Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Correction d’anomalies du développement cortical à l’aide d’ARN messagers dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour injecter des ARN messagers dans le cerveau des embryons, et les souriceaux subissent un tatouage des coussinets et une biopsie de la queue, pour tester si ces ARN corrigent des malformations cérébrales d'origine génétique. Le porteur reconnaît que la biopsie provoque une douleur et que la chirurgie peut faire souffrir si l'analgésie est mal conduite. Il affirme que le développement du cortex ne peut être étudié qu'in vivo chez le mammifère.
Objectifs
Notre laboratoire s’intéresse au développement du cortex cérébral. Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération et différentiation cellulaire peuvent aboutir à des malformations du cerveau. Des études nous ont permis de mettre au point des particules d’ARN ayant la faculté d’entrer spécifiquement dans les cellules en division des cerveau embryonnaires. Ce projet vise à déterminer si cette approche est pertinente pour développer une approche thérapeutique. Nous voulons donc tester chez la souris, la capacité des ARNm à compenser la perte de 2 gènes d'intérêt et corriger les anomalies de développement du cerveau qui leur sont associées.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de déterminer si l’utilisation d’ARN est une bonne approche thérapeutique pour corriger les anomalies cérébrales d’origine génétique.
Procédures
Les souriceaux des lignées subiront un tatouage des coussinets des phalanges et une biopsie à la queue. Les femelles gestantes de la procédure 2 subiront une anesthésie générale de 45 minutes, comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures. Des injections sous cutanées sous anesthésie d'une durée de deux minutes 2 fois par jours pendant 3 jours. Les embryons subiront une injection intra-cérébrale d'une durée de 5 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie à la queue provoque une douleur. Les actes chirurgicaux des procédures peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. L'étape d’anesthésie peut également provoquer un stress chez l’animal
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.
Remplacement
Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. En effet, le développement du cortex des mammifères et de son fonctionnement ultérieur est de mieux en mieux caractérise chez la souris et aucun modelé in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat significatif déterminés par une approche statistique.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. La litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées par anesthésie gazeuse et reçoivent des injections d'analgésiques en pré- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance et la prise en charge analgésique continue pendant 72h. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique supplémentaire ou la mise à mort de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projets tels que les modèles génétiquement modifiés. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 7 et 10 jours, âge a quel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. L'expérimentation est menée sur des embryons à E12.5 et E15.5 qui correspondent à la fenêtre d’expression de nos gènes d’intérêt. Les souriceaux à P2 et P10 nous permettent de voir l'effet de notre traitement sur les phénotypes qui apparaissent à ces stades.
Comparaison de milieux de vitrification et de survies embryonnaires post décongélation dans le cadre de transferts d’embryons équins
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
150 équidés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous gardés en vie et réutilisés pour d'autres protocoles. Les ponettes servent de donneuses ou de receveuses d'embryons, avec injections d'un inducteur d'ovulation, échographies rectales, collectes et transferts d'embryons sous sédation, pour comparer des milieux de congélation et former l'équipe au transfert. Le porteur décrit une gêne temporaire lors du cathétérisme du col et une douleur transitoire aux injections. Il affirme que la production d'embryons in vitro n'est pas opérationnelle chez cette espèce et présente les retombées surtout comme un service à la filière équine et, à terme, aux ânes.
Objectifs
Ce projet comporte 3 objectifs: - La formation de l’équipe équine au transfert d’embryon. Le franchissement du col de l'uterus doit être effectué de façon très fluide sans manipulation à l'intérieur du col pour guider le cathéter de transfert. - Définir le milieu de vitrification des embryons le mieux adapté: nous comparerons 3 milieux commerciaux. Tous les milieux contiennent comme cryoprotecteurs de l'éthylène glycol (EG) et du DiMéthylSulfOxide (DMSO). Les embryons seront collectés sur des juments de selle en dehors de notre etablissement. - Les décongélations et transferts d'embryons seront réalisées dans notre etablissement.
Bénéfices attendus
Les connaissances qui seront acquises à la fin de ce projet apporteront des solutions innovantes à la filière équine en reproduction equine. Nos resultats et ces nouvelles techniques pourront etre transposés aux especes menacées de disparition comme les anes. En effet Le col de l'utérus de l'ânesse a la particularité d'être long et étroit. Cet élément constitue un frein au cathétérisme. Un des effets positifs attendu est donc de rendre possible le cathétérisme du col chez la jument mais aussi chez l’anesse.
Procédures
Les animaux dits "donneurs", auront une injection sous cutanée d'un inducteur d'ovulation et une collecte d'embryon. Les animaux dits"receveurs", auront une injection de sédation avec un antalgique et un anti inflammatoire, du gel anesthésiant au niveau du cervix et un transfert d'embryon. Il faut compter 10 secondes pour faire une injection et 20 minutes pour réaliser la collecte d'embryon. Il faut également 20 minutes pour réaliser un transfert.
Impact sur les animaux
Les pratiques expérimentales de ce projet sont des pratiques d’élevage réalisées en routine et n’incluent pas de chirurgie. Dans le cas éventuel de stress liés à la manipulation, indiqués par une oreille dirigée vers l’arrière, des yeux grands ouverts ou encore les naseaux dilatés, le responsable de l'équipe équine décidera de réaliser une légère sédation. Les échographies sont réalisées par introduction de la sonde dans le rectum : une gêne temporaire est donc occasionnée. L’injection pour induire l’ovulation génère une douleur transitoire au site d’injection. Lors du cathétérisme du col, l’introduction du spéculum et la préhension du col induisent une gête temporaire.
Devenir
Tout les animaux sont gardés en vie et réutilisé pour d'autres protocoles après examens vétérinaires.
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation des ponettes, par un autre modèle et la production d’embryons in vitro n’est pas opérationnelle dans cette espèce.
Réduction
L’étude sera réalisée en 2023 sur 20 embryons de ponettes pour que les techniciens se forment à la technique de la pince WILSHER. Comme actuellement, le taux de collecte d’embryons de ponettes est de 50 % après induction de l’ovulation, nous aurons besoin de 40 cycles oestriens de ponettes. Le transfert d’embryon nécessite une synchronisation des cycles entre la donneuse et la receveuse pour optimiser les chances de reussite. C ‘est pourquoi pour une donneuse il est recommandé de prevoir deux receveuses soit un besoin de 80 cycles de receveuses. L’etude en 2024 utilisera 30 ponettes receveuses, la congélation des embryons permettant de déplacer, dans le temps et dans l’espace, le moment de la transplantation de l'embryon dans la jument receveuse Nous REDUISONS les effectifs à expérimenter en utilisant la procédure d’induction de l’ovulation.
Raffinement
Notre procédure sera raffinée, minimisant les interventions. De plus, les juments seront logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée avec accès au pâturage, en visibilité et contact des congénères pour rendre le plus agréable possible leur séjour durant les expérimentations. Les ponettes voient plusieurs fois par jours les animaliers et les expérimentateurs qui surveillent de près leur comportement. L’enrichissement du milieu est assuré par des brosses, des jeux, des bouts de bois à ronger. Les animaliers ont suivi une formation à la manipulation éthologique des animaux : les animaux sont habitués aux différentes procédures et les vivent sans stress. Avant l’intervention, une sédation est systématiquement réalisée avant les transferts d’embryons, en plus de l’administration d’un analgésique et d’un anti-inflammatoire non stéroïdien permettant de limiter la production de prostaglandines. Avant le transfert, un gel anesthesiant pourra etre déposé localement au niveau du col afin de faciliter le transfert.
Choix des espèces
Le but de l’expérience est d’améliorer le transfert d’embryon et la cryoconservation des embryons équins, il est donc nécessaire d’avoir des ponettes donneuses et receveuses d’embryons pour réaliser ce projet. De même en 2024, pour valider notre technique, il faut pouvoir évaluer la qualité de l’embryon après décongélation. Pour cela, le meilleur test est de réimplanter des embryons dans une femelle receveuse. Le travail proposé est sur l’espèce equine, car c’est pour elle que nous voulons améliorer les techniques de cryoconservation et de transfert des embryons. Or, l’espèce a ses propres particularités : les embryons équins ont la particularité de présenter une capsule et d’avoir un très grand diamètre dès 7 à 8 jours post ovulation. Il paraît donc difficile, voire impossible de choisir un autre modèle pour répondre à la question. Les animaux utilisés seront tous pubères, puisqu'il faut qu'ils soient capables de se reproduire.
