Biologie du développement
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Investigation du rôle des systèmes neuromodulateurs dans l’alignement de l’axe vertébral du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
2 012 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, 1 824 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 188 un niveau sévère. Une partie est exposée vingt heures par jour pendant quatre jours à un composé pharmacologique qui déforme la colonne vertébrale, avec une mortalité attendue jusqu'à 40 % chez les larves traitées. D'autres subissent une biopsie de la nageoire caudale, une immobilisation en gel d'agarose, une injection intramusculaire paralysante, puis jusqu'à quarante-cinq minutes d'illumination laser des tissus. Le porteur écrit que cette étude "ne peut donc être soumise au principe de remplacement", au motif que seules des espèces pourvues d'une colonne vertébrale permettraient d'étudier la scoliose.
Objectifs
Les déformations de la colonne vertébrale regroupent des pathologies de l’alignement du rachis qui surviennent autour de la période de forte croissance chez l’adolescent. Parmi elles, la scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la plus fréquente : elle consiste en des désalignements des vertèbres qui touchent 1 à 4% de la population. La correction de ces déformations spontanées, détectées principalement chez les filles, se base sur le port prolongé de corsets et sur des chirurgies invasives de fusions vertébrales dont le but est de recouvrer une posture correcte et d’atténuer les douleurs thoraciques associées. A ce jour, aucun traitement non invasif n’existe pour traiter la SIA, faisant de la compréhension de ses causes un enjeu majeur pour son traitement mais aussi pour sa détection précoce. L’étiologie de la SIA est restée longtemps peu comprise, principalement à cause de l’absence de modèles intégrant la complexité spatiale, temporelle et moléculaire, impliquée dans le développement et la consolidation du squelette vertébral. Récemment, le poisson zèbre a émergé comme un modèle puissant pour cette pathologie. Des travaux récents ont montré que le système nerveux est à l’origine de voies importantes, mais encore mal comprises, dans l’établissement de l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire. La finalité de ce projet est donc de comprendre, en utilisant le poisson zèbre comme modèle animal, par quels mécanismes le système nerveux influence l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire.
Bénéfices attendus
Ce projet offre deux bénéfices principaux. Du point de vue scientifique, il permettra à court terme (pendant la durée du projet) de faire progresser les connaissances liées à l’influence du système nerveux sur l’alignement de la colonne vertébrale ainsi que sur les mécanismes sous-jacents qui se mettent en place au cours du développement post-embryonnaire et de la croissance de l’organisme. Du point de vue sociétal, il permettra à plus long terme d’identifier de nouveaux marqueurs de progression ou de nouvelles cibles pharmacologiques potentielles permettant d’infléchir l’évolution de la scoliose idiopathique de l’adolescent.
Procédures
Les signes cliniques attendus dans nos modèles de scoliose consistent en des déformations de la colonne vertébrale, sans troubles visibles attendus en termes de douleur, de nage, de comportement, ou d’alimentation (durée attendue des signes cliniques allant de 2 à 32 semaines en fonction des lots). Des animaux seront exposés à des traitements pharmacologiques délivrés directement dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose (un traitement par animal 20h par jour avec 4h de récupération, pendant 4 jours ; durée attendue des signes cliniques de 8 jours). Les animaux, sous anesthésie profonde, seront soumis soit à une biopsie de la nageoire caudale (biopsie de 1-2 mm, une fois par animal, 30 secondes), soit à des immobilisations en gel d’agarose (indolore, 1 fois par animal, durée : 10 à 15 minutes) suivies d’injections intramusculaires (une fois par animal, 2 secondes) suivies de d’enregistrements non invasifs d’images en fluorescence à des stades du développement où ils sont transparents et optiquement accessibles (une fois par animal, 30 à 45 minutes). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
La première catégorie d’effets indésirables attendus est liée à l’apparition de déformations de l’axe du corps chez des animaux mutants et chez des animaux exposés à des traitements pharmacologiques permettant établir notre modèle. Ce signe clinique apparait spontanément chez les mutants étudiés (à environ 2 semaines d’âge) et sera effectif jusqu’à la fin des procédures expérimentales associées. Il sera induit pharmacologiquement chez les animaux traités pendant une durée de 7 jours. Les observations reportées dans la littérature et nos observations préliminaires n’indiquent aucun impact détectable de ce signe clinique sur l’alimentation des animaux, leur comportement de nage en milieu aquatique, et leurs interactions en groupe social, suggérant des conséquences modérées en termes de stress, de douleur ou de mobilité. La deuxième catégorie d’effets indésirables attendus est liée aux actes expérimentaux nécessaires pour effectuer des expériences d’imagerie. Elle comprend le prélèvement des animaux de leur aquarium avec une épuisette, l’anesthésie, l’immobilisation d’animaux profondément sédatés, la paralysie par injection intramusculaire, et l’illumination des tissus avec un laser. Les effets indésirables prévus pour ces animaux couvrent donc le stress induit par la manipulation jusqu’à la sédation, leur immobilisation après une sédation profonde, la douleur causée par une aiguille permettant de procéder à une injection intramusculaire et l’illumination des tissus sous un microscope à fluorescence, couvrant une durée ne dépassant pas 60 minutes par animal. La troisième catégorie d’effets indésirables concerne la toxicité du composé pharmacologique délivré dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose, auquel les animaux seront exposés et qui nécessitera une modification des conditions d’hébergement (modification du cycle jour-nuit), pouvant générer un stress, et diminuera leur taux de survie pendant la période d’exposition. Enfin l’acte de biopsie consistant à prélever un échantillon de nageoire caudale chez des adultes sous anesthésie générale afin d’identifier leur statut génétique constitue la dernière catégorie de nuisance pour les animaux étudiés.
Devenir
Pour toutes les procédures de ce projet, les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de nous permettre de réaliser les analyses prévues post-mortem. Elles comprennent des analyses de l’alignement vertébral, d’histologie, d’anatomie, et de prélèvement de tissus post-mortem qui seront utilisés pour des analyses de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal.
Remplacement
La scoliose idiopathique est une déformation de la colonne vertébrale qui apparaît spontanément chez l’adolescent au cours de la puberté. L’étude des origines génétiques ainsi que des mécanismes biologiques qui la sous-tendent ne peut donc être réalisée que chez espèces pourvues de colonnes vertébrales. Aucune alternative non animale n’existe à ce jour permettant d’étudier ces questions, notamment le rôle du système nerveux dans l’alignement vertébral, ni de sonder les conséquences induites par la manipulation de ce système sur leurs cibles en aval. Cette étude ne peut donc être soumise au principe de remplacement.
