG au cours de leur développement. L’altération structurale décelée a été associée à une diminution de la régulation émotionnelle chez ces enfants. Ces résultats, plébiscités après leur publication par la communauté scientifique ainsi que par le grand public (articles de presses parus), incitent à poursuivre ce projet de recherche translationnelle afin d’apporter une réponse au débat controversé des conséquences à long terme d’une AG dans l’enfance. Les connaissances et acquis du laboratoire en complément de la littérature scientifique rendent la souris particulièrement intéressante pour l’étude de l’impact d’une exposition précoce et répétée à une AG. Les observations réalisées à partir de l’utilisation d’un modèle murin nous incitent à étoffer la description des effets indésirables neuro-développementaux de l’AG afin d’aiguiller sur une potentielle relation mécanistique entre les atteintes observées et le mode d’action des agents anesthésiques. Le but étant d’améliorer la prise en charge anesthésique des enfants afin de minimiser l’impact sur leur développement. La chronologie du développement de la rétine, du cerveau et de leurs réseaux vasculaires est bien connue chez la souris. Cela permet notamment d'avoir un a priori des mécanismes du développement rétinien ainsi que de certaines étapes du développement cérébral chez l’Homme, via la prise en compte des fenêtres de vulnérabilité intrinsèques à chacune des deux espèces et par projection des résultats murins existants.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Conformément à la règle des 3Rs, le nombre d'animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, selon nos précédents travaux publiés et la littérature. 510 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, comprenant la réalisation de tests comportementaux et d’outils d’imagerie non invasifs permettant d'évaluer l'intégrité anatomique et vasculaire in vivo du tractus visuel et du cerveau. Tous les animaux seront sujets à ces explorations complètes dans le but de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Cependant, il peut arriver d'avoir de la mortalité ou des exclusions d’animaux durant les étapes de la procédure (exposition à l’agent anesthésique, perte de poids, anesthésie au cours des examens d’imagerie...).
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment par l'hébergement avec leur mère jusqu’au sevrage puis en groupes sociaux de 5 ou 6 animaux après le sevrage, l'enrichissement de leur environnement (maison, paillettes coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié et cela pendant toute la durée du projet afin de veiller à leur bien-être et leur bon développement. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique adaptée au niveau de sévérité du geste, durant chaque procédure. Enfin, tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun trouble du comportement lié aux protocoles .
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les animaux utilisés pour la réalisation du protocole d’AG seront âgés de 4 à 10 jours post-nataux (P4 à P10). Les études de l’impact de cette AG précoce et répétée sur ces animaux sera ensuite étudiée à 15 jours post-nataux (P15) ainsi qu’à 6 semaines (adultes). En effet, les stades P4 à P10 ont été choisis à partir d’expériences déjà menées au laboratoire et publiées dans la littérature. Enfin, les stades P15 et adultes ont été choisis afin d’évaluer à court et long terme l’effet de l’AG.
Test de stratégies expérimentales permettant de prévenir les troubles moteurs et cognitifs dans un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Nées dans l'élevage de l'équipe, d'une lignée génétiquement modifiée porteuse d'une mutation responsable d'une paraplégie spastique héréditaire, et croisée toutes les dix générations avec des souris d'un élevage extérieur, 3 086 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après une coupe du bout de la queue pour le génotypage, elles reçoivent selon les groupes un médicament mêlé aux croquettes pendant sept mois, ou une dose unique par gavage de leur mère gestante. Une partie passe trois séries d'un test de mémoire et d'un test de coordination motrice, que le porteur ne nomme pas, chacune suivie d'une prise de sang sous anesthésie, et un groupe subit jusqu'à 14 prises de sang, une toutes les deux semaines. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus ou des embryons, comme les couples reproducteurs quand leur fécondité diminue. Le porteur juge "indispensable" le recours aux souris, tout en disant utiliser des méthodes in vitro "dès que possible".
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurodégénératives d’origine génétique caractérisées par une mort neuronale, mais aussi parfois des troubles de développement du cerveau. Ces maladies sont très hétérogènes et sont causées par des mutations dans environ 80 gènes différents. Elles touchent environ 3 personnes sur 100.000 en Europe, avec un début généralement à l’âge adulte mais qui peut apparaitre dans l’enfance. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la prise en charge de ces pathologies. Nous travaillons sur une des formes les plus fréquentes de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles de développement du système nerveux. Nous utiliserons un modèle animal (souris) pour cette forme de paraplégie spastique héréditaire. Nous avons déjà montré que ce modèle présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau et il récapitule les principaux signes observés chez les patients. L’objectif du projet est de mieux caractériser les différentes étapes d’évolution de la maladie, de son développement à la mort neuronale, et d’évaluer dans un modèle animal des stratégies thérapeutiques qui pourraient permettre de prévenir l’apparition des symptômes et la mort neuronale.
Bénéfices attendus
Nous travaillons sur une des formes les plus fréquente de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles du neurodéveloppement et actuellement aucun traitement ne peut être proposé aux patients. Un premier aspect du projet permettra de tester l’efficacité de deux médicaments sur la mort neuronale dans le modèle animal de la maladie. Si nous pouvons démontrer qu’au moins un de ces deux médicaments retarde la mort neuronale, notre projet pourrait permettre d’avancer vers une stratégie thérapeutique pour les patients atteints de cette paraplégie spastique héréditaire. Par ailleurs, nous savons que la maladie que nous étudions est associée à de légers défauts de développement du cerveau, mais nous ne savons pas si, et dans quelle mesure, ces défauts participent à l’apparition des symptômes de la maladie. Notre projet pourrait permettre de répondre à cette question. Comme le diagnostic des patients a généralement lieu à l’adolescence, après la phase de développement, la compréhension du rôle du développement permettra de mieux expliquer la maladie aux patients et d’améliorer leur prise en charge.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un petit prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué sur les jeunes animaux. Cet acte sera réalisé rapidement (moins d’une minute par animal) et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des traitements pour évaluer leur impact sur l’évolution de la maladie. Une approche sera un traitement chronique pendant 7 mois qui sera administré par incorporation dans les croquettes pour éviter des gestes invasifs. Une autre approche sera une administration unique par gavage de la mère gestante à un moment précis du développement embryonnaire (une fois, inférieur à une minute). Une partie des animaux sera soumise à trois séries de 2 tests comportementaux sur des animaux vigiles (à l’âge de 6 semaines, 4 mois et 8 mois). Le premier test est répété pendant 5 jours et vise à étudier les troubles de la mémoire (3minutes maximum par session, 2 fois 5 jours) ; le second test est répété pendant 3 jours et vise à tester la coordination motrice (5 minutes maximum par session, 5 fois 3 jours). A l’issue de chaque série de tests comportementaux, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement). Un groupe d’animaux sera soumis à des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie générale toutes les 2 semaines (14 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement) L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour le génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal et un risque rare de saignement. Pour l’étude de l’effet thérapeutique de médicaments, des effets secondaires (diarrhées, perte de poids) pourraient être associés au traitement. Pour l’étude sur la contribution du développement à la maladie, nous administrerons un médicament par gavage, ce qui peut générer une gêne et un inconfort et des effets indésirables liés à la molécule administrée. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Les prélèvements de sang peuvent générer un stress, une douleur et un inconfort lié à la piqûre, et leur répétition peut engendrer une déshydratation. Il existe un risque d’hématome après le prélèvement. L’anesthésie générale mise en place pour les prélèvements sanguins sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardiorespiratoire. La mutation génétique portée par les souris porteuses de 2 copies du gène muté peut générer des souffrances après de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons dans la mesure du possible des modèles in vitro qui évitent l’utilisation d’animaux. En effet, nous utilisons des modèles in vitro qui miment le développement du cerveau et qui permettent de répondre à certaines questions sur la contribution de ce développement sur la maladie que nous étudions. Cependant ce modèle in vitro ne permet pas de répondre à toutes les questions car : (i) le comportement des neurones diffère selon leur environnement in vitro et in vivo ; et (ii) la mise en place de l'organisation du cerveau ne peut pas être reproduite in vitro. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de mener des expériences comportementales. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour notre projet, mais nous utiliserons le modèle in vitro dès que possible afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le cadre de la maladie que nous étudions, il existe un modèle de souris permettant d’évaluer les différents aspects que nous souhaitons étudier dans ce projet et ainsi obtenir des données transposables chez l’homme. L’étude de l’effet thérapeutique de médicaments sur les symptômes de la maladie ne peut se faire que sur un modèle animal et ne peut pas être remplacé par un modèle in vitro. De même, l’étude de l’influence d’un développement anormal sur l’organisation du cerveau adulte et ses conséquences comportementales ne peut se faire qu’avec des modèles animaux. Il n’existe pas de méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettent d'étudier le développement du cerveau et ses effets sur des troubles moteurs et cognitifs. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte la lignée de souris génétiquement modifiée nécessaire à l'étude et en réduisant au plus le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous affinerons les analyses statistiques en fonction de données à analyser. De plus, afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. En nous basant sur nos études précédentes, nous estimons qu’il nous faudra de 8 à 20 animaux par groupe en fonction des analyses à réaliser. Ainsi, au total, nous estimons qu’il faudra 3086 animaux pour obtenir des résultats significatifs dans ce projet. Toutefois, si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux, tous ne seront pas utilisés, ni produits. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour nos lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce et seront observés quotidiennement. Les animaux que nous utilisons sont génétiquement modifiés. Comme seules les souris porteuses de 2 copies du gène muté présentent un phénotype dommageable, nous privilégierons un schéma de croisement permettant de limiter le risque d’expression du phénotype dommageable seulement aux animaux nécessaires pour les lots expérimentaux. Le maintien de la lignée privilégiera les animaux avec une seule copie du gène muté. Les animaux porteurs de 2 copies du gène muté seront particulièrement surveillés pour détecter tout signe précoce d’expression du phénotype dommageable, notamment des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. La biopsie pour génotypage sera la plus petite possible et réalisée sur un animal jeune (cicatrisation rapide). Il s’agit d’un geste rapide, réalisé au calme et parfaitement maitrisé. Pour le maintien de notre lignée, afin d’éviter toute dérive génétique, toutes les 10 générations, nous croiserons notre lignée de souris avec des souris sauvages provenant d’un élevage extérieur. Les souris qui recevront des traitements à visée thérapeutique seront traitées à des doses déjà utilisées dans des publications et n’entrainant pas d’effets délétères. Ces souris seront néanmoins surveillées dans les jours qui suivent l’intervention pour vérifier qu’elles continuent à s’alimenter. De plus, les traitements chroniques seront administrés par incorporation à la nourriture afin de diminuer la manipulation des animaux. Pour réduire le stress en lien avec les prélèvements de sang ils seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à des prélèvements répétés, après chaque prélèvement une injection de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir toute déshydratation. Des points limites spécifiques à chaque procédure sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur et sur un animal pré-sédaté.
Choix des espèces
Dans le projet, nous utiliserons un modèle de souris déjà caractérisé et qui récapitule les principaux symptômes observés chez les patients atteints de la forme de maladie que nous étudions. L’étude de ce modèle nous permettra donc d’obtenir des données transposables chez l’homme. Le modèle de souris utilisé présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau. Ce modèle est donc parfaitement adapté pour répondre à notre question scientifique, et il est impossible de répondre à cette question sans l’utilisation d’un modèle animal. Afin d’étudier les différentes composantes de la maladie et l’impact d’un traitement à différents âges sur son évolution, nous étudierons des animaux à partir du stade embryonnaire jusqu’à l’âge de 8 mois. La mutation génétique des animaux sera vérifiée à l’âge de 7 à 10 jours.
Traitement pharmacologique dans l’enfance du Syndrome du X Fragile chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Une injection quotidienne du cinquième au vingt et unième jour de vie, puis une injection de facteur inflammatoire dans une patte arrière: c'est le sort de chacune des 3 200 souris expérimentales de ce projet sur le syndrome de l'X fragile, auxquelles s'ajoutent 350 reproductrices amputées du bout de la queue pour génotypage. Toutes sont tuées à l'issue, 3 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 350 un niveau léger. S'y ajoutent des tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique provoquant une douleur qui peut durer jusqu'à une heure, et 72 heures d'isolement visuel et olfactif pour mesurer l'activité jour-nuit. Le porteur prévoit de tuer sur le champ tout animal montrant paralysie, vocalisations ou convulsions, et explique qu'analgésiques et anesthésiques restent exclus d'un protocole dont la douleur est l'objet d'étude.
Objectifs
Le syndrome X fragile (FXS) est une maladie neurodéveloppementale, cause la plus fréquente (1/4 000 hommes et 1/7 000 femmes) de l'autisme avec retard mental héréditaire. Il est dû à une mutation sur le chromosome X qui entraîne l’absence de la protéine FMRP qui contrôle de nombreuses fonctions dont la quantité et la localisation de nombreuses protéines cellulaires dans les neurones. En clinique humaine, comme dans la souris génétiquement modifiée modèle de la pathologie, le FXS est associé à des troubles des comportements socio-cognitifs et sensori-moteurs, et à des défauts cellulaires de morphologie et de plasticité synaptique des neurones. Selon le génotype, on pourra distinguer des individus atteints (hommes et les femmes), mais aussi des femmes porteuses faiblement ou non symptomatiques. In vivo, l'inhibition pharmacologique d'enzymes particulières produit un phénomène de "sauvetage" des défauts sociaux-cognitifs des souris transgénique modèles de la pathologie humaine. Dans une perspective thérapeutique chez l'humain, ce projet a pour objectif de tester l'efficacité d'un traitement chronique précoce par des inhibiteurs pharmacologiques de ces enzymes dans l'enfance des souris modèle du FXS, sur les troubles sensori-moteurs caractéristiques de la pathologie et associés aux troubles socio-cognitifs. Quatre inhibiteurs seront testés, dont certains développés en collaboration, présentant des propriétés pharmacologiques différentes et ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Sur le plan de la recherche fondamentale, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes neuronaux moléculaires et les voies de transduction dans les fonctions sensorielles et sensori-motrices. Sur le plan de la recherche appliquée et clinique, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les symptômes associés au syndrome X Fragile et de proposer une nouvelle cibles thérapeutiques. Avant de proposer de tester de nouveaux composés chez l'homme, il faut en valider les effets sur un modèle de souris génétiquement modifié qui reproduit fidèlement les symptômes comportementaux et neuro-anatomiques des individus atteints de FXS.
