Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Production d’ovocytes de xenopus laevis par injection d’hormone pour la réalisation de fécondation in vitro.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Fournir des ovocytes et des œufs fécondés à d'autres équipes de recherche : 100 femelles xénopes sont utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisées d'une année sur l'autre. Chaque ponte suppose deux injections d'hormone dans le sac lymphatique dorsal, la femelle étant tenue en contention hors de l'eau et les yeux couverts d'un papier humidifié, puis massée une trentaine de secondes le lendemain pour récupérer les ovocytes en un seul lot. Le sperme servant à la fécondation in vitro est prélevé sur des mâles, dont le RNT ne donne ni l'effectif ni le devenir. Le porteur prévoit qu'au maximum 20 femelles atteignant un point limite, gonflement par œdème, prostration, nage anormale ou lésions cutanées, seront tuées par surdose de tricaïne.
Objectifs
La plateforme constitue une structure d’appui à la recherche qui a pour mission de fournir des ovocytes à la comunauté des chercheurs utilisant le modèle xénope dans les domaines de la biologie du développement et des neurosciences. L’obtention des ovocytes nécessite des injections d'hormones chez la femelle. Ces hormones stimulent la ponte et permettent d'obtenir un grand nombre d'oeufs. Les œufs obtenus seront ensuite fécondés de manière in vitro avec du sperme prélevé sur des mâles afin de synchroniser le développement de l’ensemble des embryons.
Bénéfices attendus
La structure d’appui à la recherche que nous constituons a pour mission de fournir des œufs fécondés ou non à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes. Les œufs non fécondés pourront être utilisés pour les expérimentations d’expression de canaux ioniques, canaux assurant le transport des ions dans les cellules, notamment, afin de mieux comprendre leur mécanisme de fonctionnement et plus spécifiquement l’impact de molécules pharmaceutiques sur leur régulation. Les œufs fécondés, du fait de leur transparence et de leur facilité d’accès (développement externes), sont un outils puissant pour comprendre les mécanismes du développement embryonnaire, et l’impact de mutations ou de molécules sur celui-ci.
Procédures
Les femelles sont soumises à des injections d’hormone (à 2 reprise pour une ponte), avec un total de 1 ponte par an. Ces injections sont réalisées dans le sac lymphatique dorsal en sous cutané. Les injections sont réalisées sur des animaux pris en contention et leurs yeux sont couverts avec un papier absorbant humidifié. Les injections sont très rapides (moins de 10 secondes), peu douloureuses (peu de volume injecté et aiguilles de petit diamètre avec un geste maîtrisé). Pour chaque ponte, les femelles sont mises par deux pendant 24h maximum dans des bacs rempli d'eau mais hors du système. le lendemain de la deuxième injection, les femelles sont doucement massées pendant environ 30 secondes pour récuperer les ovocytes en un seul lot.
Impact sur les animaux
La contention et la sortie de l’eau peuvent entrainer un stress chez le xénope, il peut également y avoir une légère douleur provoquée par les deux injections en sous cutanés.
Devenir
Les femelles xénopes issues de cette procédure pourront être réutilisées dans un autre projet ou à des fins d'enseignement : en effet, la durée de vie de ces animaux est très longue (jusqu'à 30 ans). Si certaines femelles atteignaient un point limite au cours des 5 ans du projet, alors elles seraient euthanasiées par surdose de tricaïne en balnéation. Comme décrit précédement nous estimons ce nombre à un maximum de 20, mais il est probable selon notre expérience que cela soit le cas pour moins de 5 femellees.
Remplacement
Les applications des recherches réalisées sur les xénopes nécessitent des observations sur un tissu ou individu entier, et la production d’œufs nécessite des géniteurs vivants. Il n’existe pas de modèle mathématique ou in vitro et pour certaines investigations, le œufs de xénope s’avère être le modèle le plus adapté (biotechnologies spécifiques disponibles uniquement chez ce modèle).
Réduction
Pour réduire le cheptel nécessaire aux différents besoins de nos utilisateurs, nous pourrons : 1) mutualiser les utilisations, par exemple synchroniser les fécondations de différentes équipes pour que cela ne nécessite qu’une seule manipulation 2) pour les injections, les femelles peuvent être stimulées plusieurs fois à raison d’une stimulation par an dans notre plateforme 3) faire correspondre les pontes demandées par les utilisateurs au renouvellement des stocks d’individus dans l’animalerie. Ainsi, le calcul des animaux utilisés va se baser sur plusieurs critères : capacité des femelles à pondre de nombreux oeufs et nécessité de stimulation de deux femelles par ponte pour assurer le nombre d’oeufs nécessaires par session (procédure optimisée sur des années d’expérience du centre de ressources biologiques xénopes). D’après les besoins expérimentaux, il est nécessaire d’obtenir 50 pontes par an. Nous aurons donc besoin de 100 femelles par an, que nous pourrons réinjecter pour stimulation les années suivantes, donc 100 femelles au total pour 5 ans. Un total donc de 100 animaux sur 5 ans
Raffinement
Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal comme ne pas isoler longtemps un animal, cacher des aliments “bonus” pour satisfaire leur instinct de recherche de nourriture, l'installation de cachette. Nous avons également mis en place une diversification au niveau de la nourriture : vers de vases, cœur de bœuf, nourriture sèche qui sont donnés de façon alternés. Les animaux sont nourris 2 fois par semaine. Les paramètres de l’eau sont vérifiés en continue au moyen de sondes pour le pH et la conductivité et une fois tous les 15 jours pour les nitrates/nitrites/ammonuim/dureté ou plus si modifiaction de comportement des animaux, en particulier mues plus importante. La température est de 19 degrés et la lumière dans la pièce d’hébergement est tamisée et suit un rythme 12h de jour et 12h de nuit. Lors des procédures, en cas de comportement anormal, perte de poids rapide ou progressive d’au moins vingt pour cent, ou au contraire de gonflement suite à apparition d’un œdème, état de choc associé à de la prostration, nage anormale, lésions ou changement de couleur de la peau, le responsable du bien-être des animaux fait intervenir le vétérinaire référent pour décider de la marche à suivre : administration d’analgésiques pour soulager la douleur, ou décision d’euthanasie si l’état ne s’améliore pas au bout de 4 jours.
Choix des espèces
Le xénope est un organisme modèle de choix pour l’étude des processus biologiques. Il a par exemple contribué de manière déterminante à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement embryonnaire. Il fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Par ailleurs, pour l’étude fonctionnelle de canaux ioniques, de récepteurs ou transporteurs, le modèle xénope est très intéressant car les ovocytes sont capables d’exprimer de nombreuses protéines qu’il est ensuite aisé de caractériser grâce, entre autre, à des méthodes d’électrophysiologie. Outre ces caractéristiques, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Pour pouvoir obtenir des pontes, les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés de 2 à 15 ans environ.
Analyse des anomalies de cellules du cerveau dans un modèle de lésions cérébrales induites par la naissance prématurée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Injectés d'interleukine 1 bêta pendant leurs cinq premiers jours de vie pour provoquer une inflammation cérébrale, des souriceaux peuvent en mourir dans 5 à 10 % des cas. 3 508 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de cerveau. Le projet teste un traitement donné au sevrage pour éliminer les cellules microgliales, puis évalue à 2 mois la mémoire par un test de peur qui associe une sonnerie à trois chocs électriques à la patte, et le comportement social par le choix entre un congénère inconnu et un objet. Une partie des souris subit à 45 jours une incision de la peau du crâne et une perforation de l'os pour l'injection d'un produit qui lèse le cerveau, opération qui peut entraîner, dans 10 % des cas, des infections, des troubles de la conscience persistants ou des troubles moteurs. Le porteur retient des souris blanches pour la taille des portées et les "qualités maternelles" des mères, censées limiter le stress des souriceaux injectés sans anesthésie.
Objectifs
La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection maternelle et naissance prématurée a été mis en évidence. En effet, une réaction inflammatoire chez le fœtus peut entrainer une inflammation cérébrale et par conséquent, des lésions cérébrales connues sous le nom d’encéphalopathie du prématuré. Ces lésions favorisent ensuite l’apparition de troubles du développement neurologique, en particulier les troubles du spectre autistique. Parmi les acteurs clés de l'inflammation cérébrale, on retrouve les cellules microgliales ou microglies, cellules immunitaires résidentes du cerveau. La morphologie et les fonctions des microglies sont altérées lors d’un stimulus inflammatoire précoce, conduisant notamment à des altérations moléculaires et comportementales (diminution du comportement social) caractéristiques des troubles du développement neurologique. De plus, il a été montré dans des modèles animaux associant une inflammation néonatale à une deuxième agression cérébrale, cette fois à l’âge adulte, un phénomène de sensibilisation, aggravant l’intensité de cette 2ème agression. Le remplacement spontané de ces cellules microgliales altérée par de nouvelles cellules, après leur élimination par un traitement médicamenteux (que l'on nomme recolonisation microgliale), pourrait contribuer à la correction de certaines de ces anomalies dont le rétablissement de la maturité des neurones et du comportement social. Les objectifs de cette étude sont donc d’abord de préciser les conséquences de cette inflammation précoce sur la mise en place des structures cérébrales et le comportement chez les adultes des deux sexes, de déterminer le potentiel de ce traitement quant à la correction de ces troubles neurologiques, et ensuite d’étudier le rôle des cellules microgliales dans la sensibilisation à une 2ème agression à l’âge adulte, et de déterminer le potentiel thérapeutique de la recolonisation microgliale dans ce contexte.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle souris d’inflammation précoce, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de l’élimination de cellules microgliales cérébrales altérées et leur remplacement pour traiter les troubles du développement neurologique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise. De plus, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de la stratégie de renouvellement des microglies sur l’intensité des lésions cérébrales pouvant survenir à l’âge adulte dans ce modèle de trouble du neuro développement en fonction du sexe. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise.
