Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Caractérisation du rôle des évènements de signalisation impliquant Rap1 dans les ostéoclastes et sur le développement de l’os chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une biopsie d'oreille au sevrage, puis pour une partie des femelles l'ablation des ovaires sous anesthésie : 2 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 000 d'entre elles et modéré pour 1 200. Les femelles opérées à six semaines sont tuées six semaines plus tard, après un prélèvement de sang réalisé sous anesthésie, sans réveil. Le projet cherche des cibles pharmacologiques contre l'ostéoporose en invalidant des protéines des ostéoclastes, les cellules qui dégradent l'os. Le porteur écrit qu'aucun ou peu d'effets indésirables sont attendus, tout en décrivant une douleur modérée de deux à trois jours après l'ablation des ovaires, un risque d'hypothermie, de déshydratation et d'infection de la cicatrice.
Objectifs
Les os subissent un remodelage constant tout au long de notre vie. Ce remodelage est un processus complexe qui implique l’action coordonnée de deux types de cellules : les ostéoblastes qui fabriquent la matrice osseuse, et les ostéoclastes qui dégradent l’os. Avec l’âge et dans certaines maladies inflammatoires, l’activité des ostéoclastes domine et l’os devient plus fragile. C’est le cas de l'ostéoporose qui affecte des centaines de milliers de personnes en France. Les traitements actuels affectent la viabilité des ostéoclastes, ce qui a malheureusement des effets néfastes sur les ostéoblastes et donc la formation de l’os. Dans ce contexte, il est impératif de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la perte osseuse et d'identifier des facteurs spécifiques aux ostéoclastes, qui pourraient représenter de nouvelles cibles pharmacologiques pour traiter l’ostéoporose. Nous utilisons des souris avec des mutations pour étudier in vivo les conséquences de l’invalidation des protéines candidates sur la formation des ostéoclastes et le développement des os en condition normale et aussi dans le contexte d’une perte osseuse induite par une ovariectomie qui mime la ménopause par la chute des oestrogènes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) caractériser le rôle de protéines candidates susceptibles de réguler la formation des ostéoclastes et leur activité de dégradation de l'os ; (ii) mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le développement de l'os ; (iii) valider le nouveau concept consistant à cibler la formation et/ou la fonction des ostéoclastes tout en préservant leur viabilité et, par conséquent, la formation osseuse par les ostéoblastes, plutôt que l'induction de la mort des ostéoclastes par les traitemenst actuels ; (iv) identifier de nouveaux points d'intervention thérapeutique.
Procédures
Les prélèvements sur animaux vigiles sont limités uniquement à une biopsie pratiquée sur l'oreille (moins de 2 minutes) au moment du sevrage, afin de déterminer le génotype des animaux. Nous prélevons un échantillon de sang (moins de 5 minutes) sous anesthésie générale juste avant la mise à mort des animaux sans phase de réveil. La souris ovariectomisée reste le modèle de référence pour l'ostéoporose post-ménopausique induite par la chute des estrogènes. Nous procédons à l'ablation des ovaires par chirurgie (moins de 20 minutes) sur des souris femelles âgées de 6 semaines. Les animaux contrôles sont également opérés mais sans ablation des ovaires. Le phénotype osseux est examiné 6 semaines après la chirurgie.
Impact sur les animaux
Le prélèvement d'une biopsie et la pose d'une bague à l'oreille sont susceptibles de générer une douleur d'intensité légère qui peut durer au maximum 1 à 2 heures. Acun voire peu d'effets indésirables sont attendus sur les animaux. Parfois de légères altérations de l'aspect de l'oreille peuvent être observés avec les signes d'une inflammation locale et transitoire. Le prélèvement de sang, bien que réalisé sous anesthésie générale des animaux qui sont ensuite mis à mort sans phase de réveil, peut toutefois s'accompagner d'une douleur d'intensité légère. La profondeur de l'anesthésie et de l'analgésie est vérifiée régulièrement par l'absence complète de réflexes en réponse au pincement de la patte. La chirurgie nécessaire à l'ovariectomie sont susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Ces nuisances d'intensité modérée peuvent s'étendre jusqu'à 2-3 jours après la chirurgie. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec une analgésie en phases pré- et post-operatoires. Les souris présentent alors un risque d’hypothermie et de déshydratation, c’est pour cela qu’elles sont maintenues sur tapis chauffant pendant toute la durée de la chirurgie et qu’elles recoivent de la solution saline tiède toutes les heures. Après la chirurgie, un risque d'infection au niveau de la cicatrise étant possible, les animaux sont suivis quotidiennement jusqu’à la cicatrisation de la plaie selon la grille de scoring.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure visant à analyser le phénotype osseux en condition normale et aussi dans le contexte d’une perte osseuse induite par une ovariectomie.
Remplacement
Notre projet vise à caractériser les processus moléculaires qui orchestrent la formation des ostéoclastes et le développement des os en condition normale et aussi dans le contexte d’une perte osseuse induite par une ovariectomie. Notre étude nécessite l'interaction de divers organes et systèmes biologiques que l'on retrouve uniquement chez les animaux vivants et qui ne sont pas reproductibles in vitro.
Réduction
Chaque protocole a été basé sur un examen attentif des possibilités réductrices et une étude approfondie de la littérature. Notre équipe possède un grand savoir-faire en expérimentation animale, ce qui garantira que le nombre d'animaux utilisés dans les études sera maintenu au minimum, tout en préservant la puissance statistique pour garantir des conclusions interprétables. En fonction des résultats obtenus à certaines étapes clés du projet, nous poursuivons ou arrêtons certaines expériences pour ne réaliser sur les animaux vivants que les expériences indispensables.
Raffinement
Tous les animaux reçoivennt les soins vétérinaires nécessaires et appropriés pour minimiser leur inconfort. Ils sont manipulés avec ménagement et calme, et par du personnel compétent, pour réduire leur stress. Ils ne sont jamais isolés dans une cage au cours de la procédure et bénéficiront d’un environnement enrichi (tuyau, cubes de bois). La chirurgie nécessaire à l'ovariectomie est susceptible de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Cette étape est réalisée sous anesthésie générale avec une analgésie en phases pré- et post-opératoires. Les animaux sont suivis quotidiennement après l’opération. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux sont pris en compte à chaque observation grâce à une grille de scoring détaillée. Les animaux observés en détresse ou présentant des signes de souffrance sont immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle de choix pour réaliser notre étude en raison de : (i) la facilité à mettre en oeuvre la manipulation génétique ; (ii) la littérature abondante concernant des études similaires pour éviter des expérimentations inutiles ; (iii) l'excellente caractérisation des fonds génétiques ; (iv) le fort degré de convergence des paramètres osseux chez l'homme et chez la souris ; et (v) la bonne caractérisation du modèle d’ostéoporose induite par une ovariectomie. Nous utilisons les souris à 12 semaines d'âge pour évaluer le phénotype osseux au stade adulte. La croissance et la maturation relativement rapides des souris se poursuivant jusqu'à environ 10-12 semaines d'âge, cela nous permet d'analyser les défauts osseux accumulés au cours du développement et de s'affranchir d'éventuelles manifestations d'effets liés à l'âge. Les conséquences de l'ovariectomie sur l'activité des ostéoclastes se manifestent par une dégradation osseuse qui est visible dans un délai de 5-6 semaines. Ainsi, la chirurgie pour l'ablation des ovaires est réalisée à 6 semaines d'âge et le phénotype osseux est analysé 6 semaines plus tard, c'est à dire à 12 semaines d'âge également.
Étude de la fonction de gènes impliqués dans le développement et responsables de pathologies humaines chez le poisson zèbre (Danio rerio)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Certaines lignées de poissons zèbres utilisées portent des mutations qui les tuent vers dix à douze jours après la fécondation, et 28 % des poissons déficients pour certains gènes développent des tumeurs abdominales ou oculaires vers l'âge de huit mois. 1 560 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 080 d'entre eux et modéré pour 480. Le seul acte pratiqué sur animal vivant est le génotypage : anesthésie, amputation d'un morceau de nageoire caudale, puis 24 à 48 heures d'isolement en attendant le résultat, avec des douleurs post-amputation que le porteur situe à quelques heures. Tous les poissons finissent mis à mort pour prélever organes et échantillons, y compris les adultes d'élevage, remplacés tous les dix-huit à vingt-quatre mois.