Procédures
Les souris reproductrices (350 souris) subiront une ablation du bout de queue pour génotypage. Toutes les souris expérimentales (3200 souris) subiront un traitement chronique P5-P21 (de 5 à 21 jours après la naissance) par injection quotidienne (30 sec /souris/jour pendant 15 jours), ainsi qu'un prélèvement sanguin par veine caudale sous contention (5 min), une injection intraplantaire (30") dans une patte arrière et pour la moitié une anesthésie chimique (5 min), un prélèvement sanguin sous anesthésie (1 min) avant euthanasie (5 min), alors que l'autre moitié subira une anesthésie gazeuse avant euthanasie (5 min).
Impact sur les animaux
Bien que rares, des inflammations ou infections pourront se développer aux points de prélèvements (queue) et d’injections. Le traitement chronique sur les souriceaux (P5-P21) peut entrainer une dégradation de l'état général qui constituera un point limite. Les gestes de contention et les tests d'interaction sociale, les tests sensori-moteurs et les tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique non invasifs peuvent induire du stress, qui sera néanmoins réduit (nuisance modérée) par l’habituation préalable. Un isolement visuel et olfactif relatif de 72h sera nécessaire pour mesurer les variations d’activité durant le cycle jour-nuit. Pendant les tests comportementaux de sensibilité cutanée, une douleur cutanée transitoire ou prolongée (max 1h) sera ressentie sur la queue ou une patte arrière.
Devenir
Les souris sont génétiquement modifiées et ne peuvent être disséminées dans la nature pour adoption. De plus, elles ont subi un traitement pharmacologique, ainsi que des tests comportementaux invasifs avec injections de facteurs inflammatoires. Elles ne peuvent donc pas être conservés pour une réutilisation. Elles seront donc mises à mort en fin de protocole et permettront des prélèvements sanguins et tissulaires nécessaires aux résultats expérimentaux.
Remplacement
Les expériences de comportement et de pharmacologie chez la souris sont nécessaires pour avoir accès à la complexité physiopathologique de l'intégration du message douloureux et des processus sensori-moteurs. Elles permettent aussi d'utiliser des souris génétiquement modifiées, transposition directe de la pathologie humaine chez l'animal. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques.
Réduction
L‘objectif de Réduction a été pris en compte car le nombre total de souris (3200) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (15 souris/condition + une sécurité optionnelle de 5 souris/lot pour compenser l’exclusion de certains animaux en cours d’étude selon les points limites prévus). Toute expérience rendue inutile par des résultats obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique mondiale permanente) ne sera pas conduite. En fonction de leur génotype, de leur sexe et de leur traitement pharmacologique les lots de souris seront comparés grâce à des tests statistiques adaptés à la distribution statistique des données et au type de comparaison choisies (comparaison sur le même animal ou sur des animaux différents). Le design des méthodes de reproduction a été optimisé pour pouvoir produire sur les 5 ans de la durée du projet les souriceaux les deux génotypes mâles et des trois génotypes femelles (dont des animaux normaux) qui devront être comparés (la pathologie X-Fragile est causé par une mutation sur le chromosome X). Le projet s’étalant sur 5 ans, le nombre réel des reproductions et des animaux reproducteurs pourra être réduit en fonction des portées (nombre des bébés, sexes et génotypes) déjà produits et étudiées auparavant. Les animaux reproducteurs pourront être aussi utilisés pour produire des souris dans le cadre d’autres projets du laboratoire, ou pour renouveler les lots de reproducteurs, et seront mis à mort à la fin de leur période de reproduction pour permettre des prélèvements de tissus post-mortem.
Raffinement
Pendant les expériences, un suivi quotidien sera réalisé par contrôle visuel de l'état de l'animal et de ses sites d'injection ou de prélèvement, ainsi qu’un contrôle expérimental (comportement mesuré par le test). Le poids de chaque souriceau sera relevé et, en cas de stagnation ou de décroissance de la prise de poids sur deux jours, le souriceau sera euthanasié. Les risques de rejet et de cannibalisme liés à la manipulation des souriceaux sera limité en mettant les souriceaux en contact avec l’urine de la mère avant d’être remis dans le nid. Dans le cadre de la prise en compte de leur souffrance, les animaux adultes seront habitués aux tests préalablement afin de réduire leur stress. Chaque test/intervention sera séparé au minimum d’une semaine du suivant. Si un animal est blessé ou présente des signes d’infection au site d’injection ou de prélèvement, nous l'isolerons et le soignerons jusqu'à guérison (si après une semaine l'animal est encore blessé, il sera mis à mort). Tout animal qui présenterait des signes de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement anormal (prostration, apathie…) ou d‘une pathologie quelconque serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans les protocoles qui ont pour objet d’étude la douleur.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer le comportement « normal » ("sauvage") avec le modèle transgénique du FXS (souris Fmr1-KO), et d'étudier les défauts de comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensori-moteurs que l'on peut retrouver chez les patients. D'autre part, de nombreux modèles comportementaux de douleur et de motricité font actuellement référence chez la souris dans le type d’étude que nous souhaitons mener. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques. Le traitement pharmacologique chronique sera réalisé de P5 à P21 (de 5 à 21 jours après la naissance), correspondant à l'enfance chez la souris, où le processus neurodéveloppemental est crucial. Les tests sensori-moteurs et sociaux seront conduits à 1 mois à l’adolescence, une période clé du développement de l’autisme, puis de 8 à 20 semaines afin d'évaluer le bénéfice du traitement pharmacologique précoce à l’âge adulte.
Conséquences cardio-respiratoires de la mutation d’un gène spécifique dans la forme congénitale d’une maladie génétique rare (maladie de Steinert)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
- Système respiratoire
Tous les souriceaux sont tués au plus tard deux jours après leur naissance, leurs tissus étant prélevés pour analyse. 744 souris vont être utilisées dans ce projet sur la forme congénitale de la maladie de Steinert, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mesures portent sur la ventilation des nouveau-nés éveillés pendant une heure, le jour de la naissance puis le lendemain, ce qui suppose de les séparer de leur mère aussi longtemps, et le porteur reconnaît que la mutation dans sa forme sévère peut conduire à une détresse respiratoire. Vingt-quatre femelles échappent à la mise à mort, gardées pour produire de nouvelles portées.
Objectifs
La dystrophie myotonique de Steinert est une maladie génétique qui touche environ 1 personne sur 8000 en France. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire, des problèmes cardiorespiratoires, des cataractes précoces, et des troubles de l'apprentissage. La manifestation à la naissance (congénitale), la forme la plus sévère, peut se détecter dès la période prénatale par une réduction des mouvements fœtaux et un excès de liquide amniotique. À la naissance, les bébés présentent une faible tonicité musculaire, des difficultés à sucer et à avaler, et souvent des problèmes respiratoires. La maladie est due à une anomalie d’un gène spécifique caractérisée par une répétition excessive d'un motif particulier dans le gène. Plus cette répétition est longue, plus la maladie est sévère, pouvant atteindre jusqu’à 1000 répétitions chez certains patients. Le projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie, particulièrement dans sa forme sévère, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Actuellement, aucun traitement efficace n’existe. Pour étudier cette maladie, nous disposons de souris génétiquement modifiées portant le gène muté. Ces souris reproduisent certaines caractéristiques de la maladie humaine. Il s’agit alors d’identifier les mécanismes spécifiques liés à la mutation du gène et comprendre comment ces mécanismes contribuent aux symptômes sévères observés dans la forme congénitale de la maladie.