Procédures
Les injections réalisées sur les souriceaux d’une molécule inflammatoire connue, l'interleukine-1beta (IL-1β), durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Le traitement testé sera ensuite administré dans l’alimentation au sevrage des animaux à la troisième semaine de vie et pendant 3 semaines. Les animaux seront soumis à deux tests afin d’évaluer leur mémoire et leur comportement social à 2 mois. Pour la mémoire, les animaux recevront un léger choc électrique suite à une sonnerie à 3 reprises. Deux jours plus tard, ils seront placés dans cet environnement et leur comportement de peur lors du retentissement de cette sonnerie, se traduisant par une immobilisation de l’animal, sera évalué. En termes de comportement social, les souris auront le choix d’interagir avec un nouvel animal ou avec un objet, une préférence pour l’interaction avec l’animal est attendue. L’interaction avec le nouvel animal devrait susciter l’intérêt et constituera le critère d’évaluation (reniflements, etc.). Des animaux seront aussi soumis, à 45 jours de vie, à une chirurgie pour injection intracranienne d'un produit créant une lésion du cerveau : sous anesthésie générale, la peau du crâne est incisé, une perforation de l'os du crâne est réalisée, puis le produit en question est injecté dans le cerveau. A l’issue de la chirurgie, les animaux seront maintenus vivant 5 jours avant euthanasie pour réalisation d’analyses. Enfin, des animaux subiront une chirurgie à 60 jours afin de mesurer l’activité neuronale dans différentes zones du cerveau. Pour cela, les animaux seront endormis et un antidouleur leur sera administré. L’imagerie est ensuite effectuée. L’animal est ensuite euthanasié.
Impact sur les animaux
Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre le premier et le 5e jour de vie. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps. Concernant le traitement médicamenteux pour éliminer les cellules microgliales, il sera administré pendant 3 semaines dans le régime alimentaire ou par injection pendant 5 jours selon les résultats d’une étude préliminaire. Les effets indésirables qui pourraient survenir incluent un changement de la structure du visage et du crâne. Les tests comportementaux peuvent également induire un stress chez l’animal, en particulier le test comprenant un choc à la patte. Pour cela, nous avons déterminé les durées minimales nécessaire afin d’étudier ces comportements pour minimiser la présence de nos animaux dans des environnements qui pourraient impacter leur bien-être. La chirurgie n’induira pas de nuisances, l’animal étant endormi par anesthésie et sa douleur contrôlée par un antidouleur, il est ensuite euthanasié. Concernant les injections intracrâniennes du produit créant une lésion cérébrale, il s’agit d’une chirurgie pouvant entrainer des douleurs (incision de la peau du crâne et perforation de l'os du crâne) qui sera pris en charge par administration d'un traitement antidouleur, et dans de rares cas (10%) : - des infections du site opératoire - des troubles de la conscience persistants - des troubles moteurs. Ces complications peuvent entrainer un défaut d’hydratation et d’alimentation des animaux. Une surveillance spécifique est donc mise en place post procédure.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 42 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvements de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie l’inflammation cérébrale et l’efficacité du traitement pour la protection du cerveau en développement.
Remplacement
L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral, ses conséquences et son traitement requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance du milieu physiologique et des interactions entre les différentes cellules et organes à plusieurs stades de développement. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux est utilisé pour traiter des données statistiquement exploitables. De ce fait, il est nécessaire d’avoir n=10 animaux par groupe expérimental, avec 10% d’animaux supplémentaires dans les groupes recevant la molécule inflammatoire, compte-tenu de la mortalité probable due à l’inflammation. Une seule et même analyse sera dupliquée seulement en cas de variabilité. Les études de mises au point de nos techniques sont également indispensables et comptent le nombre minimum d'animaux. Les analyses requièrent des processus de préparation différentes, un seul et même prélèvement ne peut donc pas servir pour plusieurs analyses.
Raffinement
Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles souris blanches ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal sans nécessité d’anesthésie. Après le sevrage les animaux seront hébergés avec un maximum de 6 animaux par cage. Pendant les 5 jours d’injection, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière pour détecter une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. À la fin de l’étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. L’administration de l’interleukine-1β permettra d’étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation et établir des stratégies neuroprotectrices. Cette inflammation au niveau du cerveau pendant les 5 premiers jours de vie permet de simuler une inflammation pendant la grossesse chez l’Homme. Suite à l’inflammation, les cellules altérées dans le cerveau seront éliminées par un traitement chez les souris avant l’adolescence et remplacées spontanément par des nouvelles cellules. La correction des troubles structuraux et comportementaux sera ensuite étudiée à l’âge adulte (2 mois). En plus d’une connaissance bien établie sur le développement neurologique chez la souris, les souris blanches présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que le nombre de souriceaux par portée, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère.
Effets des hormones thyroïdiennes chez Proteus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
48 protées, amphibiens cavernicoles qui vivent plus de quatre-vingts ans sans jamais se métamorphoser, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis remis en élevage avec leurs congénères après cicatrisation. Chaque animal est baigné six heures dans des hormones thyroïdiennes, puis un fragment de peau lui est coupé au bistouri, sous anesthésie, à l'extrémité de la queue. D'autres sont enfermés dans un récipient hermétique le temps que leur consommation d'oxygène soit mesurée. La plaie met plusieurs semaines à cicatriser et plusieurs mois à se régénérer, et le porteur conclut qu'aucune culture de cellules ne remplacerait cette espèce, trop singulière biologiquement et phylogénétiquement.
Objectifs
L'objectif est d'apporter des connaissances nouvelles concernant la biologie de l'amphibien Protée (Proteus anguinus) cavernicole obligatoire. C'est un animal remarquable sur plusieurs points : contrairement à l'immense majorité des amphibiens, il n’entreprend jamais de métamorphose qui permet de passer de la forme larvaire au stade adulte (c’est comme si il restait bloqué au stade têtard), et atteint par contre une longévité hors du commun (plus de 80 ans). Les hormones produites par les glandes thyroïdiennes sont cruciales dans le déclenchement de la métamorphose et le contrôle de l'activité métabolique (ensemble des transformations chimiques et biologiques qui s'accomplissent dans l'organisme) qui peut jouer par ailleurs sur la longévité (en théorie plus le métabolisme est lent, plus la longévité est importante). Le projet consiste donc ici à mesurer la réponse aux hormones thyroïdiennes par deux types de mesures complémentaires : d'une part quels gènes sont exprimés (dite réponse transcriptionnelle), et d'autre part les variations d'activité métabolique. Les variations d'expression des gènes seront mesurées sur un tissu connu pour répondre très fortement aux hormones thyroïdiennes chez les autres espèces d'amphibiens : la nageoire présente au niveau de la queue. L'activité métabolique sera mesurée dans une enceinte équipée d'un capteur à oxygène permettant de mesurer la consommation de l'oxygène par l'individu lors de sa respiration.
Bénéfices attendus
Le projet vise à établir clairement si le Protée est sensible ou non aux hormones thyroïdiennes. Si on ne s’attend pas à une réponse en termes de déclenchement de la métamorphose chez cette espèce d’amphibien chez qui ce processus ne se déroule jamais, on pourrait mesurer cependant des changements au niveau de l’expression de ses gènes et au niveau métabolique, qui pourrait expliquer en partie le ralentissement de son développement, de son activité basale et son extrême longévité, en réponse adaptative à la vie en milieu souterrain.
Procédures
Une première procédure consiste à traiter les animaux sont par un bain d’hormones thyroïdiennes pendant 6 heures. Un prélèvement de peau à l’extrémité de la queue est pratiqué sous anesthésie générale par coupe au bistouri. Après le prélèvement, on coagule la plaie, et on applique localement un anti-douleur et un désinfectant. Les animaux sont remis dans de l'eau désinfectée jusqu'au réveil. Au réveil, ils sont baignés dans une solution antiseptique, puis remis en élevage jusqu’à complète cicatrisation. Une autre procédure consiste à placer les animaux dans un récipient fermé hermétiquement rempli d’eau très oxygénée à température optimale. Leur consommation en oxygène sera suivie pendant quelques heures à l’obscurité et au calme. La durée de la mesure pourra variée en fonction de la vitesse de consommation de l’oxygène qui dépend de la masse de l’individu, mais pour se donner une marge de sécurité, l’expérience sera arrêtée si la concentration en oxygène descend à un seuil fixé très supérieur à la condition susceptible de provoquer des difficultés respiratoires. Ces mêmes individus seront ultérieurement (plusieurs semaines après) traités aux hormones thyroïdiennes, puis la mesure sera répétée et comparer à la première. Ce même protocole sera réalisé avec des individus différentes de ceux qui auront subi un prélèvement de peau.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de peau au niveau de la nageoire de la queue qui est très fine à son extrémité occasionnera une légère blessure amenée à se cicatriser lentement sur plusieurs semaines dans des conditions optimales (température de 12°C, eau à saturation en oxygène et dépourvue de pathogènes, alimentation régulière, obscurité constante, sans nuisance sonore). Puis, le tissu devrait se régénérer également très lentement sur plusieurs mois. En cas de problème de cicatrisation et/ou d’infection, l’animal recevra un traitement local d’analgésique et d’antiseptique. En cas de persistance d’une infection jusqu’à une nécrose associée à une souffrance (refus de s’alimenter, absence de réaction, posture anormale) qui ne laisse pas de doute sur l’évolution défavorable de la santé de l’animal, celui-ci sera euthanasié par surdose d’anesthésique. Après cicatrisation, l’animal sera remis en élevage avec ses congénères. Il ne sera pas utilisé dans une autre procédure.
Devenir
Tous les animaux seront remis en élevage avec leurs congénères après cicatrisation.
Remplacement
Il s’agit de recherche fondamentale visant à étudier les effets des hormones thyroïdiennes sur un organisme tout à fait particulier qui semble rester tout sa vie avec des caractères larvaires, et qui plus est cavernicole obligatoire (le seul d’Europe) et à longévité remarquable (plus de 80 ans). Les effets sont attendus chez l'individu dans sa globalité (réactions de nombreux tissus) aux niveaux métaboliques et de l’expression de gènes, ce qui ne peut être abordé par des alternatives faisant appel à des cultures d’organes ou de cellules isolées ou un chez un autre modèle du fait de la spécificité de l’espèce considérée aux niveaux biologique, écologique, phylogénétique (relation de parenté entre les espèces en fonction de leur similitude génétique).
Réduction
Nous avons choisi de limiter les interventions à une seule biopsie par individu. Le nombre d’animaux prévu pour subir le prélèvement est réduit à 3 individus par lot (3 juvéniles non traités, 3 autres juvéniles traités aux hormones thyroïdiennes, 3 femelles non traitées, 3 autres femelles traitées aux hormones thyroïdiennes, 3 mâles non traités, 3 autres mâles traités aux hormones thyroïdiennes), ce chiffre de 3 étant le standard pour les études portant sur l’expression et la régulation des gènes. En outre, ce qui est recherché ici, ce sont uniquement des réponses contrastées, entre les stades juvénile et adulte d’une part, et entre les sexes femelle et mâle d’autre part.