Objectifs
Le projet a pour objectif l'étude de gènes connus pour leur implication dans des pathologies humaines comme les anomalies du développement et le cancer. Pour cela, le modèle poisson zèbre est utilisé comme modèle expérimental afin de replacer la fonction des gènes in vivo dans un organisme entier au cours du développement. Des poissons zèbres porteurs de mutations trouvées dans des maladies humaines seront générés afin de mieux comprendre la physiologie de ces pathologies et identifier des voies de traitement. Le poisson zèbre est un modèle qui possède de nombreuses caractéristiques intéressantes pour la modélisation des pathologies humaines. En particulier, (i) le poisson zèbre possède une large descendance, environ 200 œufs par femelle et par semaine qui offre une grande confiance dans les analyses statistiques ; (ii) l’homme et le poisson zèbre partagent de grandes similarités puisque 70% des protéines humaines et 82% des protéines impliquées dans des pathologies humaines ont un orthologue chez le poisson zèbre ; (iii) de nombreux processus cellulaires peuvent être observés chez le poisson zèbre en raison de la transparence des embryons ou chez des poissons adultes dépourvus de pigmentation ; (iv) les techniques de génétique inverse telles que la transgénèse ou l’édition du génome sont facilement applicables au poisson zèbre ; (v) le poisson zèbre absorbe les molécules qui sont dissoutes dans l’eau ; (vi) les pontes et le développement de l’embryon se font dans l’eau rendant les études du développement précoce non invasives.
Bénéfices attendus
Le projet à pour objectif la modélisation de pathologies humaines chez le poisson zèbre. À court terme, le projet permettra d’identifier certains mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces pathologies pour à plus long terme identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester des molécules pharmaceutiques. Les pathologies étudiées sont essentiellement des anomalies du développement, des maladies métaboliques et le cancer.
Procédures
Seul le génotypage des poissons lors de croisements d'individus hétérozygotes sera réalisé sur animaux vivants. Pour cela, l’ensemble des animaux issus de ce type de croisements (1080 poissons) seront placés un par un dans un bac contenant un anesthésique permettant de les endormir (pendant 2 à 3 minutes). Une fois anesthésiés, une biopsie de leur nageoire caudale sera réalisée (10 secondes). Les animaux seront ensuite placés dans un bac de réveil contenant un anti-douleur et observés pendant 24 à 48h. La durée totale de l’intervention est de 4 minutes suivies de 24 à 48h de surveillance. Durant la durée du génotypage, les poissons sont maintenus isolés et afin de réduire le stress lié à l’isolement, ils sont maintenus préférentiellement par couple un mâle/une femelle, ou si seuls, en présence d'objets en plastique afin de compenser l'absence de congénères. Les bacs qui contiennent les poissons isolés sont placés au voisinage les uns des autres afin que le contact visuel avec d’autres congénères soit toujours possible. La nageoire caudale se régénère totalement après 10 à 15 jours.
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage sur des biopsies de la nageoire caudale peut induire des effets indésirables sur les poissons adultes. Le stress lié à la capture peut durer quelques secondes jusqu’à l’anesthésie ; les douleurs post-amputation peuvent durer quelques heures ; le stress lié au maintien des poissons isolés le temps d’obtenir les résultats du prélèvement peut s’étendre sur 48 heures. Le phénotype dommageable de certaines lignées génétiquement modifiées est responsable d’effets indésirables sur les animaux. Ces effets peuvent être une mort précoce avec une mort survenant vers 10-12 jours après la fécondation. Ces effets peuvent être le développement tumoral : 28% des poissons déficients pour certains gènes développent des tumeurs abdominales ou occulaires vers l’âge de 8 mois.
Devenir
Le projet nécessitant l’analyse des échantillons / organes issus des poissons, l’ensemble des animaux sera mis à mort.
Remplacement
L'étude de l'expression de gènes impliqués dans les anomalies du développement peut difficilement être modélisée in vitro ou in silico. De même, la tumorigenèse repose sur des mécanismes complexes ; prolifération, interactions cellules-cellules, interactions cellules-matrice extracellulaire, vascularisation, stimulation hormonale, action de cytokines, facteurs de croissance,... À ce jour, un tel degré de complexité ne peut être modélisé in vitro. Particulièrement, la capacité des tumeurs à attirer des vaisseaux sanguins ou à former des métastases ne peut être étudiée qu’en organisme complet. Le modèle poisson zèbre qui possède une fécondation et un développement externe permet l’étude des processus de manière non invasive et contribue à la réduction de l’utilisation des rongeurs en expériementation animale.
Réduction
Les connaissances de notre modèle et l’expérience acquise au sein de notre laboratoire nous a permis de réduire le nombre d’animaux nécessaires au minimum afin de maintenir notre élevage. Ce qui représente un total de 20 poissons (10 mâles et 10 femelles) par lignée sur une durée maximum de deux ans avant production d’une nouvelle génération. Un nombre inférieur altèrerait la cohésion sociale des individus de cette espèce conduisant à une augmentation de l’aggressivité et du mal-être des animaux. Ce nombre d’animaux permettra de maintenir l’élevage d’une lignée et de fournir les embryons et larves précoces nécessaires au projet. Les poissons sont maintenus entre un an et demi et deux ans avant la production d’une nouvelle génération. Pendant la transition entre l’ancienne et la nouvelle génération, qui dure approximativement 4 mois, une quarantaine d’individus sont maintenus en élevage (20 jeunes et 20 âgés) jusqu’à ce que nous soyons sûrs que la nouvelle génération produise une ponte de bonne qualité pour la suite de l’élevage (les animaux de l’ancienne génération sont alors mis à mort). Cette durée est un bon compromis qui laisse un temps suffisamment long entre les générations et réduit le nombre d’animaux d’élevage mais suffisamment court pour que la majorité des poissons ne présentent pas d’altérations liées au vieillissement. Une procédure de génotypage des lignées à partir d’embryons de 3 jours est progressivement mise en place afin de limiter le nombre d’animaux du génotype non désiré dans l’élevage.
Raffinement
Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, les poissons zèbres sont hébergés en animalerie conventionnelle, maintenus dans un environnement social adéquat et dans des conditions d’hébergement appropriées. L'enrichissement est assuré par : (i) L’utilisation d’un flux d’eau dynamique qui stimule la rhéotaxie, les appareils sensoriels et moteurs. (ii) L’apport journalier de nourriture vivante fournissant un enrichissement à court-terme en stimulant le comportement prédateur naturel des poissons zèbres. (iii) L’hébergement des poissons en groupe de 5 poissons / L. L’enrichissement social contribue à réduire l’anxiété et permet une meilleure récupération suite au stress. Pour des raisons expérimentales ou suspicion de maladie, des poissons peuvent être amenés à être maintenus isolés. Dans ces cas exceptionnels, les poissons seuls sont systématiquement maintenus en présence d’enrichissement de type plante en plastique et les aquariums placés au voisinage d’aquariums contenant d’autres poissons afin qu’un contact visuel avec d’autres congénères soit maintenu. Afin de protéger les animaux de toute forme de souffrance, une observation rigoureuse est réalisée deux fois par jour au moment des nourrissages selon des critères établis dans une feuille de score. L’atteinte d’un point limite ou d’un score établi entraînera la mise à mort de l’animal. Les points observés sont les suivants : - la charge pondérale des poissons - la perte d'appétit - l'amplitude respiratoire anormale (faible, forte ou incomplète) - la locomotion (nage chaotique, saccadée, en cercle), la flottabilité (changement d'occupation dans la colonne d'eau) et la position statique (déséquilibré) - l'aspect général des poissons (perte des couleurs, malformation, présence d'œdèmes, altération des nageoires) Dès l'apparition d'un de ces signes, les poissons sont observés plus particulièrement (et éventuellement isolés). En cas de persistance ou d'aggravation des signes, les poissons sont mis à mort.
Choix des espèces
Actuellement, de nombreux laboratoires à travers le monde utilisent le modèle poisson zèbre. En effet, de nombreux mécanismes de maladies humaines peuvent être élucidés rapidement grâce au poisson zèbre et la recherche menée avec ce modèle a aussi bien aidé à identifier des gènes causant des maladies humaines qu’à donner des informations précieuses du point de vue clinique. De plus, ce modèle répond particulièrement au principe des 3R permettant la réduction de l’utilisation des mammifères au laboratoire et l’expérimentation sur ses embryons n’est pas invasive, contrairement à celle menée sur les mammifères. La grande majorité des expérimentations se feront sur des embryons (0 à 72 heures après fécondation) ou sur des larves précoces (72 heures après fécondation à 12 jours après fécondation ; larves de moins de 6 mm). À ces stades, tous les organes sont mis en place. Les poissons adultes (plus de 3 mois après fécondation) seront utilisés pour maintenir les lignées et fournir les embryons et larves sur lesquels les analyses phénotypiques seront effectuées. Dans de rares cas, des prélèvements d’organes seront effectués sur des adultes préalablement mis à mort.
Etude des effets sur l’Omble Chevalier de l’exposition à un cocktail de polluant issus des particules d’usure de pneus et de chaussées
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Pour mesurer les effets d'un mélange de polluants issus de l'usure des pneus et des chaussées, 1 664 ombles chevaliers aux premiers stades de vie vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les larves sont exposées vingt-quatre heures par bain à du benzo[a]pyrène et à une molécule issue des pneus, à des doses relevées dans les bassins versants alpins, puis filmées dix minutes par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur attend jusqu'à 10 % de mortalité liée à la hausse de température, et rappelle qu'une étude antérieure avait relevé 14 % de malformations de la colonne vertébrale et du sac vitellin. Les individus malformés sont tués par surdose d'anesthésiant, les autres à la fin de l'expérience, poursuivre au-delà des stades étudiés étant jugé "inutile".
