Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Corticogénèse cérébrale du primate
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Réutilisées d'une gestation à l'autre, 42 femelles macaques de cette colonie enchaînent jusqu'à six césariennes chacune, à raison d'une tous les onze à quinze mois. 59 macaques à longue queue sont comptabilisés au total, quinze opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 44 soumis à des procédures d'un niveau de souffrance modéré, deux rendus à l'élevage. Les fœtus, 75 en tout, sont tués pour prélever leur cerveau et étudier la formation du cortex. Ceux de moins de 105 jours de gestation ne sont pas comptés dans les effectifs du projet, ce que le porteur justifie par leur utilisation avant le dernier tiers du développement.
Objectifs
Nous avons pour but de caractériser les mécanismes biologiques qui contrôlent la mise en place les caractéristiques structurelles uniques du cerveau humain. La compréhension de ces processus biologiques fondamentaux est un pré-requis pour progresser dans l'étiologie des pathologies neuro-développementales qui sont à l'origine de troubles invalidants (épilepsie, autisme, schizophrénie, etc). Le matériel histologique humain prénatal est rare et la préservation des tissus souvent non optimale, rendant l'interprétation des résultats difficile. Le singe représente un maillon préclinique incontournable. Des travaux récents ont en effet montré que certains mécanismes gouvernant le développement du cerveau sont communs au singe et à l’homme.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est de permettre d’avancer dans la compréhension du développement du cortex cérébral de l’homme. Notre projet constitue une étape incontournable pour faire avancer la recherche clinique sur les pathologies neurodéveloppementales chez l’homme.
Procédures
Les femelles auront plusieurs anesthésies générales pour les échographies et les césariennes. Les femelles participeront à un maximum de 6 césariennes selon l’avis de notre vétérinaire référente. En moyenne une femelle subit une césarienne tous les 11 à 15 mois
Impact sur les animaux
L'anesthésie générale provoquera en elle-même un inconfort au réveil avec d'éventuelles nausées. La césarienne pourra susciter des douleurs post-opératoires pendant le temps de la cicatrisation, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens.
Devenir
Nous avons une colonie de reproduction de Macaques cynomolgus composée d’environ 44 femelles pubères âgées de 4 à 8 ans et 4 mâles qui nous permettront d'obtenir 75 embryons (mis à mort pour recuperer leur cerveau), 45 (9/an) utilisés pour l'étude des précurseurs de la corticogénèse à différents stades embryonnaires (de E35 à E120) et 30 (6/an) utilisés pour des analyses génétiques (sc RNA-Seq, miRNA-Seq). A la fin de la procédure, les animaux pourront être réutilisés pour d’autres procédures ou placés dans des structures d’accueil appropriées.
Remplacement
Le macaque cynomolgus possède un cortex cérébral gyrencéphalique dont l’organisation anatomique et l’ontogénèse présentent des similitudes importantes avec le cortex humain, contrairement à d’autres espèces de primates (marmoset, microcèbe). Le génome du macaque est bien décrit et des atlas neuroanatomiques et d’expression de gènes sont disponibles pour cette espèce. La corticogénèse du macaque est bien caractérisée et a des caractéristiques communes avec le développement du cortex cérébral humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des zones germinales. Le macaque constitue donc un modèle de prédilection pour étudier les mécanismes de spécification des aires corticales et les mécanismes développementaux responsables de la mise en place de la connectivité des aires corticales.
Réduction
Les femelles pourront être utilisées pour des gestations successives sauf avis contraire du vétérinaire. En moyenne une femelle subit une césarienne tous les 11 à 15 mois (estimations statistiques réalisées sur une vingtaine d'années). Nous utilisons des tranches organotypiques de cerveaux embryonnaires que nous maintenons en culture pendant 8 à 15 jours pour des observations de la prolifération et de la migration en cinétique videomicroscopique. Afin de minimiser le nombre d’embryons nous avons fait réaliser sur mesure une platine d'observation du microscope biphotonique nous permettant de doubler le nombre de tranches organotypiques observées (48 tranches) ce qui permet de réduire le nombre d’embryons utilisés d'un tiers. Nous menons en parallèle des recherches sur les capacités de différenciation neuronale des cellules souches pluripotentes (cellules souches embryonnaires et cellules souches pluripotentes induites) de primate ce qui permet d'étudier certains aspects de la différentiation des neurones du cortex de primate, ce qui permet de ne pas avoir recours à des tranches organotypiques issues de fœtus.
Raffinement
Nous entrainons les animaux à coopérer (conditionnement par renforcement positif) pour certaines procédures de manière à diminuer le stress de l’animal (déplacement en cage de transfert pour mise au mâle ou changement de volière) et pour des actes non invasifs et non douloureux comme les échographies de contrôle de manière à éviter le recours à l’anesthésie. Actuellement un tiers des femelles sont suffisamment conditionnées pour réaliser cet acte en vigile. Les femelles subissent une anesthesie générale pour la réalisation des césariennes et une fiche de suivi après la chirurgie nous permet d’évaluer en fonction de critères spécifiques les signes indicateurs de gêne ou de souffrance et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire.
Choix des espèces
Nos travaux sur la corticogénèse chez le primate non-humains nécessite un accès à des embryons d'âge précis. Les techniques de substitution (organoïdes cérébraux) ne peuvent remplacer le tissu vivant pour l’analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires qui opèrent in vivo. En effet, les organoïdes obtenus in vitro permettent d’obtenir un échantillon de tissu cérébral sans identité régionale particulière, déconnecté de son environnement physiologique (par ex structures sous corticales, tronc cérébral) et maintenu dans des conditions artificielles qui induisent un stress cellulaire important. Ceci conduit à des anomalies de l’identité des progéniteurs corticaux et de leur différenciation dans les organoïdes. De plus, l’expression des gènes dans les organoïdes cérébraux varie en fonction de la composition du milieu et des conditions de culture, conduisant à des résultats qui ne reflètent pas la situation in vivo. Animaux matures: Femelles de plus de 4 ans et mâles de plus de 5 ans. Les mâles sont utilisés uniquement comme reproducteurs lors des reproductions naturelles et ils ne sont pas comptabilisés dans les animaux utilisés. Fœtus âgés de 35 à 130 jours embryonnaires (durée gestation 165 jours). Comme indiqué en 3.4.10, les fœtus âgés de 105 jours et moins (dans les deux premiers tiers de gestation) ne sont pas comptabilisés dans le nombre d'animaux car ils sont utilisés avant le dernier tiers de leur développement. Nous projetons d’étudier 15 fœtus âgés de plus de 105 jours (dans le dernier tiers de gestation) pour les analyses moléculaires in situ.
Signatures physiopathologiques des réseaux épileptogènes dans les hétérotopies corticales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 589
Électroporées in utero après ouverture de l'abdomen de leur mère, opérées à la naissance ou à l'âge adulte par craniotomie pour recevoir électrodes ou canules, 779 souris et 589 rats vont être utilisés, dont 184 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils développent des crises d'épilepsie spontanées ou provoquées par des injections répétées d'un agent convulsivant ou par un séjour de vingt minutes dans une enceinte chauffée, avec secousses musculaires, mâchonnements et hypersalivation. Leur activité cérébrale est enregistrée trois jours par mois, pendant un à six mois selon l'espèce. Tous sont tués pour prélever le tissu cérébral, les crises provoquées qui ne cessent pas d'elles-mêmes après cinq minutes étant stoppées par injection d'une benzodiazépine.
Objectifs
Les malformations du cortex cérébral sont à l'origine d'épilepsies pharmaco-résistantes chez l’enfant et l’adolescent. L'étude des mécanismes conduisant à ces épilepsies est un défi, car les malformations corticales sont généralement diagnostiquées seulement après les premières crises. En outre, il est impossible d'accéder directement aux changements qui se produisent dans le cerveau des patients et conduisent à l'émergence et à la progression de l'épilepsie. C’est pourquoi les organismes modèles sont essentiels pour mieux comprendre cette maladie et de son évolution, et pour développer de meilleurs traitements. Dans ce projet, nous utiliserons des enregistrements électrophysiologiques pour étudier l'activité électrique du cerveau, des analyses du transcriptome pour mesurer l'expression des gènes, ainsi que des analyses histologiques et anatomiques. Cette approche combinée, multimodale, sera appliquée chez plusieurs modèles rongeurs reproduisant des malformations corticales similaires à celles rencontrées chez l’humain, et responsables de crises d’épilepsie. Cette étude nous aidera à mieux comprendre l’évolution pathologique de l'activité cérébrale, en la reliant aux régions cérébrales impliquées et aux changements dans l'expression des gènes, à des étapes cruciales de cette évolution : avant que les crises n’apparaissent, au moment des premières crises et lorsque la maladie est établie. Notre objectif à long terme est d’identifier de nouveaux marqueurs prédictifs de la progression de l’épilepsie, ainsi que des candidats potentiels pour des thérapies ciblées visant à en infléchir l’évolution.
Bénéfices attendus
Notre objectif à long terme est de mieux comprendre les réseaux responsables des crises dans les hétérotopies de la matière grise (des malformations cérébrales responsables d'épilepsie), d’identifier de nouveaux marqueurs prédictifs de la progression de l’épilepsie, ainsi que des gènes candidats ou mécanismes potentiels pour des thérapies ciblées visant à en infléchir l’évolution. Le volet expérimental présenté ici fait partie d’un projet collaboratif au périmètre plus vaste impliquant également des études cliniques menées chez des patients, permettant ainsi un dialogue fructueux entre recherche clinique et préclinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie/analgésie : 1) pour les femelles gestantes, laparotomie afin d’exposer les cornes utérines et procéder à la transfection par électroporation (entre 30 min et 1h) ; 2) pour les jeunes adultes et les adultes, incision de la peau et implantation des émetteurs de télémétrie entre peau et muscle, incision du scalp et craniotomie pour implantation des électrodes (2h) ; 3) pour les nouveau-nés et juvéniles, incision du scalp et craniotomie pour mise en place de canules pour délivrer des vecteurs viraux (15 à 25 min). Ces interventions sont uniques et sont associés à des soins pré-, per- et post-opératoires. Les animaux seront également soumis à des protocoles d’induction de crises d’épilepsie par des moyens pharmacologiques (injections répétées toutes les 10 min de doses sous-convulsives d’un agent convulsivant, maximum 6 doses et 1h), ou par l’hyperthermie (placement dans une enceinte chauffée pendant 20 min maximum). Lorsque ces crises induites ne cessent pas spontanément après 5 min, elles sont stoppées par injection d’une benzodiazépine. Les animaux seront également soumis à des enregistrements continus et à long terme de l’activité cérébrale réalisés sous monitoring vidéo, sur des périodes de 1-3 mois pour les souris et 4-6 mois pour les rats. Ces enregistrements sont réalisés dans la cage et l’environnement de stabulation, sans contrainte (émetteurs sans fil pouvant être allumés/éteints sans contention grâce à des transpondeurs magnétiques). Ces périodes d’enregistrement durent 3 jours par mois (4-5 sessions de 3 jours sur une période de 6 mois chez le rat ; 3 sessions de 3 jours sur une période de 3 mois chez la souris).