Raffinement
Les étapes de la procédure seront pratiquées en laboratoire en conditions optimales pour l’espèce c’est-à-dire dans une eau osmosée stérilisée, à température contrôlée (12°C), à saturation d’oxygène et au calme à l’obscurité constante, jusqu'à complète cicatrisation qui devrait durer plusieurs semaines. Un abri en verre facilement nettoyable et stérilisable sera proposé à ces animaux qui apprécient de se réfugier dans les anfractuosités.
Choix des espèces
Le Protée est un amphibien qui ne se métamorphose jamais c’est-à-dire qu’il semble bloqué dans son développement au stade larvaire, caractéristique longtemps interprétée comme un défaut d'activité de la glande thyroïde (ou du moins atténuée). Il dispose pourtant d'une glande thyroïde qui mature graduellement. Les traitements aux hormones thyroïdiennes sont restés sans effets apparents sur les tissus habituellement cibles, fortement modifiés lors de la métamorphose chez les autres amphibiens (disparition des branchies et développement d’un poumon, modification de la peau, du squelette, du système digestif etc.). Les approches moléculaires promettent d'être beaucoup plus sensibles et résolutives pour mettre en évidence des effets sur la régulation des gènes et le métabolisme. En outre, c’est un animal européen disponible en captivité, en environnement contrôlé, sans besoin de prélèvement in natura. L'élevage a permis de décrire le cycle de développement inconnu en nature, et de démontrer l'absence de métamorphose à maturité sexuelle (15 ans, âge maximal pour l'instant en captivité 52 ans, longévité estimée à plus de 80 ans). L’obtention de transcriptomes c’est-à-dire de l’ensemble des gènes exprimés chez des juvéniles et adultes des deux sexes vise à déterminer un transcriptome de référence pré et post maturité sexuelle chez cette espèce qui semble pourtant bloquée tout au long de sa vie dans son développement au stade larvaire.
Génération de lignées de souris transgéniques par des techniques de transgénèse et de reproduction assistée
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système urogénital
Produire des lignées de souris transgéniques, importées de banques internationales ou créées sur place par CRISPR-Cas9 : 2 185 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 450 d'entre elles et modéré pour les 735 autres. Des femelles reçoivent deux injections hormonales à 48 heures d'intervalle pour être superovulées, d'autres sont opérées sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes pour qu'on leur réimplante des embryons dans l'utérus, et des mâles sont vasectomisés par section des canaux qui transportent les spermatozoïdes. Le porteur attend des douleurs après l'opération abdominale et des complications de cicatrisation, infection, gonflement ou ouverture de la plaie. Les femelles superovulées sont tuées pour recueillir leurs embryons, les receveuses après gestation et allaitement faute d'appareil reproducteur intact, et les mâles vasectomisés lorsque leur capacité d'accouplement est jugée nulle, constatée après huit accouplements sans résultat.
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste - À introduire au sein de notre animalerie des lignées de souris transgéniques déjà existantes dans des laboratoires extérieurs ou dans des banques internationales, par des techniques de reproduction assistée (ART). - En cas d’indisponibilité de ces modèles, créer de nouvelles lignées de souris transgéniques par des techniques de transgénèse notamment en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 , prix Nobel 2020
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour tester les concepts permettant de développer de futures thérapies innovantes.
Procédures
Certaines femelles seront injectées 2 fois à 48H d’intervalle. Le geste ne dure que quelques secondes. D’autres femelles seront anesthésiées en vue d’être opérées pour une réimplantation d’embryons dans la cavité utérine (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes) Enfin, des mâles seront anesthésiés avant d’être opérés. L’opération consiste à couper les canaux qui transportent les spermatozoïdes (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues après les injections sont des douleurs liées à la piqûre elle-même. Les femelles réimplantées avec les embryons ainsi que les mâles vasectomisés subissent une chirurgie. Une douleur est attendue à la suite de l’opération abdominale. Aussi la cicatrisation peut rencontrer certains problèmes : infection, gonflement, ouverture de la plaie
Devenir
Il est nécessaire de mettre à mort les femelles superovulées pour recueillir les embryons à une cellule. Les mâles vasectomisés sont utilisés pour leur capacité d’accouplement. Ils sont mis à mort lorsque cette capacité est nulle, établie après 8 accouplements sans femelle accouplée. Nous transférons des embryons chez des femelles receveuses en effectuant une incision au niveau de l’appareil reproducteur. Ces souris ne présentent donc pas d’appareil reproducteur intact pour pouvoir être réutilisées pour une deuxième expérience. Elles sont mises à mort après avoir mené à terme leur gestation et allaitement
Remplacement
En amont du projet, les chercheurs effectuent systématiquement des analyses préalables in-vitro quand cela est possible (culture de cellules, organoïdes…). Cependant, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Nous favoriserons l'importation de modèles transgéniques déjà répertoriés et caractérisés dans des bases de données. Cependant, si le modèle n'est pas disponible, nous créerons un modèle innovant par les approches de transgénèse ou de FIV
Réduction
Nous avons optimisé nos procédures pour générer des modèles innovants de souris génétiquement modifiées. Nous associons la technologie CRISPR/Cas9 (Prix Nobel de chimie 2020) à la technologie d’électroporation d’embryons pour le transfert de matériel génétique dans le noyau des embryons à une cellule. De nombreuses améliorations ont été apportées : • Optimisation des outils CRISPR/Cas9 grâce à des analyse in-silico • Choix des souches de femelles receveuses les plus adaptées pour recevoir ces embryons et mener à bien les gestations et les allaitements. Ces optimisations nous ont permis de diminuer d’un facteur 2 le nombre de souris donneuses et receveuses nécessaires à la création d’un modèle génétiquement modifié Nous avons également développé la technique de Fécondation In-Vitro (FIV), permettant la production de cohortes d'animaux de même âge tout en diminuant fortement le nombre d’animaux utilisé. Les approches de transgénèse et de reproduction assistée n’utilisent pas d’approche statistique.
Raffinement
L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale, par ailleurs des analgésiques permettent de prendre en charge la douleur liée à ces chirurgies. Un fluide réhydratant chauffé à 37°C est systématiquement injecté en fin de chirurgie afin d’éviter des problèmes de déshydration et permettre un réveil de qualité. Les souris opérées sont placées sur un tapis chauffant et reçoivent de la nourriture riche en graisses (9.9%) ainsi que des graines de tournesol disposées au fond de la cage. Cette disposition leur permet de se nourrir sans avoir à se mettre sur leurs pattes arrière et tirer sur leurs cicatrices. Les animaux seront surveillés pendant les 2 jours suivant l’opération pour vérifier que la cicatrisation se passe bien Il est extrêmement rare d’observer des complications dans ce types d’expériences. Néanmoins, la grille de score permettra l’arrêt l’expérience en cas d’observation d’une souffrance chez l’animal
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée - superovulation efficace et embryons faciles à injecter Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. Les femelles sont utilisées jusqu'à l'âge de 6 mois, tandis que les mâles sont utilisés jusqu'à l'âge de 12 mois.
Caractérisation des déficits sensoriels, cognitifs et émotionnels en réponse à des challenges inflammatoires en période prénatale, dans un modèle de souris déficientes en peptide vasoactif intestinal (VIP)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Quarante-cinq minutes de contention, deux fois par jour, trois jours de suite, sur des femelles en gestation : 8 311 souris vont être utilisées, dont 3 311 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 1 008 femelles gestantes reçoivent en plus des injections deux fois par jour pendant trois jours, 1 176 animaux subissent une chirurgie, 980 des prises de sang par incision du bout de la queue, et 1 960 passent des tests de mémoire, de sociabilité, d'anxiété, de résilience et de perception de la douleur. Les mères sont tuées pour prélever placentas et embryons au douzième jour de gestation, les autres pour prélever le cerveau, le porteur indiquant que les animaux épargnés en période prénatale pourront ensuite servir de reproducteurs à la colonie. Il décrit lui-même la lignée déficiente en VIP comme portant un "phénotype dommageable" : rythmes perturbés, immunité faible, troubles digestifs, hypersensibilité à la douleur et cerveau plus petit.
Objectifs
Le stress psychosocial, lorsqu’il survient pendant la grossesse, est connu pour impacter négativement le développement du bébé. Il fait partie des facteurs de risques liés à la prématurité, aux troubles placentaires, et aux troubles du neurodéveloppement (TND). Ce type de stress s’accompagne généralement d’une réponse pro-inflammatoire de l’organisme, or l’inflammation chez la mère est de plus en plus proposée comme une des causes du développement de TND. Notre équipe travaille actuellement sur les stress survenant autour de la naissance et leur impact cérébral chez le rongeur. Nous nous intéressons aussi à un facteur endogène spécifique, le peptide vasoactif intestinal (VIP), qui est impliqué non seulement dans la croissance du cerveau embryonnaire mais joue également un rôle de médiateur anti-inflammatoire Nous souhaitons étudier le rôle joué par le VIP dans le développement du cerveau, dans un contexte d’inflammation maternelle modélisée par un stress psychosocial appliqué pendant la gestation. En utilisant des souris déficientes en VIP, nous voulons voir si elles présentent une vulnérabilité accrue aux effets du stress prénatal, et si à l’inverse l’ajout de VIP permet une protection du cerveau fœtal face à ce type de challenge inflammatoire. Dans un premier temps, nous allons étudier les conséquences de la déficience en VIP et du stress prénatal chez la progéniture au niveau émotionnel, cognitif, sensoriel, placentaire et de l’immunité cérébrale (microglie). Dans un deuxième temps, nous allons regarder avec plus de précisions les interactions inflammatoires mises en jeu.
Bénéfices attendus
De nombreux stresseurs, psychosociaux, inflammatoires ou autres, peuvent toucher les femmes enceintes, et on sait aujourd’hui que les conséquences peuvent être néfastes pour le développement du bébé. Les troubles engendrés et leurs origines précises peuvent être difficiles à discerner car bien souvent, ces troubles se manifestent plus tard dans l’enfance (c’est le cas des troubles du comportement). Nos travaux combinant le VIP placentaire et le stress gestationnel devraient nous permettre d’enrichir la connaissance sur le lien de cause à effet précis entre stress maternel, placenta et développement cérébral. Ces recherches s’inscrivent dans le cadre de l’hypothèse générale de l’origine développementale de la santé et des maladies à l’âge adulte (DOHaD), et plus particulièrement dans le contexte du caractère additif des évènements délétères tout au long de la vie (théorie du hit-multiple). Notre attention se porte sur le rôle pivot du VIP, qui est présent en quantité non négligeable dans l’embryon et le placenta et dont les effets sur le système nerveux et immunitaire sont bien connus. Ainsi notre hypothèse est que si le VIP agit bel et bien comme un neuroprotecteur et un immunomodulateur, ces résultats peuvent aider à dégager de nouvelles pistes de recherche sur l’étiologie de troubles neurodéveloppementaux, souvent d’origine complexe et multifactorielle. Ils peuvent aussi sur le long terme inspirer de nouvelles pistes thérapeutiques pour la prise en charge des femmes enceintes exposées à des challenges inflammatoires primaires (stress, infection) ou secondaires (conséquences de conduite à risques). Nos études ciblent à la fois l’apport maternel (exogène) et l’apport embryonnaire (endogène, tout le long de la vie) de VIP. Ainsi, nous pouvons imaginer établir avec plus de précision la fenêtre thérapeutique à cibler pour protéger au mieux l’embryon, et/ou utiliser les niveaux de VIP circulants comme marqueur de diagnostic précoce.