Objectifs
Les grands lacs de la région alpine, comme de nombreux écosystèmes aquatiques, sont impactés par des micro-plastiques dont la majorité serait issue de l’usure des pneus et des chaussées . L’impact sur les organismes aquatiques de ces micro-plastiques spécifiques est encore mal connu même si des études ont récemment révélé la toxicité de certains constituants chimiques sur des espèces piscicoles . Cette molécule a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho. Néanmoins, le mode d'action précis de cette molécule est toutefois encore inconnu, même s’il semble être lié à une entrainer des modifications de comportement. Ainsi, avec notre étude actuelle, menée sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier contaminés à des doses environnementales a mis en évidence une augmentation du nombre de malformations. Pour aller plus loin dans la compréhension des atteintes de cette molécule nous proposons d’explorer les effets d’un mélange de molécules issues de l’usure des pneus et des chaussées. Ainsi, nous allons combinées cette molécule avec une molécule d’hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAPs). Ces dernières proviennent essentiellement des revêtements de chaussée et des fumées d’échappement des moteurs thermiques. En raison de leur structure chimique, les HAP sont des composés hydrophobes, ce qui explique sa distribution dans les sols et les sédiments. Ces polluants sont fortement présents dans le bassin Rhône Alpes Méditerranée Corse. Ainsi, le projet se propose d’étudier un cocktail issu de deux molécules, l’une émergente et l’une connue comme toxique et marqueur d’anthropisation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à amener des connaissances sur les effets à doses environnementales d’un polluant historique marquer d’anthropisation : le BaP et d’une molécule émergente dans un contexte de réchauffement climatique.
Procédures
Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogène et juvénile . Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 1h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac du au transfert de animaux entre les aquariums. Les animaux seront soumis par balnéation durant 24h a une contamination au BenzoApyrene (BaP) qui est un hydrocarbure à une dose de 0.1ng/l ainsi qu'à la molécule 2-((4-Methylpentan-2-yl)amino)-5-(phenylamino)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione qui est une molécule récement découvete (6 PPD-Q) soit à 1.5 µg/L ou à 3µg/L. Ces doses correspondent à des doses environemantales retrouvées dans nos bassins versants.
Impact sur les animaux
Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Si nous nous basons sur notre précédent projet testant la toxicité de la molécule 2-((4-Methylpentan-2-yl)amino)-5-(phenylamino)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione (6 PPD-Q) réalisée au stade embryo- larvaire sur les larves d’omble chevalier , nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité, par sécurité nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison du couplage de cette molécule au BaP. La précédente étude menée sur des ombles chevalier de même age contaminés avec une solution de (6PPD-Q) à 3µg/L et incubés à 8.5°c montre une augmentations des malformations de la colonne vertébrale et du sac vitellin de 14%. Si de tels malformations se produisent les individus seront mis à mort par surdose d'anesthésiant.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis
Remplacement
Le modèle animal n'est pas remplaçable par un modèle in vitro car il nécessite une étude dans un système intégré (différents tissus fondamentaux, différents organes et notamment système inflammatoire...).
Réduction
L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude.
Raffinement
L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends. De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience . Des points limites assez prédictifs seront établis afin de palier à toutes souffrances, mal être et stress des animaux.
Choix des espèces
Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD- Q couplé au BaP durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique. Les premiers stades de vie sont ciblés pour cette étude en raisons de : -Leur immaturité homéostatique , ainsi leur systéme de détoxification n'est pas mature et ils n'auraient pas la capacité de se défendre ou de facon optimale contre le stress. -Les premiers stades de vie sont un maillon clé pour le recrutement de la population
Etude du rôle des canaux chloriques dans la survie des neurones transitoires du cortex de la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Nés dans l'élevage des lignées génétiquement modifiées du projet, tatoués et amputés d'un bout de queue pour génotypage dans leur deuxième semaine de vie, 1 344 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 288 d'entre eux reçoivent des injections d'anesthésiant et d'analgésique avant d'être vidés de leur sang par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi certaines cellules nerveuses transitoires du cortex meurent entre le huitième et le vingt-cinquième jour après la naissance, leur maintien étant associé chez l'humain à des crises d'épilepsie. Les 1 056 autres souriceaux ne subissent que le tatouage et la biopsie, puis sont tués, leur seul rôle ayant été de faire naître les animaux réellement étudiés.
Objectifs
Le cortex cérébral contrôle la perception sensorielle ainsi que les fonctions motrices et cognitives (mémoire, pensée, réflexion…) et joue donc un rôle essentiel dans le fonctionnement du cerveau des mammifères. La mise en place de cette structure au cours du développement embryonnaire nécessite une coordination très fine de la génération des différents types cellulaires, du contrôle de leur migration et de leur positionnement final. Il est également de plus en plus reconnu que l’élimination de certains types de cellules neuronales au cours du développement périnatal est fondamentale pour la mise en place d’un cortex cérébral normal. Le maintien de ces cellules au stade adulte chez l’homme est associé notemment à des crises d’épilepsie. Certaines cellules transitoires du cortex spécialisées dans le développement du cerveau jouent un rôle clef dans la migration neuronale et la mise en place des aires corticales. Chez la souris, elles sont divisées en 3 sous-populations selon leurs origines et meurent massivement entre 8 jours et 25 jours après la naissance. Nos travaux ont impliqué l’activité électrique comme étant responsable de la mort de seulement une fraction de ces cellules. La concentration intracellulaire de chlore joue un rôle critique dans l’activité des neurones corticaux, et change drastiquement après la naissance suite à des variations importantes dans l'expression de protéines impliquées dans le transport du chlore. Or, nos cellules transitoires d'intérêt ne réalisent pas ce changement, ce qui pourrait aussi être à l’origine de leur mort. Ainsi, ce projet vise à identifier l'impact de l'expression des protéines impliquées dans le transport du chlore sur la mort des cellules transitoires d'intérêt grâce à l'utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ces travaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la mort de nos cellules transitoires d’intérêts au cours du développement du cerveau chez la souris et ainsi de mieux appréhender leur importance dans l’apparition de pathologies neurologiques chez l’homme.
Procédures
Le tatouage pour l’identification (1 minute) et un prélèvement de la queue pour génotypage (10 secondes) seront réalisés sur tous les nouveaux-nés du projet, à l’état vigile, dans leur deuxième semaine post-natale. Parmi les 1344 animaux du projet, 288 animaux subiront deux injections successives intrapéritonéales (10 secondes chacune) d'analgésiques et d'anesthésiants avant de subir une chirurgie d'exsanguination intracardiaque par perfusion de paraformaldehyde (10 minutes).
Impact sur les animaux
Les nouveaux-nés subiront un stress léger lié à la contention, au tatouage et une douleur légère liée à la biopsie de queue. Les animaux subiront un stress et une douleur légère liés aux injections intrapéritonéales
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet, soit afin d'être prélevés pour les besoins des études histologiques. soit après avoir permis de générer les animaux nécessaires auxétudes histologiques.
Remplacement
Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées que sur des cerveaux de mammifères. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cerveau, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère car nos cellules d'interêt n'existent que chez les mammifères. Le développement du cerveau des mammifères et de son fonctionnement est de mieux en mieux caractérisé chez la souris avec de nombreux modèles génétiques, ce qui en fait un modèle de choix. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous optimisons les croisements des lignées transgéniques. Nous étudions à la fois les mâles et les femelles et nous optimisons au maximum les échantillons obtenus en réalisant plusieurs séries de coupes par cerveau pour réaliser plusieurs marquages différents sur un même cerveau. Pour les études histologiques, les effectifs ont été déterminés pour mettre en évidence une différence statistique.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi (bâtonnet à ronger et coton pour la nidification) avec eau et nourriture ad libidum. La mise à mort est effectuée en limitant le plus possible la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Des points limites ont été mis en place afin d'arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ou la détresse d’un animal d’expérimentation à l’aide de mesures telles que l’euthanasie, l’arrêt du processus qui le fait souffrir, ou l'application d'un traitement visant à le soulager.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cerveau entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées, grâce à la présence des cellules transitoires d'intérêt. Nous allons étudier les rôles de l’expression des deux protéines impliquées dans le transport du chlore sur la survie des cellules transitoires d'intérêt soit 8 jours après lar naissance (au début la période de mort de nos cellules d'intérêt) soit 25 jours après lar naissance (à la fin de leur période de mort).
Influence de l’alimentation sur le remplacement des dents chez le cichlidé Astatoreochromis alluaudi
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour mesurer la durée du cycle de remplacement des dents pharyngiennes lors d'un passage à une alimentation dure, 65 cichlidés Astatoreochromis alluaudi vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est anesthésié par balnéation puis reçoit une injection de marqueur dans l'abdomen, l'ensemble durant une dizaine de minutes, avant d'être tué en fin de projet pour que ses mâchoires soient prélevées et coupées. Les individus qui développent ensuite une hydropisie, des écailles hérissées ou un trouble de la vessie natatoire sont mis à mort par surdose d'anesthésique. Le porteur justifie le choix de cette espèce du lac Victoria par le fait qu'elle est la seule à avoir déjà fait l'objet d'études documentant cette plasticité dentaire, ce qui la rend selon lui "absolument unique" pour le projet.