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir les nuisances associées aux interventions chirurgicales (laparotomie pour les femelles gestantes et l’implantation des émetteurs de télémétrie, incision du scalp et craniotomie pour implantation des électrodes et des canules), ainsi qu’à l’inconfort associé à la récupération post-chirurgie. Ces nuisances seront contrôlées par l’anesthésie et l’analgésie, ainsi que par les soins pré-, per- et post-opératoires. Les animaux vont subir des crises d’épilepsie spontanées ou induites par des moyens pharmacologiques ou l’hyperthermie. Les crises d’épilepsie spontanées du modèle rat présentant des malformations bilatérales sont des crises « absence » associées à un arrêt comportemental mais sans convulsion ni perte de conscience ni de contrôle postural. Même si elles sont très fréquentes, elles n’entrainent aucun désagrément majeur. Lorsqu’elles sont induites par des conditions favorisant leur survenue (pharmacologie, hyperthermie), les crises sont d’abord associées à des secousses myocloniques des membres et du corps, des mâchonnements, de l’hypersalivation. La phase ultime de la crise est convulsive, tonico-clonique et généralisée. Elle est associée à une perte de conscience brève et transitoire. Si les crises d'épilepsie n'entraînent pas de douleurs physiques, des blessures peuvent néanmoins survenir, liées à des chocs possibles contre les parois de l'enceinte d’observation lors des secousses myocloniques ou des convulsions. Ces blessures, très légères (ex saignements du museau suite à un choc), sont difficiles à prévenir (les parois de la cage ne peuvent pas être capitonnées afin de permettre l’observation) et ne surviennent que très rarement. De plus, les manifestations épileptiques sont peu marquées du fait de l'immaturité des animaux aux stades de développement testés (étude limitée aux stades juvéniles). La récupération post-crise fait l’objet d’un suivi attentif. Si un état de mal épileptique survient et se prolonge plus de 5 minutes, il est stoppé par injection d’une benzodiazépine. La mort de l’animal peut survenir dans de rares cas.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement du tissu cérébral en vue d’analyses histologiques et anatomiques. Ces analyses sont destinées à confirmer la présence de malformations corticales et à mesurer leur position et étendue, ceci, notamment, afin de réaliser des corrélations anatomo-fonctionnelles. Ces analyses sont également destinées à mesurer l’étendue des régions cérébrales concernées par l’expression des protéines transduites par les vecteurs viraux ou confirmer le site d’implantation des canules ou des électrodes. Enfin, la mise à mort est nécessaire afin d’explanter, le cas échéant, les dispositifs expérimentaux utilisés pour les explorations fonctionnelles (implants de télémétrie, électrodes).
Remplacement
Une part importante des expérimentations est réalisée in vitro (principe de remplacement), sur tranches de tissu cérébral maintenue en survie artificielle lors d’enregistrements électrophysiologiques, ou pour des études transcriptomiques et anatomiques réalisées après extraction de tissu et préparation de spécimens histologiques. Les explorations fonctionnelles menées in vivo sont limitées aux explorations ne pouvant être effectuées que chez l’animal entier. C'est le cas des explorations liées aux crises d'épilepsie, qui nécessitent pour se manifester de préserver le contexte in vivo, permettant d'évaluer modifications comportementales liées à la crise, en plus de l'activité électro-clinique globale.
Réduction
Ce projet combine des approches multiples (moléculaires, anatomiques et fonctionnelles, in vivo et ex vivo) menées chez 4 organismes modèles (et des témoins) appartenant à 2 espèces de rongeurs au sein d’une même équipe de recherche (3 chercheurs, 1 post-doctorant, 1 doctorant, 2 ingénieurs), permettant une utilisation au plus juste des effectifs d’animaux soumis à expérimentation. Les estimations d'effectif sont faites en utilisant un outil d'estimation des effectifs basé sur le calcul de puissance et en tenant compte du taux de succès des expérimentations.
Raffinement
Les explorations fonctionnelles menées in vivo sont limitées aux explorations ne pouvant être effectuées que chez l’animal entier : il s’agit de l’enregistrement de l’activité cérébrale par électro-encéphalographie, pratiquée dans des conditions très semblables aux explorations effectuées chez les patients avec épilepsie (principe de raffinement). Ces enregistrements sont effectués par télémétrie, grâce à des transmetteurs télémétriques permettant des enregistrements sans contrainte ("sans fil"). Les transmetteurs utilisés permettent, en plus du suivi de l'activité électrique cérébrale, de suivre la température corporelle, l'activité motrice et le rythme cardiaque, ce qui garantit une surveillance continue des indicateurs cliniques. Enfin, une partie des animaux explorés fait l'objet d'un suivi vidéo continu pour surveiller les indicateurs comportementaux associés aux crises d'épilepsie.
Choix des espèces
Le rat est adapté aux études électrophysiologiques et comportementales, mais il n’existe que peu de rats génétiquement altérés. La transfection par électroporation (voir procédures) permet d’inactiver l’expression corticale de gènes d'intérêt de manière focale et de créer un cortex mosaïque au sein duquel une population altérée se développe dans un environnement sauvage. Il est ainsi possible de créer des modèles avec des hétérotopies sous-corticales semblables à celles des patients, comme des hétérotopies en bande ou des hétérotopies nodulaires. La souris est adaptée aux études électrophysiologiques et comportementales, et de nombreuses lignées génétiquement altérées sont disponibles, permettant l'étude des conséquences de l'invalidation d'un gène, dans un tissu ou un organe spécifique. Ici, nous étudierons 2 modèles d'hétérotopies induites par l'inactivation conditionnelle et restreinte au télencéphale dorsal de 2 gènes, par croisement avec une lignée Cre. Les 2 modèles présentent des hétérotopies sous-corticales et péri-ventriculaires semblables à celles des patients.
Physiopathologie de l’appareil neuromusculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une chirurgie du nerf sciatique de dix minutes, des micro-impulsions électriques dans la patte postérieure et des injections quotidiennes pendant cinq à dix jours sont infligées à 676 souris, dont 84 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes. Le projet vise à caractériser le dialogue entre nerfs et fibres musculaires chez des lignées génétiquement modifiées. La rubrique consacrée aux effets sur les animaux ne mentionne que la biopsie de queue, les injections et le stress de l'anesthésie, et passe sous silence la chirurgie du nerf sciatique et les impulsions électriques.
Objectifs
Le système neuromusculaire nous permet de respirer, marcher, manger, sourire. Les muscles et les neurones associés dégénèrent au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans nombreuses maladies neuromusculaires d’origine génétique. Dans ce dernier cas les interactions entre les neurones et les fibres musculaires se détériorent conduisant à des défauts de contraction des fibres du muscle. Différents modèles de souris génétiquement modifiées permettent de mieux comprendre les propriétés des différents types de fibres musculaires et de leur environnement, et de leur dialogue. L’objectif principal de cette étude sera de caractériser les interactions nerf-fibres musculaires, et d’identifier les mécanismes mis en jeu dans le maitien de l’axe neuromusculaire.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les bases du système neuromusculaire, et d’en comprendre ses atteintes est un enjeu majeur. Cette étude sur la vulnérabilité neuromusculaire devrait aussi permettre de mieux comprendre les bases moléculaires qui contrôlent la formation de l’axe neuromusculaire, en fonction des muscles étudiés. En effet mieux comprendre les interactions entre neurones et fibres musculaires dans le but de caractériser, grâce à des approches techniques innovantes de nouveaux gènes qui contrôlent son intégrité est essentiel pour un jour permettre de guérir les malades atteints de défauts neuromusculaires. En conclusion, les études menées amélioreront nos connaissances sur les propriétés de l’axe neuromusculaire en prenant en compte les neurones et les fibres musculaires.
Procédures
Sur animaux vigiles : le prélèvement unique d’une biopsie de l’extrémité de la queue pour génotypage (5 secondes). L’injection quotidienne sur 5 ou 10 jours, durée 30 secondes. Sur animaux anesthésiés –Injection unique de 10 secondes. -Tonte de la patte postérieure (2 minutes par souris). -Micro impulsions électriques de la patte postérieure (5 minutes par souris). -Chirurgie du nerf sciatique (10 minutes par souris).
Impact sur les animaux
Une douleur légère et de courte durée est occasionnée lors de la biopsie de l’extrémité de la queue des animaux en vue de leur génotypage. Une douleur légère et de courte durée et un stress passager sont occasionnés lors d’injections chez les animaux. Un stress de courte durée peut aussi être occasionné lors des anesthésies.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.
Remplacement
Nous utilisons un modèle de souris car il mime la mise en place de l’appareil neuromusculaire au cours du développement embryonnaire, nous renseigne de manière unique sur le dialogue et les propriétés de l’interaction nerf-muscle en physiologie et en physiopathologie. Les modèles cellulaires ne permettent pas à ce jour de comprendre la diversité de ce dialogue et ne permettent pas de reconstituer la diversité des types de neurones moteurs et des fibres musculaires associées.
Réduction
Nous prélevons le maximum de tissus sur les animaux mis à morts pour éviter l’utilisation ultérieure de nouveaux lots d’animaux. Nous veillerons enfin à utiliser au maximum les mêmes lots d’animaux contrôle quand cela est possible pour éviter d’avoir à élever des animaux surnuméraires. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Le milieu d’hébergement est enrichi à l’aide de coton de nidification et d’une roue d’activité en accès libre. Les animaux sont surveillés régulièrement par le porteur de projet. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Des points limites ont été établis entrainant la mise à mort anticipée ou l’administration d’un analgésique si nécessaire.