Exposition au tabac in utero et trajectoires pulmonaires de l’enfance à l’âge adulte : impact sur la régénération alvéolaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont exposées à la fumée de cigarette deux heures par jour, sept jours sur sept, de l'accouplement jusqu'à la mise bas, et leurs petits, dont certains reçoivent des injections, sont mis à mort pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que les souriceaux exposés naissent avec un retard de croissance et une fonction pulmonaire diminuée, l'objectif étant d'étudier la régénération pulmonaire in vitro à partir de ces poumons. Il affirme que l'effet d'une molécule sur un organe "aussi complexe que le poumon" ne permet pas encore le recours à des méthodes de remplacement.
Objectifs
L'exposition au tabagisme actif et passif génère des coûts de santé importants à court et long terme. L'exposition au tabac perturbe la croissance globale et pulmonaire des foetus. Le tabagisme actif pendant la grossesse est un facteur de risque de certaines anomalies congénitales et est associé à un risque accru de mort foetale in utero. Le tabagisme passif pendant la grossesse est associé à un risque de prématurité avec une relation dose-effet. Le tabagisme maternel est aussi associé aux morts inattendues du nourrisson et à une diminution de la fonction respiratoire chez les enfants avec une augmentation de la susceptibilité aux infections respiratoires virales. On sait depuis quelques années que la croissance pulmonaire dans l'enfance impacte la fonction pulmonaire à l'âge adulte. Une croissance perturbée augmente le risque de bronchopneumopathie chronique obstructive à l'âge adulte. L'identification des mécanismes permettant la régénération de la structure pulmonaire chez les fœtus et nouveau-nés exposés au tabagisme passif dès la période in utero est essentielle dans un contexte où aucune thérapie n'est disponible. Nous supposons que la consommation de tabac par la mère pendant la grossesse module les différentes populations de cellules pulmonaires fœtales du micro-environnement . Les capacités du poumon à se réparer seraient altérées conduisant à un développement alvéolaire et bronchique pulmonaire anormal. Ceci serait lié à une altération du contenu en graisses et de son utilisation par les tissus pulmonaires qui contiennent des cellules souches. L'administration de médicaments stimulant ces voies métaboliques reprogrammerait ces cellules. Ceci pourrait contribuer à créer un environnement favorable à la croissance et la multiplication des cellules pulmonaires nécessaires pour induire la régénération alvéolaire chez les fœtus exposés en prénatal au tabac. L’objectif principal est donc de comparer les capacités de régénération alvéolaire des cellules pulmonaires de souris exposées ou non au tabagisme passif, en évaluant leur capacité à former du nouveau tissu pulmonaire in vitro. Dans les objectifs secondaires, nous espérons favoriser la régénération alvéolaire in vitro grâce à des traitements médicamenteux ciblés .
Bénéfices attendus
Nous espérons mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à une diminution de la construction de nouvelles alvéoles et tenter de corriger ce défaut avec des médicaments stimulant le métabolisme et l’assimilation des lipides.
Procédures
Les animaux seront exposés à la fumée de cigarettes ou à de l'air filtré. Les animaux du groupe d’exposition à la cigarette sont exposés à la fumée filtrée grand public avec une machine à fumer. Les animaux sont placés dans une boîte, et les cigarettes sont délivrées de manière cyclique afin d’imiter de près le comportement tabagique typique dans la mesure du possible. Une procédure similaire est utilisée pour les animaux témoins, sauf qu’ils sont exposés à l’air ambiant filtré plutôt qu’aux cigarettes. L’exposition aux cigarettes ou à l’air filtré est faite pendant 2 heures/jour, 7 jours/semaine, en commençant 2 semaines avant l’accouplement et sont poursuivies pendant les 3 semaines de gestation jusqu’à l’accouchement. Des souriceaux seront exposés durant leur "adolescence" aux mêmes procédures. Les souriceaux vigiles pourront recevoir dans les premiers jours de vie une injection intra-péritonéale de médicaments (durée
Impact sur les animaux
L'exposition anténatale au tabac a déjà été réalisée et a montré que la fertilité était la même chez les souris exposées ou non au au tabac. Les portées sont équivalentes en nombre. Les souriceaux dont les mères étaient exposées au tabac lors de leur gestation ont un retard de croissance intra-utérin. Le rattrapage pondéral est complet en trois semaines. Les souriceaux dont les mères ont été exposées au tabac lors de leur gestation ont une diminution de leur fonction pulmonaire sans anomalie du nombre d'alvéoles. Certains animaux vont recevoir des injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale.
Devenir
Les souris adultes seront mises à mort au moment où leurs petits seront sevrés. Les souriceaux seront mis à mort pour prélever leurs poumons qui seront étudiés en totalité pour analyse des cellules pulmonaires ou pour des analyses biochimiques.
Remplacement
Le tabagisme pendant la grossesse est associé à un risque accru de faible poids de naissance et de retard de croissance intra-utérin. L'exposition au tabac secondaire a un impact direct sur le développement pulmonaire et la morbidité respiratoire. La manière dont la fumée de cigarette affecte le développement pulmonaire et induit des conséquences à long terme reste à déterminer. Cependant, la consommation de tabac isolée induit rarement chez l’Homme une mort in utero. Le fœtus étant alors souvent porteur d’autres pathologies ce qui rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. D’autre part, les prélèvements pulmonaires humains sont difficilement accessibles dans l’enfance. Dans cette étude, le tabagisme passif chez la souris permettra d’étudier des lésions directement et uniquement liées au tabagisme passif. Les souris adultes seront exposées pendant la gestation exposant les souriceaux dès la période in utero. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation au tabac ou à un air filtré (contrôle). Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J21 ou J49 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Un seul animal sera utilisé pour répondre à plusieurs questions en utilisant diverses technologies et notamment les cultures cellulaires. A partir des poumons de souris exposées ou non au tabac, nous récupérerons des fibroblastes et des pneumocytes de type 2 pour générer des organoïdes alvéolaires en culture cellulaire. Nous prélèverons aussi des poumons pour effectuer des analyses biochimiques. Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées pour ces cultures, les cellules seront congelées à chaque fois que cela sera possible, permettant ainsi de réutiliser les cellules d'une même souris à plusieurs reprises et de multiplier par ce fait les expériences sans nécessité de réaliser de nouvelles mises à morts. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour nos études immunohistochimiques et moléculaires.
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect (général et vivacité), la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect (trophique et vivacité) et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal-être, les souriceaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point d'animaux génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Les souris ont à la naissance un développement pulmonaire très immature sans alvéole,. Ainsi, l'alvéolisation chez la souris se déroule pendant les trois premières semaines de vie post-natale ce qui en fait un modèle de choix pour l'étude de leurs poumons. Les souris adultes seront étudiées à partir de l’âge de deux mois. Les souriceaux seront étudiés dès la période anténatale et jusqu’à la fin de l’adolescence.
Effet de la température sur le développement et la croissance de la seiche commune
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
486 seiches communes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées à trois températures pendant huit semaines, elles sont capturées à l'épuisette puis anesthésiées par le froid avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau, des lobes optiques et des yeux, pour étudier l'effet de la température sur le développement de leur système nerveux et leur camouflage. Le porteur souligne que la seiche possède un système nerveux et des comportements élaborés, analogues à ceux des vertébrés. Il indique qu'aucune partie ne peut être prélevée sans dommage irréversible, ce qui "implique" la mise à mort.
Objectifs
Les facteurs externes comme la température ont des effets sur le développement du système nerveux chez certains organismes animaux. Ce projet a pour objectif de tester l’effet de la température sur le développement d’un Céphalopode, mollusque au système nerveux et comportements élaborés. Notre espèce est la seiche commune européenne. Il s’agit plus précisément de déterminer si la température modifie 1) les régulations « génétiques » en lien avec le développement du système nerveux et des yeux 2) les comportements, en particulier de camouflage. Le camouflage est en effet directement contrôlé par le système nerveux et il a été montré que le camouflage peut être modifié par la température. Dans un contexte de réchauffement climatique, y compris sur les zones côtières, ce projet permettra de mieux comprendre comment le développement du système nerveux central (cerveau et lobes optiques de la seiche) et les comportements associés peuvent être modifiés par la température afin d’inférer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur température au cours du développement, chez l’embryon et chez le juvénile après éclosion.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’identifier si la température est un facteur important voire essentiel au développement et à la croissance du système neuro/photosensoriel permettant la mise en place des capacités cognitives chez la seiche dont le système nerveux est analogue à celui des vertébrés. L’approche par l’expression des gènes et l’étude comportementale parallèle permet de tester les régulations moléculaires mises en place en lien avec les réactions observables de l’organisme. Les résultats attendus sont de déterminer quel est l’effet de la température sur cet organisme et si son comportement et son cycle biologique pourraient être affectés. Il a été montré récemment que la température pouvait modifier le comportement de camouflage à l’éclosion, mais pas celui d’exploration du milieu. Nous cherchons à évaluer en première approche si ces modifications de camouflage perdurent jusqu’à 4 semaines ou si elles se lissent et si ces modifications dependent du “substrat”. La mise en place des deux conditions (HV et HNV) permettra d’évaluer si la visibilité des activités environnantes modifie le comportement, la neurogenèse et donc l’expression des gènes (stimulation, habituation). Par ailleurs, les résultats permettront d’optimiser les conditions d’élevage de cette espèce pour laquelle les standards de culture sont inexistants.