Objectifs
Le but du projet est de déterminer la durée du cyle de remplacement des dents pharyngiennes chez une espèce de poissons de la famille des Cichlidés mangeur d'escargots non obligatoire afin de mieux comprendre la plasticité dentaire et élaborer des modèles de plasticité dentaire. Cette espèce possède un profil alimentaire varié. Comme beaucoup d'espèce elle possède une machoire pharygienne abritant des dents de différentes formes. En fonction de son alimentation, les dents sont remplacées et la forme des nouvelles dents change. Une alimentation constitué d'aliments durs entraine l'apparition de plus de dents en forme de molaire par exemple. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. Au cours d'un précédent projet, nous avons pu évaluer avec succès la durée du cycle de remplacement lors d'une prise alimentaire standard. Dans la présente demande, nous souhaitons afiner les résultats obtenus en réalisant une étude pour étudier le cycle de remplacement dentaire lors d'une transition alimentaire vers une alimentation dure contenant des escargots.
Bénéfices attendus
Afin d'explorer les mécanismes sous-jacents à la plasticité des modèles numériques de la réponse d’un bourgeon dentaire aux forces mécaniques liées à l’alimentation. Ce projet permettra en particulier de déterminer si le cycle de remplacement des bourgeons dentaires est modifié lors d'une transition d'une alimentation constituée essentiellement d'aliments mous vers une alimentation contenant des aliments durs. Ce projet aura des implications importantes pour notre compréhension du rôle de l'alimentation dans la mise en place des dents. Il permettra l'établissement de modèles numériques permettant d'étudier le développement dentaire.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés individuellement par balnéation et recevront une unique injection dans l'abdomen afin d'injecter un produit qui marquera les dents et permettra de suivre les dents qui n'ont pas été remplacées et de déterminer la longueur du cycle de remplacement des dents. L'intervention durera une dizaine de minutes en incluant l'anesthésie, l'injection et le reveil.
Impact sur les animaux
Faibles. Le projet implique de réaliser, en début de protocole, des injections dans l'abdomen qui peuvent présenter dans de rares cas des séquelles. Une vigilance particulière sera donc apportée lors de la récupération des animaux après ces injections. Après ces injections, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation (hydropisie, écailles hérissées). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou de détresse seront mis à mort par surdose d'anesthésique. Pour le reste du projet, les animaux sont conservés en groupe sociaux et nourris suivant des régimes alimentaires différenciés mais équivalents à ceux qu'ils adoptent dans le milieu naturel. Les animaux présentant des signes de stress seront isolés. Un intérêt particulier sera porté sur les animaux présentant des signes de refus alimentaires ou d'amaigrissement. Ces animaux seront sortis de l'expérimentation.
Devenir
L'analyse de la forme des dents nécessite de prélever les mâchoires des animaux et de réaliser des coupes qui seront analysées au microscope. Ceci nécessite donc la mise à mort de l'ensemble des animaux utilisés dans le projet.
Remplacement
Des approches numériques existent pour l'étude du développement dentaire malheureusement elles ne sont adaptées qu'aux mammifères. Nous souhaitons développer des modèles numériques équivalents mais qui soient adaptés aux espèces que nous étudions. Pour développer ces modèles, il est nécessaire de poursuivre des études in vivo pour fournir les données nécessaires à leur élaboration. Une fois établis, ces modèles pourront être utiliser pour étudier le développement dentaire d'autres espèces de vertébrés.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé pour fournir analyse statistique satisfaisante Un approche statisitique sera utilisée pour mettre en évidence d'éventuelles différences de longueur de cycle entre les dents positionnées au centre et celles positionnées en périphérie de la machoire en fonction du régime alimentaire suivi. Tous les tests du projet seront initiés en même temps ce qui permet de mutualiser les contrôles d'injections et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires de 10 animaux.
Raffinement
L'injection dans l'abdomen en début de protocole sera réalisée sous anesthésie et les poissons seront placés dans des bacs de réveil et surveillés lors de leur sortie d'anesthésie. Par ailleurs, les Astatoreochromis sont maintenus en groupes sociaux dans des bacs qui leur permettent d'exprimer leurs comportements naturels. Afin de favoriser le bien-être des animaux, les aquariums disposent d'un substrat (sable) qui permettent aux animaux d'exprimer leur comportement fouisseur. De même, afin de limiter les possibilités d'agression par les individus dominants, de nombreuses cachettes (gouttières renversées, pots en terre) sont mises à disposition des animaux. Les animaux disposent d'une alimentation variée proche de celle de leur milieu naturel. Autant les régimes alimentaires à base de nourriture molle que ceux à base d'escargots correspondent à des régimes alimentaires que les animaux adoptent dans leurs biotopes d'origine. Les animaux nourris d'escargots reçoivent en plus au minimum un repas constitué d'aliments variés pour éviter tout risque de dénutrition ou de carence. Les animaux sont observés quotidiennement en semaine et les animaux malades ou stressés sont isolés et placés dans un environnement différent. Après l'injection dans l'abdomen, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation au site de l'injection. Les signes de déséquilibres seront observés après l'injection (gonflement, écailles hérissées), ainsi que les signes pouvant indiquer une atteinte de la vessie natatoire (flottabilité positive ou négative). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou d'atteinte à la vessie natatoire seront mis à mort par une surdose d'anesthésique en balnéation.
Choix des espèces
En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; chasseur d'escargot non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire incorporant des escargots entiers provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet. 65 animaux seront utilisés d'une longueur standard de 6 à 8 cm (soit agés environ d'un an). A cet âge, l'injection dans l'abdomen est devient simple à réaliser et les machoires restent de taille raisonnable pour réaliser l'acquisition des données d'imagerie.
Étude fonctionnelle des gènes d’une famille de facteurs de transcription chez le poissons-zèbre pour l’étiopathogénie de la scoliose idiopathique-EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Pour vérifier si la mutation d'un gène repérée dans deux familles de personnes scoliotiques déforme la colonne vertébrale, trois lignées de poissons-zèbres mutants sont créées. 780 poissons-zèbres vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, répartis sur trois générations par lignée. Chacun subit sous anesthésie un prélèvement de quelques millimètres de nageoire caudale pour identifier sa mutation, et 180 d'entre eux passent trois séances de micro-scanner à huit, douze et seize semaines, avec un transport pouvant durer trente minutes avant chaque séance. Les 600 autres sont tués dès la lignée stabilisée, et les 180 restants après la dernière imagerie, le retour à l'aquarium principal étant exclu pour raison sanitaire.
Objectifs
La scoliose, dite idiopathique, qui touche près de 3% des sujets selon les régions géographiques, comporte une composante génétique. Cependant, les modalités exactes de transmission ne sont pas clairement établies. L’hypothèse sous-tenant le projet « scoliose et génétique » est que s’il existe des gènes de prédisposition à la scoliose « idiopathique », une analyse génétique poussée de familles scoliotiques présélectionnées par leur arbre généalogique permettra de détecter de nouvelles mutations spécifiquement associées à la pathologie par comparaison entre patients atteints et apparentés « sains ». Cette analyse a permis de découvrir une mutation d’un gène codant une protéine impliquée dans la transcription de l’ADN chez plusieurs personnes atteintes de scoliose idiopathique dans deux familles indépendantes. Chez le poisson-zèbre, il existe trois gènes qui pourraient être l’homologue de ce gène chez l’homme. Nous allons donc inactiver ces trois gènes indépendamment afin de générer trois lignées de mutants poissons-zèbres. Les mutants poissons-zèbres ainsi générés seront par la suite analysés cliniquement par l’imagerie afin de vérifier l’absence ou la présence de scoliose chez ces animaux. De ce fait, nous souhaitons utiliser le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le rôle fonctionnel de cette protéine, et son implication dans la physiopathologie de la scoliose idiopathique. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est la validation du gène exploré dans la genèse de la scoliose idiopathique. Cette hypothèse serait renforcée par le développement de scolioses chez les mutants ainsi créés. La validation de ce variant permettrait d’avancer dans la compréhension de la genèse des scolioses idiopathiques (physiopathologie) et éventuellement à long terme d’avancer dans la prédiction de progression des courbures scoliotiques découvertes. En effet, la progression de l’identification des mécanismes génétiques causaux à la scoliose dite « idiopathique » permettrait de pouvoir proposer aux patients chez qui une scoliose est découverte un séquençage exomique précoce de manière à avoir une meilleure connaissance du risque et donc d’adapter le traitement des patients (agressivité du traitement orthopédique par corset, nécessité de chirurgie correctrice).