Choix des espèces
Les muscles et les nerfs moteurs humains sont bien conservés chez la souris, qui en fait un bon modèle. Le modèle de souris permet également d’accéder à tous les acteurs qui contrôelnt la formation des muscles et des nerfs moteurs associés, sa diversité et sa physiopathologie. Les souris à différents stades de développement post natal sont utilisées pour mieux comprendre le dialogue entre les différents muscles et leurs nerfs moteurs associés.
Etude des causes génétiques des maladies affectant le cerveau et le muscle dans des modèles de souris transgéniques (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Biopsiées à l'oreille vers une semaine de vie, testées cinq fois avant trois semaines d'âge, les mêmes souris enchaînent treize tests entre dix et dix-neuf semaines, répartis sur dix semaines avec trois à sept jours de repos entre chacun. Certains se déroulent dans l'eau, d'autres mesurent la force musculaire ou la mémoire, et un sous-groupe reçoit une injection déclenchant des crises d'épilepsie. 768 souris sont utilisées dans ce second volet, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau et les muscles.
Objectifs
Les maladies du cerveau représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré les progrès récents de la génétique, près d’un patient sur deux ne bénéficie toujours pas d’un diagnostic génétique précis. Cette situation est souvent liée au fait que les gènes impliqués sont encore mal compris, ce qui entraîne des délais prolongés avant que les enfants concernés puissent recevoir un diagnostic. Ces maladies sont très diverses sur le plan génétique. A ce jour, plus de 2 000 gènes sont impliqués dans les maladies du cerveau. De plus, les atteintes du cerveau sont fréquemment associées à des problèmes musculaires, tels que des difficultés de mouvement, de coordination ou une faiblesse musculaire. Ce lien suggère que certains gènes jouent un rôle commun dans le fonctionnement du cerveau et des muscles. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre le rôle de plusieurs gènes récemment identifiés chez des patients présentant à la fois des maladies du cerveau et des atteintes musculaires. Ces gènes ont été choisis car ils sont systématiquement associés à ces deux types de symptômes, ce qui en fait des gènes candidats particulièrement pertinents pour étudier les liens entre cerveau et muscle. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées afin d’analyser le développement moteur, les capacités de mouvement et certaines fonctions cognitives, comme la mémoire, à différents stades de la vie. L’étude portera à la fois sur des stades précoces du développement et sur l’âge adulte, afin d’identifier le moment où apparaissent les anomalies et leur évolution dans le temps. Ce projet qui sera realisé sur deux établissements (EU 1/2 et EU 2/2), vise à améliorer la compréhension des maladies touchant à la fois le cerveau et les muscles chez les patients, souvent des enfants, afin de contribuer au développement futur de meilleures stratégies diagnostiques et, à terme, thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans de nombreuses maladies du cerveau, les premiers signes apparaissent d’abord au niveau des muscles, peu de temps après la naissance et avant l’apparition des atteintes cognitives. Ainsi, étudier précocement le développement moteur permettrait de détecter très tôt les signes cliniques qui sont parfois invisibles à l’âge adulte, soit parce qu’elles sont corrigées par l’organisme, soit parce qu’elles s’aggravent avec le temps. Ce projet va permettre d’identifier précisément quand apparaissent les premiers signes de la maladie, d’améliorer la compréhension de son évolution et de disposer d’indicateurs précoces utiles pour mieux orienter le diagnostic et la prise en charge des patients, tout en évitant des méthodes plus invasives.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à des interventions sans chirurgie qui sont basées sur l’observation de leur comportement et de leurs capacités de mouvement. Dans un premier temps, un très petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille de chaque souris afin de caractériser leurs gènes. Ce geste est réalisé une seule fois et dure quelques secondes. Chez les jeunes souris, des observations seront réalisées pour suivre le développement des mouvements, comme la capacité à se déplacer, à se retourner ou à utiliser leurs pattes. Ces tests sont courts et durent moins d’une minute. Le nombre total de tests effectués au stade précoce (entre 1 et 3 semaines d’âge) dans l’EU 1/2 est de cinq, pour une durée totale maximale d’environ cinq minutes, les tests étant réalisés successivement. À l’âge adulte, les mêmes souris participeront à différents tests permettant d’évaluer leur comportement, leur mémoire et leurs capacités physiques. Ces tests consistent principalement à observer leurs déplacements, l’exploration d’un environnement ou la force musculaire. Chaque test dure quelques minutes et les animaux bénéficient de périodes de repos entre les séances. Le nombre total de tests effectués à l’âge adulte dans l’EU 2/2 est de treize. Ils seront répartis sur une période de 10 semaines avec des périodes de repos de 3 à 7 jours entre les tests. Les animaux auront alors entre 10 et 19 semaines d’âge. Pour un nombre limité de souris adultes (un sous-groupe), un test spécifique permettra d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie à l’aide d’une injection unique. Les animaux seront ensuite surveillés en continu pendant 20 minutes après l’injection. Cette étape est importante car, dans de nombreux cas, les crises d’épilepsie représentent un symptôme majeur qui aggrave fortement la maladie et la qualité de vie des patients. Étudier ces crises chez la souris permet donc de mieux comprendre leur origine et leur lien avec les autres symptômes observés. À la fin du projet, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement et l’analyse de certains organes, dont le cerveau et les muscles. Ces analyses sont indispensables pour mieux comprendre les maladies qui touchent à la fois le cerveau et les muscles chez les enfants malades.
Impact sur les animaux
À l’âge d’environ une semaine, un petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille des souris afin d’analyser leurs gènes. Ce geste peut provoquer une douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Le risque de saignement est très faible. Tout au long du projet, chez les souris jeunes et adultes, différents tests seront réalisés pour observer leurs mouvements et leur comportement. Ces manipulations peuvent entraîner un stress temporaire, notamment lors de la prise en main ou de l’exposition à un nouvel environnement. Les tests sont courts, espacés dans le temps et les animaux sont habitués au matériel et à la salle d’expérimentation afin de limiter ces effets. Lors de certains tests, notamment ceux réalisés dans l’eau, les souris peuvent ressentir un inconfort passager lié au contact avec l’eau. Ces effets sont limités par une durée d’exposition courte de quelques minutes, une température de l’eau contrôlée, une surveillance continue et un séchage immédiat après chaque session. Pour un nombre limité de souris adultes, un test permettant d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie sera réalisé à l’aide d’une injection unique. Cette injection peut entraîner une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi que l’apparition temporaire de crises convulsives. Les animaux seront surveillés en continu pendant une période maximale de 20 minutes. Si des signes de détresse sévère apparaissent, le test sera immédiatement interrompu et l’animal pris en charge. Enfin, une lignée de souris particulière peut développer des tumeurs à partir de l’âge de 6 mois. Les animaux utilisés pour les tests seront mis à mort bien avant cet âge. Les animaux conservés en élevage seront également mis à mort avant l’âge limite de 6 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des muscles et du cerveau. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser des analyses anatomiques et moléculaires, permettant d’étudier les similitudes et les différences entre ces deux organes et de mieux comprendre les maladies associées.
Remplacement
Les maladies du cerveau font intervenir des mécanismes complexes qui touchent à la fois le cerveau, les muscles et le comportement. Ces interactions ne peuvent pas être étudiées à l’aide de modèles simplifiés, comme des cellules cultivées en laboratoire ou des simulations informatiques. Même si les études sur cellules permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques de base, elles ne permettent pas d’observer comment les gènes influencent le développement du cerveau, les capacités de mouvement ou les comportements dans un organisme vivant. Or, ces aspects sont essentiels pour comprendre les maladies étudiées dans ce projet. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. La souris est particulièrement adaptée, car son fonctionnement biologique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. De plus, il existe déjà un grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées, développés dans le cadre de collaborations internationales, ce qui permet d’étudier de manière ciblée le rôle de nombreux gènes impliqués dans ces maladies. Enfin, ces maladies étant rares et touchant souvent des enfants, il est très difficile de réaliser ce type d’études directement chez l’être humain. Le recours à la souris est donc nécessaire pour améliorer la compréhension de ces maladies et préparer le développement de futures approches diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats fiables, tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Les effectifs ont été déterminés à partir de données issues d’études précédentes et de méthodes statistiques, de manière à utiliser uniquement le nombre de souris strictement nécessaire. Afin de réduire le nombre total d’animaux, les mêmes souris sont suivies tout au long du projet, depuis les premières étapes du développement jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet de recueillir plusieurs types d’informations chez les mêmes animaux, évitant ainsi de multiplier les groupes expérimentaux. Ce suivi sur la durée permet également de mieux comprendre l’évolution des maladies étudiées, en observant comment les symptômes apparaissent et évoluent avec le temps. Chez la souris, l’âge adulte atteint en fin de projet correspond approximativement à un âge avancé chez l’humain, ce qui rend cette approche particulièrement pertinente pour étudier l’évolution des maladies du cerveau associées à des atteintes musculaires. Les analyses des résultats seront réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, ce qui permet d’obtenir des conclusions solides sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les souris témoins sont issues des mêmes portées que les souris génétiquement modifiées, afin de limiter la production d’animaux en excès. Au total, ce projet nécessitera un maximum de 768 souris, incluant des mâles et des femelles. Ce nombre correspond au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et des expérimentateurs et au contact avant le début de chaque procédure. Un petit tunnel sera utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10jours après la naissance, à un âge où le système nerveux est pas encore complètement développé. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera limité à une seule fois. Il sera réalisé sur une courte distance de moins de 1 km dans des conditions adaptées, en conservant les cages d’origine, la litière et les élèments d’enrichissement habituel afin de maintenir un environnement familier. À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation suffisante avant toute nouvelle manipulation expérimentale. Chez les souris adultes, une phase d’habituation sera mise en place avant le début des tests afin de réduire l’anxiété liée à la nouveauté. Les animaux seront familiarisés avec les dispositifs utilisés et la présence des expérimentateurs. Les évaluations seront organisées de manière progressive, en commençant par les moins contraignantes, avec des périodes de repos suffisantes entre chaque étape pour permettre une récupération complète. Certaines évaluations pouvant entraîner un inconfort temporaire feront l’objet de mesures spécifiques. Lors des tests impliquant une exposition à l’eau, les conditions seront strictement contrôlées, la durée d’exposition sera limitée, et les animaux seront immédiatement séchés et maintenus au chaud après chaque session afin d’éviter toute gêne. Tout au long des manipulations, les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant des abris et des matériaux adaptés, afin de favoriser les comportements naturels et de limiter le stress. Les animaux seront surveillés régulièrement, avec un suivi du poids et de l’état général, afin de détecter précocement tout signe de mal-être, de souffrance ou de détérioration de leur état de santé. Des points limites adaptés permettront d’interrompre la participation d’un animal au projet si nécessaire. En cas de dégradation de l’état général ou de souffrance persistante, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle d’étude car elle présente de nombreuses similitudes avec l’être humain. Bien que la surface de son cerveau soit plus simple que celle de l’homme, la grande majorité des structures cérébrales est commune aux deux espèces. De plus, une part très importante des mécanismes biologiques est partagée, ce qui permet d’étudier de manière pertinente l’origine de certaines maladies affectant le cerveau et les muscles. La souris est également un modèle particulièrement adapté pour l’étude des comportements. Elle permet d’analyser des fonctions complexes telles que les capacités de mouvement, certaines formes de mémoire ou les interactions sociales, qui ne peuvent pas être étudiées de manière fiable avec des modèles non animaux. Par ailleurs, ce modèle permet d’étudier séparément les mâles et les femelles, un point essentiel car certaines maladies du cerveau touchent différemment les deux sexes et sont plus fréquentes chez les garçons. Les animaux seront étudiés à plusieurs stades clés de leur développement afin de mieux comprendre l’apparition et l’évolution des maladies. Une première phase concernera la période précoce après la naissance, jusqu’à la troisième semaine de vie. À ce stade, le système nerveux et les muscles sont encore en cours de maturation. L’étude de cette période permet de détecter d’éventuels retards ou anomalies du développement moteur dès leur apparition. Une seconde phase sera réalisée chez les mêmes animaux à l’âge adulte, lorsque le cerveau et les muscles ont atteint leur maturité. Cette étape est indispensable pour évaluer de manière fiable les capacités motrices, musculaires et certaines fonctions cognitives, et pour comprendre comment les anomalies observées précocement évoluent au cours du temps.