Procédures
Les animaux sont exposés à trois conditions de températures sur une durée de 8 semaines : sur la période ceux dans des aquariums avec fonds artificiels différents sont soumis à 1 pêche à l’épuisette , ceux destines aux études moléculaires sont soumis à 3 pêches à l’épuisette (à une semaine d'intervalle) d'une durée de 10 à 20 secondes. Ils sont immédiatement transférés dans un récipient, anesthésiés, puis mis à mort.
Impact sur les animaux
Un à trois (en fonction des aquariums) prélèvements manuels à l’épuisette d’une durée de 10 à 20 secondes sont prévus par aquarium sur toute la durée de l’expérimentation, ce qui peut occasionner du stress. Un siphonnage quotidien des aquariums peut également occasionner du stress sur une durée de 2 à 3 min. La température haute (24°C) en exposition prolongée (moins de 2 mois) peut occasionner un inconfort. Cette nuisance est supposée légère.
Devenir
Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des yeux, du cerveau entre autres).
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à déterminer, par une approche physiologique globale, l’effet de la température sur le développement et la croissance des organes du système nerveux (cerveau, lobe optique, yeux) d’un organisme entier, en lien avec le comportement. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle
Réduction
La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés tous les jours dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œufs nécessaire pour réaliser cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Le nombre de 5 échantillons est le minimum adéquat pour garantir une puissance statistique suffisante pour examiner les variations d’expression. Nos expériences précédentes ont montré que les qualités d’ARN extrait étaient inégales. Le nombre d’animaux prend donc en compte la quantité d’ARN parfois insuffisante pour tester l’ensemble des gènes cibles, et les variabilités intra expérimentales (correspondant à la variabilité biologique) afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique, soit 10 animaux. Pour les estimations par approche génique de la neurogenèse, la variabilité interindividuelle peut être importante, 5 animaux sont également nécessaires. Chaque étape de prélèvement nécessite donc au total 15 individus. N’attendant pas de différence dans le nombre de neurones du cerveau, les animaux pour la phase d’études comportementales seront fixés uniquement pour les études d’expression de gènes réduisant ainsi le nombre d’animaux de 15 à 10. Cependant, afin de pallier d’éventuelles anomalies individuelles, les études de comportement intégreront 12 animaux par traitement.
Raffinement
Les juvéniles éclosent dans leur aquarium d’origine (où ont été déposés les œufs aux températures cibles) ; ils ne sont donc pas déplacés. A l’éclosion, ils auront un enrichissement environnemental varié à disposition dans les aquariums sous la forme de cachettes diverses (pièces de PVC (coude/té) de différents diamètres (16 à 25mm)) leur permettant de se cacher comme en milieu naturel. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (petites crevettes et mysis sp.) deux fois par jour (matin et après-midi). Les rations sont réévaluées quotidiennement pour adapter la quantité d’aliment distribué à la biomasse de l’aquarium et au métabolisme des animaux (température). La température haute maximale appliquée reste inférieure à la température maximale observée en plein soleil dans les « mares » à marée basse. Les constantes physico-chimiques (température, salinité, pH, oxygène) sont contrôlées quotidiennement sur toute la durée du développement. La concentration en déchets azotés (nitrate, nitrite, ammonium/ammoniac) est mesurée chaque semaine afin de suivre la qualité d’eau d’élevage. Afin de limiter le stress et la souffrance supposée des juvéniles, ils sont transférés délicatement et rapidement dans un récipient contenant de l’eau de mer du système d’élevage jusqu’à une salle adjacente où la mise à mort sera réalisée. Le récipient est mis sur glace ce qui permet un refroidissement progressif, et une anesthésie des animaux par le froid. Ils sont observés jusqu’à constatation d’une léthargie (relâchement pupillaire, le relâchement des bras et du manteau) puis une fois la mort confirmée (arrêt respiratoire); les juvéniles sont alors placés dans le fixateur
Choix des espèces
Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. La seiche européenne pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, son développement est court (
Analyse des dysfonctionnements périnataux des réseaux moteurs chez la souris SOD1-KCC2-T906A/T1007A, un modèle de la maladie SLA exprimant une activité KCC2 génétiquement augmentée
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
4 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues du croisement de deux lignées génétiquement modifiées, elles sont pesées puis soumises à des tests d'agrippement et de rotarod, le porteur prévoyant de les laisser atteindre les points limites pour évaluer un éventuel gain de survie dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique. Il indique que l'atteinte de ces points limites peut occasionner des effets indésirables et une difficulté à se nourrir en fin de vie. Sur le remplacement, il décrit des modèles in vitro qu'il juge seulement "complémentaires" de l'approche in vivo.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie caractérisée par une dégénérescence des neurones commandant les muscles. La SLA survient pendant la vie adulte et conduit à une paralysie fatale. Aucun traitement n'est disponible pour cette maladie. La plupart des études se sont focalisées sur les périodes symptomatiques ou pré-symptomatiques et non sur les mécanismes initiaux conduisant fort probablement à la survenue de la SLA. La présente DAP est basée sur nos récents travaux montrant que la transmission synaptique inhibitrice est réduite aux stades périnataux au niveau des neurones moteur de la moelle épinière de souris modèle de la maladie SLA. Notre projet est donc basé sur l’hypothèse que les premières dérégulations liées à la SLA débutent dès le développement du système nerveux central et sont accompagnées de mécanismes de compensation. L'effondrement tardif de ces mécanismes de compensation conduirait à l'apparition des symptômes de la SLA. Nos travaux montrent un déficit dans la transmission synaptique inhibitrice à des stades précoces de développement. Nous proposons donc d’augmenter la transmission synaptique inhibitrice chez la souris en utilisant une approche génétique et nous émettons l’hypothèse que cette augmentation aura des répercussions positives sur le développement de la maladie chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
Le présent projet a pour but de mettre en évidence un défaut d'inhibition chez une souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cette démonstration pourra être bénéfique aux patients SLA qui pourraient être traités par des molécules agissant sur l'inhibition synaptique.
Procédures
Aucune procédure chirurgicale n'est prévue dans le présent projet. Les souris seront pesées de manière hebdomadaire, soumises au test d'agrippement (grip-test) et au test du rotarod (locomotion sur un cylindre mobile). La survie des souris sera également évaluée. Enfin, certaines souris seront euthanasiées afin de collecter les tissus nerveux (moelle épinière).
Impact sur les animaux
Notre projet prévoit de laisser les souris atteindre les points limites afin d'évaluer l'éventuelle amélioration de leur durée de vie après croisement avec des souris ayant un niveau d'inhibition accru. L'atteinte des points limites, bien que ces derniers soient controlés, peut occasionner des effets indésirables sur les animaux. Certaines souris seront enthanasiées en vue de prélever des tissus nerveux pour étude immunohistochimique à posteriori. Là encore, bien que réduits au maximum par des injections de produits anesthésiants, des effets indésirables sur les animaux sont à considérer.
Devenir
Les souris modèle de sclérose latérale amyotrophique ayant atteint les points limites et les animaux contrôles du même âge seront euthanasiés afin de prélever des tissus nerveux et réaliser à postériori des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les souris utilisées dans notre projet sont des souris transgéniques modèles murins de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) et des souris génétiquement modifiées afin d'augmenter le niveau d'inhibition au sein du système nerveux. Les deux souris seront croisées pour obtenir des animaux doublement génétiquement modifiés. Des animaux contrôles de la même lignée (et même portée) seront utilisés. Les modèles murins de la maladie SLA sont les animaux les plus utilisés pour tenter de comprendre les mécanismes de développement de cette maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs. Des modèles in vitro ont été développés pour l'étude du dysfonctionnement des motoneurones issus de patients SLA mais ces modèles restent complémentaires aux approches in vivo. Il est donc logique que le modèle murin de la SLA soit utilisé dans le cadre de la présente DAP.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre projet basé sur des méthodes variées permet d'utiliser au maximum tous les embryons et animaux néonataux disponibles issus d'une portée. Concernant les expériences réalisées chez l'adulte, un nombre minimum d'animaux est programmé en accord avec les tests statistiques qui seront réalisés à posteriori.