Réduction
2012 animaux seront utilisés dans ce projet. Afin de limiter le plus possible le nombre d’animaux prévus dans notre étude, nous avons évalué le nombre d’individus nécessaires pour chaque procédure en se basant sur : (i) l’identification de lots déterminés par les stades développementaux clés pour mener nos investigations et tester nos hypothèses de travail, (ii) une estimation de l’échantillonnage nécessaire pour détecter les effets biologiques testés, basée sur une comparaison statistique, (iii) la prise en compte d’une comparaison de groupes expérimentaux liée à l’identité génétique de frères et sœurs dont la distribution est connue, (iv) un taux de survie estimé à 80 pour cent pour les alevins mis élevage, (v) une mortalité maximale estimée à 40 pour cent pour les larves exposées au traitement pharmacologique permettant de mettre en place notre modèle, (vi) la prise en compte d’un échantillonnage équivalent de mâles et de femelles. Pour chaque quantification effectuée, les tests statistiques appropriés seront utilisés pour évaluer la significativité des effets observés dans nos procédures. Certains animaux seront utilisés pour mener des investigations post-mortem et répondre à plusieurs questions scientifiques. Pour chacune des procédures conçues, un nombre d’animaux inférieur à celui prévu sera utilisé si nos résultats sont statistiquement fiables avant l’utilisation de l’ensemble des animaux envisagés. En particulier, nous tenterons de développer une technique de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant leur mise en élevage. Si cette implémentation s’avère fructueuse, un nombre moins important d’animaux sera effectivement utilisé, notamment pour les groupes témoins, pour atteindre des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée, où les paramètres environnementaux sont vérifiés, contrôlés et adaptés si nécessaire (qualité et température de l’eau, cycle lumineux, etc.). Les animaux seront nourris 1 à 2 fois par jour avec une alimentation adaptée à leur stade physiologique. Les mesures spécifiques de raffinement qui seront prises incluent : (i) une surveillance accrue des mutants étudiés et des animaux soumis aux traitements pharmacologiques permettant d’induire des scolioses, afin de détecter et limiter les signes de mal-être liés à leur désalignement axial ou à l’exposition au composé pharmacologique utilisé à cet effet, (ii) l’hébergement des animaux par groupes de phénotypes semblables dès que possible au cours du développement post-embryonnaire afin de limiter un accès compétitif à la nourriture si cela est pertinent, (iii) l’utilisation d’une grille de score standardisée au sein de la structure d’hébergement, permettant d’évaluer les signes de mal-être, de douleur ou de souffrance et permettant une prise en charge rapide et optimale par l’utilisateur en coordination avec la structure chargée du bien-être animal et l’équipe vétérinaire, (iv) l’identification de points limites pour chacune des procédures permettant une prise en charge rapide et optimisée en fonction des procédures expérimentales, (v) l’utilisation d’un composé non aversif et à induction rapide pour l’anesthésie et l’euthanasie, (vi) le choix de manipulations douces des animaux avec des instruments atraumatiques (épuisette, cuillère), (vii) la mise en place d’une habituation des animaux à un changement environnemental lorsque cela est pertinent, (viii) l’optimisation d’une technique de biologie moléculaire permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant sa mise en élevage afin de permettre l’hébergement d’animaux qui auront des signes cliniques comparables, avant que ces derniers ne se déclarent ; (ix) une technique de biopsie sur animaux adultes sous anesthésie générale à induction rapide incluant des manipulations atraumatiques et un prélèvement limité avec des outils désinfectés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre constitue un modèle de choix pour l’étude de la scoliose idiopathique de l’adolescent. En effet, sa colonne vertébrale partage les mêmes caractéristiques morphoanatomiques que celles de l’homme. Elle est soumise, du fait qu’il évolue en milieu dense, à des forces biomécaniques similaires à celles des espèces bipèdes, contrairement aux quadrupèdes dont le rachis subit des sollicitations influencées par une perception différente de la gravité. Le poisson zèbre possède un génome conservé à 70 pour cent avec celui de l’homme, permettant des analyses étiologiques poussées. Il présente enfin l’avantage de se reproduire en milieu externe et de rester optiquement transparent pendant une large partie de son développement post-embryonnaire, permettant d’implémenter des méthodes non invasives basées sur la microscopie in vivo afin de mener les investigations appropriées sans induire de dommages durables. Chez le poisson zèbre, des animaux âgés de 4 à 29 jours post fertilisation sont considérés comme des larves, des animaux âgés entre 30 et 89 jours post fertilisation sont considérés comme des juvéniles, et au-delà de 90 jours post fertilisation comme des adultes. Dans ce projet, 1556 animaux seront utilisés au stade larvaire (7 jours à 4 semaines post fertilisation), 52 animaux au stade juvénile (6 semaines post fertilisation) et 404 animaux au stade adulte (12 et 32 semaines post fertilisation) afin de répondre aux questions scientifiques testées.
Caracterisation fonctionnelle d’une sous-population astrocytaire dans le cerveau de souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse histologique, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 120 femelles gestantes subissent une électroporation in utero, une chirurgie d'environ une heure que le porteur reconnaît pouvoir provoquer douleurs, infections et stress, tandis que 120 autres animaux reçoivent des injections quotidiennes de tamoxifène pendant deux jours. Un glioblastome est induit chez une partie des souris, pour observer le comportement d'une sous-population d'astrocytes dans l'environnement tumoral, embryons, souriceaux et adultes étant prélevés à six stades du développement. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'étude de la diversité des astrocytes repose "entièrement" sur les lignées de souris transgéniques et qu'aucun substitut n'existe aujourd'hui.
Objectifs
Dans le système nerveux, les cellules gliales, oligodendrocytes et astrocytes sont les cellules qui forment l'environnement des neurones. Leur fonction dans le traitement de l'information nerveuse est aujourd'hui reconnue comme essentielle au fonctionnement du cerveau. Cependant, des études récentes de la biologie des cellules gliales mettent en avant les aspects simplificateurs de cette classification ne reflétant pas leur diversité fonctionnelle, surtout pour les astrocytes. La même problématique s‘applique aux gliomes, tumeurs primaires du cerveau qui se caractérisent par leur hétérogénéité. Les astrocytes sont aussi présents dans le microenvironnement tumoral, caractériser leurs fonctions et interactions dans ce contexte est une priorité de la recherche fondamentale en neuro-oncologie. Nos travaux récents nous ont permis de mettre en évidence dans le cerveau de souris une sous-population non identifiée d'astrocytes (Olig2-AS) qui peut être distinguée des autres populations d'astrocytes par l'expression d'Olig2, une protéine actuellement reconnu comme une caractéristique des gliomes. Nos objectifs sont les suivants : -Etablir la distribution des astrocytes-Olig2 dans le cerveau de souris au cours du développement et chez l’adulte. -Déterminer le rôle de ces astrocytes-Olig2 au sein de l’environnement tumoral dans un modèle de souris ou un glioblastome sera induit. -Etablir le rôle de la protéine Olig2 dans les astrocytes-Olig2 au cours du développement cortex cérébral.
Bénéfices attendus
Il n’existe aucune donnée sur la caractérisation des astrocytes-Olig2 dans le cortex cérébral de souris. Ce projet aura pour but de caractériser ces cellules ce qui aura pour conséquence une meilleure connaissance du développement des astrocytes dans le cerveau. D’autre part, le projet permettra d’étudier le rôle de ces cellules dans un contexte tumoral ainsi que le rôle de la protéine Olig2 dans ces cellules. En conclusion, ce projet pourrait conduire à la caractérisation d'un nouveau sous-type d'astrocytes associés à la tumeur dans le microenvironnement du glioblastome. Ce microenvironnement est de plus en plus reconnu comme un élément pivot de la tumorigénicité et pourrait participer à la résistance du glioblastome aux thérapies actuelles observée chez les patients. Ainsi, ce projet aura des retombées à la fois en termes d'innovation et de thérapie qui sont des aspects clés pour recherche sur le cancer.
Procédures
Dans le cadre du projet des électroporations seront réalisées, c’est une procédure chirurgicale sur femelles gestantes. 120 femelles dans le cadre du projet seront concernées par cette opération qui dure environ une heure. Des injections de tamoxifène seront aussi réalisées, l’opération dure en moyenne moins d’une minute et concernera 120 animaux. Elles seront quotidiennes sur une durée de deux jours. En termes de prélèvements terminaux sur animaux anesthésiés, le cerveau sera prélevé pour les futures analyses.
Impact sur les animaux
L'électroporation in utéro est une procédure chirurgicale qui peut entrainer des douleurs, des infections et du stress. En ce qui concerne les injections, les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 30 secondes. Ces injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses histologiques
Remplacement
Les observations réalisées sur les tissus embryonnaires et adultes dans lesquels les cellules d’intérêt restent localisées dans leur contexte endogène et, en particulier, restent soumises à l’influence des signaux de communication émis par les autre types cellulaires (neurones, cellules endothéliales etc..) sont absolument requises pour comprendre le développement des cellules gliales et leur diversité. Ce contexte complexe, mal connu, ne peut être recréé in vitro et il n’est pas possible de travailler sur des modèles de cellules en culture. Nous utiliserons des lignées de souris déjà établies dans lesquelles des mutations génétiques ont été ciblées sur les gènes d’intérêt. L’étude de la diversité astrocytaire repose à ce jour entièrement sur l’utilisation de lignées de souris transgéniques, il n’est pas possible à l’heure actuelle de remplacer ce modèle animal.
Réduction
-Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous concentrerons nos analyses pour la distribution des Olig2-AS sur 4 stades clés du développement embryonnaire du cerveau et un stade perinatal. Pour les électroporation durant la période embryonnaire, les analyses seront réalisées en périnatal (analyse morphologique), et chez l’adulte (analyse glioblastome) -Les analyses seront réalisées sur 6 individus pour chaque génotype à chaque stade et pour chaque type d'analyse ce qui est le minimum nécessaire pour obtenir des données statistiquement fiables, c’est ainsi que nous avons pu déterminer le nombre d’animaux à utiliser pour chaque procédure. Pour les analyses immunohistochimiques nous réaliserons des coupes fines (paraffine ou coupes à congélation) ce qui nous permet de collecter un grand nombre de coupes pour chaque échantillon et ainsi réaliser toute la série de marquages immunohistochimiques nécessaires à la caractérisation des phénotypes.
Raffinement
La surveillance renforcée permettra une vigilance accrue en cours d'expérimentation et la détection de l'atteinte des points limites. Les souris seront quotidiennement observées et pesées par du personnel compétent. Des grilles de scoring seront utilisées pour suivre les animaux en expérimentation afin de mettre en place, lorsque nécessaire, des mesures pour atténuer la douleur, l'angoisse ou le stress. Les critères d’observations seront : le poids, la quantité d’aliment ingérée quotidiennement, l’apparence du pelage, l'activité et comportement. Pour l'électroporation in utero, les souris reçoivent une injection d’analgésique 30 min avant d’être anesthésié via un gaz. Seuls les embryons facilement accessibles sont injectés afin de diminuer le temps d'anesthésie.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris, modèle mammifère dans lequel il est possible d’introduire des mutations génétiques ciblées ou des transgènes rapporteurs de l’expression d’un gène d’intérêt. C’est aussi le modèle génétique le plus proche de l’Homme. Dans ce contexte, les résultats obtenus à la suite des expériences proposées pourront potentiellement trouver une application dans des études d’intérêt thérapeutique chez l’Homme. Afin d’étudier le développement et la maturation des astrocytes en condition physiologique et pathologique, les embryons, souriceaux et souris seront collectés à 6 stades différents du développement qui couvrent tout le début de la vie de l’animal.