Etude des causes génétiques des maladies affectant le cerveau et le muscle dans des modèles de souris transgéniques (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour porter des mutations trouvées chez des enfants atteints à la fois de maladies du cerveau et de faiblesse musculaire, 768 souris vont être utilisées, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un morceau d'oreille leur est prélevé vers 7 à 10 jours de vie pour le génotypage, puis cinq tests de motricité leur sont appliqués entre une et trois semaines d'âge. Un sous-groupe reçoit une injection destinée à déclencher des crises d'épilepsie, avec vingt minutes d'observation ensuite. Toutes sont tuées pour prélever cerveau et muscles, la comparaison de ces deux organes étant l'objet même du projet.
Objectifs
Les maladies du cerveau représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré les progrès récents de la génétique, près d’un patient sur deux ne bénéficie toujours pas d’un diagnostic génétique précis. Cette situation est souvent liée au fait que les gènes impliqués sont encore mal compris, ce qui entraîne des délais prolongés avant que les enfants concernés puissent recevoir un diagnostic. Ces maladies sont très diverses sur le plan génétique. A ce jour, plus de 2 000 gènes sont impliqués dans les maladies du cerveau. De plus, les atteintes du cerveau sont fréquemment associées à des problèmes musculaires, tels que des difficultés de mouvement, de coordination ou une faiblesse musculaire. Ce lien suggère que certains gènes jouent un rôle commun dans le fonctionnement du cerveau et des muscles. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre le rôle de plusieurs gènes récemment identifiés chez des patients présentant à la fois des maladies du cerveau et des atteintes musculaires. Ces gènes ont été choisis car ils sont systématiquement associés à ces deux types de symptômes, ce qui en fait des gènes candidats particulièrement pertinents pour étudier les liens entre cerveau et muscle. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées afin d’analyser le développement moteur, les capacités de mouvement et certaines fonctions cognitives, comme la mémoire, à différents stades de la vie. L’étude portera à la fois sur des stades précoces du développement et sur l’âge adulte, afin d’identifier le moment où apparaissent les anomalies et leur évolution dans le temps. Ce projet qui sera realisé sur deux établissements (EU 1/2 et EU 2/2), vise à améliorer la compréhension des maladies touchant à la fois le cerveau et les muscles chez les patients, souvent des enfants, afin de contribuer au développement futur de meilleures stratégies diagnostiques et, à terme, thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans de nombreuses maladies du cerveau, les premiers signes apparaissent d’abord au niveau des muscles, peu de temps après la naissance et avant l’apparition des atteintes cognitives. Ainsi, étudier précocement le développement moteur permettrait de détecter très tôt les signes cliniques qui sont parfois invisibles à l’âge adulte, soit parce qu’elles sont corrigées par l’organisme, soit parce qu’elles s’aggravent avec le temps. Ce projet va permettre d’identifier précisément quand apparaissent les premiers signes de la maladie, d’améliorer la compréhension de son évolution et de disposer d’indicateurs précoces utiles pour mieux orienter le diagnostic et la prise en charge des patients, tout en évitant des méthodes plus invasives.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à des interventions sans chirurgie qui sont basées sur l’observation de leur comportement et de leurs capacités de mouvement. Dans un premier temps, un très petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille de chaque souris afin de caractériser leurs gènes. Ce geste est réalisé une seule fois et dure quelques secondes. Chez les jeunes souris, des observations seront réalisées pour suivre le développement des mouvements, comme la capacité à se déplacer, à se retourner ou à utiliser leurs pattes. Ces tests sont courts et durent moins d’une minute. Le nombre total de tests effectués au stade précoce (entre 1 et 3 semaines d’âge) dans l’EU 1/2 est de cinq, pour une durée totale maximale d’environ cinq minutes, les tests étant réalisés successivement. À l’âge adulte, les mêmes souris participeront à différents tests permettant d’évaluer leur comportement, leur mémoire et leurs capacités physiques. Ces tests consistent principalement à observer leurs déplacements, l’exploration d’un environnement ou la force musculaire. Chaque test dure quelques minutes et les animaux bénéficient de périodes de repos entre les séances. Le nombre total de tests effectués à l’âge adulte dans l’EU 2/2 est de treize. Ils seront répartis sur une période de 10 semaines avec des périodes de repos de 3 à 7 jours entre les tests. Les animaux auront alors entre 10 et 19 semaines d’âge. Pour un nombre limité de souris adultes (un sous-groupe), un test spécifique permettra d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie à l’aide d’une injection unique. Les animaux seront ensuite surveillés en continu pendant 20 minutes après l’injection. Cette étape est importante car, dans de nombreux cas, les crises d’épilepsie représentent un symptôme majeur qui aggrave fortement la maladie et la qualité de vie des patients. Étudier ces crises chez la souris permet donc de mieux comprendre leur origine et leur lien avec les autres symptômes observés. À la fin du projet, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement et l’analyse de certains organes, dont le cerveau et les muscles. Ces analyses sont indispensables pour mieux comprendre les maladies qui touchent à la fois le cerveau et les muscles chez les enfants malades.
Impact sur les animaux
À l’âge d’environ une semaine, un petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille des souris afin d’analyser leurs gènes. Ce geste peut provoquer une douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Le risque de saignement est très faible. Tout au long du projet, chez les souris jeunes et adultes, différents tests seront réalisés pour observer leurs mouvements et leur comportement. Ces manipulations peuvent entraîner un stress temporaire, notamment lors de la prise en main ou de l’exposition à un nouvel environnement. Les tests sont courts, espacés dans le temps et les animaux sont habitués au matériel et à la salle d’expérimentation afin de limiter ces effets. Lors de certains tests, notamment ceux réalisés dans l’eau, les souris peuvent ressentir un inconfort passager lié au contact avec l’eau. Ces effets sont limités par une durée d’exposition courte de quelques minutes, une température de l’eau contrôlée, une surveillance continue et un séchage immédiat après chaque session. Pour un nombre limité de souris adultes, un test permettant d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie sera réalisé à l’aide d’une injection unique. Cette injection peut entraîner une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi que l’apparition temporaire de crises convulsives. Les animaux seront surveillés en continu pendant une période maximale de 20 minutes. Si des signes de détresse sévère apparaissent, le test sera immédiatement interrompu et l’animal pris en charge. Enfin, une lignée de souris particulière peut développer des tumeurs à partir de l’âge de 6 mois. Les animaux utilisés pour les tests seront mis à mort bien avant cet âge. Les animaux conservés en élevage seront également mis à mort avant l’âge limite de 6 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des muscles et du cerveau. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser des analyses anatomiques et moléculaires, permettant d’étudier les similitudes et les différences entre ces deux organes et de mieux comprendre les maladies associées.