Bénéfices attendus
La maladie de Steinert est caractérisée par la répétition exagérée d'un motif spécifique. La compréhension de la conséquence de cette répétition est capitale pour mieux gérer la maladie, la progression des symptômes et leur variabilité, pour identifier d'autres gènes impliqués et pour tester de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Pour les femelles gestantes : Isolement de la femelle gestante 4 jours avant la mise bas. Pour les souriceaux : Mesure de la ventilation , de la fréquence respiratoire, du volume inhalé à chaque cycle respiratoire, de la durée et du nombre d'apnées chez les souriceaux éveillés pendant 1 heure le jour de la naissance et à J+1.
Impact sur les animaux
1/Séparation maternelle le temps de réaliser l'enregistrement des paramètres ventilatoires d'une heure. 2/ La mutation dans sa forme sévère peut conduire à une détresse respiratoire. 3/ Les femelles gestantes sont isolées 4 jours avant la mise bas pour permettre la nidation et réduire le stress lors de la prise en charge à la naissance.
Devenir
Tous les souriceaux sont euthanasiés au plus tard 2 jours après leur naissance. Prélèvement tissulaire postmortem pour des analyses à l'échelle des molécules. Les femelles sont ré-utilisées pour obtenir de nouvelles portées.
Remplacement
Les études sur des cultures cellulaires sont importantes dans la compréhension de la maladie. Toutefois, ces modèles sont limités car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge. Étant dans l’optique de recherche de traitement pharmacologique notamment pédiatrique, l’Agence européenne du médicament recommande l’utilisation de l’animal en développement. L’expérimentation animale ne peut alors être évitée. Dans la maladie de Steinert, il n’y a actuellement pas de traitement pharmacologique satisfaisant.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle sur les variables observées comme la ventilation, nous avons déterminé un effectif de 30 animaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.
Raffinement
Pendant les mesures, la surveillance est constante. Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux (deux premiers jours de vie) comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau (coloration du souriceau, mouvement spontané, respiration spontanée, réaction à la douleur, présence de lait dans le ventre) et le comportement de la mère envers sa portée (constitution du nid, présence de lait dans le ventre). Pour les mesures, nous utilisons des techniques non invasives et contrôlées (durée de la mesure, température dans les chambres de mesure) pour minimiser l'angoisse des animaux. La durée maximale de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure. Les cages des femelles gestantes isolées puis les mères avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid. Par ailleurs, le personnel technique de l'animalerie effectue une vérification journalière obligatoire des espaces d'hebergement des souris et toutes les cages sont vérifiées.
Choix des espèces
L’approche sur un animal entier permet de voir les effets de la mutation dans un contexte physiologique. La souris constitue un modèle de neuro-développement humain et la souris avec modification génétique est largement utilisée dans l'analyse ou l'étude du développement d'une maladie génétique. Dans le cas de la maladie de Steinert, les modèles animaux existants sont murins. Ces modèles murins permettent alors de préciser les processus conduisant à la maladie et de tester ultérieurement les stratégies thérapeutiques. Notre investigation est au stade postnatal précoce, les deux premiers jours de vie (à la naissance (P0) et à P1).
Comprendre le développement hématopoïétique normale et leucémique pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour les leucémies humaines
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées à la fin des procédures pour éviter la dissémination d'organismes génétiquement modifiés, 2 770 souris transgéniques sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir une greffe de cellules leucémiques, des injections antitumorales deux fois par semaine pendant quatre semaines, un gavage quotidien sur la même durée, jusqu'à douze prélèvements sanguins et trois prélèvements de moelle osseuse. Une partie est irradiée avant greffe, ce que le porteur qualifie d'affaiblissement modéré et transitoire, les animaux à pathologie avancée perdant du poids et s'affaiblissant jusqu'à l'arrêt de la procédure. Sur le remplacement, il conclut que le modèle murin est "incontournable", notamment parce que les lignées cellulaires cultivées divergent des échantillons de patients.
Objectifs
Les leucémies aiguës myéloblastiques sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Les mutations sur lesquelles nous travaillons restent de très mauvais pronostic. Dans l'ensemble, l'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Nos résultats précédents indiquent que le stade développemental (ex: fœtal, nouveau-né ou adulte) dans lequel ces altérations surviennent est important. Nos analyses moléculaires suggèrent que des mécanismes induits par ces fusions et des mécanismes de coopération entre différentes mutations sont importants pour les cellules leucémiques. Il est donc indispensable de développer des modèles physiologiques prenant en compte le stade du développement pour comprendre les mécanismes de la transformation leucémique et tester leurs rôles dans l'initiation ou le maintien des tumeurs. A ce jour, l'étude de l'inactivation de certains gènes in vivo, ainsi que le rôle chez l'animal entier ne peuvent pas encore être complètement remplacés par les modèles sophistiqués de remplacement. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies à mauvais pronostic et de tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, dans le contexte d’un organisme entier.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette à court terme: -De caractériser les mécanismes impliqués dans le développement leucémique, le maintien leucémique, la rechute et la résistance aux traitements. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -D’évaluer l’effet de l’inflammation dans le développement et la propagation leucémique. -A plus long terme, nous visons l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ces leucémies.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend entre quelques secondes et 3 à 5 minutes en fonction de la voie d'injection. -Injection de molécules: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et sont journaliers sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle: jusqu'à 3 prélèvements par souris avec un intervalle d'au moins 15 jours entre deux prélèvements. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général qui récapitule la maladie humaine nécessitant une surveillance renforcée, des soins puis un arrêt de la procédure. Les gavages pourront entraîner un stress léger et un inconfort temporaire. L’irradiation peut également entrainer à court terme un affaiblissement modéré transitoire des souris .
Devenir
Tous les animaux sont transgéniques et doivent être euthanasiés à la fin de la procédure pour éviter la dissémination des OGM. Des analyses post-mortem sur les organes des animaux permettent aussi de caractériser la pathologie par des analyses histologiques.
Remplacement
L'utilisation de modèles murins dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération de toutes les cellules du sang n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.
Réduction
Pour déterminer l’efficacité des modèles, nous évaluons le développement tumoral entre les groupes contrôles et les groupes expérimentaux à l'aide de différents paramètres (nombre de globules blanc, globules rouges, plaquettes dans le sang; pourcentage de cellules anormales par les analyses de cytométrie en flux; poids des rates et des foies) grâce à un test statistique. La robustesse des modèles est évaluée en confrontant ces résultats au cours du temps. Les nombres calculés dans ce projet sont des nombres maximaux calculés par des méthodes de calcul de puissance ou limités par le matériel cellulaire disponible (ex: dans le cas de populations purifiées de progéniteurs hématopoïétiques). Pour ce projet, nous avons favorisé l'utilisation de modèles transgéniques développés sur la base d'une expression des oncogènes proche de la physiologie et qui développent des hémopathies de manière pénétrante. Ainsi, le développement tumoral est contrôlé et le nombre de souris utilisé correspond précisément au nombre de souris permettant d'obtenir une valeur statistique des résultats.
Raffinement
Les procédures douloureuses sont accompagnées d’anesthésie et d’analgésie appropriées. Les animaux sont observés avec une fréquence adaptée à la procédure. L'utilisation d'une grille de score nous permet de suivre les animaux et d'intervenir pour les soulager en cas d’observation d'une souffrance. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Comme explicité plus haut, l’irradiation peut entrainer à court terme un affaiblissement des souris. Pour prévenir les conséquences après une irradiation léthale suivie de greffe et assurer le confort des animaux durant le premier mois post-irradiation, une nourriture enrichie est mise à disposition.