Raffinement
Les souris sont élevées avec un enrichissement. Des points limites sont établis afin de réduire au maximum la souffrance des animaux liée à leur difficulté à se nourrir en fin de vie.
Choix des espèces
La souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) que nous utilisons reproduit les symptômes de la maladie de manière fiable et reproductive. L'autre souris présente un taux d’inhibition accru. Ces deux souris seront croisées afin d'obtenir des souris SLA ayant un niveau plus élevé d'inhibition (souris présentant une double modification génétique). Ces souris et leur contrôles non génétiquement modifiés seront testées chez des mâles puis femelles, au niveau comportemental à l'âge de 8 semaines jusqu'à l'âge de 20 semaines environ (= âge moyen de fin de vie de nos souris modèles de SLA).
Impact de la neuroinflammation et des encéphalites virales sur le développement précoce du système nerveux
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
10 345 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie gardée vivante comme géniteurs et les autres tués à l'issue. Aux stades larvaires surtout, ils sont infectés par des virus neuroinvasifs ou reçoivent des injections de cytokines et une activation optogénétique, pour étudier l'impact d'une inflammation précoce sur le système nerveux. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte d'équilibre, hémorragies, arythmies et nécrose cérébrale, les larves atteignant un point limite étant alors anesthésiées. Il affirme que ces interactions complexes ne peuvent être "totalement remplacées" in vitro, tout en signalant un modèle mathématique réduisant le nombre d'animaux.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels une neuroinflammation précoce peut conduire à des déficits neurologiques ou des maladies psychiatriques, en utilisant le poisson-zèbre comme modèle animal. D’une part, nous étudierons les conséquences de cette inflammation dans le contexte d’une infection virale neuroinvasive, comme modèle d’encéphalite virale du nouveau-né. Nous utiliserons pour cela le modèle d’infection par le virus de Sindbis (SINV), bien établi, et nous développerons un autre modèle par le virus de herpès simplex (HSV-1). Nous chercherons à distinguer les impacts du virus lui-même sur ceux de l’inflammation dans les déficits neurologiques observés. D’autre part, nous analyserons les impacts d’une inflammation stérile sur le système nerveux en cours de développement ou de réparation. L’inflammation peut se manifester de diverses façons avec l’induction du plusieurs cytokines (molécules permettant la communication entre cellules) aux effets parfois antagonistes. Pour clarifier notre analyse, nous aurons essentiellement recours à l’injection de cytokines recombinantes. Nous développerons par ailleurs des systèmes optogénétiques pour induire l’expression de cytokine in vivo sans avoir recours à une injection. Afin de disséquer les mécanismes impliqués, nous aurons recours à différents mutants dans les voies de signalisation des cytokines ou dépourvus de certains types cellulaires importants. Nous vérifierons d’éventuelles modifications neurologiques chez ces mutants adultes. Nous étudierons le comportement de nos animaux ainsi que la morphologie et la composition cellulaire du système nerveux, avec un intérêt plus particulier pour le système dopaminergique (système particulier de transmission nerveuse) impliqué dans plusieurs maladies psychiatriques qui ont été liées à des infections précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux appréhender le rôle de la neuroinflammation dans les déficits neurologiques constatés après une encéphalite d’origine infectieuse ou stérile. Ceci devrait aider à décider du bien-fondé des traitements anti-inflammatoires dans ces situations. L’identification de gènes protecteurs contre l’infection sans effet indésirables lors d’une surexpression par des neurones ouvrira de nouvelles pistes vers le traitement ou la prévention des encéphalites virales par thérapie génique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigile. Pour du génotypage de routine, des prélèvements d'un fragement de nageoire seront réalisés sous anesthésie. Microscopie intravitale effectuée sous anesthésie (durée maximale une heure, avec des sessions quotidennes pendant 10 jours au plus). Tests de comportement: enregistrement de la locomotion spontanée ou après stimuli lumieux ou sonore (durée maximale 1 heure, avec deux sessions par semaine au plus). Suivi d'une infection virale établie par microinjection sous anesthésie (pendant 7 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par microinjection de protéines sous anesthésie (pendant 14 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par activation optogétique (pendant 3 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par transgénèse (pendant 7 jours au plus). Suivi de le régénération du cerveau après arrêt d'une infection virale (pendant 17 jours au plus).
Impact sur les animaux
Les infections virales des larves sont susceptibles d’entraîner les effets suivants : perte d’équilibre, hyperactivité, apathie, hémorragies localisées, arythmies cardiaques, oedèmes, et ceci tant que l’infection persiste. Dans les cas d’infection létale (attendue chez certains mutants notamment) un assombrissement du cerveau sera préalablement observé, traduisant un début de nécrose, qui entraînera une anesthésie profonde évitant tout décès non traité. Les injections de cytokines inflammatoires (ou leur équivalent optogénétique) devraient causer hyperactivité ou apathie, comportements anxieux, arythmies cardiaques. Ces effets devraient être transitoires (moins de 24 heures) pour la plupart. Lors des tests de surexpression des ISGs (gènes induits par les interférons, qui sont des cytokines antivirales) par des neurones, ces effets sont attendus pour les ISGs qui seraient neurotoxiques. Dans les cas les plus extrême une nécrose localisée pourrait être observée, entraînant là aussi une anesthésie définitive. Dans les expériences de régénération du cerveau chez les juvéniles, une perte d’appétit et une apathie globale est attendue. Chez les adultes mutants pour les gènes immunitaires d’intérêt, une susceptibilité aux infections opportunistes peut se traduire par l’apparition plus précoce de signes classiques tels que cachexie, lordose, pétéchies, ou nage anormale.
Devenir
Les animaux utilisés à des fins d'élevage et entrant dans les procédures de génération de lignées transgéniques, de génotypage de routine, ou de caractérisation de lignées potentiellement délétères, seront conservées pour servir de géniteurs. Tous les autres animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Nous travaillons sur des interactions complexes entre les nombreux types cellulaires du système nerveux, du système immuntiaire, et un pathogène, qui ne peuvent être totalement remplacées par des modèles in vitro ou in silico. Nous avons toutefois développé un modèle mathématique de la progression virale et de la réponse interféron de type I dans le système nerveux et la périphérie, à partir de nos données d'imagerie et de mesure d'expression des gènes par biologie moléculaire. Ce modèle permet de déduire certains paramètres expérimentaux, comme l'évolution du titre viral, réduisant le nombre d'animaux nécessaires à certaines de nos expériences.
Réduction
Les nombres d'animaux employés dans les expériences sont basés sur notre expérience passée pour des tests comparables, nous permettant de prédire la variance attendue et donc de réaliser des tests de puissance statistique. Lorsqu'il n'y a pas d'nterférence attendue entre deux tests, les animaux sont réutilisés pour plusieurs mesures.
Raffinement
Grâce à la transparence de la larve de poisson-zèbre, il nous est possible de mesurer la localisation de l'infection et la charge virale par des approches d'imagerie intravitale non-invasives. Pour limiter la douleur liée à l'infection de la larve sans interférer avec le déroulement de l'expérience, nous suivons les larves infectées en mesurant un score clinique quotidien; si l'infection est avancée avec atteinte de point limite, les larves sont anesthésiées pour éviter toute souffrance, tout en nous permettant de continuer à suivre l'évolution de l'infection.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle animal bien établi. En tant que vertébré, les principes de fonctionnement de ses systèmes nerveux et immunitaire sont semblables aux nôtres. Sa manipulation génétique est aisée et la petite taille, la transparence, et l’anesthésie facile de ses larves en fait un excellent système pour la microscopie intravitale. De nombreuses lignées transgéniques fluorescentes permettent d’observer la localisation et/ou l’activité de diverse populations neurales ou immunes. Combinées avec des pathogènes eux-mêmes porteurs de gènes fluorescents, on peut suivre en temps réel la propagation d’une infection et la réponse immune et neurale. La très grande majorité de nos expériences seront réalisées au stade larvaire, qui se prête le mieux à la microscopie et requiert le moins d’espace. Toutes les infections, notamment, seront réalisées à ce stade, avec des animaux maintenus en plaques multi-puits en incubateur dans un laboratoire de sécurité de niveau 2, facilitant le confinement des pathogènes. L’élevage de poissons adultes aura pour finalité principale la production des larves destinées à nos expériences. Si le(s) transgène(s) et/ou la mutation portés par ces adultes sont potentiellement dommageables, nous mesurerons cela aux stades juvénile et adulte. Les conséquences à long terme de certaines manipulations au cours du stade embryonnaires seront évaluées chez des poissons juvéniles.