Remplacement
Les maladies du cerveau font intervenir des mécanismes complexes qui touchent à la fois le cerveau, les muscles et le comportement. Ces interactions ne peuvent pas être étudiées à l’aide de modèles simplifiés, comme des cellules cultivées en laboratoire ou des simulations informatiques. Même si les études sur cellules permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques de base, elles ne permettent pas d’observer comment les gènes influencent le développement du cerveau, les capacités de mouvement ou les comportements dans un organisme vivant. Or, ces aspects sont essentiels pour comprendre les maladies étudiées dans ce projet. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. La souris est particulièrement adaptée, car son fonctionnement biologique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. De plus, il existe déjà un grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées, développés dans le cadre de collaborations internationales, ce qui permet d’étudier de manière ciblée le rôle de nombreux gènes impliqués dans ces maladies. Enfin, ces maladies étant rares et touchant souvent des enfants, il est très difficile de réaliser ce type d’études directement chez l’être humain. Le recours à la souris est donc nécessaire pour améliorer la compréhension de ces maladies et préparer le développement de futures approches diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats fiables, tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Les effectifs ont été déterminés à partir de données issues d’études précédentes et de méthodes statistiques, de manière à utiliser uniquement le nombre de souris strictement nécessaire. Afin de réduire le nombre total d’animaux, les mêmes souris sont suivies tout au long du projet, depuis les premières étapes du développement jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet de recueillir plusieurs types d’informations chez les mêmes animaux, évitant ainsi de multiplier les groupes expérimentaux. Ce suivi sur la durée permet également de mieux comprendre l’évolution des maladies étudiées, en observant comment les symptômes apparaissent et évoluent avec le temps. Chez la souris, l’âge adulte atteint en fin de projet correspond approximativement à un âge avancé chez l’humain, ce qui rend cette approche particulièrement pertinente pour étudier l’évolution des maladies du cerveau associées à des atteintes musculaires. Les analyses des résultats seront réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, ce qui permet d’obtenir des conclusions solides sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les souris témoins sont issues des mêmes portées que les souris génétiquement modifiées, afin de limiter la production d’animaux en excès. Au total, ce projet nécessitera un maximum de 768 souris, incluant des mâles et des femelles. Ce nombre correspond au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et des expérimentateurs et au contact avant le début de chaque procédure. Un petit tunnel sera utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10jours après la naissance, à un âge où le système nerveux est pas encore complètement développé. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera limité à une seule fois. Il sera réalisé sur une courte distance de moins de 1 km dans des conditions adaptées, en conservant les cages d’origine, la litière et les élèments d’enrichissement habituel afin de maintenir un environnement familier. À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation suffisante avant toute nouvelle manipulation expérimentale. Chez les souris adultes, une phase d’habituation sera mise en place avant le début des tests afin de réduire l’anxiété liée à la nouveauté. Les animaux seront familiarisés avec les dispositifs utilisés et la présence des expérimentateurs. Les évaluations seront organisées de manière progressive, en commençant par les moins contraignantes, avec des périodes de repos suffisantes entre chaque étape pour permettre une récupération complète. Certaines évaluations pouvant entraîner un inconfort temporaire feront l’objet de mesures spécifiques. Lors des tests impliquant une exposition à l’eau, les conditions seront strictement contrôlées, la durée d’exposition sera limitée, et les animaux seront immédiatement séchés et maintenus au chaud après chaque session afin d’éviter toute gêne. Tout au long des manipulations, les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant des abris et des matériaux adaptés, afin de favoriser les comportements naturels et de limiter le stress. Les animaux seront surveillés régulièrement, avec un suivi du poids et de l’état général, afin de détecter précocement tout signe de mal-être, de souffrance ou de détérioration de leur état de santé. Des points limites adaptés permettront d’interrompre la participation d’un animal au projet si nécessaire. En cas de dégradation de l’état général ou de souffrance persistante, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Sur le plan anatomique, même si la surface du cerveau de la souris adulte présente moins de circonvolutions que celle de l’homme, la quasi-totalité des structures cérébrales est commune aux deux espèces. Sur le plan génétique, environ 90% des gènes sont conservés entre la souris et l’homme, ce qui rend les études génétiques particulièrement pertinentes dans ce modèle. Sur le plan comportemental, la souris présente un excellent compromis entre complexité comportementale et proximité phylogénétique, permettant la modélisation de pathologies associées à des comportements complexes tels que la reconnaissance sociale ou la reconnaissance d’objets. Et enfin, contrairement à certains autres modèles expérimentaux, la souris permet également d’étudier les différences liées au sexe, un paramètre particulièrement important dans les troubles du neurodéveloppement, qui présentent une prévalence plus élevée chez les garçons. Les souris seront utilisées à différents stades de développement.
Generation de lignées transgéniques pour étudier la formation de l’organe olfactif chez le poisson zébre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1 312 poissons zèbres sur 2 920 vont être tués parce qu'ils ne portent pas le bon génotype, les 1 608 autres étant gardés pour la reproduction, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certains individus issus de douze des trente lignées créées subissent une biopsie de moins de deux minutes, seul geste invasif prévu, suivie d'un isolement de moins de trois jours. Les adultes ne servent qu'à produire des embryons, dont le développement externe permet l'imagerie à haute résolution sur le vivant. Le porteur présente ce modèle comme permettant la transgenèse "sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur", dans un projet qui prévoit la mise à mort de 1 312 poissons au tri génotypique.
Objectifs
Notre projet vise à caractériser les mécanismes gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 30 nouvelles lignées pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.
Bénéfices attendus
Le projet nous permettra d’établir de nouvelles lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons à mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. De plus ces lignées seront accessibles à toute la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, d'enzymes ou pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques impliqués dans de nombreux processus et pathologies.
Procédures
Certains individus issus de 12 lignées générées, pourront subir une biopsie. Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Les animaux générés par transgénèse seront observés et sélectionnés dès le 1er jour, ainsi toutes malformations du développement seront écartées rapidement. Ils seront suivis journalièrement, afin de détecter le plus précocement possible tous signes de souffrances, et ce sur 2 générations. Les individus issus de certaines lignées mutantes homozygotes, pourront présenter précocement des signes cliniques liés à l'âge. Le prélèvement de tissu invasif peut provoquer un stress lié à la manipulation (quelques secondes) et à l'isolement (
Devenir
Les animaux n'ayant pas le bon génotype seront mis à mort. Les autres animaux seront conservés à des fin de reproduction.
Remplacement
Des recherches ont montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains parmi lesquels 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, cela en fait donc un très bon modèle pour comprendre le développement de l’organe olfactif et la modélisation des maladies humaines. De plus, le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus intéressante pour l’injection, le suivis du développement embryonnaire et l’imagerie sur le vivant. C’est pourquoi notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre. L’espèce animale et notamment l’organisme entier utilisé ne peut donc être remplacée. Cela nécessite une approche in vivo sur l’animal.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.
Raffinement
Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendre la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.
Choix des espèces
Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif dont la perturbation peut conduire chez l’Humain à des pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques et complexes. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » à haute résolution grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet également aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse ainsi qu’à la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe, ce qui permet d'avoir accès à ses embryons facilement, et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulent entre le stade 1 cellule (oeuf) et 4 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. En effet, la mise en place du système olfactif s'effectue entre 12 heures post fécondation (hpf) et 36hpf. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives.
Production d’ovocytes de xenopus tropicalis par injection d’hormone et fécondation in vitro
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Les 150 mâles sont tués après stimulation hormonale pour qu'on leur prélève les testicules, les 48 femelles restant en vie et sollicitées à nouveau tous les quatre mois, soit 198 xénopes utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Femelles et mâles reçoivent une injection d'hormone sur animal vigile maintenu en contention de dix à trente secondes, les femelles étant ensuite isolées 48 heures pour finir de se vider de leurs ovocytes, faute de quoi leurs congénères les mordent pour manger les œufs. Le porteur indique que la ponte provoquée n'a pas d'impact négatif sur la santé des femelles et qu'elles peuvent être utilisées ainsi toute leur vie, soit une dizaine d'années en captivité. Cette structure ne mène pas de recherche propre, elle fournit ovocytes et embryons à d'autres équipes.
Objectifs
La plateforme constitue une structure d'appui à la recherche qui a pour mission de fournir des ovocytes et des embryons à la communauté des chercheurs utilisant le modèle xénope dans les domaines de la biologie du développenent et des neurosciences. L'obtention d'oeufs fertilisés nécessiste des injections d'hormones chez la femelle et chez le mâle. Ces hormones stimulent la ponte (femelles) et la maturation des gamètes (mâles) afin d'obtenir des fertilisations in vitro de qualité et en quantité.
Bénéfices attendus
Notre structure d’appui à la recherche a pour mission de fournir des œufs fécondés ou non à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes. Les oeufs non fécondés pourront être utilisés pour des expérimentations de biochimie (quantification de protéines, expériences sur des extraits). Les oeufs fécondés, du fait de leur transparence et de leur facilité d'accès (développement externes) sont des outils puissants pour comprendre les mécanismes du développement embryonnaire. Par exemple, parmis les équipes qui bénéficieront de la production d'ovocytes, certaines utilisent actuellement le xénope pour développer un nouveau système modèle pertinent et robuste pour étudier et comprendre des maladies humaines liées au développement précoce du cerveau et à l'émergence des tumeurs pédiatriques. Une autre équipe étudie les mécanismes fondamentaux de la dépense énergétique dans le développement.
Procédures
Femelles : Les femelles seront soumises à une administration d’hormone sur animal vigile en contention afin de stimuler la ponte. Cet acte dure de 5 à 10 secondes. Après récolte de leurs œufs, les femelles sont ensuite maintenues en hébergement individuel durant 48h pour surveillance. Cette période permet à la femelle de se vider de ses ovocytes matures, ce qui évite que ses congénères ne la mordent en voulant manger les ovocytes. Les femelles retournent ensuite dans leur groupe d’origine. Mâles : Les mâles seront soumis à une administration d’hormone sur animal vigile en contention afin de stimuler la production de sperme de qualité. Cet acte dure de 5 à 10 secondes. Les mâles seront ensuite euthanasiés pour récupérer leurs testicules.
Impact sur les animaux
Les animaux seront hébergés individuellement, mais le stress social n’est pas applicable chez cette espèce. Le Xénope est en effet un animal poïkilotherme, à comportement solitaire en conditions normales d’élevage. Les nuisances attendues lors de la stimulation hormonale des femelles et des mâles vigiles sont principalement de type inconfort et stress, ainsi qu’une douleur légère et transitoire. Le stress et l’inconfort peuvent être liés : 1. à la capture de l’animal dans l’aquarium, 2. au maintien en contention, d’une durée brève (10 à 30 secondes), 3. à la manipulation nécessaire à la récolte des ovocytes chez les femelles. Une douleur légère et transitoire peut également survenir lors de la stimulation hormonale.
Devenir
Chez la femelle Xenopus, la ponte est déclenchée par une injection lorsqu’elle est adulte. En respectant un délai suffisant entre deux stimulations (environ 4 mois), cette procédure n’a pas d’impact négatif sur sa santé et peut être répétée plusieurs fois au cours de sa vie. Les femelles peuvent ainsi être utilisées tout au long de leur durée de vie. Les mâles, quant à eux, sont utilisés pour la production de spermatozoïdes nécessaires à la fécondation in vitro. Après stimulation hormonale, ils sont euthanasiés pour permettre le prélèvement des testicules et ne sont donc pas maintenus en vie après la procédure.