Procédures
Stress de contention : animal vigile, 161 femelles, durée de 45 min 2x/jour pendant 3 jours Injections prénatales : animal vigile, 1008 femelles, 2x/jour pendant 3 jours Injections prénatales + stress de contention : animal vigile, 322 femelles, durée 45 min 2x/jour pendant 3 jours Tests comportementaux (pour étudier mémoire, sociabilité, anxiété, résilience, perception de la douleur) : animal vigile, 1960 animaux, max 1 test/jour 5 jours sur 7 pendant 6 semaines Prise de sang : animal vigile avec antalgique, 980 animaux, 2x à une semaine d’intervalle Chirurgie : animal anesthésié, 1176 animaux, une seule fois Biopsie de queue : animal vigile (âgé de 5-10 jours), tous les animaux, 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
L’objectif de notre projet est d’induire un stress chez la mère gestante. Il est possible qu’à l’issue des 3 jours de stress, les femelles gestantes conservent un état de stress chronique. La progéniture soumise au stress prénatal est également susceptible de présenter une anxiété accrue, c’est un paramètre que nous avons prévu de mesurer. Les injections chez les mères gestantes ne mettent pas la grossesse en danger mais sont susceptibles de causer une inflammation du site d’injection ou une infection. Ce paramètre sera surveillé. L’injection de corticostérone peut induire l’apparition de comportements anxio-dépressifs chez la mère gestante similaires à ceux causés par un stress chronique. L’injection d’IL-1beta est susceptible de provoquer des perturbations cérébrales chez les petits mais pas de dommage spécifique pour la mère. Le neuropeptide VIP étant connu pour ses fonctions cardiovasculaires (action rapide) et immunitaires (action lente), nous serons particulièrement attentifs au comportement des mères gestantes (rythme cardiaque et respiration accélérés) au cours des 2 premières heures après injection. Notre lignée d’animaux déficients en VIP possède un phénotype dommageable, caractérisé par une perturbation des rythmes, des capacités reproductives diminuées, une faible immunité, des troubles digestifs, une hypersensibilité à la douleur et un cerveau plus petit. Les tests de perception de la douleur prévus sont court et n’induisent qu’un stress mineur chez l’animal. Les tests comportementaux induisent un changement d’environnement pour les animaux et donc un stress léger. Le test de résilience implique le déclenchement d’un stress pour mesurer cette capacité. Les prises de sang avant et après le stress sont réalisées en pratiquant une incision de l’extrémité de la queue qui peut engendrer de la douleur. La biopsie de queue induit une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélever leur cerveau ou prélever les placentas et les embryons. Ces différents tissus serviront à des analyses ultérieures alimentant notre projet.
Remplacement
Le stress mobilise le cerveau et les organes périphériques. Un tel système ne peut être modélisé qu’avec un organisme entier. De plus, nous souhaitons étudier des perturbations du développement embryonnaire, et il n’existe pas encore de système alternatif capable de modéliser une gestation et de prendre en compte toutes les interactions mère-embryon qui en résultent. Enfin, afin d’appliquer au mieux nos résultats à l’humain, il est nécessaire d’utiliser un modèle de mammifère avec un placenta, un système nerveux et un système immunitaire proches des nôtres. C’est le cas de nos souris.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux et de groupes du projet, certaines injections seront communes entre les cohortes utilisées au cours de l’étude. Un maximum de tests comportementaux seront effectués sur les mêmes animaux, tant que leur accumulation n’engendre pas de souffrance ou d’inconfort chez ces individus. Les mères gestantes mises à mort pour prélever des placentas et des embryons seront les mêmes que celles utilisées pour les prélèvements sanguins par exsanguination. Elles pourront également avoir été utilisées pour générer des petits au préalable. Les animaux n’ayant pas subi de procédure en période prénatale pourront être réutilisés comme reproducteurs pour la colonie à la fin des tests comportementaux. Si certains tests ne montrent aucun impact du stress prénatal de contention couplé à la déficience en VIP, ils ne seront pas reconduits. Si certains tests ne montrent aucune différence sexe-spécifique, les mâles et les femelles seront mélangés et le nombre d’animaux requis par groupe pourra être diminué lors des tests suivants. Il en va de même si certains sous-groupes se comportent de la même manière, les individus seront mélangés pour la suite des tests afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, certains animaux seront réutilisés dans plusieurs tests. Par ailleurs nous nous efforcerons toujours de prélever un maximum d’échantillons biologiques aux animaux mis à mort (placenta, embryons, sang embryonnaire et maternel, cerveaux et sang chez les animaux adultes) afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés pour constituer nos banques de matériel biologique.
Raffinement
Dans toutes les procédures, nous mettrons en œuvre les mesures nécessaires pour assurer des conditions expérimentales en adéquation avec le bien-être animal, lorsqu'elles ne vont pas à l'encontre de ce que nous souhaitons étudier (par ex. le stress). Pour les tests de comportement, les animaux sont habitués à la pièce et l'expérimentateur, et des seuils limites sont définis (tests stoppés si signes de détresse ou de douleur). Les prises de sang et les chirurgies sont accompagnées de l'administration d'anti-douleur, et d'anesthésiants pour les dernières. Les animaux sont hébergés en groupe (sauf exceptions) dans des cages à environnement enrichi (de quoi faire un nid et ronger pour que l’animal exprime son comportement naturel). Les animaux génétiquement modifiés sont observés au moins deux fois par semaine par les expérimentateurs et les zootechniciens, tout en veillant à les déranger le moins possible, plus particulièrement en cas de gestation. Ils sont pesés toutes les deux semaines. Un suivi renforcé est mis en place dans les jours suivants les injections et les prises de sang. Au moindre signe anormal, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et les mesures de soin préconisées seront mises en place.
Choix des espèces
Pour étudier les troubles du neurodéveloppement (TND), nous avons besoin d’une espèce avec un cerveau aux structures proches du cerveau humain. Il faut aussi un modèle avec une gestation de type mammifère. Pour travailler sur le placenta nous avons besoin d’un rongeur ou d’un lagomorphe (lapin) ou d’un primate. On a déjà un modèle transgénique de souris, et la souris correspond à tous ces critères. Elle est fréquemment utilisée pour modéliser des TND, et les modèles transgéniques (déficience en VIP) et de stress sont assez bien caractérisés et semblent pertinents pour l’appliquer à l’humain. La souris exprime également une grande variété de comportements comparables aux nôtres (sociabilité, douleur, anxiété, mémoire). Les animaux utilisés lors des tests comportementaux seront âgés d’au moins 30 jours pour les reproducteurs, afin de s’assurer de leur fertilité, et de 60 jours pour les autres, âge auquel le cerveau est entièrement développé et mature. Le stress prénatal appliqué à la mère ainsi que les différentes injections seront réalisés au 9e, 10e et 11e jours de gestation, afin de cibler la période critique pour la formation des neurones. Les embryons seront prélevés au 12e jour de gestation.
Analyses protéomiques dans un modèle de syndrome neurodéveloppemental chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du tissu à analyser, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Issues de lignées transgéniques, elles sont tatouées et biopsiées au bout de la queue vers 7 à 10 jours, passent à l'adolescence ou à l'âge adulte des tests comportementaux que le porteur ne nomme pas, puis reçoivent une injection pour la mise à mort. Le porteur attend des données "cruciales" sur les mécanismes de l'autisme, et un projet qui "pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques". Le remplacement tient en une phrase : l'approche comportementale, écrit-il, n'est possible qu'à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme sont des troubles du neurodéveloppement qui touchent 1 à 2% de la population. Ils sont caractérisés, entre autres, par des altérations dans le développement des capacités cognitives, de communication et d'interaction sociales. Ils constituent un véritable handicap pour le patient et malheureusement, à ce jour, il n’existe aucun traitement curatif car les causes de cette pathologie restent encore mal connues. Les progrès récents ont permis d’identifier plus de 200 gènes de risque liés aux troubles du spectre de l’autisme. Notre travail vise à identifier, dans le cerveau, les mécanismes de régulation qui sont à l’origine de ces troubles. Les protéines identifiées pourront être ciblés à l’avenir pour le développement de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter des données cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans les troubles du spectre de l’autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
Injections intra-péritonéales et sous-cutanées (1 fois pour mis à mort). Identification par tatouage, biopsie de l’extrémité de la queue: stress et douleur légère de courte durée (1 fois, durée 30 seconds)
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux utilisés peuvent induire un stress léger. Injections intra-péritonéales et sous-cutanées, identification par tatouage, biopsie de l’extrémité de la queue : stress et douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience pour le prélèvement du tissu à analyser.
Remplacement
Cette étude nécessite une approche comportementale qui n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier, nous devons donc faire appel à des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Les souris seront observées quotidiennement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques.
Choix des espèces
L’espèce souris a été choisie car ces animaux présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. De plus, les modèles transgéniques utilisés dans ce projet ont été créés uniquement chez la souris. Pour toutes maladies neurodéveloppementaux il est important de comparer des animaux adolescents avec des animaux adultes car certains symptômes se manifestent différemment. Donc, nous utiliserons des animaux au stades adolescents (4 semaines) et adultes (4 mois). L’identification des animaux sera réalisée à l'âge de 7-10 jours.
Analyse développementale des dysfonctions neurovasculaires cérébelleuses dans un modèle murin de Troubles Causés par l’Alcoolisation Fœtale (TCAF)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
De l'alcool est injecté sous la peau de souris gestantes, neuf fois entre le douzième et le vingtième jour de gestation, pour reproduire une alcoolisation fœtale. 1 921 souris, mères et petits confondus, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les souris vacillent après l'injection, l'alcoolémie étant mesurée trente minutes plus tard, et affirme qu'elles ne montrent pas de signe de souffrance au moment de l'injection. Toutes sont tuées, les mères anesthésiées puis mises à mort pour prélever les embryons, les souriceaux pour prélever leur cervelet à neuf stades de développement.