Suivi des progéniteurs cardiaques à l’aide d’outils génétiques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 508 d'entre elles tuées à l'issue et 28 mâles réutilisés pour maintenir les lignées. Les femelles gravides reçoivent une injection intrapéritonéale de doxycycline, puis sont tuées entre cinq heures et six jours après pour prélever leurs embryons. Le porteur décrit un travail sur des lignées génétiquement modifiées visant à suivre les progéniteurs cardiaques au début du développement. Il indique disposer d'un modèle in vitro de type gastruloïde mais affirme qu'il ne reproduit pas l'embryon entier, ce qui rendrait la souris "indispensable".
Objectifs
Le coeur est le premier organe à fonctionner dans l’embryon, ce qui implique la mise en place de processus développementaux complexes très tôt lors de l’embryogénèse afin de permettent la formation correcte du coeur. Les étapes précoces de l’embryogénèse sont critiques dans l’apparition des pathologies cardiaques. Les défauts de développement cardiaque suite à des anomalies congénitales touchent 1% des naissances viables. Certaines de ces anomalies sont associées à d’autres malformations qui touchent d'autres organes. Les stratégies thérapeutiques actuelles restent inefficaces face aux maladies cardiovasculaires, qui sont les premières causes de mortalité. Afin de mettre en place de nouvelles stratégies de thérapie cellulaire, il est nécessaire d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant les premières étapes du développement cardiaque, plus particulièrement le destin des progéniteurs cardiaques précoces. Le projet de recherche consiste ainsi à étudier la spécification des progéniteurs cardiaques précoces lors des étapes précoces du développement de l'embryon, à la fois in vivo en utilisant comme modèle la souris, et in vitro en utilisant des cellules souches embryonnaires comme modèle alternatif. Pour cela, le projet fera appel à des lignées de souris génétiques permettant de suivre les progéniteurs cardiaques et tous leurs descendants (cellules filles). Le but du projet, est d’étudier ainsi la contribution de sous-populations de progéniteurs cardiovasculaires vers un lignage ou des régions cardiaques particulieres.
Bénéfices attendus
Ces travaux dans leur globalité permettront d’identifier les mécanismes essentiels pour la programmation du développement cardiaque et ainsi contribueront à améliorer les techniques de thérapie cellulaire dans le cadre des pathologies cardiovasculaires.
Procédures
Le projet repose sur le suivi d'animaux de lignées nouvellement créées (sans phénotype dommageable attendu à l'état hétérozygote). Il repose également sur des procédures d'injections uniques par voie intra-péritonéale (d'un antibiotique sans conséquence pour l'animal) au cours de la gestation chez des femelles gravides. Les animaux sont ensuite mis à mort entre 5h et 6 jours après injection pour prélèvement d'embryons.
Impact sur les animaux
L’impact de l’expérimentation sur les animaux repose sur l’acte d’injection par voie intra-péritonéale de Doxycycline (antibiotique) pouvant induire stress, douleur et inconfort le temps de l’injection. Aucun effet du traitement sur le comportement ou la santé de l’animal n’a été reporté.
Devenir
A l'issu du suivi de la création de nouvelles lignées, les mâles si aucun phénotype n'est détecté seront réutilsés pour croisement avec des femelles C57Bl6 pour maintient des lignées. A l'issu de la procédure d'injection de doxycycline, les souris seront mise à mort pour prélévement.
Remplacement
Pour mimer les premières étapes du développement cardiovasculaire, nous utilisons un modèle de remplacement in vitro de type embryoïde (gastruloïde). Cependant, la morphogénèse du cœur y est incomplète et les chambres cardiaques ne sont pas établies. Ces modèles ne peuvent donc pas remplacer l'embryon entier en raison de la complexité de l’organe. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris génétiquement modifiées est indispensable pour une partie du projet dédiée à l’étude intégrée des phénomènes physiopathologiques.
Réduction
Afin de limiter ou éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal/embryon et analyserons les lignages cardiques mais également extra-cardiaques. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques couplée à notre expérience (nos investigations passées montrent que certains effets varient selon les mesures de 30 à 70%) permettent d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse chez l’animal. - Modifications apportées à l'élevage afin d'améliorer le bien-être des animaux : enrichissement des cages notament lorsque les males reproducteurs sont isolés (kraft, dôme, bâtonnets à mâcher). Chaque souris injectée verra également son environnement enrichi (kraft, dôme, bâtonnets à mâcher). - La planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) diminue le stress des animaux et favorise la validité de l'expérience. - Etablir des points limites les plus précoces possibles en fonction de l'objectif de l'expérimentation.
Choix des espèces
Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du coeur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Par ailleurs, les souris génétiquement modifiées représentent le modèle le plus pertinent en ce qui concerne la compréhension des maladies congénitales cardiaques. Les lignées nouvellement crées seront suivies à partir de la naissance (nouveaux nés) et après le sevrage (21 jours). Les souris gravides injectées par de la doxycycline (entre E6.5 et E7.5), seront mises à mort 5h à 6 jours après injection pour prélèvement d'embryons.
Analyse des anomalies de cellules du cerveau dans un modèle de lésions cérébrales induites par la naissance prématurée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour reproduire chez la souris les lésions cérébrales liées à la prématurité, 2 452 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à 42 ou 60 jours de vie pour le prélèvement du cerveau. Pendant leurs cinq premiers jours, des souriceaux séparés de leur mère le temps des gestes reçoivent des injections d'interleukine-1 bêta, une molécule inflammatoire qui peut entraîner déshydratation, retard de croissance, hémorragie interne et la mort dans 5 à 10 % des cas. Viennent ensuite au sevrage un traitement censé éliminer certaines cellules du cerveau, puis à 2 mois un test de mémoire par trois chocs électriques précédés d'une sonnerie, un test de choix entre un congénère inconnu et un objet, et une chirurgie sous anesthésie pour mesurer l'activité des neurones. Les souris dont le poids varie fortement ou qui montrent isolement ou agressivité sont tuées avant terme, et le porteur ajoute 10 % de souriceaux aux groupes injectés pour compenser la mortalité qu'il anticipe.
Objectifs
La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection maternelle et naissance prématurée a été mis en évidence. En effet, l’inflammation systémique chez le fœtus peut entrainer une neuroinflammation et par conséquent, des lésions cérébrales connues sous le nom d’encéphalopathie du prématuré qui favorisent ensuite l’apparition de troubles du développement neurologique, en particulier les troubles du spectre autistique. Parmi les acteurs clés de la neuroinflammation, on retrouve les cellules microgliales (MG), cellules immunitaires résidentes du cerveau. La morphologie et les fonctions des MG sont altérées lors d’un stimuli inflammatoire précoce, conduisant notamment à des altérations moléculaires et comportementales (diminution du comportement social) caractéristiques des troubles du développement neurologique. Le remplacement spontané de ces cellules microgliales, après leur élimination par un traitement médicamenteux, pourrait contribuer à la correction de certaines de ces anomalies dont le rétablissement de la maturité des neurones et du comportement social. Les objectifs de cette étude sont donc d’abord de préciser les conséquences de cette inflammation précoce sur la mise en place des structures cérébrales et le comportement chez les adultes des deux sexes, et ensuite de déterminer le potentiel de ce traitement quant à la correction de ces troubles neurologiques.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle souris d’inflammation précoce, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de l’élimination de cellules cérébrales altérées et leur remplacement pour traiter les troubles du développement neurologique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise.
Procédures
Les injections réalisées sur les souriceaux d’une molécule inflammatoire connue sous interleukine-1beta (IL-1β) durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Le traitement testé sera ensuite administré dans l’alimentation au sevrage des animaux à la troisième semaine de vie et pendant 3 semaines. Les animaux seront soumis à deux tests afin d’évaluer leur mémoire et leur comportement social à 2 mois. Pour la mémoire, les animaux recevront un léger choc électrique suite à une sonnerie à 3 reprises. Deux jours plus tard, ils seront placés dans cet environnement et leur comportement de peur lors du retentissement de cette sonnerie, se traduisant par une immobilisation de l’animal, sera évalué. En termes de comportement social, les souris auront le choix d’interagir avec un nouvel animal ou avec un objet, une préférence pour l’interaction avec l’animal est attendue. L’interaction avec le nouvel animal devrait susciter l’intérêt et constituera le critère d’évaluation (reniflements, etc.). Enfin, les animaux subiront une chirurgie à 60 jours afin de mesurer l’activité neuronale dans différentes zones cerveau. Pour cela, les animaux seront endormis et un antidouleur leur sera administré. L’imagerie est ensuite effectuée. L’animal est ensuite euthanasié.