Remplacement
La production d'embryons permettra d'explorer les étapes précoces du développement chez les vertébrés. Nous intervenons sur les animaux adultes dans un seul but : stimulation hormonale de l’ovulation des femelles vivantes dans le but de récolter les ovocytes suite à leur ponte qui seront ensuite fécondés in vitro pour la production des embryons. Il n’y a pas de méthode de substitution possible. Les équipes utilisent au maximum des approches in silico et si possibles des approches dans des cellules mammifères en culture en complément de nos approches in vivo. De plus le vertébré tétrapode non mammifère Xenopus tropicalis répondent idéalement aux recommandations des 3R : Remplacer, Réduire et Raffiner. L'amphibien Xenopus tropicalis possède une longévité et une période de reproduction remarquables (10 ans) ce qui en fait un excellent modèle pérenne pour les études d’ordre génétique.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous nous appuyons sur le fait qu’un petit nombre d’adultes permet d’obtenir un grand nombre d’embryons par fécondation in vitro. Les expériences sont organisées de manière à optimiser l’utilisation de ces embryons, en coordonnant le travail de plusieurs expérimentateurs et en regroupant les essais. Nous adaptons en permanence nos pratiques grâce à une veille scientifique régulière et nous ne réalisons des expériences sur les animaux que lorsqu’elles sont indispensables. Les résultats obtenus sont analysés afin d’ajuster au plus juste le nombre d’animaux nécessaires. En pratique, une à deux fécondations sont réalisées par semaine, en utilisant 3 à 4 femelles, avec généralement un seul mâle suffisant pour chaque série. Les mâles reçoivent également une injection hormonale et sont donc inclus dans le nombre total d’animaux. Les femelles peuvent être sollicitées plusieurs fois, en respectant un intervalle de repos de 4 mois, afin de limiter leur stress et de réduire le nombre total d’individus utilisés. Lorsque cela est possible, des femelles issues de projets précédents sont réutilisées. Au total, sur toute la durée du projet, le nombre maximal d’animaux adultes utilisés est estimé à 48 femelles et 150 mâles, soit 198 animaux. Cette estimation prend en compte la réutilisation raisonnée des animaux, le respect de périodes de repos et l’optimisation des procédures expérimentales.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des aquariums ayant une capacité de 10 litre par aquarium, contenant de l’eau déchlorée, filtrée et oxygénée, à 20 degrés . Des sondes surveillent en temps réel la température, le pH et la conductivité. Les aquariums sont enrichis par des tubes en plastique où certains animaux peuvent se cacher, ainsi que par des aménagements intérieurs (plantes artificielles et petites billes), bien que le comportement majoritaire consiste à rester allongé sur le fond de l’aquarium. La nourriture non consommée et les fèces sont éliminées quotidiennement. Un nettoyage des parois des aquariums est effectué tous les 15 jours. Six à huit animaux sont regroupés par aquarium. Aucun stress n’est observé lorsque le groupe est réduit ou lorsque l’individu est hébergé seul, cette espèce présentant un comportement solitaire. Lors de la réception, les animaux sont placés dans des bacs individuels et observés pendant deux semaines avant leur introduction dans le circuit fermé. Ils sont ensuite acclimatés pendant deux semaines avant d’être intégrés à un protocole expérimental. Les xénopes adultes sont nourris deux fois par semaine à satiété avec des granulés de poisson et des vers de vase et/ou du cœur de bœuf. Les animaux sont prélevés à la main ou à l’aide d’une épuisette, en évitant tout mouvement brusque afin de limiter le stress. Une grille de score est réalisée à intervalles réguliers, avec des points limites définis afin d’assurer le suivi et l’évaluation des paramètres observés.
Choix des espèces
Le xénope est un organisme modèle de choix pour l’étude des processus biologiques. Il a par exemple contribué de manière déterminante à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement embryonnaire. Il fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Outre ces caractéristiques, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Pour pouvoir obtenir des pontes les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés de 1 an environ pour X. tropicalis, jusqu’à leur mort (environ 10 ans en captivité).
Étude du rôle du gène H13 au cours du développement chez la souris pour évaluer son implication dans une maladie rare, le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Colin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Pesée chaque semaine de 2 à 15 semaines d'âge, soumise à six tests moteurs et neurodéveloppementaux et à deux prélèvements de sang, chaque souris de la lignée étudiée porte l'inactivation d'un gène soumis à empreinte parentale. 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et toutes seront tuées pour que la plupart de leurs organes soient disséqués et prélevés. Le porteur attend un retard de croissance, une minéralisation osseuse anormale, un museau déformé, des difficultés à se nourrir et une faiblesse musculaire, signes qu'il rapproche du syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin observé chez des enfants. Il annonce des tests destinés à évaluer la motricité, la mémoire et l'anxiété sans préciser lesquels, et deux échographies sous anesthésie chez les mères pour la partie embryonnaire.
Objectifs
L'empreinte parentale est un mécanisme biologique qui influence l'activation (ou l'expression) de certains gènes en fonction de leur origine maternelle ou paternelle. En générale, nous héritons de deux copies de chaque gène, une de notre mère et une de notre père. Cependant, environ 150 gènes ne s'expriment qu'à partir de l'une des copies (soit celle de notre mère, soit celle de notre père). Ces gènes sont importants pour la croissance et le développement. Lorsqu'un problème survient dans ce processus, cela peut entrainer des maladies rares, comme le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Colin. Cette pathologie se caractérise par un retard de croissance, des difficultés d'alimentation et parfois d'autres troubles du développement. Chez les personnes atteintes de ce syndrome, la cause génétique est la présence de deux chromosomes 20 provenant de la mère, mais aucun provenant de leur père. Cela perturbe l'expression normale de certains gènes présents sur ce chromosome. Parmi ces gènes, nous avons identifié deux gènes d'intérêt qui pourraient jouer un rôle clé. Le premier gène d'intérêt est actif uniquement lorsqu'il vient du père, tandis que le second s'exprime différemment selon qu'il vient du père ou de la mère. Les versions maternelles de ce second gène d'intérêt produisent une enzyme particulière, alors que la fonction des versions paternelles reste inconnue. Ce projet a pour but d'étudier en détail la région de ces deux gènes d'intérêt chez la souris pour comprendre comment elle pourrait être impliquée dans le MBCS. Pour mieux comprendre l'impact de ces gènes sur le développement, nous allons utiliser des modèles cellulaires et un modèle de souris. En particulier, nous allons étudier des souris qui ont une modification génétique dans ce second gène et déterminer les conséquences de la transmission de cette modification à partir du père ou de la mère notamment sur la croissance et le métabolisme. L'objectif final est d'étudier comment l'absence de ces différentes versions du gène (selon qu'elles viennent de la mère ou du père) influence le développement de l'organisme, afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Colin.
Bénéfices attendus
Les maladies rares touchent environ 6 % de la population mondiale, ce qui constitue un enjeu important pour la santé humaine. La majorité de ces maladies (80 %) sont d'origine génétique. Identifier les causes génétiques est essentiel, non seulement pour mieux comprendre les mécanismes qui provoquent ces maladies, mais aussi pour améliorer leur diagnostic et permettre des traitements plus précoces. Ce projet vise à étudier le rôle d’une région du génome afin de mieux comprendre les mécanismes conduisant à une maladie rare, le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin (MCBS). Cette maladie, découverte en 2016 se manifeste par des troubles de la croissance et du développement. Ce projet évaluera si le gène ciblé est impliqué dans cette maladie, et si c’est le cas, cela suggérera qu'il existe des causes génétiques du MBCS, non encore identifiées, affectant uniquement cette région. Il serait alors intéressant d'examiner les patients présentant des symptômes similaires à ceux du MCBS pour voir s'ils ont des anomalies génétiques dans cette région. Ce travail permettra de mieux comprendre les effets de ces anomalies et d'aider à développer des tests pour diagnostiquer les patients atteints de maladies génétiques affectant la croissance et le développement, mais qui n'ont pas encore de causes connues.
Procédures
Dans le but d'étudier le rôle de la région du génome ciblé et d'évaluer son lien avec une maladie humaine appelée le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin, une lignée de souris déficientes pour les différentes formes de ce gène sera étudiée. L'objectif est de voir si la perte de ce gène entraîne des symptômes similaires à ceux observés chez les patients. Une première partie de l’étude se focalisera sur le développement embryonnaire de cette lignée. Lors de cette étude, les animaux (mères) seront soumis à deux échographies sous anesthésie générale gazeuse pour contrôler le développement des embryons. La durée de ces échographies est d’environ 15 minutes. Ensuite, l’étude de la croissance des souris sera surveillée en mesurant le poids de 72 souris chaque semaine de 2 à 15 semaines d’âge. Ces souris seront soumises à des tests moteurs et neurodéveloppementaux, de difficulté légère, pour évaluer leurs capacités motrices, leur mémoire et leur niveau d'anxiété (6 tests dont la durée est de quelques minutes, toujours inférieur à une heure). L’hypotonie néonatale sera testée entre 8 et 10 jours après la naissance sur une durée de quelques minutes. Les données préliminaires montrent un retard de croissance, c'est pourquoi deux prélèvements sanguins à l’âge de 4 et 15 semaines seront effectués sur les souris pour mesurer les hormones de croissance (la durée de la prise de sang est d’environ 1 minute). Perfusion intracardiaque, sous anesthésie générale : Réalisée une seule fois sur 30 animaux en fin de protocole. Durée totale de la procédure de l'injection d'anesthésique au prélèvement des tissus : environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude pourront développer des symptômes similaires à ceux observés lors d'une étude préliminaire et chez les patients atteints de MBCS. Chez la souris, ces symptômes incluent un retard de croissance, une augmentation du contenu minéral des os, une forme anormale du museau, ainsi qu'une baisse du taux de sucre dans le sang après les repas chez les mâles. De plus, certaines souris pourraient avoir des difficultés à se nourrir et une hypotonie (faiblesse musculaire). Concernant les procédures expérimentales, les étapes consistant à l’identification et au suivi de la croissance sont simples et ne causent presque pas de gêne. Elles sont classées comme des procédures légères. Pour la partie étude embryonnaire, deux anesthésies gazeuses sont prévues pouvant induire un stress léger. Les prélèvements sanguins seront limités au nombre de deux par animal et espacés dans le temps, ce qui en font aussi des procédures de classe légère. Les tests physiques et neurodéveloppementaux, utilisés pour vérifier la force musculaire, la coordination, la mémoire ou le niveau d’anxiété, sont de classe légère. Certains tests pourraient provoquer une légère anxiété, mais celle-ci sera de courte durée, avec un maximum de 6 tests espacés de minimum 48h. L'anesthésie générale réalisée en vue de la chirurgie terminale sans réveil (perfusion) peut induire un stress passager et une hypothermie de courte durée avant la perte de conscience.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés au cours des différentes procédures du projet décrit ici sera mis à mort à la fin du protocole. La majorité des organes sera disséquée et prélevée afin de poursuivre les études moléculaires et anatomo-pathologiques après avoir caractérisé le phénotype global des animaux. Ainsi, le maximum est fait pour obtenir le plus grand nombre de données à partir du nombre le plus restreint d'animaux.