Choix des espèces
L'espèce souris a été choisie pour les raisons suivantes : -Les souris possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l'homme et de nombreux modèles de souris existent déjà permettant des croisements avec nos modèles. -Les approches précliniques in vivo sur souris sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères. Les nombreux modèles murins déjà disponibles reposent sur la proximité entre le développement des cellules du sang chez l'homme et la souris et ils permettent de comparer les résultats avec ceux d'autres études. Nous utiliserons des souris adultes et/ou des nouveau-nés et des embryons. Les souris adultes auront entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, un article récent montre l’importance d'utiliser des receveurs à différents stade de développement. Ainsi, nous utiliserons à la fois des cellules fœtales (foie fœtal), des cellules de nouveau-nés et des cellules adultes qui seront greffées dans des receveurs soit nouveau-nés soit adultes, âges qui correspondent à la population de patients..
Exposition maternelle aux nanoparticules par voie pulmonaire pendant la période périnatale : étude des conséquences sur la fonction pulmonaire de la descendance
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
Pour mesurer si des nanoparticules inhalées par une mère abîment les poumons de sa descendance, 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Les femelles gestantes puis allaitantes reçoivent les nanoparticules directement dans la trachée sous anesthésie, une fois par semaine pendant six semaines. Leur descendance passe des mesures de fonction pulmonaire de 5 à 45 minutes, éveillée, à quatre stades de développement, de la fin de gestation à l'âge adulte. Le porteur annonce que les souriceaux grandissent normalement, tout en prévoyant qu'un comportement maternel anormal et des anomalies de développement pourraient apparaître, et une mise à mort rapide dès l'atteinte d'un point limite.
Objectifs
Les nanotechnologies sont en plein essor depuis le début du XXIème siècle. Cependant, l'utilisation exponentielle des nanoparticules (NP) suscite des inquiétudes quant à leurs potentiels effets sur la sante de l’Homme et sur l’environnement. En effet, en raison de leur présence dans de nombreux produits du quotidien (produits cosmétiques, alimentation, produits d’entretien, expositions professionnelles etc.), nous y sommes régulièrement exposés, que ce soit par voie cutanée, orale ou pulmonaire. Des analyses toxicologiques sont donc nécessaires pour connaitre les risques liés à leur utilisation, notamment dans le cadre d’expositions pendant la période périnatale, lorsque l’organisme en développement est particulièrement sensible aux agressions environnementales. Des études récentes réalisées chez la souris ont montré que des nanoparticules administrées à des femelles gestantes ou lactantes peuvent atteindre le fœtus, traversant la barrière placentaire via la circulation sanguine, ou le souriceau après passage dans le lait maternel. Les conséquences de ces expositions périnatales jusqu’à l’âge adulte sont encore peu étudiées, il apparait cependant qu’elles peuvent provoquer des défauts dans divers organes (reins, foie, organes sexuels) chez la descendance. Une étude a montré qu’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la gestation (voie pulmonaire) provoque des anomalies de développement pulmonaire chez la descendance. Ce présent projet s’inscrit dans leur continuité. Le développement pulmonaire (chez l’Homme comme chez la souris) comporte une phase prénatale et une phase post-natale allant jusqu’à un mois après la naissance chez la souris. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la période de lactation sur le développement et la fonction pulmonaires de la descendance et d’évaluer les potentiels effets combinés d’une exposition pendant la gestation et la lactation, à l’aide d’approches in vivo et in vitro complémentaires. Les résultats obtenus permettront de contribuer à l’évaluation des risques liés à ce type d’exposition chez les femmes enceintes, allaitantes et leurs enfants.
Bénéfices attendus
Bien que l’impact d’une exposition directe aux nanoparticules sur le site d’exposition (poumons, systeme digestif) ait été bien décrit ces dernieres années, les conséquences d’expositions maternelles aux nanoparticules sont relativement peu etudiées et se concentrent sur le développement prénatal de la descendance. Les analyses des conséquences a l’age adulte d’expositions périnatales a ces nanoparticules sont rares, notamment dans le cas particulier du développement pulmonaire. Ce projet nous permettra donc d’en apprendre davantage sur la toxicite des nanoparticules chez la souris, dans un modèle in vivo permettant d’étudier la transmission de ces particules de la mère a la descendance (circulation sanguine, lait maternel) et ses conséquences sur le développement pulmonaire des souriceaux dans des conditions physiologiques. Ce projet aura pour bénéfice de contribuer a l’évaluation des risques liés a des expositions périnatales aux nanoparticules pour les femmes enceintes, allaitantes ainsi que leurs enfants.
Procédures
Les femelles gestantes et lactantes seront soumises a des expositions pulmonaires aux nanoparticules (administration par voie pulmonaire via la trachée) sous anesthésie de manière hebdomadaire pendant 6 semaines (geste technique realisé en quelques minutes, réveil et récupération rapides pour l’animal). La descendance sera soumise à des mesures longitudinales non invasives de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant de 5 à 45 minutes à plusieurs stades de leurs vies.
Impact sur les animaux
La descendance des souris femelles exposées aux nanoparticules au cours de la gestation ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. Dans le cadre de ce projet, les expositions comprendront la période de gestation ainsi que celle de lactation. L’exposition des femelles chaque semaine pendant la gestation puis la lactation pourrait induire un stress conduisant à un comportement maternel anormal. Des anomalies de développement pourraient apparaitre chez la descendance, une attention particulière sera portée a leur croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux nanoparticules (prélèvement d'organes).
Remplacement
Notre étude porte sur l’impact d’une exposition maternelle aux nanoparticules sur le développement pulmonaire de la descendance. Ces nanoparticules peuvent passer des poumons de la mère à son systeme sanguin, s’accumuler dans ses organes et enfin atteindre la descendance, en traversant le placenta ou en passant dans le lait maternel ingéré par les nouveau-nés. Cette transmission résulte d'une complexité impossible a modéliser de manière bioinformatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.
Réduction
Nous avons optimisé les protocoles afin d’étudier le phénotype pulmonaire à la fois des mâles et des femelles. Nous réalisons un maximum d’analyses sur le même animal afin d’utiliser tous les animaux générés dans nos procédures et d’en minimiser le nombre, tout en gardant la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence des variations biologiques Afin de reduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous n’effectuerons que les seules expériences indispensables, et nous nous efforcerons de réutiliser les animaux lorsque celà est possible, notamment le contingent de mâles d’accouplement nécessaires pour générer des femelles gestantes.