Objectifs
Les Troubles Causés par l’Alcoolisation Fœtale ou TCAF sont des troubles du neurodéveloppement liés à des consommations modérées ou discontinues d'alcool pendant la grossesse. Cette pathologie, dont la prévalence est évaluée à 1% des naissances, se traduit par l’apparition d’atteintes neurologiques chez l'enfant avec des répercussions fonctionnelles qui se révèlent progressivement avec l’âge. Dès lors, de nombreuses études visant à caractériser les anomalies du neurodéveloppement chez les enfants TCAF se sont portées sur des structures intégratives telles que le néocortex ou encore l’hippocampe. Celles-ci ont notamment révélées une tortuosité significative des vaisseaux sanguins induisant un mauvais positionnement des cellules nerveuses. Pour autant, plusieurs déficits observés chez ces enfants, tels que les troubles orthoptiques ou des défauts de motricité fine, suggèrent que le cervelet pourrait également participer aux déficits induits par une alcoolisation in utero. Les objectifs de ce projet seront donc (i) de caractériser la vascularisation et les interactions neurovasculaires au cours du développement du cervelet, puis ii) d’évaluer l’impact de l’alcoolisation in utero sur la mise en place vasculo-associée des cellules du cortex cérébelleux. A terme, nous pourrons ainsi déterminer si le cervelet participe aux déficits observés chez les enfants TCAF afin d'optimiser leur prise en charge.
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra tout d'abord d’identifier pour la première fois le mécanisme de mise en place de la vascularisation dans le cervelet murin en développement. Ainsi, nous pourrons déterminer si une migration vasculo-associée participe à la mise en place du cervelet au cours de l'embryognenèse ou lors de la période postnatale et si celle-ci est altérée en condition d'alcoolisation foetale comme déjà démontré dans le cortex cérébral et la rétine. De plus, l’implication d'un service de pédiatrie néonatale dans ce projet nous permettra d’envisager une transposition de nos résultats immunohistochimiques à l’enfant. Dès lors, une corrélation entre les altérations histologiques du cervelet et les atteintes neurodéveloppementales observées chez les enfants atteints de TCAF pourra être envisagée et la prise en charge de ces enfants pourra alors prendre en compte les déficits neurologiques de manière plus intégrée, i) en orientant la thérapeutique vers la cible vasculaire et ii) en incluant la participation du cervelet lors des traitements symptomatiques.
Procédures
Afin de mimer une alcoolisation foetale, de l’alcool sera administré par voie sous cutanée à des souris gestantes du 12ème au 20ème jour embryonnaire soit 9 injections au total Avant la procédure d'injection, les souris gestantes seront préalablement légèrement anesthésiées afin de limiter le stress. La manipulation dure environ 1 minute pour chaque injection. Ce protocole d'alcoolisation répétée par injection est décrit dans des cas d’alcoolisation maternelle. Lors des prélèvements des embyrons, les mères seront soumises à une anesthésie dans une chambre d'induction avant leur euthanasie. Lors des prélèvements des cervelets chez les souriceaux postnataux, les animaux sont également anesthésiés avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
A la suite de l’injection d’alcool chez les mères gestantes, les souris vacillent reflétant l’alcoolémie mesurée après 30 minutes comme observé chez l’humain après alcoolisation. Au cours de l’injection, les souris ne montrent pas de signe de souffrance. Les études déjà réalisées sur ce modèle murin TCAF n'ont pas démontré d'augmentation de fausses couches ou de mortalité précoce chez les embryons/souriceaux.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans cette étude sera euthanasié à la fin de l'expérimentation soit du fait du prélèvement d'organes ou d'embryons, soit du fait qu'ils auront reçu des injections journalières pendant 9 jours (de NaCl 0.9% ou d'alcool) et qu'ils ne pourront donc pas être réutilisés pour d'autres expérimentations (mères gestantes).
Remplacement
Certains déficits observés chez les enfants TCAF, tels que les troubles cognitifs, orthoptiques ou des défauts de contrôle de la motricité fine laissent penser que le cervelet pourrait participer aux déficits induits par une alcoolisation foetale. A l'appui de cette hypothèse, les images d'IRM montrent que ces enfants présentent un volume cérébelleux plus faible. De plus, plusieurs études réalisées sur des modèles animaux ont montré que les populations nerveuses du cervelet présentent une sensibilité importante à l'alcool. Cependant, au regard de ces travaux, il reste difficile d'évaluer l'impact d'une exposition prénatale à l'alcool sur le développement du cervelet. En effet, les modèles utilisés jusqu'alors sont soit des cultures cellulaires, ce qui ne permet pas d'obtenir un système intégré, soit des souris entre le 4ème et le 10ème jour postnatal, ce qui correspond au 3ème trimestre de gestation chez l'Homme, alors que les différents types cellulaires sont déjà présents au sein du cervelet, et ce qui implique d'étudier les effets directs de l'alcool et non l'effet d'une alcoolisation de la mère sur le développement du petit. De plus, il n'existe que peu voire pas de données sur la mise en place de la vascularisation et sur l'existence d'une migration vasculo-associée au cours du développement embryonnaire du cervelet, et, par voie de conséquence, l'impact de l'alcoolisation foetale sur ces événements précoces n'a jamais été étudié. Notre étude vise donc tout d'abord à décrire la vascularisation du cervelet chez des embryons de souris à différents âges pour déterminer si les cellules cérébelleuses utilisent les vaisseaux sanguins en tant que support de migration au cours de l'embyrogenèse. Puis, en utilisant un modèle animal TCAF, nous pourrons identifier les mécanismes impactés par une alcoolisation foetale afin de mieux appréhender la participation du cervelet aux déficits TCAF et d'adapter la prise en charge thérapeutique.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet et obtenir des résultats statistiquement interprétables à l'aide du test non paramétrique Mann-Whitney. 1. Pour la caractérisation de la vascularisation et de la migration vasculo-associée dans le cervelet au cours du développement, les âges d’intérêt ont été identifiés en s’appuyant sur la littérature afin qu'ils soient en corrélation avec les étapes clefs du neurodéveloppement cérébelleux humain. Ainsi 4 stades embryonnaires et 5 stades postnataux seront étudiés à raison de 4 animaux par stade pour obtenir une moyenne statistiquement interprétable des paramètres vasculaires et vasculo-associés. Ces 4 animaux devront être de portées différentes pour prendre en compte la variabilité inter-portée dans l'interprétation des résultats. Pour les marquages immunohistochimiques, 10 anticorps différents sont requis pour identifier l'ensemble des vaisseaux sanguins et des populations cellulaires cérébelleuses. En transparisation, les marquages immunohistochimiques sont obligatoirement réalisés sur des embryons ou cervelets postnataux entiers, ce qui nécessitera 4 animaux de portée différente par stade et par marquage. En revanche, pour l'immunohistochimie sur coupe, la taille du cervelet permettra de réaliser plusieurs marquages différents sur le même échantillon, permettant de réduire le nombre d'animaux. 2. Pour étudier l'impact d'une alcoolisation foetale sur la vascularisation et la migration vasculo-associée, il sera nécessaire de réitérer l'ensemble des marquages précédents sur des embryons « contrôle sham » dont la mère a reçu des injections de NaCl pour confronter les résultats obtenus avec les animaux « alcoolisés in utero » et éviter les biais expérimentaux liés à l'injection en elle-même. Pour les études de PCR et western blot, la taille du cervelet nécessitera un animal par condition et par technique jusqu'à l'âge de la naissance inclus. En revanche, pour les stades plus tardifs, ces 2 techniques pourront être réalisées en parallèle sur un même animal en divisant le cervelet en deux au moment du prélèvement. Enfin, pour la zymographie, un animal par condition sera nécessaire du fait de la préparation de l'échantillon.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. Ils seront maintenus dans un environnement stabilisé (température 21 ± 1 °C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux avec photopériode régulée (cycle jour/nuit 12h/12h)). Ils auront libre accès à l’eau et à la nourriture, et un enrichissement sera mis en place (tunnel en carton, demi-sphère de cellulose et lanières de papier kraft). Ils seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et leur bien-être sera surveillé après les injections d’alcool/NaCl. En cas de dépassement des points limites identifiés (signe de douleurs extérieurs indexés sur Mouse Grimace Scale, manifestations de signe de détresse ou d’infection) ou de défauts significatifs de développement, les animaux seront mis à mort comme décrit précédemment. Lors de la procédure d'alcoolisation foetale, les mères seront conservées dans leur cage d’hébergement et amenées dans la pièce d’expérimentation 1h avant les injections pour limiter tout stress de l’animal. Cette pièce est calme et isolée d'autres animaux. Les mères ayant reçu l'injection seront surveillées en temps réel pendant 45 min avant leur retour dans leur hébergement. Lors des prélèvements, les animaux en attente de l'euthanasie sont placés à l'écart de la table d'expérimentation pour éviter tout stress environnant.
Choix des espèces
La Souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes physiologiques complexes dont les mécanismes sont similaires aux mammifères. C'est le cas du développement cérébral par exemple. Or le cervelet suit les mêmes étapes de développement que le reste du cerveau avec des séquences de prolifération, migraion, différenciation et apoptose. L'utilisation de ce modèle est donc tout à fait pertinent dans cette étude. De plus, la majorité des publications antérieures relatives aux TCAF a été réalisée chez la souris. Par souci de cohérence et de vision intégrée de l'effet de l'alcoolisation foetale sur le développement nerveux, il est donc nécessaire de poursuivre avec ce modèle murin avant la transposition clinique. Les stades de développement d’intérêt ont été déterminés sur la base des événements clefs de la neurogenèse du cervelet qui sont également bien identifiés chez l'Homme. Ainsi les stades embryonnaires choisis correspondent respectivement à la naissance des cellules de Purkinje, à l’émergence des précurseurs des cellules en grains puis des cellules de Golgi, et enfin à la mise en place de la couche granulaire externe. Puis, pour les études postnatales, les trois premières semaines postnatales représentent successivement une phase de prolifération des cellules en grains dans la couche granulaire externe, le développement de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje, la mise en place du circuit cortical cérébelleux et enfin la fin du développement du cervelet chez le jeune adulte. L'alcoolisation sera réalisée uniquement chez la mère gestante mais pas directement sur le souriceau postnatal.