Création et maintien d’une lignée transgénique de poisson zèbre pour étudier une nouvelle mutation génétique impliquée dans une pathologie osseuse
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Amputés d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, baignés deux nuits dans un colorant sans nourriture, anesthésiés chaque semaine pendant trois semaines pour des séances d'imagerie, 1 832 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Tous seront tués à la fin du projet. Les poissons porteurs de la mutation étudiée développeront des malformations du crâne et de la colonne, que le porteur annonce sans en faire un critère d'exclusion, l'objectif étant de vérifier qu'une mutation repérée chez des enfants de petite taille cause bien la maladie. Il présente pourtant le poisson comme permettant des approches "largement non-invasives", tout en indiquant que le prélèvement de nageoire à trois jours entraîne aujourd'hui une importante létalité.
Objectifs
En étudiant 400 enfants de petite taille, il a été identifié une nouvelle mutation génétique responsable d'une maladie caractérisée par une petite taille et des malformations du squelette de la tête. Si le rôle de ce gène dans le développement squelettique a déjà été décrit, il n'a jamais été associé à une maladie humaine. Le développement d'un modèle animal est indispensable à la fois pour confirmer la pathogénicité de cette mutation et pour déterminer les mécanismes responsable de cette maladie. Par conséquent l’objectif de ce projet consiste à l’établissement et à la caractérisation d’un modèle de poisson-zèbre exprimant cette mutation afin d’étudier l’impact de la mutation sur le développement du squelette de la tête.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux définir le rôle d'une protéine au cours du développement squelettique. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défaut de la croissance osseuse . La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Un prélèvement d'un bout de nageoire, sera réalisé sous anesthésie (1 minute) sera effectué sur certains poissons. Certains poissons seront baignés 2 fois dans un colorant pendant une nuit à chaque fois hors flux sans nourrissage Certains poissons seront imagés 1fois/semaine pendant 3 semaines (3 minutes environs). Certains poissons subiront une injection intrapéritonéale sous anesthesie (5 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d'intérêt, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. D'autre part, les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs 1/ aux anesthésies répétées lors de l’acquisition d’images hebdomadaires, 2/ aux colorations in vivo, 3/ aux isolements nécessaires pour les acquisitions d’images et pour le génotypage des poissons, 4/au prélèvement d’un fragment de 1mm de la nageoire caudale sous anesthésie générale et 5/ à une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale.
Devenir
L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été réalisées soit au court des procédures soit seront réalysees en post mortem.
Remplacement
Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différent types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencé par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l'utilisation du poisson comme espèce modèle permet cependant des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire. Ce nombre a été pour chaque protocole déterminé afin d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour l’obtention de résultats significatifs en prenant compte de la variabilité de la croissance des poissons observé au cours de précédents projets du laboratoire. Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Au cours de la procédure 3 afin d’une part d’augmenter la puissance statistique et d’autre part de réduire le nombre d’animaux utilisé, les acquisitions d’image seront réalisées sur le même animal à différents temps. Nous mettons en place actuellement le prélèvement de la nageoire des poissons pour génotypage à 3 jours post fécondation au sein de l'animalerie. A l'heure actuelle ce geste entraine une importante léthalité et nécessite une amélioration. Néanmoins au cours de ces 5 prochaines années, la mise en place de cette technique permettra de réduire le nombre d'animaux par procédure.
Raffinement
Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d’interet, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. Dans le cas d’un défaut mandibulaire trop important, l’analyse des poissons se limitera à l’analyse des premières étapes du développement crâniofacial jusqu’à 5 jours post fecondation). Dans le cas d’un défaut mandibulaire modéré à faible, Les bacs à surveiller seront indiqués, le comportement des animaux face à la nourriture sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les animaliers. D’autre part l’apparition de symptômes morphologiques ou comportementaux sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Seuls les poissons nécessaires à la création, au maintien des lignées et à l’analyse du squelette post mortem aux stades adultes seront génotypés à 3mois post fécondation sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésiques pendant 48h. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie. Le milieu aqueux utilisé pour maintenir les poissons dans la bonne position pendant l’acquisition permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations.
Choix des espèces
Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette dela tête. Le squelette de la tête présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de poissons exprimant des protéines fluorescences dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse du squelette se fera du stade larvaire (7jours post fécondation (jpf) ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 1 semaines, 2 semaines, 3 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois).
Comportement olfactif du poisson cavernicole aveugle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1 920 poissons cavernicoles aveugles, encore au stade larvaire, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue pour l'étude de leur cerveau. Mis à jeun 72 heures puis isolés, ils sont exposés à une odeur alimentaire pendant trente minutes, quatre jours de suite, 1 440 élevés en lumière normale et 480 dans le noir. Le porteur attend de ces observations une meilleure compréhension des mécanismes évolutifs qui permettent à des animaux non-humains de survivre à un changement brutal d'environnement, sans autre retombée annoncée. Sur le remplacement, il écrit en une phrase que les comportements étudiés sont non prévisibles et que le recours à l'animal est "requis par définition".
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment certaines composantes biologiques participent à la modification du système nerveux central et des comportements qu’il gouverne dans le cadre de l’adaptation à des changements d’environnement.
Bénéfices attendus
Grâce aux résultats que nous espérons obtenir nous pourrons mieux comprendre les mécanismes évolutifs et biologiques qui seuls ou combinés permettent à des animaux de survivre à un changement brutal d'environnement (lumière, température, nourriture) puis comment au cours de l’évolution ces mêmes animaux deviennent adaptés à ce nouvel environnement.
Procédures
Test de comportement olfactif : animaux vigiles mis en présence d’une odeur alimentaire pendant 30 minutes, 4 jours de suite sur 1440 animaux élevés en condition normale et sur 480 animaux élevés dans le noir.
Impact sur les animaux
Nuisance 1 : Mise à jeun. Les alevins sont à jeun 72 heures. Pas d'effets indésirables attendus car les poissons supportent naturellement la mise à jeun. Nuisance 2 : Isolement. Une étude précédente montre que le niveau de cortisol des poissons après changement d'environnement et isolement revient à la normale après 24 heures. Nous effectuons une acclimatation de 3 jours pour que le jour du test, le niveau de stress de l'alevin soit au niveau basal. L'effet indésirable attendu est l'augmentation du stress pendant 24 heures suivi d'un retour à la normale.
Devenir
Dans les deux procédures les alevins sont euthanasiés pour études neuranatomique post-mortem.
Remplacement
Remplacement : Les comportements étudiés dans ce projet sur des poissons adaptés à des milieux différents sont non prévisibles, notre projet nécessite donc une approche in vivo.
Réduction
Réduction : afin de réduire les nombres nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques qui permettent d’obtenir des résultats fiables avec moins d’animaux. Les tests d’observation du comportement étant non invasifs nous utiliserons les mêmes animaux dans différents tests de comportement ce qui contribuera aussi à réduire le nombre d'animaux utilisés. Nous ne nous attendons pas à observer des signes de souffrance autre que parfois un stress lié au changement d’aquarium. Cependant, nous suivrons les signes de stress éventuels des animaux et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience
Raffinement
Raffinement : nous avons mis en place des conditions d’observation du comportement qui visent à minimiser au maximum le stress des animaux : ni contention humaine, ni immobilisation, ni contrainte dans un espace réduit.
Choix des espèces
Nous souhaitons décrire et quantifier des comportements animaux. Le recours à l'animal est requis par définition. De part l'existance des deux éco-morphotypes de cette espèce de poisson est un modèle idéale pour étudier l'évolution du système nerveux. Le système olfactif est complètement développé à partir de 4 semaines. Avant ce stade, les seuils de détection olfactifs sont très variables d'un individu à l'autre ce qui complique l'interprétation du comportement de réponse aux odeurs. Cependant la transparence des larves de 4 semaines rend difficile la détection des larves par un logiciel de tracking or à 6 semaines, les larves sont détectées. Nous étudions donc le comportement des larves de 6 semaines car les seuils de détection sont moins variables et les larves sont bien détectées par un logiciel de suivi de la locomotion.
Effet direct et transgénérationnel de la température sur la différentiation sexuelle du poisson zèbre
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Pour comprendre comment la température fait basculer le sexe des poissons, 920 poissons zèbres sont élevés à des températures modifiées puis tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur ne décrit ni chirurgie ni prélèvement sur animal vigile : les atteintes tiennent à l'enrichissement limité, à la vie en milieu contraint et aux variations de température imposées. Les individus sont analysés à cinq stades, de l'œuf fécondé au poisson adulte de 135 jours, pour établir le sex-ratio de chaque groupe. La mise à mort sert à cette détermination et à constituer une banque d'échantillons, dans un projet rattaché à la protection de l'environnement naturel.