Raffinement
Pour les besoins de notre étude, nous travaillerons avec les femelles gestantes et lactantes particulièrement sensibles au stress. Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser ce stress, en les hébergeant a deux par cage, en rangeant ces cages aux endroits de plus faible passage dans le box d’hébergement, et en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanieres de papier. Apres le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, et seront hebergées en groupes sociaux de 5 souris maximum par cage, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront realisées en limitant au maximum la souffrance et l’angoisse animale. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise a mort rapide à l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
Le modele murin a été choisi dans notre projet car la souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la litterature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, le projet nécessite un modèle mammifère permettant la transmission des nanoparticules de la mère a la descendance par la circulation sanguine et le lait maternel. Or, les quelques études décrivant cette transmission ont été réaliées dans le modèle murin. Le but du projet est de caractériser les effets d’une exposition périnatale aux nanoparticules sur le développement et la fonction pulmonaires jusqu’à l’âge adulte, les poumons se développant chez la souris en pré et post-natal. Le phénotype pulmonaire de la descendance sera analysé a 4 stades : en fin de gestation (dernier tiers), a la naissance (nouveau-ne) afin d’étudier l’impact d’une exposition prénatale, au stade juvénile afin de visualiser les effets d’une exposition post-natale pendant la période de lactation et à l’âge adulte afin d’en évaluer les conséquences a long terme
Etude du gène impliqué dans la formation et le fonctionnement de l’appareil urinaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
187 souris vont être utilisées, 42 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 145 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Des femelles gestantes reçoivent un traitement par voie orale puis une injection intrapéritonéale pour déclencher la suppression d'un gène, avant d'être tuées par dislocation cervicale, leurs embryons étant décapités aussitôt après. Les souris qui naissent et survivent sont pesées deux fois par semaine puis suivies jusqu'à six mois, âge auquel elles sont tuées après évaluation de leur phénotype dommageable, malformations ou dysfonctionnements de l'appareil urinaire. Le porteur affirme travailler dans une boîte de Pétri chaque fois qu'il le peut, et conclut que ce gène doit être étudié "dans sa globalité", donc dans un organisme vivant.
Objectifs
Les anomalies congénitales du rein et le tractus urinaire (CAKUT) font partie des malformations les plus importantes à la naissance. Les maladies CAKUT peuvent être létales à la naissance ou pendant l’enfance ou l’adolescence. Chez les adultes, les maladies CAKUT prédisposent à des pathologies rénales chroniques, une maladie qui conduit souvent à une insuffisance rénale terminale. Malgré cet impact important de santé publique, dans 80% des maladies CAKUT, aucun gène n’a été à ce jour identifié. La mutation de gène de notre intérêt a été récemment identifiée chez les individus souffrants des maladies CAKUT. Pour autant les mécanismes d’action de ce gène et son rôle pendant l’embryogenèse et au cours de la vie d’adulte est totalement méconnu à ce jour. Dans ce projet, nous allons d’une part activer la délétion de ce gène sur les femelles gestantes pour analyser les embryons à des stades précoces de l’embryogenèse. D’autre part, si la délétion de ce gène n’est pas léthale pendant la grossesse, nous allons vérifier si les souris adultes présentent des problèmes de santé sur trois générations. Nous avons calculé que nous aurons besoin de 187 animaux au total.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale va permettre de comprendre comment le dysfonctionnement de notre gène d’intérêt altère la formation du rein conduisant à des malformations voire à l’absence totale des reins aboutissent à une mortalité précoce ou à des maladies rénales chroniques pour lesquels à ce jour, à part la dialyse ou la greffe d’organe, la médecine n’a aucun autre recours.
Procédures
Administration par voie orale sur les femelles gestantes d’un traitement pour activer la délétion du gène d’intérêt (40 secondes par animal) suivi, 48h plus tard, par 1 injection intrapéritonéale (20 secondes par injection). -A partir du sevrage, pesée 2 fois par semaine (20 seconds) jusqu’à l’âge de 2 mois puis 1fois/semaine jusqu’au 3ème mois puis 1 fois/mois jusqu’au 6ème mois.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient développer des malformations et/ou dysfonctionnement des organes uro-génital. La contention cause du stress et la piqure cause une légère douleur.
Devenir
Procédure 1: Mise à mort avant la naissance. Procédure 2 : Procédure de suivie du phénotype de la naissance jusqu'à 6 mois. Notre étude porte sur l'analyse du rein en development donc nous avons besoin d'avoir des embryons que nous obtenons à partir des femelles gestantes qui sont mises à mort par dislocation cervicale. Les embryons sont décapités rapidement après la mise à mort de la mère. Tous les animaux qui survivent après la naissance seront mis à mort à l'âge de 6 mois à l'issue d'évaluation du phénotype dommageable. En effet, à 6 mois d’âge, nous pouvons analyser de manière exhaustive les effets du phénotype sur le développement du rein et la fonction rénale. Des analyses antérieures seraient incomplètes, car certaines anomalies pourraient ne pas être visibles avant que le développement ne soit entièrement achevé. S’il y a phénotype dommageable cela pourrait apparaître progressivement et devenir pleinement visible à l’âge adulte, soit vers 6 mois. Attendre cet âge nous permet d’évaluer pleinement l’expression du phénotype et ses répercussions sur l’organisme, garantissant ainsi que toutes les manifestations du phénotype ont été correctement observées et documentées.
Remplacement
Nous avons les outils et l’expertise d’étudier notre gène d’intérêt dans une boîte de Pétri et nous le réalisons à chaque étape que nous le pouvons. Toutefois, ce gène a un rôle important dans la formation de plusieurs organes pendant la formation de l’embryon. Par conséquent pour mieux comprendre le fonctionnement de ce gène, il est nécessaire de l’étudier dans sa globalité en occurrence dans un organisme vivant.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs nous avons besoin de 20 embryons par expérience (histologie et analyses quantitatives) et par génotype. Toutefois pour réduire le nombre de souris utilisées si nous obtenons des résultats statistiquement significatifs avant l’utilisation de 20 embryons, nous ne ferons pas des accouplements supplémentaires. En ce qui concerne évaluation des problèmes de santé sur les animaux adultes : En nous appuyant sur la littérature et notre propre expérience, nous prévoyons l’analyse de 4 portées issus de 4 couples indépendants au cours de 3 générations (en suivant la législation en cours) pour évaluer le phénotype de la lignée générée dans ce projet. Le nombre minimum d’animaux nécessaire pour l’analyse de la prolifération cellulaire, les paramètres histologiques et physiologiques que nous envisageons d’analyser a été déterminé par des calculs statistiques basé sur un calcul de puissance associé à l’utilisation de tests de significativité statistiques.
Raffinement
Nous pratiquons un élevage sans phénotype dommageable grâce à un modèle de délétion conditionnelle où nous délétons le gène au moment voulu et uniquement dans certains tissus. Quant aux animaux susceptibles de développer un phénotype dommageable, outre de leur fournir un environnement enrichi pour satisfaire leur besoin de rongeur et leur instinct de nidification, de les héberger en permanence avec leur congénère de même portée, de les surveiller au quotidien, nous avons établis 2 grilles d’observation selon lesquels, les personnels formés et compétents noteront la moindre anomalie susceptible de compromettre leur état de santé, leur comportement et leur bien-être et prévoyant des points limites précoces et adaptés. Pour les injections, nous prenons la précaution de chauffer la solution au préalable à 37°C. Lors de mis à mort des animaux, nous les anesthésions au gaz isoflurane à 4% dans la chambre d’induction pendant 2 à 3 min (temps nécessaire pour une anesthésie profonde) aussitôt après la souris est mis à mort par la dislocation cervicale. Les accouplements seront programmés afin d’éviter les mises-bas le week-end permettant d’assurer une meilleure surveillance des animaux autour de cette phase critique au cours de laquelle des points limites pourraient être atteints (avortement spontané, risques de dystocie). Un vétérinaire dédié de manière permanente à notre animalerie est disponible à toutes nos requêtes sur l’état de santé de nos animaux et plus particulièrement de ceux sous la procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme. Le modèle de souris mutante pour le gène étudié dans ce projet mime fidèlement la pathologie humaine résultant du dysfonctionnement de gènes humains homologues. Les stades du développement : Depuis la naissance jusqu’ à l’âge de 6 mois, période nécessaire et suffisante pour évaluer le bien-être de la lignée génétiquement modifiée créée dans ce projet. Les femelles âgées de 8 semaines à l’optimum de leur maturité sexuelle pour la production d’embryons objets de l’étude.