Procédures
EU1 : Afin d’identifier le type de mutation porté par les poissons, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale sera réalisé sous anesthésie générale afin de minimiser la souffrance des animaux. Un seul prélèvement de quelques millimètre sera effectué par animal, la manipulation dure 1-2 minutes. Cette intervention n’entraîne pas de séquelles impactant la nage ou les capacités d’alimentation. EU2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (UE1) jusqu’au laboratoire d’imagerie (EU2) pour la réalisation d’une imagerie micro-scanner à 8,12 et 16 semaines de vie. La durée est de 30 minutes maximum par trajet. L’analyse par imagerie micro-scanner, anesthésie incluse aura une durée totale de 3 à 4 minutes. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Concernant la création d’une lignée mutante, le phénotype (Ensemble des caractères apparents d'un individu) attendu causerait éventuellement une déformation de la colonne vertébrale, il ne devrait pas y avoir d’impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter (classe légère). L’inactivation d’un gène codant pour une protéine qui est impliquée dans la synthèse des neurotransmetteurs pourrait entrainer des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance et leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer, bien qu’ils puissent être de taille plus petite ou avoir un axe corporel incurvé ou déformé. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique est une petite plaie de quelques millimètres suivie ensuite d’un processus cicatriciel, indolore et capable de se regénérer en quelques jours. Le transport jusqu’au lieu du scanner ainsi que la réalisation des imageries peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin de maintenir les poissons immobiles, ce qui peut entrainer un risque anesthésique. Les animaux sont placés en quarantaine jusqu’à la fin du protocole d’imagerie puis euthanasiés afin d’éviter toute contamination par d’éventuels pathogènes de l’aquarium principal.
Devenir
Nous générons au total 780 animaux, 180 animaux porteurs d’une mutation des gènes cibles seront conservés à l’animalerie. Les autres animaux (soit 600 animaux) seront euthanasiés une fois la génération d’une lignée de mutation de troisième génération, stable sur le plan génétique soit établie. Ces 180 animaux seront euthanasiés après la procédure d’imagerie micro-scanner, un retour de quarantaine au système principal de l'animalerie étant impossible par sécurité sanitaire.
Remplacement
Les études sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la colonne vertébrale en entier et de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de leur forme longitudinale, permettant une torsion axiale de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) sont un modèle de choix pour l’étude des scolioses.
Réduction
Nous n’avons pas de résultats préliminaires nécessaires pour effectuer des tests statistiques. Les expériences sont réalisées sur des poissons juvéniles puis adultes. Nous limitons le nombre minimal au maintien d’une lignée, dont 20 poissons/aquarium. Nous élèverons 20 poissons pour la première génération (F0), puis 120 poissons (homozygotes, hétérozygotes et les sauvages à identifier) pour la deuxième generation (F1), 120 poissons (homozygotes et hétérozygotes à identifier) pour la troisième génération (F2). Nous avons besoin de 3 générations, de ce fait nous aurons au total 260 individus (20 F0 + 120 F1 + 120 F2) pour chaque lignée. Nous aurons 780 (260 x 3) individus pour les trois lignées de mutants (3 gènes homologues à celui de l’Homme chez le poisson-zèbre). La population adulte de poissons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées. Concernant la réalisation des scanners : nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Ce nombre permettra d’effectuer des analyses statistiques comparatives ainsi qu’une analyse de variabilité inter-observateurs avec une puissance suffisante (score kappa de Fleis attendu : >0.8 ; alpha
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux une densité de 20 poissons/aquarium de 3.5L sera appliquée. Nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse. L’alimentation sera composée d’aliments secs et de proies vivantes adaptés au stade développemental des poissons-zèbre afin de leur permettre d’exprimer leur comportement naturel de prédateur. Les animaux ne seront jamais hébergés seuls. Dans le cas de l’identification d’un poisson-zèbre exprimant notre mutation d’intérêt, alors nous mettrons en place un enrichissement social en introduisant dans l’aquarium d’autres congénères. Les poissons présentant des anomalies qui les empêcheraient d'appréhender leur milieu normalement seront euthanasiés. De même pour préserver l'ensemble des poissons hébergés et le maintien d'un certain statut sanitaire, une limite d'âge de 18 mois est appliqué pour éviter la propagation d’infections par des animaux vieillissants. Les manipulations nécessitant une immobilisation et les prélèvements de nageoire caudal, seront conduites sur animaux anesthésiés. Nous surveillerons les animaux après le prélèvement de la nageoire caudale pour vérifier qu’il n’y ait pas de saignement et que dans les jours qui suivent la régénération de la plaie se met en place. Dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une mise à mort.
Choix des espèces
Le modèle poisson-zèbre partage 71% de son génome avec celui de l’homme et celui-ci est facilement modifiable par des techniques de biologie moléculaire. De plus, son élevage et sa reproduction sont rapides et aisés. Dans le cas de notre étude sur la scoliose qui est une déformation en trois dimensions de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont de mauvais modèles d’étude car la présence d’appui sur les pattes avant leur permet de compenser et d’empêcher l’évolutivité d’une telle déformation. Les poissons-zèbres cependant constituent un bon modèle pour ces déformations vertébrales, leur colonne vertébrale comportant de grandes similarités avec l’espèce humaine : une structure vertébrale longitudinale, constituée d’éléments osseux mobiles et de disques intervertébraux, organisée en 4 segments. L’analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par micro scanner chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études précédentes. Nous analyserons les images issues du scanner micro-CT avec un logiciel dédié. Grâce à ces images, nous mesurerons les courbures de la colonne vertébrale des mutants par comparaison avec celle de poissons sauvages. Les animaux seront étudiés du point de vue phénotypique (apparition de scoliose) à 3 points cinétiques à 8, 12 et 16 semaines, qui correspondent respectivement à une période de forte croissance, au stade juvénile (parallèle avec l’aggravation pubertaire des scolioses humaines) et une analyse finale au stade adulte. Ceci permettra de suivre l’évolution de la scoliose dans le temps lors de sa phase de constitution puis une analyse finale à l’âge adulte
Élevage de lignées murines permettant l’exploration du développement du cerveau.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Tuées si leur génotype n'est pas celui attendu, ou une fois qu'elles ont servi à la reproduction, les souris de cet élevage qui portent le bon génotype partent vers d'autres projets. 30 600 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né est maintenu une minute pendant qu'on lui tatoue un ou deux coussinets et qu'on lui prélève un bout de queue, et des mâles peuvent être hébergés seuls jusqu'à trois semaines. Le porteur justifie l'effectif en une phrase, indiquant que les accouplements ont été calculés d'après ses expériences antérieures pour produire un nombre suffisant d'animaux, sans autre élément sur ces 30 600 individus.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent la formation du cortex cérébral dans le contexte normal mais aussi pathologique. L’utilisation de modèles souris génétiquement modifiées nous aident à mieux caractériser notamment les mécanismes de génération, de migration et de mise en place de l’identité cellulaire des différents types neuronaux.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’augmenter la connaissance scientifique sur la formation du cerveau en condition normale ou pathologique.
Procédures
Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle un ou deux coussinet des pattes seront tatoués et une biopsie de queue sera prélevée. Des mâles pourront être hébergés individuellement pendant un maximum de 3 semaines.
Impact sur les animaux
La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress et une légère souffrance chez l’animal. L’hébergement individuel des mâles peut entrainer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure si leur génotype n'est pas celui attendu ou après accouplement, les autres seront utilisés dans des projets scientifiques.
Remplacement
Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent pas être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculés selon nos expériences antérieurs pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien à nos expériences.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social tout au long de leur vie. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après l’intervention pour vérifier qu’ils sont bien ré-acceptés par leur mère.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le developpement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme.
Enregistrement et contrôle optogenetique des activités neuronales néonatales chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
276 souris vont être utilisées, dont 252 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : chaque nouveau-né, âgé de trois à six jours, subit une chirurgie du cerveau de trente minutes pour la pose d'électrodes et d'une barre de tête, puis deux heures d'enregistrement pendant son sommeil. En amont, les mères gestantes sont opérées de l'abdomen pour que leurs embryons reçoivent une injection intracrânienne. Le porteur range parmi les effets indésirables la douleur, le stress et la faim des nouveau-nés, et le stress ou la douleur des femelles. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé pour localiser les électrodes, l'apport annoncé étant de servir de référence à d'autres travaux sur les pathologies néonatales.
Objectifs
Après la mise en place des neurones de l'embryon, le cerveau subit un processus de maturation spécifique impliquant des activités spontanées,ne dépendant pas de stimuli externes à l’individu. Chez l’homme ce processus de maturation se met en place lors du 3e trimestre de grossesse, chez le rongeur, lors des deux premières semaines Post-Natales (PN). Ces activités néonatales (ANs), orchestrées par une catégorie spécifique de neurones, jouent un rôle important dans la mise en place des circuits du cérébraux et leurs fonctions ultérieures. Cependant les mécanismes impliqués sont encore mal connus et sont sujets à controverse. Cette question est d’autant plus importante qu’il existe des pathologies neurologiques graves avec retard mental et épilepsies affectant les enfants dès la naissance. Or, une majorité de ces pathologies affectent de façon directe ou indirecte la classe de neurones qui orchestrent ces ANs. Notre but est donc de comprendre, pendant la première semaine de vie comment s'organise l'activité de ces neurones chez la souris en développement et de comprendre quelle est leur influence sur la mise en place des circuits. Pour ce faire, nous utilisons une technique de biologie moléculaire qui nous permet d'activer ces neurones à la demande par la lumière lors des enregistrements de l'activité cérébrale de la souris nouveau-née en sommeil.