Remplacement
L'objectif de ce projet est d'étudier la fonction d'une région du génome cible, afin de comprendre son rôle dans une maladie rare affectant le développement, appelée syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin (MBCS). L'étude se fera en utilisant un modèle de souris, car il est impossible de remplacer cet animal pour cette partie du projet. En effet, pour comprendre comment ce gène agit au cours du développement, il est nécessaire d'observer les effets de la perte de ses différentes formes au fil du temps, depuis l'embryon jusqu'à l'âge adulte. Les signes attendus, comme un retard de croissance, des retards de développement et des troubles musculo-squelettiques (concernant les muscles et les os), ne peuvent être étudiés que dans un organisme entier en développement, comme la souris, modèle utilisé dans ce projet. Par exemple, le retard de croissance peut être dû à des problèmes de placenta (qui nourrit le fœtus), et cela ne peut être observé que pendant le développement de l'embryon dans l'utérus. En revanche, pour étudier les fonctions de ce gène au niveau moléculaire, il n'est pas nécessaire d'utiliser un organisme entier. Ces études seront réalisées in vitro, en utilisant des lignées de cellules souches neurales de souris, déjà disponibles, et d'autres lignées qui seront dérivées des animaux pour poursuivre les analyses moléculaires.
Réduction
La stratégie expérimentale sera planifiée afin d’utiliser le nombre d’animaux le plus petit possible pour l’obtention de résultats fiables et statistiquement exploitables. Ainsi, l’élevage est minimisé (en prenant en compte que le gène cible est soumis à empreinte parentale) et les schémas de croisements permettent de générer les animaux contrôles et tests dans la même portée. Pour les données testées (courbe de poids par exemple) dans l’étude pilote, un calcul de taille de l’échantillon a été réalisé. L’utilisation des animaux pour les différentes analyses sera optimisée afin que les animaux utilisés pour l’étude de croissance servent également à l’analyse des phénotypes neurodéveloppementaux et aux prélèvements sanguins. Enfin pour l’ensemble des animaux, à la fin de l’étude, la plupart des organes seront disséqués et collectés (congélation, inclusion en paraffine) afin de pouvoir réaliser a posteriori des analyses moléculaires et anatomo-pathologiques.
Raffinement
Une surveillance quotidienne sera effectuée par l'expérimentateur et/ou le personnel de l'animalerie afin d'identifier tout signe de souffrance ou de stress chez les animaux, ce qui permettra une intervention rapide si nécessaire. Si un animal présente une douleur excessive, une apparence anormale, des comportements répétitifs ou inhabituels, des mesures seront prises par le personnel avec la supervision d’un vétérinaire pour soulager l’animal jusqu’à un retour à la normale. Si un retour à la normale n’est pas possible, l’animal sera euthanasié par le personnel de l'animalerie. D'après les résultats préliminaires obtenus chez la souris et les caractéristiques observées chez les patients, les animaux pourraient montrer des défauts de croissance et des difficultés à s'alimenter. Si ces problèmes deviennent trop sévères, des mesures seront prises pour compléter leur nourriture, et l'étude de la croissance se concentrera principalement sur le développement embryonnaire. Les animaux seront logés par groupes de quatre au maximum par cage, conformément à la réglementation en vigueur. Les cages comprendront des éléments d'enrichissement, tels que des tubes et du matériel de nidification, pour améliorer le bien-être des animaux. En nous basant sur les résultats d’une analyse préliminaire, nous avons optimisé les croisements prévus dans cette étude afin d’une part d’éviter la mort embryonnaire associée à certains animaux mutants (qui ne seront pas produits dans nos croisements) et d’autre part de générer les animaux utiles, contrôles et mutants, à partir des mêmes portées.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est motivé par la conservation des mécanismes d’empreinte parentale entre la souris et l’homme. Ainsi il sera possible d’évaluer la contribution de la région d’empreinte ciblée à une pathologie humaine rare liée à l’empreinte parentale, le MBCS. De plus, le modèle de souris génétiquement modifiées, présentant une inactivation du gène d'intérêt, est disponible (puisque générée par l’IMPC) et des données pilotes de tests phenotypiques sont disponibles. Enfin, il existe de nombreux outils chez cette espèce rendant les analyses plus faciles. Pour la caractérisation du phénotype après la naissance, les animaux seront étudiés à partir de 2 semaines (jeune non sevré) jusqu’à l’âge adulte (15 semaines pour la croissance et entre 4 et 15 semaines pour les tests comportementaux). Pour les études embryonnaires, les animaux seront étudiés à 18.5 jours après la fécondation.
Prélèvement invasif de tissu pour la caractérisation de lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des pathologies osseuses
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une biopsie d'oreille, un tatouage sur les coussinets, et pour les souris dont la mâchoire inférieure pousse trop en avant, une coupe des dents jusqu'à deux fois par semaine. 20 400 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour un projet qui ne couvre que l'élevage, le marquage et l'analyse des gènes de lignées destinées à l'étude des maladies osseuses. La mâchoire déformée est un phénotype dommageable produit par la modification génétique elle-même, et le porteur ramène la coupe des dents à une douleur et un stress de courte durée. Les animaux trop âgés pour se reproduire, stériles, ou dont le génotype n'est pas celui attendu sont tués.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la création et le maintien de lignées de souris génétiquement modifiées permettant l’étude des mécanismes impliqués dans la formation de l'os dans un contexte physiologique mais aussi pathologique. Cette demande de projet concerne strictement l’élevage, le marquage et l’analyse des gènes de ces animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de générer et de maintenir des modèles de souris permettant l’étude des mécanismes impliqués dans les maladies osseuses afin d'envisager des approches thérapeutiques. Une meilleure compréhension des mécanismes permettra d’améliorer les traitements à destination des patients atteints de ces maladies.
Procédures
Prélèvement de tissu à l'oreille sur animal vigile (1 fois, 5 secondes); tatouage sur les coussinets (1 fois, 5 secondes); coupe de dents pour les animaux présentant une mâchoire inférieure trop avancée (maximum 2 fois par semaine, 15 secondes); application d'une solution de désinfection et de pommade anti-septique si une infection est constatée à l'endroit de la biopsie (1 fois par jour, maximum 3 jours de suite).
Impact sur les animaux
La contention, la biopsie et le tatouage peuvent provoquer un stress léger chez l’animal. La coupe des dents due au phénotype dommageable (mâchoire inférieure trop avancée) provoque une douleur et un stress de courte durée.
Devenir
A l’issue de la procédure d’élevage, les animaux trop âgés pour se reproduire ou stériles sont mis à mort, ou si leur génotype n’est pas celui attendu.
Remplacement
Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées que dans un organisme vivant, car le squelette entier à différents âges est étudié. Il s’agit ici d’études sur la formation et la croissance osseuse, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle hors du vivant, ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien les projets de recherche. Les modèles souris miment de nombreuses pathologies et sont impliqués dans de différents projets.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi adapté. Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Des points limites spécifiques ont été établis. Tout animal en souffrance recevra un soin adapté (compression, application de pommade anti-septique). Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement du squelette, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux de son développement du squelette entre les rongeurs et l’Homme. De plus, de nombreux outils d'analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Afin de permettre l’identification des souris et l’analyse de leurs gènes avant leur sevrage, le tatouage des coussinets et le prélèvement d'oreille sont effectués entre 7 et 10 jours de vie.
Caractérisation du phénotype cortical d’une lignée de souris reproduisant une mutation sur le gène cdc25b identifiée chez des patients microcéphales.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Tuées pour le prélèvement de leurs embryons, les femelles gestantes forment l'essentiel des 450 souris utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré tient en une injection de deux à trois secondes destinée à marquer l'ADN, la gravité annoncée ne portant que sur ce geste. Le porteur veut comprendre comment une mutation du gène cdc25b, identifiée chez des patients microcéphales, réduit la taille du cerveau en développement. Il indique que les organoïdes permettent de repérer les gros défauts de développement mais varient trop d'un échantillon à l'autre pour compter finement progéniteurs et neurones.
Objectifs
Chez les vertébrés, le développement d’un système nerveux central fonctionnel nécessite une coordination étroite entre production d’un stock de cellules souches neurales et leur différentiation en neurones. Des défauts dans cette coordination peuvent entraîner des anomalies de développement graves telles que la microcéphalie (développement d’un cerveau plus petit que la moyenne). Il est désormais bien établi que les gènes qui contrôlent le cycle cellulaire, mécanisme permettant la division des cellules, sont important pour cette balance division/differentiation. L’analyse du développement du cortex cérébral dans un modèle de souris dans lequel le gène CDC25B, acteur du cycle cellulaire, est inactivé, nous a permis de montrer que CDC25B joue un rôle important pour produire les cellules nerveuses du cortex au cours du développement. Récemment, une nouvelle mutation dans ce gène a été identifiée chez l’homme, associée à de la microcéphalie. Cette découverte établie un lien direct entre une dérégulation de CDC25B et le développement d’une microcéphalie chez l’homme. L'objectif de ce projet est d’élucider ce lien entre CDC25B et microcéphalie pour mieux comprendre le développement de ce défaut de développement. Pour cela, nous analyserons deux lignées de souris porteuses de cette nouvelle mutation. L’analyse des premières portées issus de l’élevage montrent que cette mutation entraine bien, comme chez l’homme, une microcéphalie. L’objectif du projet est de caractériser cette microcéphalie et de déterminer quelles étapes du développement sont affectées par cette mutation en analysant les étapes clés du développement du cerveau chez des souris mâles et femelles afin de voir si cette mutation affecte différemment les deux sexes.