Objectifs
Bien que le sex-ratio représente un paramètre démographique simple et basique, il fournit une information essentielle sur le futur potentiel reproducteur d'une population et donc, sur sa viabilité. Chez la plupart des espèces, le sex-ratio est approximativement de 1:1 (ie autant de mâles que de femelles). Cependant, ce dernier peut être biaisé sous l’effet de facteurs environnementaux. Depuis plusieurs décennies les scientifiques alarment sur le fait que le changement global entraine des biais dans les sex-ratios des populations. L’exemple le plus frappant est celui de la température chez les tortues. Chez la plupart des tortues, la détermination sexuelle (le fait de devenir mâle ou femelle) est dépendante de la température d'incubation des œufs. En-dessous d’un certaine température d'incubation, des bébés mâles sortent de leurs œufs ; au-delà, ce sont des bébés femelles. Ainsi, avec le réchauffement climatique, on observe une féminisation progressive des populations de tortues et on estime que d’ici 2100, le sex-ratio de certaines populations atteindra 93 % de femelles, ce qui risque de mener à l’extinction de l’espèce. Si l’on suspecte que beaucoup de facteurs peuvent agir sur la détermination sexuelle et biaiser les sex-ratios des populations chez les reptiles, amphibiens et poissons, les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Comprendre ces mécanismes revêt une importance cruciale et constitue un défi de longue date en biologie avec des implications importantes pour les populations et la biodiversité. Nous avons récemment mis en évidence chez le poisson zèbre (Danio rerio) que la température, les radionucléides ou le cadmium (un métal non essentiel issu de l’extraction minière) peut entrainer de manière directe ou à la génération suivante des biais importants dans le sex-ratio des populations. Le présent projet a pour objectif d’apporter des données nouvelles sur le déterminisme sexuel sous influence environnementale chez cette espèce en étudiant plus particulièrement les effets d’une hausse des températures et en étudiant à la fois les effets directs et transgénérationnels. L’objectif à terme sera de développer un outil moléculaire (basé sur des modifications épigénétiques) permettant d’apprécier l’effet de divers facteurs en lien avec l’activité humaine (réchauffement, pollution chimique, lumineuse ou sonore, …) sur la détermination sexuelle et le sex-ratio des populations en utilisant le danio comme modèle de poisson.
Bénéfices attendus
Les preuves s’accumulent pour démontrer que le changement global affecte le sex-ratio des populations sauvages de poissons, reptiles et amphibiens, fragilisant et menaçant ainsi le futur des espèces. Si de nombreux facteurs environnementaux ont été identifiés comme affectant le processus de différentiation sexuelle (ie le fait de devenir mâle ou femelle), les mécanismes biologiques sous-jacents demeurent largement inconnus. Les résultats obtenus permettront d’acquérir des données nouvelles et originales sur (i) l’impact de l’environnement dans le processus de différentiation sexuelle chez les poissons (ie le fait qu’un poisson devienne mâle ou femelle au cours de son développement précoce), (ii) l’évolution des mécanismes impliqués dans la différentiation sexuelle et (iii) sur comment l’expérience environnementale vécue par les parents peut affecter le sex-ratio de leur descendance (appelé sex-ratio à la naissance et qui correspond à la proportion de mâles et de femelles dans une ponte). In fine, la compréhension des mécanismes impliqués dans le sex-ratio à la naissance permettra le développement d’outils moléculaires permettant d’évaluer et prédire l’impact des facteurs environnementaux, notamment une hausse des températures et des contaminants, sur le sex-ratio des populations (effet reprotoxique et perturbateur endocrinien). Alors que la majorité des outils utilisés à l’heure actuelle pour évaluer l’impact des activités humaines sur l’environnement ne donnent que peu d’indications sur l’état de santé des animaux et reflètent une exposition/effet à un instant donné, un tel outil permettrait (i) de relier un évènement moléculaire à un effet à l’échelle de l’individu (sexe) et de la population (sex-ratio), un défi de longue date en biologie et (ii) d’évaluer de potentiels effets transgénérationnels, ie effets à long terme sur les populations (en rupture par rapport aux approches classiques).
Procédures
Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de procédure chirurgicale
Impact sur les animaux
Enrichissement limité, Vie en milieu contraint, Variation de la température
Devenir
L'ensemble des individus seront euthanasiés à l'issue de l'expérience pour analyse, détermination du sex-ratio des populations et création d'un banque d'échantillons.
Remplacement
Le présent projet a pour objectif majeur de développer des outils permettant d’évaluer et prédire l’effet de divers facteurs environnementaux (une hausse de la température étant étudié comme facteur masculinisant) sur le processus de détermination sexuelle chez le poisson et conjointement sur le sex-ratio des populations ainsi que de comprendre et décrire les mécanismes moléculaires sous-jacents. Un tel projet ne peut s’effectuer sur des modèles in vitro.
Réduction
Le sex-ratio pouvant fortement varier d’une famille à une autre (effet génétique) et d’un aquarium à un autre (effet environnemental), notre étude nécessite de recourir à au moins 3 aquariums et 3 familles par condition expérimentale pour obtenir des résultats scientifiquement pertinents et statiquement exploitables. Par ailleurs, une augmentation de la température entrainant une masculinisation de la population (90 % des poissons élevés à la plus forte température seront des mâles), le nombre de poissons utilisé correspond au minimum d’individus nécessaires pour obtenir un nombre suffisant de femelles matures pour assurer les analyses ( n = 6 par condition) et la reproduction.
Raffinement
La qualité de l’eau est un point fondamental pour assurer le bien-être des poissons. Les conditions d’élevage seront optimales. Chaque aquarium sera équipé d’une pompe assurant la filtration mécanique et biologique. La température et le pH seront suivis quotidiennement. Le bullage dans les unités sera contrôlé visuellement et quotidiennement. Les individus seront nourris 3 fois par jour afin de nourrir les poissons ad libitum tout en conservant une bonne qualité de l'eau (en évitant l'accumulation de nourriture non consommée dans les aquariums). En accord avec les préconisations et les études réalisées chez le poisson zèbre, l’enrichissement reposera sur (i) le maintien des individus en groupe (le danio étant un poisson grégaire), (ii) l’utilisation de photos de graviers placés sous les aquariums afin de créer un substrat et (iii) l’utilisation d’aliments vivants (les animaux seront nourris quotidiennement avec des artémies vivantes). Pendant toute la durée de l’expérimentation, des observations quotidiennes permettront de suivre l’état de santé des individus. Les potentielles atteintes au bien-être des animaux seront évaluées par des modifications comportementales et physiques en utilisant une grille de score. Dans le cas où les animaux présenteraient des signes de stress, la fréquence des observations serait augmentée. Dans le cas où plusieurs individus seraient affectés en même temps, un vétérinaire serait immédiatement contacté. En cas de signe de souffrance ou de prolongement de comportements anormaux, les individus seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le poisson zèbre (Danio rerio) est utilisé comme modèle biologique en recherche depuis de très nombreuses années. Ainsi, il existe beaucoup de littérature et de protocoles disponibles pour assurer son élevage et le maintien du bien-être des animaux. Dans le cas particulier de notre projet, les avantages du Danio sont : (i) il présente une fécondité élevée, un temps de génération rapide (3,5 mois) et une petite taille (3.5 cm à l’âge adulte), ce qui en fait un modèle idéal pour des études transgénérationnelles ; (ii) il possède un génome complètement séquencé et de haute qualité, ce qui en fait un modèle idéal pour des études de génétique et d’épigénétique et (iii) il est facile d'identifier le sexe des individus par des caractères sexuels externes à l'âge adulte ce qui en fait un modèle idéal pour des études sur la détermination du sexe. Pour répondre à nos objectifs de recherche, des individus adultes mâles et femelles ainsi que des juvéniles (sexe encore non établi) seront étudiés. En effet, chez le danio, l’ensemble des individus sont initialement femelles et présentent des ovocytes non matures de l’âge de 11 à 21 jours (post fertilisation). Entre les jours 21 et 50, en fonction de la génétique, de l’environnement ou de l’expérience environnementale vécue par les parents, ces ovocytes vont, soit se maintenir, soit dégénérer, permettant le développement de spermatozoïdes et donc de mâles. Après le 50ème jour de vie, le sexe est fixé et tout inversion est impossible. Afin de balayer la période de détermination sexuelle (appelée fenêtre critique), les individus seront analysés à J0 (œufs fécondés, pour analyser la relation parents-enfants), J18 (juvéniles femelles), J25 (début de la différentiation sexuelle), J40 (juvéniles mâles ou femelles) et J135 (adultes matures mâles et femelles).