Evaluation de la réponse immunitaire et de stress oxydatif de la truite face à une contamination aux polluants éternels (per- et polyfluoroalkylées)
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Injectées dans la cavité abdominale avec un mélange de polluants perfluorés, 90 truites d'environ deux ans subissent deux prélèvements de mucus, deux pesées et un test comportemental mené sans anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit pourtant que les interventions n'impliquent que des "stress légers", et s'appuie sur des études antérieures n'ayant relevé aucune mortalité pour justifier les concentrations retenues. La mise à mort sert à prélever le foie et à y doser des marqueurs de stress, afin de vérifier si le mucus pourrait un jour remplacer ces prélèvements.
Objectifs
Les substances per- et polyfluoroalkylées, également connues sous le nom de PFAS, sont une large famille de plus de 4 000 composés chimiques. Ces substances sont nommées polluants éternels en raison de leur persistance dans l’environnement dû à leur faible dégradation dans l'environnement. Ces composés sont utilisés pour largement utilisés dans l’industrie ; ils rentrent par exemple dans la composition du téflon, des mousse anti-incendie, des revêtements imperméables, le fart pour le ski, les produits antitaches…. Ces substances sont largement rependues à l’échelle mondiale en raison de leur utilisation variée, ainsi tous les milieux peuvent être concernés par des contaminations : l’eau, l’air, les sols, et la chaîne alimentaire. Depuis, 2023 certaines de ces substances sont classés « cancérogène pour les humains » pour le PFOA (acide perfluorooctanoïque) et « peut-être cancérogène pour les humains » pour le PFOS (sulfonate de perfluorooctane ) par Centre international de recherche sur le cancer. De plus, des concentrations plus élevées ont été retrouvé pour des poissons sauvages avec des concentrations supérieures à la teneur maximale de 450 μg/kg de poids frais. De précédentes études relatent une toxicité pour les organismes aquatiques, sur les systèmes endocrinien et immunitaire, sur la reproduction et le comportement. Néanmoins, il n’existe à notre connaissance pas d’études portant sur l’impact de ces substances sur les protéines de l’immunité et du stress chez les poissons. Un salminidé est choisi pour ce projet car elle présente de multiples intérêts : patrimonial, socio-économique et comme sentinelle de la qualité des rivières. De plus, de poisson est largement présent dans les rivières et est largement péchés et consommés. Ainsi, l’objectif sera de tester des marqueurs de l’activité immunitaire et de stress afin d’observer les potentiels effets néfastes de ces substances. Le prélèvement de mucus apparait comme un bon candidat pour un marqueur moins invasif, en de précédentes études montrent que les prélèvements successifs de mucus n'ont aucun effet sur la réponse immunitaire ni sur la structure de la peau du poisson.Ces connaissances et mise au point sur le mucus pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer des stratégies de surveillance de la qualité des rivières moins invasives.
Bénéfices attendus
Ainsi, l’objectif sera d’observer les potentiels effets néfastes de ces substances per- et polyfluoroalkylées sur des marqueurs immunitaires et de stress.
Procédures
Pour l'ensemble des interventions les animaux seront sous anesthésies. Les interventions de ce projet n'impliquent que des stress légers : la premiére intervention (T0) sur le poissons fera l'ojet d'une pesée puis le prélévement de mucus et une injections intrapéritonéale. Une seconde intervention sur le poisson à 7 jours (T7) fera l'objet d'une pesée et d'un prélévement de mucus. Une troisiéme intervention sur les animaux aura lieu pour une étude de comportement à 9 jours (T9) , lors de cette derniére les poissons ne seront pas anesthésiés.
Impact sur les animaux
Les procédures de ce projet n'impliquent qu'un stress modéré du aux manipulations. Un stress pourra également survenir lors des étape de pesée qui auront lieu 2 fois lors l'expérimentation à T0 et T7 , du prélèvement de mucus qui auront lieu 2 fois lors de l'expérimentation à T0 et T7 , lors de l’injection intrapéritonéal qui aura lieu 1 fois lors de l'expérimentation à T0 ainsi que lors de l'analyse comportmental qui aura lieu 1 fois lors de cette expérimentation T9. Pour cela les poissons seront anesthésiés afin de minimiser les nuisances pour les étapes d'injection intrapéritonéla, de pesée et de prélévement de mucus. Le prélévement de mucus est réalisés sour anesthésie afin de minimiser le stress. Cette opération à une durée inférieure à 1minutes par poissons. Le prélèvement de mucus ne devrait pas engendrer de stress ou de nuisance, en effet de précédente étude montrent que les prélèvements successifs de mucus n'ont aucun effet sur la réponse immunitaire (activité bactéricide) ni sur la structure de la peau du poisson . L’injection intrapéritonéal à une durée infériure à 30s par poissons. Les analyses de comportements qui seront rélisées 1 fois durant l'expérimentations (T9 le surlendemain de la premiére injection). Cette analyse peut engendrer du stress en raison du transfert des poissons entre les aquariums. Pour ces analyses les poissons sont seront placées par lot de 5 dans des aquariums de 200L et seront acclimatées durant 20 minutes puis filmées durant 15 minutes. L’eau de l’aquarium sera la même que celle des conditions d’hébergements (pompage -51m) afin de garantir la même oxygénation et la même température.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis. De plus, afin d’éviter le développement d’effet néfastes à long terme les individus sont mis à mort. Suite à leur mise à morts des prélèvements de tissus, foie permettront de réaliser des dosages classiques de marqueur de stress pour tester si la réponse dans le mucus est pertinente et permet de remplacer ces prélèvements classiques.
Remplacement
Le modèle animal n'est pas remplaçable par un modèle in vitro car il nécessite une étude dans un système intégré (différents tissus fondamentaux, différents organes et notamment système inflammatoire...). En effet, une etude précédente ne montre pas d'augmentation de la mortalité pour les concentrations des mélanges testés lors de ce projet , mais montre des différences de bioaccumulation de ces molécules.
Réduction
Les analyses statistiques envisagées seront des analyses de variances . L’effectif totale est de 90 individus afin de s’assurer un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 15 individus par conditions = 15 *6 conditions. Ce nombre a été choisi sur la base d'études antérieures afin de réduire la variabilité individuelle observée. Des études antérieures portant sur des expositions individuelles aux PFOS n'ont révélé aucune mortalité au cours du mois d'exposition.
Raffinement
Les animaux seront visités au minimum quotidiennement durant la semaine et une fois durant les weekends. De plus, dans chaque bassin, des tiges flottantes (jeux) , des plantes en plastiques et des caches seront installées pour permettre aux truites de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience. La détermination précose de nos point limites permettront réduire la souffrance et le stress . Afin de minimiser les nuisances, les animaux seront anesthésiés avant les procédures, d’injections, de récoltes du mucus et de pesée.