Bénéfices attendus
Pour mieux comprendre comment, dans la période qui entoure la naissance, le cerveau se prépare aux premières expériences sensorielles, il est important de déterminer le rôle respectif des grandes classes de neurones dans la maturation du cerveau et de ses circuits. La théorie en vigueur sur l'action d'une certaine classe neurones (neurones inhibiteurs) à ces âges précoces est de plus en plus remise en cause, ce qui nous interroge sur les mécanismes fondamentaux du développement du cerveau. Or, des dysfonctionnements de cette même classe de neurones sont impliqués dans un tres grand nombre de troubles neurologiques infantiles (troubles du spectre autistique, épilepsies, retard mental). En déterminant la fonction de cette classe de neurones lors du développement du cerveau sain, cette étude servira donc de référence à d'autres travaux sur les pathologies néonatales.
Procédures
Un groupe de souris gestantes, porteuses des embryons à traiter, subira une chirurgie abdominale sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgésie. Leurs embryons, sous l'influence de ces traitements, subiront une injection intracrânienne. Après la naissance ces animaux subiront une chirurgie du cerveau (30 minutes) afin de préparer le placement d'électrodes et d'une barre de tête. Ceci se fera sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgésie. Une demi-heure plus tard, toujours sous analgésie, l'activité cérébrale sera enregistrée pour un maximum de 2h alors que la souris nouveau-née dort.
Impact sur les animaux
La chirurgie des nouveau-nés peut avoir des effets indésirables, tels qu'une douleur, un stress ou la faim. La chirurgie des souris gestantes peut induire du stress ou de la de la douleur.
Devenir
Les animaux seront mis a mort et les cerveaux prélevés post-mortem pour prendre des images des structures cérébrales et reveler la localisation des electrodes.
Remplacement
L'étude des activités neuronales dans la periode de la naissance nécessite l'observation de systèmes neuronaux intacts, en phase de sommeil lent et d'être correlés aux activités motrices de l'individu (contractions spontanées ou sursauts physiologiques du nourisson). Il est donc impossible de la réaliser sur un modèle informatique ou les modèles récents d'alternative à l'experimentation animale (s cellules souches). La souris présente davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale (la réalisation de mutation génétique est plus simple que sur d’autres modèles). A ce jour, aucune étude n'a été faite pour enregistrer et manipuler par électrophysiologie et optogénétique l’activité cérébrale des souris nouveau-nées. Nous avons opté pour l’utilisation de souris plutôt que de rat étant donné que les modèles transgéniques qui nous intéressent ne sont disponibles que chez la souris. La souris présente aussi davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale et la facilité d'élevage.
Réduction
Les chirurgies sont réalisées sous anesthesie gaseuse, locale et sous analgésie pour réduire au minimum la souffrance potentielle causée par ces procédures. Les enregistrements des nouveaux-nés sont ausi faits sous analgésie. L’avancée technologique concernant la miniaturisation des systèmes électroniques et d’électrodes permet d’enregistrer un grand nombre de neurones, sur de multiples sites simultanément. Ces progrès nous permettent de diminuer fortement le nombre de souris utilisées. Les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels. Les animaux sont preparés par petites series de 4 ou 5 (une portée à la fois) et les resultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procedure s'arretant des que le nombre d'animaux requis est atteint. Nous utilisons à la fois des males et des femelles. Le nombre d'animaux à utiliser a été déterminé par calculs statistiques (calculs de puissance) établis sur la base de données publiées par notre groupe et d'autres laboratoires.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie conventionnelle (température, luminosité, cycle jour-nuit et hygrométrie contrôlée) avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’hébergement respecte les groupes sociaux. Les animaux font l'objet d'un suivi quotidien par les expérimentateurs et les zootechniciens, et leurs conditions d'hébergement sont enrichies (matériaux pour nidification, tunnels, dômes). Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué réguliérement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Nous procédons à un suivi post-opératoire lors duquel le bien être des animaux est évalué et traité (anesthésie et analgésie appropriée). Les nouveau-nés, sont maintenus en condition proche de celles de la portée, (maintien de la température corporelle, contension légère avec du cotton , nourrissage de lait maternisé).
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser les pathologies neurologiques du développement, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique, facilite d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'humain) et les dommages éventuels (souffrance liée aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). Ceci nous permet d'apporter des connaissances complémentaires à la communauté scientifique et permet une reproduction idéale des résultats. Enfin, les patrons électrophysiologiques des souris nouveau-nées sont fortement similaires à ceux observés chez l'enfant prématuré et le nourrisson. Les souris sont étudiées entre 3 et 6 jours post-nataux, inclus.
Comparaison de trois méthodes d’administration d’une molécule permettant d’induire l’expression de modifications génétiques ciblées dans le cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'âge de deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie d'oreille entre douze et quinze jours, puis une injection quotidienne pendant cinq jours, le porteur indiquant que le produit injecté peut provoquer une inflammation et que les points d'injection sont changés d'un jour sur l'autre. À deux mois, elles sont profondément anesthésiées pour une perfusion intracardiaque, tuées, puis leur cerveau est prélevé et leur corps disséqué pour repérer les effets secondaires aux sites d'injection. Comparer trois voies d'administration afin de retenir la moins traumatisante est présenté comme un raffinement, et le porteur écrit que l'usage d'animaux vivants y est "incontournable".
Objectifs
Les lignées de souris génétiquement modifiées constituent des modèles précieux pour comprendre le fonctionnement du cerveau chez les mammifères. Dans certaines de ces lignées, il est possible de choisir le stade de développement à partir duquel une modification génétique sera exprimée dans le cerveau. Ces modèles inductibles sont très utiles, par exemple pour modéliser des pathologies qui surviennent chez l'adulte, alors que le cerveau n'a pas eu de problème particulier au cours du développement. En pratique, l'induction de l'expression d'une mutation à un moment donné est souvent réalisée par injection d'un produit dans le ventre des souris. Plusieurs études ont montré que cette voie d'administration pouvait occasionner des dommages dans l'abdomen des souris. Récemment, plusieurs équipes ont testé l'administration de la même molécule par la voie sous-cutanée, a priori moins invasive. Des résultats très probants ont été obtenus pour induire l'expression de modifications génétiques dans divers organes tels que le foie, le rein et l'intestin. De plus, une équipe a également rapporté l'efficacité de l'administration de la même molécule par voie orale (ingestion spontanée par la souris d'un liquide présenté goutte à goutte). Dans un objectif de raffinement de nos pratiques expérimentales, nous souhaiterions tester les voies orale et sous-cutanée sur nos modèles. Cependant, il n'est pas démontré si ces voies administration sont efficaces pour induire l'expression de modifications génétiques spécifiquement dans le cerveau. Le cerveau est un organe très protégé de la circulation sanguine. Cette protection est utile contre les agressions (maladies notamment), mais elle pose souvent problème quand il s'agit de faire entrer des médicaments dans le cerveau. De fait, l'induction de l'expression de modifications génétiques à partir d'un moment choisi est beaucoup moins efficace dans le cerveau que dans les autres organes. Pour cette raison, il est primordial de vérifier que le choix de la voie sous-cutanée ou de la voie orale ne réduira pas l'efficacité de l'induction. Notre projet est donc de tester l'efficacité de ces deux voies d'administration pour induire l'expression d'une modification génétique dans le cerveau chez la souris.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu concerne le raffinement des méthodes expérimentales : si les injections sous-cutanées ou l'administration par voie orale s'avèrent aussi efficaces et moins traumatisantes que les injections dans l'abdomen pour induire l'expression de mutations conditionnelles dans le cerveau, la méthode la moins traumatisante sera adoptée immédiatement par notre équipe. Les résultats seront divulgués à toute la communauté scientifique utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées pour étudier le cerveau.
Procédures
Une biopsie d'oreille sera réalisée entre 12 et 15 jours d'âge dans le but de réaliser des analyses génétiques. Entre 21 et 25 jours d'âge, certaines souris recevront une injection chaque jour (durée de chaque injection < 10 secondes). A l'âge de deux mois, les souris seront profondément anesthésiées (par injection de médicaments, < 20 secondes), après injection d'un analgésique (< 20 secondes). Une procédure chirurgicale sera employée (durée < 10 minutes) pour injecter dans le coeur un produit qui permet d'assurer une bonne conservation de la structure du cerveau, pour la réalisation d'analyses histologiques. Ces souris seront mises à mort sous anesthésie après la procédure chirurgicale.