Etude du rôle des gènes de la famille prion au cours d’infections grippales chez la souris.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Aucune souris ne sortira vivante de la zone confinée, et le porteur en fait la raison même de leur mise à mort. 2 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, infectées par un virus grippal instillé dans le nez sous anesthésie, puis pesées, prises de température, saignées et soumises à des mesures respiratoires chaque jour. L'infection peut provoquer une perte de poids, une hypothermie et une gêne respiratoire entre le quatrième et le dixième jour, et aucun analgésique ne sera administré, l'inflammation étant l'objet même de l'étude. Sur le remplacement, le porteur affirme que sa recherche est "impossible à mettre en œuvre sans animaux" parce que la réponse immunitaire mobilise plusieurs organes à la fois.
Objectifs
Ce projet est axé sur l'étude des interactions hôte-pathogène liées aux virus respiratoires, ainsi que sur la compréhension du rôle des gènes de la famille prion dans ces processus infectieux. L'objectif de notre travail est de caractériser le rôle des différentes protéines de la famille prion dans la sévérité de la pathologie grippale. Pour atteindre cet objectif, nous avons choisi d'utiliser un modèle murin, offrant une plateforme propice à l'étude du couple "hôte-virus" dans un contexte physiopathologique. Ce modèle nous permettra de comparer la virulence de différents sous-types de virus grippaux au sein de lignées de souris présentant divers génotypes, par rapport à des souris témoins sauvages. Notre approche implique l'utilisation de 6 lignées de souris différentes, chacune invalidée pour différents gènes et cela dans 2 fonds génétiques. En nous basant sur une étude démontrant une sensibilité accrue des souris invalidées pour l’un des gènes ainsi que sur d’autres résultats, nous explorerons la possibilité qu'une invalidation de la protéine prion puisse agir comme un facteur délétère vis-à-vis de la pathologie grippale. Cette approche comparative nous permettra de corréler la virulence de la souche avec le génotype de la lignée testée et l'ampleur de la réponse de l'hôte. En résumé, ce projet vise à fournir des informations fondamentales sur la fonction des gènes de la famille Prion dans la physiopathologie de la grippe, tout en éclairant les mécanismes mis en œuvre par l'hôte infecté pour se défendre contre le virus. Du point de vue pratique, ce travail ouvrira la voie à de nouvelles stratégies de lutte contre la grippe en ciblant de manière précise des protéines de l'hôte essentielles au virus.
Bénéfices attendus
Ce projet va définir les bases moléculaires et cellulaires de la protection conférée par les gènes de la famille prion dans la cadre d’une infection virale respiratoire chez l’animal non gestant, mâle ou femelle et chez la femelle gestante. Il va, en outre, définir l’importance de cette famille de gènes dans la protection du fœtus dans le cadre d’un stress infectieux maternel.
Procédures
Les interventions réalisées sur les souris seront les suivantes : Anesthésie et instillation intra-nasale : 2160. Cette anesthésie chimique se fera une fois et durera 20 minutes. Manipulation et contention pour pesée et prise de température quotidienne sur animaux vigiles : 2160. La pesée et la prise de température durent 1 minute. Prise de sang, i.e. contention et prélèvement (50µl) sur animaux vigiles : 2160. L'intervention dure 1 minute. Mesures des paramètres respiratoires, animaux vigiles : 2160. Cette mesure est quotidienne et dure 2 à 3 minutes. Imagerie intra-vitale sous anesthésie gazeuse: 2160. Cette anesthésie gazeuse et l'imagerie se feront 2 fois à 4 jours d'intervalle et dureront moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le protocole nécessite de manipuler les animaux quotidiennement pour évaluer certaines constantes (poids, température, etc…). Ces manipulations quotidiennes sont susceptibles de générer un stress chez les souris manipulées. L’infection en elle-même nécessite une anesthésie générale, et donc l’injection de l’anesthésique, provoque une douleur, l’anesthésie (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Aucun animal ne peut sortir vivant d'une zone confinée de niveau 2.
Remplacement
Notre thématique de recherche est impossible à mettre en œuvre sans animaux. En effet la protection conférée par les gènes de la famille prion dans notre modèle infectieux s’opère à de multiples échelles et nécessité une implication concomitante de plusieurs organes pour orchestrer la réponse immunitaire. De plus, dans le cas du modèle gestant, la transmission de signaux de stress maternaux vers les embryons en développement ne peut être reproduit par des méthodes alternatives.
Réduction
Notre stratégie de réduction est basée sur l’emploi de tests statistiques nous permettant de valider nos hypothèses scientifiques sur la base de résultats obtenus avec le nombre minimal d’animaux en termes d’effectifs. Pour comparer les groupes entre eux, nous utiliserons des tests statistiques qui ne font pas d'hypothèses spécifiques sur la distribution des données.
Raffinement
Le développement de la pathologie grippale chez la souris peut générer une douleur chez l'animal. L'emploi d'analgésiques et d'anti-inflammatoire n'est malheureusement pas envisageable car il fausserait les analyses à réaliser sur les animaux : la composante inflammatoire étant un des objets du projet de recherche. Des points limites seront appliqués et les animaux trop malades seront euthanasiés. Tous les animaux de ces procédures bénéficieront de carrés de coton, de buchettes de bois à ronger et de maisons en carton.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle pertinent pour étudier les mécanismes pathologiques induits par l’infection grippale puisque le virus se réplique au sein de cet hôte dans les mêmes organes que chez l’homme et provoque une maladie respiratoire comparable à celle observée chez l’homme. Le choix de la souris est aussi guidé par la possibilité de réaliser de l’édition du génome et donc de générer des animaux génétiquement modifiés dont un ou plusieurs gènes ont été invalidés. Cette approche, par comparaison avec les souris non modifiées, nous permet de caractériser les fonctions des gènes invalidé dans la lutte contre le virus. Souris mâles et femelles non gestantes : infection à l’âge de 8 semaines car le système immunitaire est mature. Souris gestantes (agées de 8 à 10 semaines) : infection au stade E9,5 afin de cibler le début de la placentogénèse.
Autophagie et stimulation immunitaire précoce : effets neuro-inflammatoires et comportementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 60 d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Dans leurs deux premières semaines de vie, les souriceaux reçoivent des injections intramusculaires de composés pro-inflammatoires sous anesthésie, séparés de leur mère, puis passent des enregistrements de vocalisations ultrasoniques, de l'actimétrie et un test de nidification. À trois mois, chaque animal est isolé pendant trois semaines avant le test d'interaction sociale, pour stimuler ses comportements sociaux. Le porteur présente ces tests comme "non invasifs" tout en décrivant par ailleurs le stress lié à la séparation maternelle, à l'hébergement individuel et aux prélèvements sanguins.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions différentes particules auxquelles l’organisme est exposé dans les premières semaines de vie. La toxicité de ces composés bio-persistants et fortement pro-inflammatoires a été montrée dans différentes études, notamment en lien avec un effet sur le neurodéveloppement. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres par différents tests de comportements, à différents âges, chez un modèle souris pour lequel i) un gène de l’autophagie a été invalidé ; ii) une exposition précoce aux particules est réalisée. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes cellulaires et la mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs : enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte de séparation maternelle (5 minutes), enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte d’interaction sociale (8 minutes à trois stades : jeune, adolescent, adulte), actimétrie à 2 et 3 mois (2 heures d’enregistrement), test de nidification (suivi sur 24 heures). Les souris sont isolées pendant 3 semaines en amont de la session de test d’interaction sociale à l’âge de 3 mois, afin de stimuler les comportements d’interactions. Les injections intra-musculaires de composés pro-inflammatoires (durée du geste d’environ 10 secondes) sont réalisées sous anesthésie (5 minutes d’anesthésie) et ne sont pas de nature à impacter de manière durable le bien-être des animaux. Ils sont ensuite soumis à une chirurgie sans réveil de quelques minutes réalisée sous anesthésie et analgésie, se finissant par l’euthanasie de l’animal. Deux prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés à deux âges différents, le second prélèvement sera suivi d’une euthanasie.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, l’anesthésie gazeuse, les prélèvements sanguins (douleur légère liée à la piqûre de la veine et risque possible d’hémorragie), la mise en place d’une période d'hébergement individuel pour les animaux, les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques avant la chirurgie sans réveil, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. Pour l’anesthésie une détresse respiratoire et l’hypothermie des animaux est possible.