Bénéfices attendus
Des collaborateurs viennent d’identifier chez l’homme une nouvelle mutation dans le gène CDC25B qui conduit à de la microcéphalie et à des défauts neurodeveloppementaux. C'est une anomalie du développement qui se traduit par une moindre espérance de vie et un déficit cognitif. La reproduction de cette mutation dans deux lignées de souris nous permettra d’étendre notre compréhension des mécanismes développementaux déficients lors de la survenu de la microcéphalie et de comprendre comment un défaut de régulation des paramètres du cycle cellulaire peut entrainer une microcéphalie.
Procédures
Des souris femelles gestantes recevront une injection pour marquer leur ADN (2 à 3 secondes)
Impact sur les animaux
Un stress léger lié à la contention et à l'injection pendant moins de 5 secondes pourra être engendré sur les femelles. Cette nuisance est de classe légère.
Devenir
Les femelles gestantes seront mises à mort pour prélever les embryons.
Remplacement
Notre projet vise à caractériser la fonction d’un acteur du cycle cellulaire, CDC25B dans la survenue de la microcéphalie. Cette anomalie développementale est caractérisée par des mesures crâniennes, périmètre et diamètre de la tête, inférieurs à la normale. Ces mesures supposent l’intégrité de l’embryon durant toute la durée de l’expérimentation. Nous voulons également analyser différentes étapes de la neurogenèse de façon quantitative. Les techniques de développement des premières étapes du développement du cerveau en culture (organoïdes) sont utiles pour identifier de gros défauts de développement mais il y a trop d’hétérogénéité entre les différents organoïdes sauvages pour pouvoir quantifier de façon fine le nombre de progéniteurs et de neurones. Il est donc difficilement envisageable de réaliser des quantifications précises de ces cellules dans ce modèle à l’heure actuelle.
Réduction
Afin de limiter les nombre d’animaux utilisés, nous concentrerons nos analyses sur quelques stades clés du développement du cerveau. Pour réduire significativement le nombre d’échantillons nécessaires à une bonne analyse de nos résultats, nous utiliserons un test statistique spécifiquement développés pour notre projet et qui permet d’obtenir une bonne puissance statistique sur un petit nombre d’échantillons. Enfin, chaque embryon prélevé sera utilisé pour un maximum de mesures et d'analyses.
Raffinement
Aprés l'injection , les femelles seront surveillées durant toute la durée de l’expérience (2H à 72h). Si un abcès se développe au point d’injection elles seront mises à mort.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car c’est un modèle mammifère chez qui on peut introduire des mutations génétiques ciblées et que l’on peut élever facilement. Ce modèle génétique se caractérise par un développement du cerveau largement comparable à celui de l'homme. Dans ce contexte, les résultats obtenus à la suite des expériences proposées pourront servir la compréhension de la survenue de défauts neurodéveloppementaux chez l’homme. Nous utiliserons des males de 8 à 32 semaines comme reproducteurs pour générer les embryons. Nous utiliserons des souris femelles de 8 à 20 semaines comme mères porteuses. Nous collecterons également des embryons de 3 stades de développement differents pour analyser le comportement des cellules souches neurales et la mise en place des differentes populations de cellules nerveuses dans notre modéle.
Régulation de la formation du ganglion lymphatique par le réseau lymphatique (EU 1/2) (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Des femelles gestantes reçoivent une injection, leurs nouveau-nés sont gavés deux fois puis biopsiés de la queue entre le cinquième et le onzième jour pour repérer une mutation, et à quatre semaines trois gavages supplémentaires suivent. À l'âge adulte viennent cinq prélèvements de sang, deux injections et un prélèvement de lymphe sous anesthésie. 520 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur signale des ulcérations au point d'injection, une perte de mobilité des membres postérieurs, des raideurs de la patte et un essoufflement pour certains lots. Toutes sont tuées à la fin du projet pour analyse post-mortem, le porteur affirmant que la culture cellulaire ne reproduit pas fidèlement le fonctionnement des ganglions lymphatiques.
Objectifs
Les cellules immunitaires, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés par le réseau lymphatique dans les ganglions. Un lien entre la fonction du réseau lymphatique et la taille et la structure du ganglion lymphatique a été suspecté mais jamais démontré (MODIFICATION DEBUT : notamment la différenciation des fibroblastes, cellules structurantes du ganglion. FIN MODIFICATION). Ce projet vise à mieux comprendre cette relation en utilisant des modèles de souris présentant des défaillances dans le réseau lymphatique tissulaire et en analysant les conséquences sur le ganglion lymphatique et la réponse immunitaire. D’ores et déjà, nous savons que l’engagement du récepteur RANK exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques par son ligand RANKL est nécessaire pour le développement du ganglion lymphatique. Le projet est un projet multi-sites.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisé en thérapie contre l’ostéoporose, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection ou le cancer.
Procédures
Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages (durée moins d’une minute). Le gavage permet une meilleure prise du traitement et est moins douloureux qu’une injection. MODIFICATION DEBUT : 3 gavages sur souris vigile de 4 semaines (durée moins d’une minute), soit un gavage par jour tous les 2 jours. FIN MODIFICATION. Les souris adultes seront soumises selon les groupes à 5 prélèvements de sang d’une durée inférieure à 1 minute, à deux injections d’une durée inférieure à 1 minute sur animal anesthésié et à un prélèvement de lymphe (durée 2 minutes) sur animal anesthésié au site où la lymphe est la plus accessible. Les délais entre les prises de sang sont au minimum de 7 jours. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue (inf à 1mm) pour déterminer une mutation génétique (durée inférieure à 1 minute). Des souris gestantes recevront une injection (durée moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Le gavage, l’injection des produits (par exemple l’anesthésie) et le prélèvement sanguin nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation des souris pourrait conduire bien que très rarement à une ulcération au site d’injection et à une perte de mobilité des membres inférieurs. Le transport entre les sites partenaires et les procédures effectuées pourront générer un stress. Les procédures peuvent également induire une perte de poids, ainsi qu’un changement de comportement avec risque d’essoufflement pour certains lots. Des ulcérations et des raideurs de la patte peuvent advenir.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à la fin du projet pour analyse post-mortem
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le système lymphatique et la réponse immunitaires dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles ciblent de façon quasi exclusive les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, anesthésie, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Le transport des souris entre les sites s’effectue par un professionnel agrée. A l’arrivée les souris sont pris en charge par un personnel expérimenté pendant la quarantaine d’une semaine avant le transfert en zone de maintenance. Les animaux seront acclimatés à la nouvelle structure au minimum 2 semaines avant le début de la procédure.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du réseau lymphatique. MODIFICATION DEBUT : Une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée sera utilisée pour étudier le rôle des fibroblastes, cellules structurantes du ganglion. FIN MODIFICATION. La mesure de la réponse immunitaire utilise des moyens techniques qui n’existent que chez la souris. Toutes modifications génétiques ont été introduites chez la souris. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des embryons et des nouveau-nés ont également été choisis, puisque le développement du réseau et des ganglions lymphatiques commence pendant l’embryogenèse.
Etude d’un géne impliqué dans le développement craniofacial et le système cognitif et évaluation de molécules thérapeutiques contre cette pathologie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Jusqu'à 28 injections et 28 contentions par animal, huit sessions de tests comportementaux de dix minutes, une biopsie d'oreille et un prélèvement de sang. 12 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 760 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte un phénotype dommageable, une déviation du museau qui provoque une pousse excessive des dents. Le porteur veut comprendre une maladie osseuse rare qui touche un enfant sur 20 000, puis corriger le phénotype par un traitement. Sur un effectif de 12 800 animaux, il consacre deux phrases au raffinement, annonce des points limites appliqués strictement sans les décrire, et ne dit pas lesquels sont les tests comportementaux pratiqués huit fois.
Objectifs
Ce projet porte sur une pathologie osseuse rare qui touche 1 enfant sur 20 000. Les patients présentent des malformations craniofaciales dues à la fusion prématurée des sutures crâniennes, des anomalies oculaires, des troubles neurologiques, des troubles auditifs. Cette pathologie est due à une mutation génétique. L'objectif est de mieux comprendre la pathologie humaine pour ensuite corriger le phénotype par un traitement thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre la pathologie grâce à un modèle animal mimant la pathologie humaine. L'étude du phénotype ainsi que la mise en place d'approches thérapeutiques, que ce soit au niveau du développement squelettique ou cognitif, permettra à long terme d'envisager une nouvelle approche thérapeutique pour les patients.
Procédures
Prélèvement à l'oreille sur animal vigile (une fois, 5 secondes). Injections (maximum 28 fois, une minute). Contention (maximum 28 fois, une minute). Tests de comportement : 10 min 8 fois. Prélèvement de sang sous anesthésie (une fois, 4 minutes).
Impact sur les animaux
Les biopsies et les injections peuvent causer un stress et douleur légère de courte durée. Les tests de comportement peuvent entrainer un stress de courte durée. Le prélèvement de sang peut causer un stress et douleur légère de courte durée. Le phénotype dommageable des animaux provoqueUne deviation du museau entrainant une pousse excessive des dents
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
L'objectif est d'étudier le développement squelettique et le système cognitif chez la souris. À ce jour, il n’existe pas dans la littérature de modèle de remplacement pour étudier le développement du squelette et pour réaliser des tests de comportement. L'utilisation des modèles animaux est donc nécessaire.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris générera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après l'expérience du laboratoire sur le modèle souris.
Raffinement
Les points limites définis dans le projet seront strictement appliqués. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et des responsables du projet.
Choix des espèces
La souris est particulièrement adaptée pour étudier le développement squelettique, de la période anténatale à l’âge adulte. En effet, les processus d’ossification chez l’homme et la souris sont similaires. Le projet implique des approches intégrées sur l'animal entier, ainsi que des explorations comportementales sur des animaux vigiles, qui ne peuvent donc pas être substituées par d'autres approches. En ce qui concerne l'étude du développement squelettique, le phénotype des souris sera analysé à la période post-natale, de 1 jour à 6 mois. Ces études doivent être réalisées à ces différentes périodes, car la croissance squelettique est étudiée au cours du développement et le squelette est aussi étudié à l'âge adulte. Les approches thérapeutiques seront ensuite réalisées en période prénatale et post-natale. Pour les études de comportement, des souris adultes âgées de 1 à 4 mois seront utilisées.