Étude de l’impact d’une exposition chimique aux composés organophosphorés sur l’unité neuro-vasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une perte de poids de plus de 15 % ou un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace déclenche la mise à mort. 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. La moitié d'entre elles reçoit une prothèse crânienne posée en quarante-cinq minutes, puis toutes sont intoxiquées par un composé organophosphoré et passent une à trois heures par séance sous IRM ou imagerie ultrasonore. Le porteur indique que l'intoxication peut provoquer fasciculations, mâchouillements, chute du tonus musculaire, tremblements généralisés et mort, et présente ces travaux comme une réponse à la menace des armes chimiques et aux 300 000 décès annuels par pesticides.
Objectifs
Bien que très réglementée, l’utilisation de composés organophosphorés (OPs) est courante dans l’agriculture où sont utilisés des pesticides tels que le chlorpyrifos. L’incidence d’intoxication passive, active ou accidentelle avec des pesticides OPs est associée à près de 300 000 décès annuels dans le monde pour près de 3 millions de cas d’intoxication reportés. Plus inquiétant, l’utilisation en 2017 d’armes de guerres neurotoxiques contenant des OsP (Sarin en Syrie et VX en Malaisie), démontre une menace toujours actuelle pour les populations civile et militaire. Sur le plan physiopathologique, l’intoxication aigue aux OP entraîne l’inhibition irréversible des cholinestérases augmentant la concentration d’acétylcholine dans l’ensemble de l’organisme ce qui conduit à une hyperactivité du système nerveux central (SNC) qui peut engendrer des œdèmes cérébraux, de la neurodégénérescence et des crises épileptiques voir la mort. Si le traitement d’urgence permet de stabiliser les victimes, son efficacité au niveau du SNC est limitée. De plus certaines victimes peuvent être exposées à de faibles doses d’OPs sans présenter les symptômes de la phase aigue mais présentent des déficits cognitifs à long terme. Très peu d’études se sont intéressées aux effets des faibles doses sur le système neurovasculaire. Ainsi, ce projet vise à mieux comprendre l’impact d’une intoxication aux OPs au sein de l’unité neurovasculaire (UNV) à court et moyen terme. De plus, améliorer nos connaissances sur ce domaine nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées sur la physiopathologie des intoxications aux composés organophosphorés. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Procédures
(Souris Mus musculus ; n=460) : Modèle d’intoxication - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation de l’inflammation cérébrale et de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par imagerie par résonnance magnétique (IRM) (durée : 1h/mesure). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie Doppler et functional ultrason imaging (fUS) sous anesthésie (durée : 1h/mesure). (Souris Mus musculus ; n=460 ) : Modèle d’intoxication vigile - Pose de prothèse crânienne/récupération (durée : 45min). - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie fUS vigile (durée : 1-3h/mesure).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. De plus, l’intoxication aux organophosphorés est susceptible d’induire des symptômes caractéristiques tels que : l'arrêt d’activité, des fasciculations (contractions involontaires des muscles), mâchouillements/bâillements, chute du tonus musculaire, dos vouté, tremblements généralisés allant jusqu’à la mort de l’animal.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, des approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées concernant la physiopathologie d’une intoxication aux OPs.
Réduction
Avant de procéder à une telle étude, une approche statistique a été réalisée afin de s’assurer d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. De plus, des méthodes d’études non-invasives telle que l’imagerie (IRM, fUS…) sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes (type IV. La nourriture, la boisson et la litière sont changés une fois par semaine. Néanmoins, ces changements pourront être effectués plus fréquemment si nécessaire. De plus, une maison en carton et des produits nécessaires à la nidification seront placés dans les cages des animaux. La litière et les enrichissements du milieu d'hébergement des animaux permettront de réduire leur stress et de faciliter leur thermorégulation. Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée (ex : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies diagnostiques et de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour non seulement étudier les effets de l’intoxication aux composés organophosphorés sur le SNC mais également pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 10 semaines et auront un poids compris entre 35 et 40g lors de l’intoxication. Nous choisissons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer les données existantes au laboratoire et dans la littérature, puisque le modèle d’intoxication au NIMP a été développé chez des animaux ayant un stade de développement identique.
Etude de l’impact d’une séparation maternelle néonatale sur les propriétés électrophysiologiques des neurones relais du système nociceptif spinal et supraspinal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
La moitié des ratons sont retirés de la cage de leur mère trois heures par jour, du deuxième au douzième jour après la naissance. 160 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour le prélèvement de tissus nerveux. Le protocole cherche à reproduire chez le rat les effets de la prématurité humaine, puis à enregistrer l'activité des neurones de la moelle épinière et de l'hippocampe, le porteur décrivant lui-même ce stress comme installant une anxiété chronique et des troubles durables de l'adaptation au stress. Les mères ne retournent pas à la reproduction et sont tuées après le sevrage, parce que la séparation a altéré le fonctionnement de leur système nerveux.
Objectifs
Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés (nés avant la 35ème semaine de grossesse) dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN, 3h/jour du 2ème au 12ème jour post-natal) est un stress postnatal qui a été décrit comme un modèle reflétant la prématurité humaine. De nombreux travaux ont montré que les animaux exposés à ce stress postnatal présentaient des hypersensibilités douloureuses des troubles des comportements sociaux, une modification de la perception douloureuse au niveau de la moelle épinière ainsi que des déficits cognitifs. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner notre compréhension de l’impact de la séparation maternelle néonatale sur le codage de l’information nociceptive par les structures nerveuses spinales et supraspinales. L’objectif est de caractériser les modifications fonctionnelles au niveau neuronal qui rend compte des symptômes observés.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces travaux nous permettra de mieux comprendre les phénomènes de sensibilisation nociceptive ainsi que des déficits cognitifs qui semblent se mettre en place durablement suite à des épisodes de stress non douloureux durant la période néonatale en utilisant le modèle de séparation maternelle néonatale. Nous répondrons à la question d'une origine d'un dysfonctionnement de communication nerveuse expliquant les symptômes qui façonne l’expérience douloureuse et augmente le risque de développer une neuropathologie chronique selon les études épidémiologiques sur le sujet.
Procédures
La moitié des animaux sera soumis au protocole de séparation maternelle néonatale : séparation des ratons de la cage de leur mère 3h/j du 2ème au 12ème jour post-natal.
Impact sur les animaux
La séparation maternelle neonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux (expression de symptomes d'anxiété chronique et troubles de l'adaptation au stress). Les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante avant d’éviter tout risque d’hypothermie. Le protocole de SMN est également connu pour augmenter les comportements maternels après retours de ratons dans la cage de la mère. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation maternelle altère le fonctionnement de son système nerveux, ce qui induit au niveau comportemental une anxiété accrue.
Devenir
Les enregistrements electrphysiologiques nécassitant le prélèvement de tissus nerveux, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet portant sur l’étude d’un système intégré et mature, il nous a été impossible de remplacer l’utilisation d’animaux par des tests in-vitro.
Réduction
Nous prévoyons un nombre d’animaux suffisant pour d’obtenir des résultats exploitables en termes statistiques. Le nombre d’animaux prend en compte les deux sites d’enregistrement nécessaires (moelle épinière et hippocampe) ainsi que les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests paramétriques.
Raffinement
Notre étude s'interesse à l'impact de l'environement sur les nouveaux-nés. Pour pouvoir comparer nos groupes d'animaux, il nous faut un environnement enrichi tout en étant le plus homogène possible. Ceci nous permets d'étudier uniquement l'impact de la séparation maternelle. Les animaux sont ainsi hébergés en cage collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à leur disposition de la frisure pour nid, un bâton à ronger et un tunnel. Ils sont placés en conditions de températures et hygrométrie contrôlées, en cycle jour/nuit de 12h/12h avec eau et nourriture ad libitum. Durant la séparation maternelle néonatale, les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante afin d'éviter toute hypothermie.
Choix des espèces
Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3e trimestre de gestation chez l’homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie post natales chez le rat. Nous utiliserons des rats agés de 30 et 50 jours postnataux, une période qui correspond à la phase de maturité du système nociceptif. Les précédentes études portant sur l’hypersensibilités nociceptives des animaux séparés maternels chez le rat jeune et adulte, le projet continuera sur cette ligne en faisant des enregistrements électrophysiologiques in vitro chez des animaux à un stade de développement équivalent
Effets de la pollution au cuivre sur la métamorphose du sar à tête noire, Diplodus vulgaris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
380 sars à tête noire, capturés au stade larvaire dans les zones portuaires où ils viennent grandir, sont exposés au cuivre pendant trois semaines, 360 d'entre eux répartis à quinze par aquarium de trois litres, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun passe ensuite quinze minutes dans un bassin à deux arènes, où l'on mesure une seule fois le temps qu'il passe près de congénères plutôt que près de saupes. Tous sont tués par surdosage d'anesthésique, l'arrêt des battements du cœur vérifié à la loupe binoculaire, avant les mesures de croissance, de pigmentation et d'expression de gènes. Le bénéfice annoncé est d'améliorer la protection des écosystèmes côtiers où vit cette espèce, et le porteur qualifie le recours à ces larves d'"incontournable".