Impact sur les animaux
La biopsie d'oreille induit une douleur temporaire. La contention des animaux pour l'administration des traitements entraîne un stress temporaire. Les injections répétées quotidiennement pendant 5 jours induisent une douleur temporaire au point d'injection. De plus, le produit injecté est susceptible d'induire une inflammation.
Devenir
Il est nécessaire de mettre à mort les souris de ce projet, car nous devrons prélever le cerveau pour pouvoir évaluer l'efficacité de l'induction de l'expression de la modification génétique souhaitée. De plus, les corps des souris ayant reçu des injections seront disséqués pour évaluer les effets secondaires potentiels au niveau des sites d'injection (sous la peau et dans l'abdomen).
Remplacement
L'objectif de cette étude étant de comparer l'impact sur la souris de trois méthodes d'injection, il n'est pas envisageable d'utiliser une méthode alternative. L'utilisation d'animaux vivants est incontournable pour répondre à la question.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en fonction de notre connaissance du modèle, en tenant compte de la probabilité de transmission d'un transgène d'une génération à la suivante, ainsi que du risque de perte de matériel biologique pendant l'expérience (mort inexpliquée d'un animal avant la fin de l'expérience ou problème lors des analyses post mortem). De plus, nous avons choisi la lignée de souris de manière à ce qu'une partie du matériel biologique collecté dans ce projet puisse être utilisé pour compléter une étude en cours dans le cadre d'un projet précédemment autorisé. Cette mutualisation des animaux permettra de réduire le nombre total d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront observées et pesées régulièrement pendant toute la durée de l'étude. En cas d'approche d'un point limite par l'un des animaux, la surveillance sera réalisée quotidiennement. La formulation du produit injecté aux souris a été récemment améliorée pour éviter tout dommage sur les souris. Afin de limiter la douleur, les points d'injection seront changés d'un jour sur l'autre, pour la série de 5 injections quotidiennes. A la fin de l'étude, les souris recevront un antalgique et seront profondément anesthésiées pour éviter toute douleur liée à la perfusion intracardiaque du produit permettant une bonne conservation du cerveau.
Choix des espèces
L'objectif du projet étant de comparer l'impact sur la souris de trois méthodes d'injection d'un produit, il ne serait pas pertinent de réaliser cette étude sur une autre espèce. Les souris seront incluses dans ce protocole dès l'âge de 7 jours, car il sera nécessaire de connaître leur génotype précocément. Le produit permettant d'induire l'expression d'une modification génétique sera administré pendant la 4ème semaine d'âge et les souris seront mises à mort à l'âge de 2 mois, lorsque le cerveau aura acquis ses caractéristiques adultes, car les travaux que nous menons actuellement portent sur le développement du cerveau après la 3ème semaine de vie.
Le role des macrophages périvasculaires dans le drainage cérébral : effets sur les maladies neurodégénératives.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
1 036 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une seule injection dans le cou, de dix minutes, et le porteur qualifie les nuisances attendues de "très minimes" tout en signalant que les souris de la lignée APP/PS1 peuvent mourir prématurément du fait de leur phénotype dommageable. Certaines sont suivies jusqu'à 700 ou 800 jours d'âge pour observer les macrophages périvasculaires aux stades avancés, l'objectif déclaré étant de comprendre comment ces cellules participent à l'accumulation des plaques amyloïdes de la maladie d'Alzheimer. Le porteur justifie l'usage de la souris par le fait que ces macrophages n'ont été décrits que chez les rongeurs, ce qui exclut selon lui les espèces non couvertes par la réglementation comme le nématode ou la drosophile.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer, c'est quand le cerveau accumule une sorte de déchet appelé "plaque amyloïde". Cela se produit car le cerveau a des problèmes pour se débarrasser de ces déchets, ce qui fait qu'ils s'agglutinent et se déposent. On a découvert que des cellules spéciales appelées macrophages, qui normalement aident à nettoyer ces déchets, peuvent être en partie responsables de ce problème. Ils sont comme des éboueurs, mais dans ce cas, ils semblent avoir du mal à faire leur travail correctement. Notre idée, c'est de comprendre exactement comment ces cellules contribuent à la maladie d'Alzheimer, depuis le tout début jusqu'aux stades avancés. On pense qu'en comprenant mieux leur rôle, on pourrait trouver des moyens de les aider à mieux faire leur travail et ainsi empêcher l'accumulation de ces déchets. Pour cela, on va : 1. Regarder de près comment ces cellules et les plaques se développent ensemble dans le cerveau au fil du temps. On veut aussi voir quand ces cellules commencent à mal fonctionner. 2. Essayer de comprendre comment ces cellules fonctionnent au niveau moléculaire. Cela pourrait nous donner des indices sur ce qui déclenche et aggrave la maladie. On espère aussi trouver des signes qui pourraient nous aider à détecter la maladie plus tôt. 3. En comprenant mieux le rôle de ces cellules dans le nettoyage du cerveau, on espère pouvoir restaurer cette fonction chez les personnes atteintes de la maladie d'Alzheimer. Pour nos recherches, on dispose de modèles de souris qui reproduisent certains aspects de la maladie d'Alzheimer. Cela nous permettra d'étudier ces cellules et de tester des idées pour voir si elles pourraient aider à ralentir la progression de la maladie. Si nos découvertes sont fructueuses, cela pourrait ouvrir la porte à de nouveaux traitements pour la maladie d'Alzheimer et d'autres maladies du cerveau, ce qui pourrait aider à retarder leur évolution.
Bénéfices attendus
La maladie d'Alzheimer est causée par un problème de nettoyage du cerveau, mais on ne comprend pas encore très bien comment cela se produit. Avec notre recherche, nous espérons : 1. Mieux comprendre comment les macrophages périvasculaires agissent dans le cerveau. 2. Découvrir le rôle spécifique des macrophages périvasculaires dans le nettoyage des plaques amyloïdes dans le cerveau. 3. Trouver de nouvelles idées pour traiter la maladie d'Alzheimer, en plus des traitements actuels.
Procédures
Les animaux auront des injections au niveau du cou. Chaque souris subira une seule injection de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues seront très minimes. Cependant, il est possible que les animaux soient stressés suite à leur contention et aux injections. Ils pourront donc être sujets à des fluctuations de poids et présenter une douleur locale au niveau du site d’injection, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite. De plus, les souris de la lignée APP/PS1 peuvent être sujette à une mort prématurée, entrainant leur phénotype dommageable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chacune des procédures dans le but de prélever les organes (cerveaux, méninges et moelle épinière) pour des études post-mortem.
Remplacement
Ce projet nécessite l’étude de macrophages dans leur contexte environnemental et dans leur tissue natif. L’étude in-vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de leurs rôles, alors il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale. Etant donné que ces macrophages sont décrits seulement chez les rongeurs, l’utilisation des modèles animaux qui ne sont pas soumis à une règlementation comme c elegans, drosophila melanogaster, etc ; n’est pas possible.
Réduction
Sur la base de notre expérience, le nombre est calculé au plus juste pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie.
Raffinement
Toutes les expériences sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. De plus, les animaux seront suivis à l’aide d’une grille de score, des relevés de poids seront réalisés et des points limites précoces seront établis pour prendre en charge rapidement toute douleur ou mal être observé. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les macrophages périvasculaires avant et après le déclenchement de la maladie d’Alzheimer. Ceci nécessite l’utilisation de souris du stage jeune (âge 22 jours), jeune adulte (âge 60 jours) jusqu’au stade adulte très avancé (âge 700-800 jours). Nos données suggèrent que le pic de présence des macrophages périvasculaires est aux alentours de 22 jours et que les macrophages périvasculaires sont altérés chez les souris APP/PS1 très agées. Nos données suggèrent également que le défaut de drainage observé chez nos souris est maximal à 4 mois.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de modèles murins permettant l’étude des mécanismes gouvernant le développement des cellules germinales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
13 000 souris vont être utilisées pour un unique geste de quelques secondes chacune, une biopsie de la queue pratiquée sur animal vigile dès l'âge de dix jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce prélèvement sert à trier les descendants de croisements destinés à invalider seize gènes de la reproduction. Le porteur reconnaît que la contention et le geste provoquent une douleur légère et un stress. Les souris dont le génotype ne convient pas sont tuées et leurs tissus récupérés, les autres restent en vie pour intégrer d'autres projets de recherche que le RNT ne décrit pas.
Objectifs
L’objectif principal du projet est d’acquérir de nouvelles connaissances fondamentales dans le domaine de la biologie de la reproduction. Plus précisément, ce projet vise à comprendre les mécanismes qui gouvernent la gamétogenèse, le processus biologique qui permet la formation des gamètes, les cellules sexuelles impliquées dans la reproduction. Pour cela seize gènes clefs vont être étudiés. Afin de mieux comprendre leur fonction nous étudierons l’effet de leur invalidation au cours de la gamétogenèse. Le second objectif de ce projet est d’identifier de potentielles causes génétiques d’infertilité. L’infertilité est une pathologie qui touche environ un couple sur six et dans de nombreux cas les causes en demeurent inconnues. Mieux comprendre les acteurs impliqués dans le processus de gamétogenèse et les mécanismes associés permettra de mieux diagnostiquer l’infertilité.