Devenir
Le projet décrit est réalisé sur des souris. L’ensemble des 1380 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 1380 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Les paramètres environnementaux comprennent une humidité de 50 pour cent plus ou moins 20 pour cent, une température constante entre 20 et 24 degrés Celsius. L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification ainsi que d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés. Les injections intramusculaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Le stress induit par la séparation est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation. Les travaux antérieurs menés au laboratoire ou par d’autres équipes indiquent que l’injection intramusculaire des molécules pro-inflammatoires d’intérêt n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les portées seront particulièrement observées après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation impactant potentiellement l’élagage synaptique et la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (test à 9 jours de vie), jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie). Les injections seront réalisées pendant les deux premières semaines de vie de l’animal, de manière à modéliser une situation d’exposition réaliste chez l’enfant pendant sa 1ère année de vie.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour fournir à des laboratoires utilisateurs des souris dotées d'un système immunitaire humain, une plateforme prévoit de faire naître en cinq ans 4 800 souris de quatre lignées immunodéficientes, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souriceaux reçoivent avant 9 jours de vie des cellules souches humaines, chaque souris une irradiation, puis selon les protocoles jusqu'à huit prises de sang, des injections répétées sous la peau, dans l'abdomen, le muscle ou les veines, du gavage, jusqu'à dix séances d'imagerie, une greffe de tissu humain, une infection par le VIH ou des cellules tumorales humaines qui provoquent des tumeurs. Immunodéficientes, elles sont exposées aux infections et aux dermatites, et l'irradiation peut provoquer des tumeurs, observées selon le porteur chez moins de 10 % des adultes. Une souris prise de dyspnée dans les 5 à 10 minutes suivant une injection hydrodynamique est mise à mort. Le projet ne déclare aucune souris gardée en vie. Le porteur écrit pourtant que des souris pourront être incluses, "à la demande des utilisateurs de la plateforme", dans d'autres procédures décrites dans une demande de projet ultérieure, et n'annonce la mise à mort que pour celles de la procédure de validation d'immunomodulateurs.
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines telles que le VIH (virus de l'Immunodéficience humaine) et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité anti-infectieuse ou anti-tumorale et/ou leur impact sur le système immunitaire humain et/ou d’autres tissus humains.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie luminescente intravitale (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois) - greffe de tissus humain (1 par animal, durée 20min)
Impact sur les animaux
Du fait de leur degré d’immunodéficience et après infection par le VIH, ces animaux sont très sensibles aux infections. Après irradiation certaines souris transgéniques peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. De potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection hydrodynamique. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort. Après injection cellules tumorales humaines les souris développeront des tumeurs.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain(HIS), générés dans la procédure « génération de souris HIS » pourront être inclus dans des procédures permettant de stimuler les cellules immunitaires humaines et/ou de valider l’activité d’immuno-modulateurs. Les souris HIS dont la population de cellules immunitaires aura été augmentée, pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme dans les procédures permettant de greffer des tumeurs ou des tissus humains et/ou d’infecter les souris par des pathogènes afin d’étudier in vivo la réponse immunitaire humaine contre des pathogènes humains ou des tumeurs humaines. Ces animaux pourront également être inclus dans la procédure permettant de valider l’activité d’immuno-modulateurs ou dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet. Certaines souris issues de la procédure « génération de souris HIS » pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris HIS issues de la procédure permettant de valider, dans ce modèle de souris, l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort par analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
ous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 770 souris par an soit un total de 3850 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme. 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé en moyenne à 8 par an. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an). Afin de produire ces souris HIS, nous aurons 4 lignées de souris immunodéficientes en élevage en continu. Nous aurons 2 trios reproducteurs de chaque lignée en continu pendant les 5 années. Ce nombre est le minimum possible pour maintenir un élevage sans croiser les frères/sœurs. En partant du fait que chaque femelle d’un trio produit 5 petits par mois, chaque trio produit 10 petits/mois soit 10x12 = 120 petits/an. Ainsi pour chaque lignée, 120x2trios= 240 animaux seront produits chaque année. Pour chaque lignée, il y aura donc une production de 240x5ans = 960 animaux/lignée sur 5 ans. Nous produirons donc, pour les 4 lignées, 960x4 = 4800 animaux produits en 5ans.
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Un outil informatique de randomisation sera utilisé en amont des expériences pour garantir la répartition équilibrée entre les groupes de souris de variables susceptibles d'interférer (biais) avec la mesure ou l'analyse des résultats de l'essai. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de dermatite, les animaux seront placés sur une litière à base de cellulose et les lésions traitées avec un désinfectant. Après chaque intervention chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages chauffées pendant la phase de réveil, et auront du gel hydrique à disposition pendant plusieurs jours. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines dans des souriceaux nouveau-nés (
Impact de la craniectomie décompressive sur la neuroinflammation après un AVC ischémique malin.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une grande partie de la voûte crânienne retirée, la peau seule refermée sur le cerveau : 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. 160 subissent cette craniectomie, 160 un accident vasculaire cérébral provoqué, 180 les deux combinés, 160 constituant le groupe témoin avec des incisions cutanées refermées. Le porteur indique que le déficit neurologique provoqué peut entraîner des difficultés à se mouvoir, à se nourrir et à s'hydrater, ainsi que des troubles de la vigilance pouvant conduire au décès. Il affirme que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent être remplacées, tout en écrivant que le bénéfice de la craniectomie décompressive est déjà démontré chez les patients.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologique fréquente et grave dont un des traitements standards est l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA, par son action lytique sur le caillot fibrino plaquettaire, restaure le flux d’une artère occluse et améliore le pronostic neurologique du patient lorsqu’il est mis en place précocement. Un AVC malin est un type particulier d’AVC qui présente un volume important et notamment plus de 50% du territoire de l’artère sylvienne. Il est associé à plus de 80% de mortalité. La craniectomie décompressive (CD), procédure courante en neurochirurgie, permet de limiter à 30% le taux de mortalité de ces AVC. Elle consiste à retirer une grande partie de la voûte crânienne et à ne fermer que la peau sur le cerveau. Cela permet de limiter la compression du cerveau, de diminuer la pression intracrânienne et d'améliorer la perfusion cérébrale. Son bénéfice a été clairement démontré en clinique. Elle limite le risque de lésions cérébrales secondaires et diminue donc le risque de handicap séquellaire lourd. Cependant, même si la craniectomie décompressive présente un bénéfice à court terme en contrôlant l'augmentation de la pression intracranienne, il est probable que le fait de laisser le patient sans voûte crânienne puisse modifier la physiologie cérébrale, ainsi que les phénomènes secondaires à l’œuvre après une lésion cérébrale. Il est décrit dans la littérature que la voute cranienne est composé de niches de leucocytes. Dès lors, enlever la voûte cranienne pourrais influencer la neuroinflammation qui est un phénomène central lors d'un AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle (AVC et processus inflammatoires). Nous souhaitons évaluer l’évolution de la neuro inflammation lors de la réalisation d’une craniectomie et notamment mettre en évidence une modification de l’infiltrat leucocytaire. Cela permettra d’améliorer nos connaissances sur les craniectomies décompressives, et donc potentiellement d’en affiner les indications et les caractéristiques techniques. Ainsi, nous espérons améliorer la prise en charge future des patients.
Procédures
L’ensemble des animaux de la procédure seront soumis à une craniectomie décompressive (n = 160 ; 15 minutes), un modèle d’AVC (n = 160 ; 75 minutes), ou la combinaison des 2 techniques (n = 180 ; 90 minutes). Le groupe « sham » subira des incisions cutanées, ensuite refermées (n = 160 ; 5 minutes). 24 heures et 5 jours après, chaque animal fera l'objet d’un examen par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n = 660 , 45 minutes), ainsi qu’une évaluation comportementale (n = 660, 2 minutes). Un génotypage par biopsie sur la queue sera effectué à 1 semaine de vie pour les souris transgéniques (n=560).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress. La procédure d’AVC provoque un déficit neurologique qui peut entrainer une situation anxiogène importante associée à de difficultés pour se mouvoir, se nourrir et s‘hydrater. L’augementation de la pression dans la tête peut être à l’origine de troubles de la vigilance et peut conduire au décès. En plus, on peut noter des dysrégulations thermiques et des troubles hydroélectrolytiques dans le contexte de souffrance cérébrale. La biopsie de la queue lors du génotypage peut entrainer une douleur légère et de courte durée.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du système nerveux central (SNC).
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Au vu de l’implication à la fois locale et systémique de l’inflammation, il est nécessaire de réaliser les procédures in vivo. De plus, nous souhaitons évaluer l’inflammation dans la moelle osseuse, les méninges et le parenchyme ce qui implique d’avoir un ensemble de tissus (méninges, parenchymes…) non modélisables actuellement.
Réduction
Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Dans chaque phase du projet, le minimum d’animaux a été prévu afin d’arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet et des données de la littérature sur la neuroinflammation. Les procédures décrites ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas d'animaux. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’imagerie par résonnance magnétique sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s’alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l’oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage maximum, coton, paillettes, petite maison. Pendant les 48h critiques au modèle, les animaux seront également évalués et pesés 3 fois par jour pour surveiller les points limites. Une mise à mort sera réalisée si les points limites sont atteints et non reversés. Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau cervical et/ou crânien. Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront d’une couverture analgésique. Au vu des difficultés d’alimentation attendues, nous leur disposeront des croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage et mettrons également du « diet gel ».