Impact sur les animaux
Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre le premier et le 5e jour de vie. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps. Concernant le traitement médicamenteux pour éliminer les cellules microgliales, il sera administré pendant 3 semaines dans le régime alimentaire ou par injection pendant 5 jours selon les résultats d’une étude préliminaire. Les effets indésirables qui pourraient survenir incluent un changement de la structure du visage et du crâne. Les tests comportementaux peuvent également induire un stress chez l’animal, en particulier le test comprenant un choc à la patte. Pour cela, nous avons déterminé les durées minimales nécessaire afin d’étudier ces comportements pour minimiser la présence de nos animaux dans des environnements qui pourraient impacter leur bien-être. La chirurgie n’induira pas de nuisances, l’animal étant endormi par anesthésie et sa douleur contrôlée par un antidouleur, il est ensuite euthanasié.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 42 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvements de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie l’inflammation cérébrale et l’efficacité du traitement pour la protection du cerveau en développement.
Remplacement
L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral, ses conséquences et son traitement requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance du milieu physiologique et des interactions entre les différentes cellules et organes à plusieurs stades de développement. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux est utilisé pour traiter des données statistiquement exploitables. De ce fait, il est nécessaire d’avoir n=10 animaux par groupe expérimental, avec 10% d’animaux supplémentaires dans les groupes recevant la molécule inflammatoire, compte-tenu de la mortalité probable due à l’inflammation. Une seule et même analyse sera dupliquée seulement en cas de variabilité. Les études de mises au point de nos techniques sont également indispensables et comptent le nombre minimum d'animaux. Les analyses requièrent des processus de préparation différentes, un seul et même prélèvement ne peut donc pas servir pour plusieurs analyses.
Raffinement
Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles souris blanches ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal sans nécessité d’anesthésie. Après le sevrage les animaux seront hébergés avec un maximum de 6 animaux par cage. Pendant les 5 jours d’injection, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière pour détecter une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. À la fin de l’étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. L’administration de l’interleukine-1β permettra d’étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation et établir des stratégies neuroprotectrices. Cette inflammation au niveau du cerveau pendant les 5 premiers jours de vie permet de simuler une inflammation pendant la grossesse chez l’Homme. Suite à l’inflammation, les cellules altérées dans le cerveau seront éliminées par un traitement chez les souris avant l’adolescence et remplacées spontanément par des nouvelles cellules. La correction des troubles structuraux et comportementaux sera ensuite étudiée à l’âge adulte (2 mois). En plus d’une connaissance bien établie sur le développement neurologique chez la souris, les souris blanches présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que le nombre de souriceaux par portée, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère.
Rôle de CD44 et de l’ostéopontine au cours des complications hépatiques liées à l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras, elles reçoivent des injections répétées induisant fibrose puis cancer du foie, avec des prélèvements sanguins, pour évaluer le rôle de deux protéines dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur résume les retombées en une phrase, la validation des "effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs". Il affirme qu'"il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé" et conserve les organes pour tirer un maximum de données de chaque souris.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs ont été déjà identifiés (diabète, inflammation, modification du microbiote intestinal). Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à 2 acteurs clefs impliqués dans le développement de ces maladies. Ces acteurs peuvent agir de pair favorisant le développement de ces maladies chroniques du foie. Pour une meilleure compréhension de leurs rôles, nous évaluerons sur des animaux, l’impact potentiellement bénéfique de leur absence sur le développement et la progression de ces maladies du foie.
Bénéfices attendus
Ces études précliniques valideront les effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs dans les maladies chroniques du foie .
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la cicatrisation hépatique. Pour la procédure 2 : les souris recevront une injection 2 fois par semaine pendant 6 semaines à partir de 7-8 semaines d’âge. Pour la procédure 3 : une unique injection sera réalisée sur les souris mâles âgés de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont les contentions, les prises de poids régulières ainsi que les injections en fonction des procédures. Les effets indésirables attendus pourraient être principalement une faible inflammation locale au site d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, certains aspects du projet seront réalisés sur des cellules. Cependant, il est nécessaire de réaliser des études précliniques car les études sur cellules ne permettent pas de reproduire la maladie humaine. Ainsi, il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé pour ces études.
Réduction
Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes et exploitables. Les expériences seront reproduites pour confirmer la significativité statistique. Les organes obtenus à partir des souris seront conservés et stockés pour des analyses ultérieures afin d'enregistrer autant de paramètres que possible à partir d'une seule souris.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières (grille d’observation) nous permettront d'identifier précocément tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée et pertinente pour étudier ces maladies. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La maladie développée par la souris récapitule les symptômes et les caractéristiques de la maladie chez homme. Pour la procédure 1, la mise sous régime riche en graisse débutera lorsque les souris auront 8-10 semaines d’âge. En effet, un tel régime induit une prise de poids importante et peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Cette procédure permet d’analyser la progression des maladies chroniques du foie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline. Pour la procédure 2, le traitement chimique induisant la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge. Cette procedure permettra d’étudier les mécanismes moléculaires associés à la fibrose hépatique. Pour la procédure 3, l’injection du réactif induisant le cancer hépatique sera effectuée à environ 2 semaines d’âge (âge approprié pour cette procédure) et la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge (animaux relativement jeunes). Cette procédure permettra d’étudier les stades le plus avancés de la maladie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline.
Etude des mécanismes moléculaires régulant la maturation méiotique des ovocytes de xénope.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
100 xénopes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Les femelles sont opérées jusqu'à quatre fois au cours de leur vie pour prélever des ovocytes, ou reçoivent jusqu'à six injections hormonales, avant mise à mort. Le porteur étudie les mécanismes de la division des ovocytes et justifie ce modèle par le grand nombre d'ovocytes obtenus par individu, plusieurs centaines contre quelques unités chez la femme. Il décrit l'ovocyte de xénope comme "indispensable" à son étude et situe les retombées pour la reproduction humaine à long terme.
Objectifs
Notre laboratoire étudie les mécanismes moléculaires régulant les deux divisions cellulaires qui définissent la maturation méiotique (passage d’un ovocyte immature et ovocyte mature). Nous nous intéressons en particulier aux protéines qui contrôlent le bon déroulement de la méiose et à leurs modifications post traductionnelles impliquant des protéines kinase et phosphatase. Ce modèle est propice pour cette étude compte tenu du nombre d’ovocytes qu’il est possible d’obtenir par individu (plusieurs centaines). Ce nombre est à comparer avec celui d’une souris (quelques dizaines) ou d’une femme (quelques unités). Les connaissances actuelles montrent que l’ovocyte de xénope est un modèle de choix pour comprendre comment les ovocytes des vertébrés supérieurs (xénope, souris, femme) se divisent et deviennent haploïdes avant d’être fécondables et fécondés. Ce projet se déroulera sur 5 ans et permettra de comprendre avec plus d’information et de précision les connexions entre les voies de signalisation qui conduisent un ovocyte immature à devenir la cellule essentielle avec le gamète mâle pour la formation du futur embryon.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes gouvernant la maturation des ovocytes est un enjeu majeur de la recherche fondamentale. De plus, le modèle de l’ovocyte de xénope pallie l’absence quasi totale en recherche de l’ovocyte humain. Les résultats obtenus devraient permettre à court terme d’avoir une vision plus précise du fonctionnement de ces acteurs protéiques, des voies de signalisation qu’ils contrôlent et des régulations qui en résultent. A plus long terme, ils pourraient contribuer au développement de connaissances des mécanismes qui régissent la maturation méiotique des ovocytes humains.
Procédures
Le projet comporte deux procédures permettant l'obtention d'ovocytes : 1. par chirurgie sur animal anesthésié (procédure chirurgicale simple d'une dizaine de minutes) pour obtention d’ovocytes immatures 2. par injection hormonale pour obtention d’ovocytes matures La durée de vie de ces animaux étant d’une dizaine d’années, les femelles issues de ces procédures pourront être opérées à plusieurs reprises (4fois) au cours de leur vie en s'assurant de la complète récupération de l'animal et après accord du SBEA et du vétérinaire chaque année. Un autre lot de xénope dédiée à l’injection hormonale sera injecté plusieurs fois (6fois) au cours de leur vie au laboratoire tout en respectant un délai minimum de 4 mois. Ici encore le SBEA et le vétérinaire seront sollicités pour avis et conseil.