Bénéfices attendus
La fonction de reproduction est très particulière. C’est en effet une des premières à se mettre en place au cours du développement et une des dernières à devenir fonctionnelle à l’âge adulte (c.a.d. lorsqu’un individu souhaitera procréer). Il existe de ce fait une ‘boite noire’ entre le moment où cette fonction peut être altérée et le moment de la découverte de l’infertilité. Il est donc capital de prévenir autant que de ‘guérir’ toute atteinte à la fonction de reproduction et ceci implique une connaissance poussée des mécanismes biologiques impliqués. La compréhension du rôle des gènes est essentielle pour comprendre globalement la gamétogenèse, et donc ce qui assure la fertilité. Connaitre les gènes et comprendre les processus permettra d’identifier les causes génétiques et améliorera la prise en charge et le conseil apporté aux patients. Plus spécifiquement, notre projet améliorera cet aspect en apportant des connaissances fondamentales sur les étapes dérégulées lorsque des gènes impliqués en méiose sont invalidés. La méiose est le processus qui permet la formation des gamètes haploïdes (ovules et spermatozoïdes).
Procédures
Un biopsie de queue sera réalisé sur animal vigile afin de déterminer son statut génétique. La durée de cette procédure est de quelques secondes. Un prélèvement unique sera réalisé par animal. Celui-ci servira à déterminer le statut génétique de l’animal. En effet, afin d’étudier le rôle d’un gène dans la fonction de reproduction, nous produirons des animaux déficients pour ce gène à partir de croisements d’individus hétérozygotes (ne possédant qu’une copie sur deux du gène invalidés). Les descendants de ces animaux seront alors soit sauvages génétiquement (avec les deux copies du gène non mutées) soit hétérozygotes, soit homozygotes mutants (avec les deux copies du gène mutées). Nous allons comparer les tissus reproducteurs des animaux homozygotes à ceux des animaux sauvages pour comprendre l’effet de l’invalidation du gène candidat. Les animaux hétérozygotes serviront à maintenir la lignée. Exceptionnellement si le résultat de l’analyse génétique, n’est pas concluant, un second prélèvement peut être envisagé.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue est un geste qui provoque une douleur légère. L’animal est maintenu en contention (pour éviter qu’il bouge) lors du prélèvement ce qui représente une source de stress.
Devenir
A l’issue de la procédure (prélèvement d’un morceau de queue) tous les animaux sont maintenus en vie. au-delà, les animaux dont le génotype ne convient pas seront euthanasiés et leurs tissus pourront être récupérés post-mortem. Les autres animaux seront maintenus en vie pour intégrer des projets de recherche nécessitant ce type d’animaux.
Remplacement
La fonction de reproduction ne peut être efficacement modélisée in vitro car elle implique plusieurs tissus et types cellulaires en interaction. De plus, l’étape centrale de la gamétogenèse, la méiose, est absolument impossible à mimer avec une lignée cellulaire. En effet, la méiose est une division cellulaire différente de la mitose qui ne permet pas la multiplication cellulaire et donc exclut l’usage d’une lignée cellulaire par définition. La souris est un modèle de choix pour l’étude de la fonction de reproduction du fait de son cycle rapide de reproduction et de l’existence de nombreux modèles mutants avec des phénotypes finement décrits dans la littérature facilitant la comparaison des données. A ce jour cette méthode, la biopsie de queue, est la seule parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire pour le génotypage des souris portant des constructions génétiques spécifiques. Ce processus est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et permettre l’entretien de ces lignées.
Réduction
Sur la base de notre expérience, nous avons estimé le nombre d’animaux requis pour l’étude de ces différents gènes en fonction des étapes supposées être atteintes. Le croisement d’animaux hétérozygotes permettra de générer à la fois des animaux homozygotes et sauvages dont les phénotypes seront comparés. L’étude du processus de reproduction dans les deux sexes simultanément devrait limiter la génération d’animaux non exploités. Les animaux hétérozygotes issus des mêmes croisements serviront à maintenir les lignées.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les souriceaux âgés de 10 à 21 jours sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place. Dans les cas exceptionnels ou une seconde biopsie serait requise au-delà de 21 jours, un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place.
Choix des espèces
Les souris sont de petits animaux au développement et à la reproduction rapides. Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines, notamment l’infertilité, car les souris possèdent de grandes similarités génétiques avec l'être humain. La production des cellules sexuelles est bien décrite dans cette espèce et il est donc aisé, par comparaison, de positionner le rôle d’un nouveau gène. Chez les vertébrés, il n’existe pas d’autre modèle dans lequel autant de mutations affectant la fertilité aient été décrites. Chez les organismes modèles invertébrés (levure, ver, mouche) de nombreuses mutations affectant la fertilité sont rapportées mais la conservation des gènes est relativement faible vis-à-vis de l’espèce humaine. Les biopsies de queues sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 10 jours. Le génotypage (pour visualiser le(s) gène(s) d’intérêt) des lignées est essentiellement réalisé à cet âge pour permettre d'avoir le résultat au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.
Genotypage invasif des lignees transgéniques
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Une biopsie de l'oreille ou du bout de la queue, moins d'une minute de contention, moins de 5 mm de tissu prélevé : l'acte est bref et il concerne 100 000 souris. Toutes sont déclarées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, 10 000 sont annoncées comme réutilisées, les autres sont tuées, à l'issue d'un projet autorisé ou dès le génotypage quand elles ne portent pas le génotype recherché. Le porteur indique qu'au moins la moitié des souris nées dans son animalerie ne portent pas ce génotype, qu'un quart est utilisé pour des prélèvements de tissus et un quart pour des projets validés par le ministère. Le chiffre de 100 000 n'est adossé à aucun calcul dans le résumé, ni à un nombre de lignées, ni à une durée.
Objectifs
L'objectif est la caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés
Bénéfices attendus
Il est nécessaire d'identifier tous les individus génétiquement modifiés dans le cadre de la gestion d’élevage afin de répérer les animaux d'intérêt pour les différents projets scientifiques.
Procédures
Prélèvement d'une biopsie (auriculaire ou caudale) par animal (contention et biopsie < 1 minute, prélèvement en lui même < 1s, taille du prélèvement < 5mm)
Impact sur les animaux
L’effet indésirable qui peut survenir est une douleur légère et très passagère (quelques secondes) lors du prélèvement.
Devenir
Les animaux génotypés sont utilisés soit pour l'élevage, soit pour l'expérimentation. Dans le cas de l'expérimentation, les animaux sont euthanasiés à l'issue d'un projet scientifique autorisé par le ministère. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Les animaux qui n'ont pas le génotype nécessaire pour les expérimentations ou le maintien de la lignée seront euthanasiés lorsqu'ils ne peuvent pas être réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype.
Remplacement
Les animaux produits dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents organismes scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Avant de déposer cette demande, une alternative non-invasive (arrachage de bulbe pileux) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables. De plus, cette méthode, ainsi que d’autres méthodes non-invasives (analyse de fécès, prélèvement buccal) entraînant toutes un niveau de stress équivalent à la biopsie invasive à la queue ou à l’oreille, n’ont pas été retenues.
Réduction
L'animalerie élève de nombreuses lignées pour prélèvement de tissus ou pour des protocoles d'expérimentation animale. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Le maintien des lignées par reproduction nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter la consanguinité, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité génétique des animaux et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Selon les lignées et les projets, au moins la moitié des animaux n'ont pas le génotype nécessaire à l'expérimentation, environ un quart est utilisé pour prélèvement de tissu, et un autre quart dans des projets scientifiques validés par le ministère. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans d’autres projets.
Raffinement
Les méthodes de prélèvement (biopsie à l’oreille ou à la queue) et de marquage (boucle d'oreille lors du sevrage, ou tatouage avant sevrage) ont été choisies pour minimiser l'inconfort en fonction de l'âge des animaux (et donc du développement de la queue et de l'oreille). La biopsie à l’oreille prélevée lors du marquage au sevrage des animaux n'induit pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'incomfort, et du fait que l'oreille est très peu vascularisée, n'engendre pas de saignement. Dans le cas de biopsies précoces, quand l'oreille n'est pas assez développée, la biopsie est prise sur l'extrémité de la queue, qui n'est pas ossifiée dans les 10 jours après la naissance. Le saignement est minime (moins d'une goutte) et s'arrête immédiatement. Le marquage comme le prélèvement sont réalisés avec du matériel adapté, le geste est rapide et sûr, réalisé en routine par du personnel formé. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les animaliers. Ainsi, de même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé, en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées modifiées génétiquement permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. 5 à 10% des animaux sont utilisés après sevrage (entre 21 et 30 jours après la naissance) lorsqu'un génotypage précoce n'est pas nécessaire. Pour minimiser le stress, sexage, marquage et biopsie sont réalisés en même temps.