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Ceci se justifie par le fait que l’AVC touche principalement les adultes. De plus, les études antérieures concernent également des modèles murins adultes. Dans ce sens, afin de faciliter le comparatif, nos souris le seront également.
Maintien de lignées transgéniques modèles d’une neurocristopathie (Renouvellement)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Les souris porteuses de l'allèle p53 muté sont tuées d'office à huit mois, pour devancer l'apparition de tumeurs spontanées. 200 souris vont être utilisées dans cet élevage, 150 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 50 un niveau sévère, avec une mortalité périnatale annoncée pour les porteuses d'une certaine combinaison génétique. Les actes déclarés se limitent à une biopsie de l'oreille de un millimètre et un tatouage d'identification. Le projet ne produit pas de résultats en propre, il entretient une lignée modèle d'une neurocristopathie, les animaux jugés intéressants partant vers un autre établissement pour d'autres projets et le reste étant tué si l'élevage s'arrête.
Objectifs
Nous avons montré que notre protéine d'intérêt est essentielle au developpement des cellules souches. Ces cellules souches donnent les os et le cartilage de la face ainsi que les neurones sensoriels et les cellules de Schwann des nerfs périphériques. L'ensemble de nos travaux montre que les modèles murins que nous avons générés développent des caractéristiques très similaires aux neurocristopathies humaines, pathologies d'origine génétique hétérogène induisant des défauts de développement des crêtes neurales. Ces maladies font partie des maladies rares. En outre, il a été montré qu'une inactivation d'un gène suppresseur de tumeur fait disparaitre totalement ou partiellement les signes cliniques de diverses neurocristopathies. C'est pourquoi nous souhaitons étudier si l'inactivation de ce gène dans nos souris, permet d'éviter ou de limiter le phénotype dommageable, renforçant l'intérêt de notre modèle comme modèle de neurocristopathie et soulignant aussi le rôle de notre protéine intérêt dans ces pathologies. Pour cela, et c'est l'objet de la présente demande, il nous faut maintenir notre élevage de souris. Les animaux aux caractéristiques interessantes pour l'étude seront transférés dans une autre EU pour intégrer différents projets.
Bénéfices attendus
Cet élevage à pour objectif de fournir des reproducteurs pour nos expérimentations dans une autre EU. Nos études apportent une meilleure connaissance du rôle du métabolisme de certaines cellules souches au cours du developpement embryonnaire et dans leurs dérivés.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie à l'oreille de 1 mm et un tatouage d'identification. Les douleurs produites à cette occasion seront légères et de courtes durées. La biopsie et le tatouage sont sans conséquences sur le bien être des animaux.
Impact sur les animaux
Tumeurs spontanées à partir de l'âge de 8 mois pour les animaux porteurs de l'allèle muté du gène suppresseur de tumeur. Mort périnatale pour les animaux porteurs de la combinaison génétique neutralisant notre gène d'intérêt.
Devenir
Les animaux produits ont pour vocation de maintenir notre modèle et de fournir des animaux pour les projets de recherche que nous menons dans un autre EU. A la fin de la procédure d'élevage, si nos projets de recherche sont prolongés ou bien si d'autres projets font l'objet d'un financement au delà de la période de cette DAP, nous ferons une nouvelle demande d'autorisation de projet pour maintenir notre lignée. Dans le cas contraire notre lignée étant cryopréservée, nous stopperons l'élevage en procédant à la planification de l'arrêt des reproductions et l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Nous travaillons sur des syndromes liés à des défauts de développement embryonnaire. Ces pathologies génétiques rares au tableau clinique complexe n'ont pas de modèle in vitro. En parallèle d'études des mécanismes moléculaires in vitro sur une lignée de cellule de crêtes neurales, il est nécessaire d'étudier le devenir de ces cellules in vivo, dans leur microenvironnement. Pour étudier l'impact réel des modifications génétiques sur l'évolution de ces pathologies, nous devons faire naitre des animaux.
Réduction
Nous ne faisons pas de croisement produisant les phénotypes sévères et létaux à la naissance, ce qui réduit fortement le nombre d'animaux à phénotype dommageable.
Raffinement
Pour les animaux porteurs de l'allèle muté p53, nous pratiquons l'euthanasie systématique à l'age de 8 mois afin d'éviter l'apparition de tumeurs spontanées. Cette méthode a montré son efficacité sur la dernière période de 5 ans au cours de laquelle l'apparition d'une tumeur a concerné moins de 2% des souris porteuses de cet allèle. Pour les 2% se souris qui peuvent présenter des tumeurs avant cette date, elles seront euthanasiées dès qu'une grosseur ou un signe de mal-être sera détecté au cours des observations quotidienne et du change des litières. Les points limites ainsi définis permettent de mettre en place des critères d'arrêt prédictifs et précis pour limiter la souffrance de nos animaux. Les conditions d'hébergement sont respectées pour nos animaux selon les recommandations gouvernementales avec, notamment, la mise en place d'enrichissement. Enfin, le personnel travaillant sur nos animaux est compétent et formé
Choix des espèces
La souris est un vertébré au developpement embryonnaire comparable au developpement embryonnaire humain avec un cyle de gestation court et des portées nombreuses. Cela permet de générer rapidement des embryons et des souriceaux. En outre la souris est un modèle courant pour l'étude des neurocristopathies. C'est notre modèle depuis une dizaine d'année et un grand nombre de nos données antérieures portent sur ce modèle. Tous les animaux ont pour fonction de maintenir la lignée. Nous les utiliserons donc à l'âge adulte.
Effets phénotypiques de la déficience et de la supplémentation en acides aminés indispensables : Identification et validation des biomarqueurs chez le rat en croissance (multisites 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
720 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe la période expérimentale seul en cage, dont deux fois 24 heures en cage métabolique et deux fois trois jours en cage de calorimétrie, avec deux radiographies sous isoflurane, deux prises de sang de 500 microlitres à la queue et un transport en voiture jusqu'à une plateforme distante. Ils sont nourris de régimes volontairement déficients en acides aminés indispensables, pour chercher dans leurs urines et leur sang des marqueurs de cette carence. Le porteur affirme que mesurer la croissance et le comportement alimentaire "empêche" tout remplacement par des modèles cellulaires, et présente le rat comme un modèle de l'enfant dénutri.
Objectifs
La qualité de l’apport alimentaire en protéines des régimes alimentaires dépend de leur capacité à satisfaire les besoins en acides aminés (AA) indispensables (AAI) tout au long des cycles de vie. C’est une question majeure de sécurité nutritionnelle, principalement dans les pays en voie de développement, où l’apport protéique total est modéré, voire bas. Plus généralement, la connaissance de la qualité de l’apport alimentaire en protéine est primordiale pour comparer les différentes sources de protéines, notamment dans le cadre des discussions sur le rééquilibrage des sources alimentaires végétales et animales, et la recherche de sources alternatives de protéines. La composition en AAI est variable selon les sources protéiques. En effet, les protéines d'origines animales ont un profil homogène et équilibré en AAI, alors que les protéines de céréales et les protéines de légumineuses (comme le gluten) sont déficientes en certains AAI. Les profils de référence de besoin en AAI, utilisés pour l’évaluation de la qualité protéique, initialement déterminés à partir de données de bilan azoté, ont été révisés à la hausse (Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)/Organisation mondiale de la santé (OMS),2007) sur la base de nouvelles méthodes, rendant plus sélectifs les critères de qualité des protéines. Cependant, ces valeurs révisées restent discutées. Ainsi, lors de son rapport sur le besoin en protéines et AA en nutrition humaine, le comité (FAO/OMS) a conclu qu’aucune méthode actuelle d’estimation du besoin en AAI n’est entièrement fiable et qu'iI est donc primordial de proposer de nouvelles approches complémentaires pour préciser les valeurs des besoins et d’évaluer le statut nutritionnel protéique des différentes populations. Pour cela, la FAO a recommandé le recours à l’usage d’outils tels que la métabolomique (ensemble des métabolites), qui a notamment été appliquée avec succès pour estimer le besoin en d’autres micronutriments. L’objectif de ce projet est d’identifier les variations des profils du métabolome urinaire et plasmatique comme biomarqueurs spécifiques de la déficience en AAI et à évaluer l’efficacité de la supplémentation pour valider les biomarqueurs identifiés. Ce projet fait suite à deux projets précédents pour lesquels nous avons identifié et validé des biomarqueurs urinaires pour trois des neuf AAI. Ce projet se déroulera sur 2 sites, dont une plateforme pour évaluer leur dépense énergétique et la composition corporelle.
Bénéfices attendus
L’identification et la validation de biomarqueurs du statut en AAI permettra, à terme, de mieux définir les besoins en acides aminés indispensables. Cela servira à affiner les politiques nutritionnelles et à mieux évaluer la qualité des sources protéiques. De plus, cette étude nous renseignera sur les effets d’une supplémentation en ces acides aminés indispensables après une phase de déficience. Ces effets n’étant que peu rapportés dans la littérature, ces informations seront très utiles, notamment pour l’étude de la sous-nutrition chez l’enfant avec retard de croissance.