Objectifs
La majorité des poissons marins ont un cycle de vie découpé en deux parties, composé d’une phase en pleine mer dîte pélagique, où les larves se dispersent et grandissent, suivie d’une phase plus sédentaire, en milieu côtier, où poissons juvéniles et adultes continuent leur croissance. La transition écologique des larves pélagiques aux juvéniles côtiers, ou recrutement larvaire, est primordiale pour le renouvellement des populations de poissons. En milieu marin, les changements climatiques et les pollutions affectent principalement les milieux côtiers où se déroule le recrutement larvaire. Dans certaines zones littorales, la baisse des stocks de poissons est plus la conséquence d’un échec du recrutement larvaire que d’une surmortalité des populations adultes mais les mécanismes biologiques à l’origine des échecs de recrutement larvaire restent méconnus. Nous avons démontré que le recrutement larvaire des poissons marins s’accompagne d’une métamorphose des larves en juvéniles, sous contrôle des hormones thyroïdiennes. Nous faisons l’hypothèse que les stress environnementaux et anthropiques peuvent agir en tant que perturbateurs endocriniens sur les larves de poissons, perturbant leur métamorphose, c’est-à-dire la mise en place des modifications physiologiques, morphologiques et comportementales nécessaires à la survie en tant que juvéniles, causant in fine un échec du recrutement larvaire. Dans un projet récent, nous avons pu révéler différentes concentrations de cuivre dans des zones portuaires de recrutement larvaire du sar à tête noire, Diplodus vulgaris. Dans ce contexte, notre objectif est d'évaluer expérimentalement la toxicité du cuivre sur le recrutement larvaire et la métamorphose de D. vulgaris, à travers des mesures de différents biomarqueurs : 1/ comportementaux (préférences visuelles, vis-à-vis de poissons de la même espèce – conspécifiques – et d’une autre espèce, la saupe Sarpa salpa), 2/ morphologiques (croissance, pigmentation), et 3/ physiologiques (expression de gènes de la métamorphose, taux d’hormones thyroïdiennes). Ce projet permettra d’identifier le potentiel de perturbateur endocrinien d’un polluant commun des zones littorales françaises (le cuivre) sur le recrutement larvaire et la métamorphose de D. vulgaris, afin d’améliorer les mesures de conservation et de protection de ces écosystèmes côtiers.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier le potentiel de perturbateur endocrinien d’un polluant commun des zones littorales françaises (le cuivre) sur le recrutement larvaire et la métamorphose de D. vulgaris, afin d’améliorer les mesures de conservation et de protection de ces écosystèmes côtiers. D. vulgaris a un fort intérêt économique (pêche récréative) et écologique (espèce représentative). Ce projet permettra également de mettre en place une corrélation entre mesures comportementales et mesures physiologiques dont l’objectif est, à terme, de se restreindre aux mesures comportementales et ainsi réduire le nombre d’échantillons biologiques nécessaires aux futures études dans ce domaine.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé. Après exposition à différentes concentrations de cuivre (pour une durée de 3 semaines) les poissons seront transférés individuellement dans un aquarium de choix (aquarium composé de deux arènes identiques, 1 et 2, circulaires, de 30 cm de diamètre, et reliées par un couloir de 5 cm par 5 cm). Dans cet aquarium de choix, les préférences pour des signaux visuels de congénères (signaux présentés dans l'arène 1) versus des signaux visuels de poissons d'une autre espèce (Sarpa salpa, non prédatrice, signaux présentés dans l'arène 2) seront évaluées durant 15 min via une comparaison du temps passé dans chacune des deux arènes. Une seule mesure comportementale sera réalisée par poisson, avant leur euthanasie par surdosage d’anesthésique (balnéation jusqu'à l'arrêt complet des mouvements operculaires et vérification de l’arrêt des battements cardiaques effectué sous loupe binoculaire). Toutes les autres mesures (morphologiques, pigmentaires et physiologiques) seront réalisées sur les poissons après cette euthanasie.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux résultent du stress lié à l'exposition des individus aux polluants. On peut faire l’hypothèse d’un changement de comportement alimentaire et d’une perturbation du développement larvaire avec des retards de croissance et d’apparition du patron de pigmentation, ou à l’inverse, d’une métamorphose plus précoce. Le changement d’aquarium pour les tests de préférence (expérience d’écologie comportementale) peuvent également être source de stress pour les poissons mais sera minimisé par un transfert à l’aide d’un bécher.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de l’élevage afin de procéder aux différentes analyses de morphologie et de biologie moléculaire.
Remplacement
L'étude écotoxicologique comprend des mesures 1/ comportementales (préférences visuelles dans un aquarium de choix), 2/ morphologiques (croissance, pigmentation), et 3/ physiologiques (expression de gènes de la métamorphose, taux d’hormones thyroïdiennes). Il s’agit donc de mécanismes non modélisables car s'appliquant à des organismes vivants dans l’intégrité et la complexité qui leur sont propres. Ainsi, aucune expérience in silico ou in vitro ne permet d'accéder à ce type de données. Par conséquent, il n'existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet et l'utilisation du modèle animal est incontournable.
Réduction
La planification du design expérimental a été faite afin de réduire le nombre d’individus échantillonnés pour l’ensemble des conditions testées permettant une analyse statistique pertinente, c’est-à-dire des triplicats pour chacune des concentrations de cuivre testées (3x4 = 12 aquariums de 3L chacun), et ce dans deux duplicats techniques (2 pédiluves d’expérimentation), soit un total de 24 aquariums contenant chacun 15 larves, soit un total de 360 larves de D. vulgaris exposées. Nous avons pu réduire notre échantillonnage à ce nombre en adaptant notre protocole afin de combiner les mesures comportementales, morphologiques/pigmentaire, et de biologie moléculaire sur les mêmes individus, au lieu d’utiliser 3 groupes d’individus pour ces trois types de mesure. Nous appliquons donc une réduction par 3 du nombre d’animaux prévus dans le cadre de cette experience. Dans le cas où des animaux mourraient durant l’exposition, ces individus ne seront pas remplacés. De plus, ce projet permettra de mettre en place une corrélation entre mesures comportementales et mesures physiologiques dont l’objectif est, à terme, de se restreindre aux mesures comportementales et d’ainsi réduire le nombre d’échantillons biologiques nécessaires aux futures études dans ce domaine.
Raffinement
Les individus seront élevés selon le protocole développé et maîtrisé au sein de notre service d’aquariologie. Ce protocole a été développé pour que le bien-être des individus soit optimal, permettant une bonne croissance et une bonne survie. Notamment, une attention particulière et quotidienne sera portée tout au long de ce projet sur la température et la salinité de l'eau, deux facteurs importants de source de stress. Par ailleurs, le bien-être des animaux sera assuré par un personnel compétent 7J/7J pour l’observation et le soin des animaux. La durée d’exposition a été réduite à 3 semaines, car même si l’ensemble des étapes du recrutement larvaire et de la métamorphose de cette espèce peut prendre jusqu’à 3 mois, nous avons décidé de nous focaliser sur des biomarqueurs dont les principaux changements larves/juvéniles ont lieu dans les 3 premières semaines, afin de réduire la durée d’exposition au cuivre des individus de notre expérience. Bien qu’il n’existe à ce pas encore de grille de scoring officiellement établie chez les poissons, nous examinerons attentivement le comportement de nage afin de déceler tout comportement inhabituel, comme une difficulté de l’individu à contrôler la flottaison, à maintenir son équilibre ou ses trajectoires de nage. Ce comportement individuel sera comparé aux comportements de nage des autres individus de l’expérience.
Choix des espèces
Le sar à tête noire, Diplodus vulgaris, a été choisi comme un modèle adapté pour mener à bien ce projet. En effet, il s’agit d’un modèle pertinent écologiquement pour l’étude du développement larvaire d’un poisson méditérranéen caractéristique de milieux pouvant être sujet à la toxicité des polluants métalliques. Les zones portuaires constituent un secteur de nourricerie pour les D. vulgaris où l’exposition à de multiples facteurs de stress anthropiques est présente. Ces informations ont pu être confirmées par les suivis et mesures effectuées dans un précédent projet de recherche. Nous travaillons sur la période de transition larve - juvénile chez cette espèce et devons donc capturer ces jeunes stades de vie en milieu naturel, au moment du retour des larves dans les habitats côtiers.
Production de souris à phénotype dommageable pour des études moléculaires et cellulaires d’une maladie neurodéveloppementale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une souris qui convulse est tuée sur le champ, et la prostration ou les tremblements déclenchent aussi l'arrêt immédiat du protocole. 2 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 1 200 fœtus sortis un par un de la corne utérine et décapités, et 720 souris porteuses d'un phénotype dommageable dont le porteur indique que 10 % meurent avant trois mois et environ 30 % avant quatre mois, de crises d'épilepsie spontanées. Une partie subit une ouverture de la cage thoracique sous anesthésie profonde pour une perfusion intracardiaque de fixateur, opération de trente minutes menée sans réveil. Ces souris ne sont produites que pour l'analyse post-mortem, aucune autre procédure expérimentale n'étant prévue, et le projet se ramène à fabriquer des individus atteints pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Le but de ce projet est d’analyser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sont impactés dans un syndrome neurodéveloppemental avec retard mental, autisme, déficit moteur et épilepsie. Le gène déficitaire dans ce syndrome est exprimé dans le cerveau au cours du développement et chez l’adulte. Les modèles que nous étudions présentent une inactivation soit d’une copie, soit des deux copies du gène spécifiquement dans une population de neurones, les neurones produisant le neurotransmetteur GABA qui est le principal neurotransmetteur inhibiteur dans le cerveau. Cette approche nous a permis de montrer que la plupart des symptômes associés au syndrome dont l’épilepsie et les troubles autistiques étaient liés à l’inactivation du gène dans cette population neuronale. L’inactivation des deux copies du gène nous permet de comprendre le rôle de ce gène dans les neurones GABAergiques au cours du développement. Le but ici est maintenant de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont impactés dans ces modèles en regardant quelles sont les sous-populations de neurones GABAergiques affectées par des études immunohistologiques et les voies moléculaires dérégulées grâce à des études moléculaires. Les animaux de cette étude sont uniquement dédiés à de l’analyse post-mortem et ne font pas l’objet d’autres procédures expérimentales. Ils font l’objet d’une demande d’autorisation de projet pour phénotype dommageable. Le modèle avec inactivation d’une copie du gène présente des épilepsies spontanées qui se déclarent à partir de 6-8 semaines tandis que le modèle avec inactivation des deux copies du gène entraine une absence de formation d’une structure du cerveau appelée striatum servant à l’exécution des mouvements. L’absence de striatum entraine des spasmes musculaires à la naissance et le décès des petits dans les premiers jours de vie. Les études sur ce modèle ne concernent donc que les foetus dans le dernier tiers de développement (à partir de 15 jours de développement embryonnaire) et jusqu’au jour de naissance, c’est-à-dire avant que le phénotype dommageable ne s’exprime.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de permettre la production de souris et de fœtus pour 2 modèles murins impliqués dans le syndrome neurodéveloppemental avec retard mental, autisme, déficit moteur et épilepsie. Ces 2 modèles présentent des phénotypes dommageables dont la caractérisation nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l’origine des troubles du neurodéveloppement associés à cette pathologie.
Procédures
Une partie des souris subissent une chirurgie sans réveil pour pouvoir fixer le cerveau de manière optimale. Pour cela, une anesthésie profonde est couplée à un anti-douleur. La procédure consiste en un acte chirurgical avec une ouverture de la cage thoracique et perfusion par voie intracardique d'un agent de fixation. La procédure dure environ 30 minutes et n'est réalisée qu'une seule fois par souris, celle-ci étant sans réveil.