Choix des espèces
Les salmonidés ont un fort attrait économique grâce à l’activité de pêche de loisir et de son intérêt économique avec une production aquacole de 700 tonnes en France et de 19432 tonnes au niveau mondial . De plus, la truite est une espèce dont cycle de vie est maitrisé au sein de par notre organisme. Contrairement à d'autres modèles de poissons utilisés en laboratoire, comme le poisson-zèbre, les études sur la truite sont facilement extrapolables à d'autres espèces de poissons présentant un intérêt écologique. Les truites choisies pour cette expérimentation seront âgées d’environs 2 ans et pèseront environ 110 g afin d’assurer un prélèvement de mucus suffisant et de la non maturité sexuelle des individus.
Etudes des aneuploïdies chez les embryons bovins
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
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Douze ponctions ovariennes par animal, sous anesthésie épidurale et sur bête vigile, avec pose et retrait répétés d'un dispositif vaginal et cinq injections de superovulation à douze heures d'intervalle avant chaque collecte : 12 génisses Prim'Holstein subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et sont gardées en vie à l'issue. L'ensemble sert à produire 400 embryons pour mettre au point la détection des anomalies chromosomiques dès le stade préimplantatoire, afin d'éviter les transferts sans issue et de réformer les animaux porteurs. Le porteur mentionne des hématomes possibles au point d'injection et un stress ponctuel lié aux contentions. Il classe la procédure en gravité modérée du fait de la répétition d'actes légers et, écrit-il, en l'absence de données objectives sur le sujet.
Objectifs
Depuis 2009, la sélection génomique s’est développée dans la filière bovine avec près de 300 000 analyses annuelles du génome réparties désormais dans une quinzaine de races, dont 80% pour une gestion du renouvellement en élevage. La lecture du génome peut également être effectuée plus précocement, dès le stade embryonnaire préimplantatoire après analyse de l’ADN préamplifié issu d’une biopsie de quelques cellules d‘un embryon (utilisation dans le cadre des schémas de sélection). Ces données génomiques sont principalement utilisées aujourd’hui pour prédire les performances futures de chaque individu mais ne sont pas valorisées pour détecter des problèmes d‘aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) qui peuvent survenir à chaque génération. Ces anomalies chromosomiques entrainent souvent l’arrêt du développement voire des problèmes d’infertilité ou de stérilité sur l’individu né. Le projet présenté vise à développer des approches méthodologiques permettant valoriser les données de génotypage pour détecter les anomalies chromosomiques (monosomie, trisomie) le plus précocement possible chez l’embryon et chez le veau afin de les prévenir et les gérer. Le projet justifiant cette demande d’autorisation porte uniquement sur la détection des anomalies chromosomiques chez les embryons, les approches chez les veaux nécessitant uniquement l’exploitation de données de génotypages déjà disponibles dans les bases de données nationales.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de développer et valider des méthodologies de détection des problèmes de ploïdie (monosomie, trisomie) dès le stade embryonnaire préimplantatoire chez les bovins. Ces indicateurs permettront à la fois d’éviter de transférer les embryons aneuploïdes (probabilité de gestation et naissance quasi-nulle alors même que l’aspect morphologique semble bon) mais également de mieux diagnostiquer des problèmes de fertilité chez des animaux aneuploïdes et ainsi les réformer pour éviter la dissémination de ces tares génétiques.
Procédures
La production des embryons nécessitera la répétition, pour chaque génisse du projet, de 12 collectes d'ovocytes (1 collecte d'ovocytes tous les 15 jours par animal) réparties en deux séries entrecoupées d’une période de repos de plusieurs semaines. Au début de chacune des deux séries de collecte d'ovocytes, un traitement de synchronisation des chaleurs sera effectué comprenant la pose et le retrait d'un dispositif vaginal ainsi qu'une injection intramusculaire (chaque intervention durant moins d'une minute à chaque fois). Chacune des collectes d'ovocytes nécessite une succession d'interventions sur les animaux : ponction ovarienne (15 minutes) et pose d'un dispositif vaginal (moins d'une minute) suivi 2 jours plus tard d'un traitement de superovulation (5 injections intramusculaires à 12 heures d'intervalle; chaque injection durant moins d'une minute à chaque fois) et enfin ponction ovarienne multiple sous contrôle échographique (30 minutes) avec changement de dispositif vaginal (moins d'une minute). Les ponctions ovariennes seront systèmatiquement effectuées sur animaux vigiles anesthésiés.
Impact sur les animaux
Du fait des injections intramusculaires liées aux traitements de superovulation, un hématome peut apparaitre au niveau du site d’injection. Afin de limiter ces risques, les injections seront réalisés alternativement de chaque côté de l'encolure. De plus, les différentes interventions et contentions prévues dans le projet peuvent engendrer un stress ponctuel chez les animaux. Néanmoins, du fait de la répétition d'actes induisant des nuisances légères et en l'absence de données objectives sur le sujet, la procédure expérimentale est considérée en degré de sévérité modérée dans ce projet.
Devenir
Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.
Remplacement
Avant de passer à l’utilisation de l’animal, les méthodes de détection de l’aneuploïdie ont d’abord été développées et validées sur embryons produits in vitro à partir d’ovaires prélevés post-mortem en abattoir. Néanmoins, compte-tenu des différences de qualité ovocytaire avec le modèle de prélèvement sur animaux vigiles et de la volonté d’étudier l’impact de la répétition des sessions de production sur le taux d’aneuploïdies des embryons, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, la production d’embryons in vitro après ponction folliculaire sur animaux vigiles représente le protocole principalement utilisé par les professionnels de la filière. Le développement méthodologique effectué doit donc nécessairement être validé en conditions de production réelles avant d’être mis en œuvre en routine.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre d’embryons à produire pour étudier le taux d’aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) des embryons selon les facteurs étudiés (protocole de production des embryons, taureau utilisé pour la fécondation, rang de collecte des ovocytes) et en tenant compte des impératifs pratiques imposés par le protocole de production (nombre de femelles traitées par jour et intervalle de temps entre les sessions). Ainsi, l’utilisation de 12 génisses permet de limiter le nombre d’intervention sur chaque animal avec 12 ponctions ovocytaires par individu permettant la production de 400 embryons sur l'ensemble du projet. Ces effectifs sont à priori nécessaires pour mettre en évidence, s'ils existent, les effets du taureau (présumés faibles), du protocole de production d’embryons (présumés importants) et du rang d’OPU (inconnus; aucune donnée bibliographique n'étant disponible sur le sujet) avec les exigences statistiques fixées (risque de 5% de conclure que l'effet existe alors qu'il n'existe pas; risque de 20% de conclure que l'effet n'existe pas alors qu'il existe).
Raffinement
L’étude est mise en place sur 12 génisses qui seront hébergées dans une stabulation libre avec aire paillée intégrale. Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales, enrichissement de milieux avec différents objets,...). Afin de limiter les risques d’hématomes, au niveau du site d’injection IM du traitement de superovulation, nous alternerons le lieu et le coté des injections. De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement aux ponctions ovocytaires. Enfin, dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention, lors de la phase d’acclimatation ainsi que pour les collectes d'ovocytes.
Choix des espèces
Compte tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon sur le terrain. Afin de produire les embryons du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères et âgées de 14 à 18 mois. Le modèle génisse est représentatif de la population de donneuses d’embryons en France et à l’étranger. De plus, il a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….).