Procédures
Durant la période expérimentale , les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire. Les animaux seront placés deux fois pendant la période expérimentale en cages métaboliques pendant 24h pour collecter les féces et les urines, et deux fois en cage de calorimétrie pendant 3 jours pour la mesure de dépense énergétique. La densité minérale osseuse et la longueur du tibia seront analysés par radiographie deux fois au cours de l'expérience après anesthésie gazeuse (anesthésie à l'isoflurane 2% pendant 10-15min). Deux prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue de 500μl chacun .A la fin de l'expérimentation, les animaux seront mis à mort et une injection de valine 13C sera réalisée 30 minutes avant l’euthanasie (150μmol/100g poids corporel), dans le but de mesurer la synthèse protéique.
Impact sur les animaux
Durant la période expérimentale, les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire et de leur dépense énergétique (cages de calorimétrie indirecte), ainsi que la collecte des urines et fécès (cages métaboliques), ce qui peut engendre un stress modéré dû à l’isolement des animaux. Les animaux seront transportés à la plateforme 3 jours avant d'effectuer les mesures, afin d’évaluer leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte et leur composition corporelle. La plateforme se situe à plusieurs km de l’unité de rechercheset le transport des animaux sera réalisée en voiture ce qui peut engendrer un stress modéré. Aussi, les prélèvements sanguins lors de la procédure 2 sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré. Une injection sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. L’anesthésie gazeuse permettra de réduire la douleur engendrée par l’injection.
Devenir
Tous les rats seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser des analyses sur différents tissus cibles.
Remplacement
La nécessité de mesurer les conséquences de l'ingestion d’un régime à faible teneur en AAI sur le comportement alimentaire et les paramètres de la croissance (gain de poids et composition corporelle) empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Les résultats de ce projet permettront de mettre en place une étude clinique chez l’enfant dénutri. Ainsi, les objectifs de ce projet ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal, le rat étant un modèle pour l'humain, en particulier pour la nutrition.
Réduction
A partir des données issues d’une étude précédente, nous avons déterminé qu’un effectif de 10 rats par groupe est le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garder une puissance statistique satisfaisante. Cette étude inclue 6 lots, correspondant à chaque AAI à étudier. L’expérimentation comprendra 80 animaux pour chaque AAI étudié.
Raffinement
Le projet impose l'hébergement des rats en cages individuelles (répondant aux normes en vigueur) pour la mesure précise de la consommation alimentaire. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils continuent à échanger par vocalises, et ils les voient et les sentent, ce qui modère l’impact de l’isolement. De plus, les cages seront enrichies au moyen de différents objets (tunnel, d’une tasse renversée, …) . De plus, un enrichissement social est prévu : les animaux seront placés en cages collective tous les jours pendant 2 h (durant les mesures de poids corporel et de gaspillage alimentaire). Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. Des aiguilles spécifiques permettant un écoulement plus efficace du sang en sortie d’aiguille sont utilisées, ce qui permet de limiter la durée et le stress engendré par les prises de sang. Les animaux seront transportés à la plateforme en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : Les animaux seront regroupés en fonction des régimes en cages collectives de transport avec de l’eau en gelée et de la nourriture à disposition. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus, l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’homme, le porc ou le rat pour étudier la qualité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Nous utiliserons ainsi des rats en croissance comme modèle de l'enfant en croissance.
Rôle d’une protéine identifiée dans les lésions du cerveau induites par l’inflammation à la naissance chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux âgés de un à cinq jours reçoivent neuf injections d'une molécule inflammatoire dans l'abdomen, pour reproduire les lésions cérébrales des enfants nés prématurément. 493 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 387 d'entre elles et sévère pour 106. Le porteur qualifie l'injection intrapéritonéale sur animal vigile d'acte "peu douloureux" ne nécessitant aucune anesthésie, tout en annonçant une mortalité de 5 à 10 % liée à cette injection, un retard de croissance et des troubles du comportement. Une partie des souriceaux passe des tests de vocalisation, de préférence maternelle et des trois chambres, avant que tous soient tués aux 3e, 15e et 60e jours de vie pour prélever le cerveau.
Objectifs
Les enfants nés prématurément, avant 37 semaines de grossesse, sont à haut risque de développer des lésions cérébrales (substance blanche), qui induisent un large spectre de pathologies neurologiques. 40% des naissances prématurées surviennent dans un contexte inflammatoire entrainant alors chez le fœtus une inflammation au niveau des différentes cellules du cerveau. La microglie est un ensemble de cellules dans le cerveau qui constitue la première ligne de défense contre les infections mais joue également un rôle majeur dans le développement cérébral. En cas d’’inflammation au cours de la période néonatale, la microglie va s’activer et devenir néfaste pour le développement du cerveau. Une protéine a été́ identifiée comme l’un des éléments centraux qui sont régulés par le développement et modulés par l’inflammation. Cette protéine est exprimée par la microglie pendant le développement chez la souris et chez l’Homme. Dans un modèle murin mimant les lésions cérébrales du prématuré́, l’exposition précoce à l’inflammation induit une persistance de l’expression de cette protéine dans la microglie. L’objectif de notre étude est de décrire les rôles de cet protéine en supprimant son expression dans la microglie. Pour cela, nous croiserons 2 types de souris permettant d’éliminer la production de cette protéine uniquement au niveau de la microglie.
Bénéfices attendus
le premier bénéfice attendu est l'amélioration des connaissances scientifiques sur le rôle d'une protéine dans la cellule microgliale Le deuxième bénéfice attendu est l'amélioration des connaissances scientifiques sur une protéine au cours du neurodéveloppement Enfin, ce projet permettra de proposer des pistes expliquant les mécanismes en cause dans les lésions cérébrales chez le prématuré
Procédures
Les souriceaux, vigiles, recevront deux injections intra-péritonéales ( dans l abdomen) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du 1er au 4ème jour de vie, puis une le matin du 5ème jour. L’injection dure moins de 5 secondes. Une partie des animaux sera soumise à des tests de comportement (vocalisation, préférence maternelle, test ds 3 chambres) aux 2ème, 8ème et 60ème jours de vie. Ces tests ne durent que quelques minutes, mais peuvent être sources d’un stress modéré.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : - Une mortalité de 5 à 10% liée a l'injection- Une infection locale dans la zone d’injection - Un retard de croissance et des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...) stress induit par les tests comportementaux
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures pour prélever le cerveau pour analyse.
Remplacement
Les mécanismes étudiés dans ce projet mettent en jeu des connexions au sein de l’organisme qu’il est impossible de reproduire in vitro. Le traitement visant à réduire l’expression d'une protéine dans le cerveau a été au préalable évalué in vitro sur des cultures cellulaires et reste insuffisant pour confirmer les données sans avoir recours à un organisme vivant entier. Il s’agira donc ici d’évaluer les fonctions de cette protéine chez l’animal pendant le développement et de comprendre les conséquences sur les autres cellules, et sur les comportementaux anormaux induits par l’inflammation.
Réduction
Les précédents travaux ont permis d’affiner le nombre d’animaux nécessaires pour chacune des approches expérimentales de ce projet. Nous avons estimons par calcul statistique que 6 à 24 animaux par groupe permettra de répondre aux questions scientifiques de ce projet,
Raffinement
Un enrichissement des cages est réalisé systématiquement avec du papier doux absorbant qu’utilisera la mère pour former son nid. Les cages des femelles gestantes génétiquement modifiées, qui peuvent être plus stressées que des femelles normales, seront enrichies d’une maison en plexiglass rouge qui servira de refuge réduisant ainsi l’anxiété. Nous réalisons des injections intrapéritonéales sur animal vigile ; c’est un acte peu douloureux, aucune anesthésie n’est nécessaire. Une évaluation quotidienne vérifiera le bien etre des animaux: à la phase aiguë, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière de la prise de poids, de l’absence de troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
La souris a été choisie car les mutations génétiques sont plus faciles à réaliser dans cette espèce que chez d’autres rongeurs, Ce modèle est par ailleurs pertinent car il présente des lésions du cerveau et des troubles du comportement similaires à ceux observés chez les enfants prématurés. Ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré de moins de 28 semaines, car un souriceau à 1 jour de vie correspond à un prématuré de 28 jours, par ailleurs, cette correspondance a l’avantage de ne pas impliquer d’intervention in utero. L’inflammation sera provoquée chez le souriceau entre le 1er et le 5ème jour de vie, stade correspondant au 3ème trimestre de grossesse chez l’homme. Cette stimulation mime ainsi les situations d’infection à la période de la naissance, et lors de naissances prématurées. Une partie des animaux sera euthanasiée au 3ème jour de vie, qui correspond au pic de l’inflammation dans le cerveau, puis au 15ème jour, qui correspond à une phase importante de maturation du cerveau, et enfin à P60 qui correspond au stade jeune adulte.