Impact sur les animaux
Des épilepsies apparaissent chez certains animaux dont une copie du gène a été inactivée dans les neurones GABAergiques à partir de l’âge de 6-8 semaines. Ces crises se caractérisent par des myoclonies (secousses musculaires localisées au niveau des vibrisses, de la face, des oreilles et des membres antérieurs) ainsi que des crises tonico-cloniques (une course intense, une perte d’équilibre et une chute sur le flanc accompagnée de myoclonies généralisées pendant quelques secondes). Ces crises sont généralement indolores car il y a perte de connaissance. Si la crise est forte, certaines souris peuvent aller jusqu’à la crise tonique qui se manifeste par une hypertonie des quatre membres de la souris tendus en direction de l’appendice caudal. Cette dernière peut s’accompagner de la mort de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car leur cerveau est prélevé pour des analyses moléculaires et histologiques
Remplacement
Pour les études concernant le cerveau, il n'existe à l'heure actuelle pas d'alternative à l'utilisation des animaux. Les organoïdes cérébraux, censés mimer la structure et les fonctions principales du cerveau, n’ont pas la capacité de répliquer toutes les structures et réseaux neuraux d’un cerveau adulte. Il n'existe donc pas encore de modèle de cerveau in vitro ou autre permettant de réaliser les analyses qui sont faites dans ce projet.
Réduction
Pour chaque étude, les effectifs ont été calculés afin d'avoir un nombre minimal d'animaux d’intéret (n=6 individus par sexe et âge) tout en ayant des résultats scientifiquement et statistiquement interprétables. Nous prévoyons de produire 10 lots par an sur 5 ans, soit 12 x 10 x 5 = 600 animaux au phénotype dommageable. Nous prévoyons des animaux supplémentaires pour compenser la perte de certains animaux lors de crises épileptiques. En effet, nous avons observé qu’environ 10% des souris décèdent lors des trois premiers mois et ~30% avant 4 mois). Basé sur une estimation de la moitié des animaux qui seront sacrifiés avant l'âge de 3 mois et l'autre après, nous aurons besoin de produire 120 animaux en plus, ce qui donne un total de 600 + 120 = 720 animaux . Nous produirons aussi des mâles au phénotype dommageable pour de nouveaux accouplements. Sachant que nous perdons environ 30% de ces mâles avant l’âge de 4 mois et que certains mâles ont du mal à se reproduire, nous estimons devoir produire en continu 6 animaux en âge de se reproduire. A cela, nous devons ajouter le même nombre de femelles qui seront aussi produites en même temps. Nous produirons donc 6 animaux x 2 sexes x 4 trimestres x 5 ans = 240 animaux. Pour les analyses des foetus, nous prévoyons de produire 10 lots par an sur 5 ans, soit 12 x 2 génotypes x 10 x 5 = 1200 foetus. Nous utiliserons donc au maximum 2160 animaux.
Raffinement
L'état général et le comportement des souris est suivi quotidiennement par l'animalier: examen de l’apparence de l’animal, de l'état du pelage, de la coloration des muqueuses, évaluation de l'état de souillure de l'arrière-train, analyse visuelle de la respiration. Le premier signe d'alerte sera une perte de poids, un arrière-train souillé et un pelage mal entretenu qui entraînera une surveillance accrue (niveau 1). Le second signe d'alerte sera la prostration (et/ou des tremblements) qui entraînera un arrêt immédiat du protocole et l'euthanasie de l'animal (niveau 3). Certains animaux avec inactivation d'une copie du gène d'intérêt pouvant présenter des crises convulsives spontanées à n’importe quel moment à partir de l’âge de 6-8 semaines. Cependant, les crises ayant tendance à apparaitre après stimulation, elles peuvent se produire lors de la manipulation de l’animal. Afin d'éviter au mieux le stress pouvant provoquer une crise chez ces animaux, ceux-ci seront manipulés avec un tunnel lors des changes de cages. Si nous observons une souris qui convulse, celle-ci sera euthanasiée. Les souris avec inactivation des deux copies du gène d'intérêt développent des spasmes musculaires (dystonie) peu après leur naissance et meurent pendant les premiers jours de vie. Ces animaux sont prélevés et mis à mort avant que le phénotype dommageable n’apparaisse. Les foetus seront sortis de la corne utérine un par un et euthanasiés par décapitation directement afin de réduire au minimum le stress lié à cette sortie.
Choix des espèces
Cette étude vise à comprendre le rôle du gène d'intérêt dans le développement et le fonctionnement des neurones inhibiteurs GABAergiques. L’utilisation d’un modèle d’inactivation conditionnelle permet d’étudier l’impact spécifique de ce gène dans ces neurones. Cette étude requiert un modèle animal suffisamment proche de l’homme tel que la souris. Les animaux sont utilisés à différents stades pré- et postnatals : E15.5-E18.5, avant sevrage (1-12 jours) juvénile (3-6 semaines), adulte (2-4 mois). Les études nécessitent de comprendre le développement dès le stade embryonnaire et jusqu’à l’établissement de la pathologie à l’âge adulte.
Entretien des lignées à phénotype dommageable KO-VIP et KO-VIP – KI-CX3CR1
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Un puçage sous-cutané à 21 jours avec prélèvement de poils, ou un tatouage entre 5 et 10 jours pour les souriceaux trop petits, sans administration d'antidouleur. 200 souris de deux lignées transgéniques sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, le projet consistant à entretenir et faire reproduire ces lignées dans un nouvel établissement. Le porteur décrit chez elles des rythmes perturbés, des capacités reproductives diminuées, un transit ralenti qui augmente le risque de cancers digestifs à partir de six mois et une hypersensibilité aux stimuli douloureux, puis conclut que leur bien-être n'est pas altéré en hébergement classique. Les reproducteurs sont tués vers huit mois, quand ils ne renouvellent plus la colonie, à l'exception d'environ 25 souris KO plus jeunes destinées à des projets ultérieurs.
Objectifs
Notre équipe travaille actuellement sur un facteur spécifique qui est impliqué dans la croissance et la protection du cerveau embryonnaire, et joue un rôle de médiateur anti-inflammatoire. Nous souhaitons étudier le rôle joué par ce facteur pendant la gestation, en cas d’inflammation maternelle. Pour cela, nous souhaitons utiliser une lignée transgénique de souris qui n’expriment pas ce facteur, et une seconde lignée transgénique qui permet d’étudier spécifiquement l’inflammation cérébrale. Dans la mesure où ces colonies sont transférées vers un nouvel établissement, nous souhaitons entretenir et faire reproduire ces deux lignées dans le nouvel environnement afin de voir si elles pourront être utilisées dans des projets ultérieurs.
Bénéfices attendus
De nombreux facteurs de stress, psychosociaux, inflammatoires ou autres, peuvent toucher les femmes enceintes, et on sait aujourd’hui que les conséquences peuvent être néfastes pour le développement du bébé. Cela peut engendrer l’apparition de troubles neurodéveloppementaux (TND), dont l’origine est souvent mal comprise car complexe et multifactorielle. Nos lignées de souris transgéniques permettent l’étude de facteurs protégeant le cerveau de l’inflammation. En transférant ces lignées dans notre nouvel établissement et en s’assurant de leur bonne adaptation, nous pourrons mettre en œuvre des projets enrichissant la connaissance sur le lien entre l’inflammation maternelle et le développement de TND.
Procédures
Identification par puçage : animal vigile, une seule fois à 21 jours, suivie d’un prélèvement de poils. Tous les animaux sont concernés sauf exception. Durée de quelques secondes. Identification par tatouage : animal vigile, une seule fois entre 5 et 10 jours d’âge. Concerne les animaux pour lesquels le puçage est impossible. Ces interventions ne nécessitent pas l’administration d’anti-douleur. Durée de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Nos deux lignées d’animaux transgéniques présentent une légère perturbation des rythmes, des capacités reproductives diminuées, et des troubles digestifs (transit ralenti qui augmente le risque de développer des cancers digestifs à partir de l’âge de 6 mois). Lors de tests spécifiques, ils peuvent également présenter une hypersensibilité aux stimuli douloureux, et une hyperréactivité pro-inflammatoire face à une infection. Néanmoins, dans des conditions d’hébergement classiques et en absence de stimulation ou de tests, le bien-être de ces animaux n’est pas altéré.
Devenir
Les animaux seront mis à mort lorsqu’ils seront trop âgés pour permettre le renouvellement de la colonie (autour de 8 mois). Si à la fin du projet il reste des animaux KO de moins de 8 mois, ils seront réutilisés dans des projets futurs. On estime qu'il devrait rester environ 25 animaux KO maximum susceptibles d'être réutilisés.
Remplacement
Nous souhaitons utiliser ces lignées de souris pour étudier dans le futur des perturbations du développement embryonnaire, et il n’existe pas encore de système alternatif capable de modéliser une gestation et de prendre en compte toutes les interactions mère-embryon qui en résultent. De plus, afin d’appliquer au mieux nos résultats à l’humain, il est nécessaire d’utiliser un modèle de mammifère avec un placenta et un système nerveux proches des nôtres. C’est le cas de nos souris. Enfin, l’utilisation d’un modèle transgénique pour effectuer des travaux à l’échelle de l’organisme entier et du système immunitaire ne peut se faire que via un modèle animal. Ces deux modèles existent chez la souris, répondant à tous nos critères précédents, c’est pourquoi nous souhaitons utiliser ces lignées.
Réduction
Les couples d’animaux reproducteurs pourront être utilisés plusieurs fois afin d’entretenir la lignée. Le nombre d’animaux générés sera suffisant pour le maintien de la colonie, et des animaux supplémentaires ne seront générés que s’ils sont nécessaires à la réalisation de tests définis au préalable dans une demande d’autorisation de projet correspondante. Les animaux transgéniques en bonne santé et aptes à se reproduire à la fin du projet pourront être réutilisés dans des projets ultérieurs.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages permettant l’expression de leur comportement naturel (bâtons à ronger, de quoi faire des nids). Ils seront habitués à être manipulés par les expérimentateurs et seront transportés dans des tunnels pour réduire leur stress. Les animaux génétiquement modifiés sont observés au moins deux fois par semaine par les expérimentateurs et les zootechniciens tout en veillant à les déranger le moins possible, plus particulièrement en cas de gestation. L’objectif est de surveiller leur comportement, leur posture, et leur aspect général. Ils sont également pesés deux fois par mois. Si des signes anormaux ou une perte de poids atteignant les points limites choisis sont détectés, la surveillance sera renforcée.
Choix des espèces
Les rongeurs sont un modèle de choix pour étudier les troubles du neurodéveloppement (TND) grâce à l’organisation de leur cerveau et leur mode de gestation mammifère comparables à l’humain. Cela permet, entre autres, de se substituer à l’utilisation des primates. De plus, de nombreux modèles transgéniques s’appuient sur la souris plutôt que le rat, c’est pourquoi nous souhaitons profiter de l’expertise préexistante de ces lignées transgéniques pour mener des travaux futurs sur les TND. Les reproducteurs seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge. La progéniture sera sevrée à partir de 3 semaines d’âge. En raison du maintien de la colonie, des animaux de tous les âges et de tous les stades de développement seront présents dans notre animalerie.