Impact sur les animaux
Toutes les mesures seront prises pour limiter au maximum tout stress et toute douleur à l'animal lors de la procédure de chirurgie (10 min) en réduisant notamment au maximum les étapes de manipulation de l'animal pour ne pas lui causer de stress au moment de l'anesthésie et du réveil. L’animal sera mis sous observation pendant quelques jours afin de s’assurer qu'il a pleinement recouvré son état de santé avant de retourner en stabulation avec ses congénères. La durée de vie de ces animaux étant longue (une dizaine d'années), les femelles issues de la procédure pourront être à nouveau opérées (4 fois, en respectant un intervalle de repos de 4 mois au minimum entre chaque opération) avec accord du vétérinaire. Pour les individus injectés avec l’hormone, une procédure plus légère sera appliquée avec une surveillance de deux jours et une nouvelle injection après 4 mois minimum de repos.
Devenir
La durée de vie des xénopes est longue (une dizaine d'années). Les femelles issues du lot de la procédure chirurgie pourront être à nouveau opérées, en respectant un intervalle de repos d'au minimum 4 mois entre chaque opération et après accord du SBEA et vétérinaire. Le suivi de l'animal à une fréquence journalière permet également de s'assurer de la bonne récupération de l'animal entre 2 opérations. De plus, les animaux seront systématiquement mis "au repos" pendant 4 mois de plus au moindre doute. Les animaux âgés ayant subi 4 chirurgies ne seront pas réveillées à la fin de la procédure et seront euthanasiées en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce. En ce qui concerne les individus du lot de la procédure injection, ils seront injectés 6 fois en respectant une période minimum de 4 mois. Ces animaux seront aussi gardés sous surveillance journalière. Au moindre doute, l’animal sera écarté et traité individuellement afin qu’il retrouve un état normal. A la fin de la 6éme injection, l’animal sera mis à mort en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce.
Remplacement
L'ovocyte de xénope est un modèle de choix pour l’étude fonctionnelle de régulateurs de la méiose. Ces ovocytes sont de grosses cellules (1mm de diamètre) et leur taille permet une manipulation aisée. Ils peuvent être micro-injectés par de nombreuses protéines, Morpholinos, Anticorps dont les effets sont ensuite facilement caractérisables et analysable grâce, entre autres, à des méthodes biochimiques. De plus, cette cellule étant biologiquement proche des ovocytes de souris et humains, les voies de signalisation caractérisées pourront s’avérer importantes pour aborder une étude de la méiose des ovocytes humains. D’autres alternatives à l’utilisation des ovocytes immatures de xénope ont été envisagées en utilisant à chaque fois que cela était possible les ovocytes pondus. En effet, ces ovocytes pondus sont obtenus après injection de l’hormone. Toutefois, le stade cellulaire des ovocytes obtenus par chirurgie est différent de celui obtenu après injection hormonale et il est impossible de réaliser la totalité des expériences sur les ovocytes pondus. Tout ceci rend l'utilisation des ovocytes de xénope indispensable pour notre étude.
Réduction
Ce projet a été conçu pour utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Ainsi les besoins des utilisateurs de l’équipe de recherche seront regroupés pour limiter le nombre d'opérations réalisées (6 opérations par mois en moyenne) et à chaque procédure les ovocytes obtenus sur une xénope femelle serviront pour les lots contrôles (non-injectés) et pour les lots injectés. Nous pourrions également envisager de mutualiser les opérations avec d'autres Etablissements Utilisateurs toujours pour réduire le nombre d'animaux opérés (chaque opération peut permettre d'obtenir plus de 2000 ovocytes qui peuvent être conservés plusieurs jours suivant l'étude).
Raffinement
Toutes les mesures de raffinement appropriées seront prises pour favoriser le bien-être de l’animal dans le cadre de ce projet: 1. Les xénopes sont élevées dans une animalerie agréée où elles bénéficient d'un environnement social et physique enrichi en étant regroupées par bac de 40 à 50 individus (xénopes pour injection hormonale) et 4 à 6 individus (xénopes pour la chirurgie) (ce qui autorise une surveillance individuelle de chaque animal tout en préservant leur besoin d'interaction) 2. en laissant à leur disposition des refuges (tuyaux à plusieurs entrées/sorties) dans chaque bac. Lors de la chirurgie, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques appropriés et l'utilisation d'une alèse humidifiée permettra de maintenir une hydratation permanente de la peau. La manipulation des animaux est minimale et tout sera fait pour leur permettre un réveil d'anesthésie sans stress en abaissant le niveau de l'eau dans le bac de réveil. 3. Enfin, une attention particulière sera accordée à ne pas isoler longtemps un animal après son opération tout en lui apportant un soin optimal qui sera poursuivi lorsqu'il aura rejoint son bac en stabulation grâce à un suivi journalier des zootechniciens personnalisé de l'animal opéré. 4. Ceci sera rendu possible par l'identification aisée de l'animal dans un bac à faible densité (puçage sous-cutanné pour l'identification de l'animal). 5. Les possibilités de raffinement supplémentaire seront explorées tout au long du projet par la structure du Bien-être animal (qui comprend un vétérinaire spécialisé dans les espèces aquatiques, les statuts sanitaires) et testées pour continuer à améliorer en permanence le bien-être des animaux. Nous nous baserons sur notre grille de score qui mentionne les points limites et les actions à mener.
Choix des espèces
L’ovocyte de xénope est reconnu depuis plus de 50 ans comme modèle de choix dans l’étude des mécanismes impliqués dans les problématiques de cycle cellulaire et de développement embryonnaire. Ces ovocytes permettent de réaliser des études fonctionnelles car ils sont capables d’évoluer, hors de l’ovaire, du stade immature à celui de mature. Ce processus peut être perturbé par la micro-injection de protéines, ARNm, Morpholinos, Anticorps capables de mettre en évidence la fonction de la protéine ciblée. Outre ces caractéristiques propres à l'ovocyte, le xénope est facile à élever et à maintenir en laboratoire. Les opérations de chirurgie pour récupérer les fragments d'ovaires sont simples et rapides à réaliser par les utilisateurs formés. Les injections d’hormones pour obtenir les œufs pondus sont aussi facilement réalisables. Pour pouvoir obtenir des ovocytes, les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés d'au moins 2 ans.
Etude de l’alvéolisation chez le rat en cas de retard de croissance intra-utérin induit par un régime hypoprotidique per gestationnel.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
568 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont les niveaux de souffrance vont de l'absence de réveil au modéré. Des rates gestantes reçoivent un régime pauvre en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance chez leurs petits, puis 288 ratons subissent une injection quotidienne pendant dix jours avant mise à mort pour analyse des poumons. Le porteur indique que ce régime n'entraîne ni malformation ni surmortalité et classe l'injection comme peu douloureuse. Il présente le bénéfice, un traitement des troubles pulmonaires des grands prématurés, comme un objectif à moyen terme, et décrit le régime hypoprotidique comme le seul modèle animal reproduisant ces lésions.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une adaptation à un environnement intra-utérin défavorable et a comme conséquence des altérations permanentes du métabolisme, de la croissance et du développement notamment pulmonaire et cérébral. Les conséquences du RCIU sont nombreuses et durables dans le temps. Le RCIU chez l'Homme multiplie par 6 la probabilité d'avoir un développement pulmonaire et notamment alvéolaire insuffisant chez le nouveau-né prématuré. L’alvéole pulmonaire est le principal site des échanges gazeux. Si sa taille diminue, la possibilité d’échanges gazeux entre l’air et les milieux intérieurs du corps humain diminue. En pratique, un nouveau-né prématuré a besoin d’apports en oxygène de façon prolongée car ses alvéoles ne sont pas suffisamment développées. Pour fonctionner, l’alvéole pulmonaire forme une niche de cellules en interaction et en communication. Les principales cellules participant à la croissance alvéolaire sont les pneumocytes de type 2 et les lipofibroblastes. Ces cellules sont régulées par des gènes jouant un rôle sur le métabolisme lipidique notamment le gène du Peroxisome Proliferative Activated Receptor (PPAR). Cette voie est modifiée en cas de RCIU. Le seul modèle chez l'animal reproduisant un RCIU et des troubles de l'alvéolisation est le régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD) pendant la gestation. Ce projet a pour but i) d'étudier les conséquences du régime LPD sur le développement pulmonaire de rats en étudiant l’aspect du poumon ii) de mieux caractériser les différentes cellules et leur répartition et iii) de proposer des traitements innovants pour favoriser la croissance et la régénération alvéolaire grâce à des médicaments agissant sur ces voies clés du métabolisme lipidique en recréant in vitro un poumon.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera la compréhension des anomalies de l'alvéolisation liées au retard de croissance intra-utérin et permettra d'aboutir à moyen terme à un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains.
Procédures
Les rates femelles adultes gestantes seront soumises à un régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant toute la durée de la gestation (21jours) Une partie des ratons (n=32) aura une analyse de leur fonction respiratoire : âge au moment des explorations fonctionnelles : 21 à 60 jours (durée des explorations : 1 jour). Une partie des ratons (n=288) recevra du 1er jour de vie au 10ème, une injection intrapéritonéale médicamenteuse (1 injection par jour d’une durée
Impact sur les animaux
Le régime Low Protein Diet a déjà été administré chez les rates gestantes sans complication en dehors d’une diminution de la prise pondérale pendant la gestation leurs petits. Le nombre de ratons par portée était identique à celui obtenu en cas d'utilisation d'un régime contrôle. Les animaux naissent avec un retard de croissance. Ils ne présentent pas de malformation associée. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul in utero ou après la naissance. Les injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale sont couramment utilisées et n'induisent pas d'effet indésirable particulier pour les molécules étudiées en dehors de la douleur légère induite par l'injection elle-même. Les médicaments injectés ne sont pas décrits antérieurement comme induisant une douleur supplémentaire à l’injection. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 10%), les ratons seront mis à mort.
Devenir
Les ratons recevant les injections (procédure 2) seront gardés en vie au maximum jusqu'à J120. Les ratons de la procédure 1 (EFR) seront mis à mort à la fin de celle -ci. Les ratons seront mis mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement d’organes pour des études post mortem.
Remplacement
La principale cause de RCIU chez l’Homme est la prééclampsie. Il s’agit d’une pathologie exclusivement humaine. Plusieurs modèles de RCIU ont donc été mis au point chez l’animal. Le modèle de RCIU reproduisant au mieux les lésions observées chez l’Homme et le moins invasif pour l’animal est le régime Low Protein Diet (LPD). Notre première étude l'a démontré chez le rat où nous avons montré la ressemblance entre les lésions pulmonaires et cérébrales observées chez le rat et les RCIU humains. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les ratons issus des rates exposées ou non à un régime hypoprotidique seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J4, J7, J10, J21, J60 ou J120 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Le nombre de ratons et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour chacune de nos analyses statistiques lors de nos études morphométriques, immunohistochimiques et moléculaires précédentes (qPCR, Western blot etc...). Une fois les données relevées, les tests statistiques prévus sont le Mann - Whitney test pour la comparaison des 2 groupes entre eux : comparaison de la masse des ratons (en g), etc... Le test utilisé pour la comparaison de 4 groupes après tests ex vivo sera un Two-way ANOVA (pour tester l'effet du régime et l'effet du traitement, ainsi que la combinaison des deux).
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect, la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect et la mesure quotidienne du poids pour les ratons. Les rates seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les rates auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, du papier kraft ciselé pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne. Aucune sur-mortalité n’avait été enregistrée précédemment et aucune malformation n’a été détectée. En cas de mal être : blessure, poids trop faible (si le poids est de 20% en dessous de la moyenne de la portée), déshydratation, les ratons seront mis à mort. Pour les mères adultes une attention particulière sera portée sur la quantité de nourriture mangée et sur le suivi de leur poids. En cas de perte de poids, la rate gestante sera sortie de l'expérimentation et mise à mort.
Choix des espèces
Le rat est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Notre première étude a montré de résultats reproductibles chez le rat et nous souhaitons le confirmer en allant plus loin dans les analyses moléculaires
Etude chez la souris de l’impact d’une inflammation lors des premiers jours de vie sur la prédisposition à l’obésité. 2/2
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le lendemain de leur naissance, les souriceaux reçoivent deux injections quotidiennes d'une molécule inflammatoire pendant cinq jours, puis subissent des tests de tolérance à l'insuline et au glucose avec prélèvements de sang à la queue et un isolement d'une semaine en cage métabolique. Le porteur indique une mortalité de 5 à 10 % pendant les injections, un retard de croissance, des troubles du comportement et une douleur locale. Il affirme qu'aucune approche in vitro ou informatique ne peut reproduire les connexions entre le cerveau et le métabolisme et tue tous les animaux pour prélever leurs organes.
Objectifs
La naissance prématurée (avant la fin normale de la grossesse) est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons prématurés qui survivent au-delà de l’enfance est en hausse. Il existe néanmoins une inflammation importante chez 20 à 40% de ces enfants à la naissance, qui peut entraîner des lésions du cerveau. Ces lésions sont à l’origine de handicaps, de déficits des certaines capacités intellectuelles et de troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte et sont regroupées sous le terme d'Encéphalopathie du Prématuré (EDP). En plus de ces déficits, des études récentes ont démontré qu’1 enfant prématuré sur 5 développe de l’obésité pendant l’enfance. L'obésité est le principal facteur de risque pour le diabète de type 2. Pour comprendre comment une inflammation au moment de la naissance peut favoriser le développement d’une obésité et du diabète, nous utiliserons un modèle de EDP chez le souriceau combiné avec un régime hypergras. Les mères seront soumises jusqu’au sevrage de leurs petits soit à un régime hypergras soit à un régime contrôle sous forme de croquettes plus ou moins riches en graisse.
Bénéfices attendus
Comprendre pourquoi la naissance prématurée et l’inflammation à la naissance peuvent favoriser ensuite l’apparition d’une obésité et d’un diabète peut permettre de proposer des régimes alimentaires ou des traitements pour prévenir et éviter ces maladies chez l’homme.
Procédures
Les souriceaux recevront deux injections intrapéritonéales (au niveau de l’aine) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du jour après la naissance (P)1 à P4, puis une le matin du P5. Cette injection prend quelques secondes. Pour savoir si les animaux développent un diabète, un lot de souris recevra de l’insuline et la glycémie sera mesurée à t=0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 30’, 40’, 60’, 90’ et 120’ sur une goutte de sang récupérée par légère piqure au bout de la queue (animal éveillé). Le même test sera reproduit 48h plus tard, en remplaçant l’insuline par du glucose. D’autres animauxseront utilisés pour l’analyse de leur métabolisme. Ceci nécessite leur isolement pendant 1 semaine dans des cages individuelles spéciales appelées « cages métaboliques », permettant le recueil des urines, des selles et des gaz. Une semaine d’habituation en cages individuelles classiques sera réalisée auparavant.
Impact sur les animaux
Site 1: - Une mortalité de 5 à 10% peut survenir en période d’injection de la molécule inflammatoire. - LUne douleur due à infection locale dans la zone d’injection intra-péritonéale - Un retard de croissance, - des manifestations de stress : troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...), accélération de la fréquence respiratoire. Lors du test de résistance à l’insuline ou au glucose réalisé à 4 semaines : sensation modérée de faim due à la privation de nourriture pendant 5h, puis douleur légère au bout de la queue pour permettre les prélèvements de sang. Comme il y a une seule incision, il y aura peu d’inconfort pour les animaux, à part le stress généré par la manipulation répétée. - Site 2 uniquement : L’isolement en cage métabolique peut induire un stress.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes et du sang, et comprendre si l’inflammation au début de la vie peut causer un diabète. Le rôle du cerveau, du foie, du pancréas et du système immunitaire sera analysé.
Remplacement
Notre étude s’intéresse aux liens entre le cerveau et l’utilisation des lipides par l’organisme. Il est impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques) toutes les connexions concernées.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été obtenu grâce aux données du laboratoire, de la littérature et d’une estimation statistique. Si les résultats obtenus à mi-projet sont suffisamment clairs, il sera réduit de moitié.
Raffinement
Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Des grilles de surveillance en fonction de l’âge des animaux seront utilisées pour s’assurer de leur bien-être et déterminer l’atteinte éventuelle des points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, et jusqu’à P10, on surveillera quotidiennement l’apparence, le poids, et le positionnement des animaux au sein du nid. A partir de P10, avant sevrage, la surveillance aura lieu deux fois par semaine. Les scores de surveillance prendront également en compte une éventuelle prise de poids susceptible de gêner la locomotion de l’animal. Si le score atteint le niveau du point limite, l’animal sera euthanasié selon les méthodes réglementaires. Le transport d’une partie des animaux entre deux laboratoires sera nécessaire à 3 semaines. Il sera assuré par un transporteur agréé, garantissant les bonnes conditions de trajet pour les animaux. Une semaine d’habituation en cage individuelle classique sera réalisée avant celle passée en cage métabolique.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de l’inflammation cérébrale, les études scientifiques montrent que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau, car les régions principales de cet organe (qui correspondent aux fonctions motrices et intellectuelles), et ses cellules sont très proches de celles de l’homme. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; les observations pourront donc être extrapolables au nouveau-né humain. Les différents temps d’exploration et de prélèvements choisis ensuite permettent de suivre les animaux jusqu’au stade jeune adulte.