Biologie du développement

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un gène de l'autophagie invalidé, elles subissent une série de tests de développement puis des tests comportementaux nommés, dont l'activité locomotrice, l'anxiété, la résignation et la communication, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. L'objet est d'étudier le rôle de l'autophagie dans les troubles du neurodéveloppement comme l'autisme, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l'effet d'un tel défaut sur le comportement ne peut s'étudier autrement qu'in vivo.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier à différents âges le développement du système nerveux central chez un modèle souris pour lequel un gène de l’autophagie a été invalidé, par des approches complémentaires d’études du comportement et d’analyses des tissus prélevés. En particulier, nous étudierons le développement sensoriel et moteur chez le jeune animal pendant les trois premières semaines de vie, par la mise en place de tests successifs classiquement utilisés ; puis nous étudierons un ensemble de registres comportementaux individuels ou sociaux chez l’animal adolescent et adulte, tels que le niveau d’activité locomotrice, l’anxiété, les capacités cognitives, les comportements compulsifs, la résignation et les capacités de communication. Les échantillons prélevés nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de développement ou de comportement non invasifs. Ils sont tous soumis à une procédure sans réveil de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans les procédures du présent projet, les animaux subissent exclusivement des tests non invasifs de développement et de comportement, jusqu’à l’euthanasie, pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place.

Devenir

A l’issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux sont soumis à la procédure 4 (sans réveil). La procédure 4 décrit une perfusion intracardiaque réalisée afin de prélever les tissus d’intérêt. Les procédures 1, 2 et 3 sont classées en degré de gravité « modéré » et la 4ème est une procédure sans réveil. Les 3 premières procédures concernent chacune 120 animaux, la 4ème est réalisés sur l’ensemble des 360 animaux soumis à l’une des 3 premières procédures modérées. Nous comptons donc dans cette demande d’autorisation de projet 360 animaux en procédure modérée et 0 en procédure sans réveil. Les animaux ne sont donc pas maintenus en vie à l’issue de la procédure 4.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 360 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, quand cela est possible, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et la réalisation de séries de coupes par cerveau nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement : La normalité de la distribution des data obtenues sera analysée par le test de Shapiro-Wilk, et des tests paramétriques (ANOVA et test a posteriori de Bonferroni pour les données issues des tests de développement et comportement ou test t de Student pour les analyses des échantillons) ou non paramétriques (test de Kruskal-Wallis puis Mann-Whitney) seront ensuite appliqués. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié par décapitation avant PND14 et dans une chambre à CO2 après PND14. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place (procédure 4). Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en oeuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement (voir 3.3.2). Plusieurs stades de développement seront analysés : nous nous intéressons en effet aux conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, correspondant chacun à un temps d’euthanasie, seront étudiés : jeune (procédure 1 de PND4 à 17), adolescent (procédure 2 de PND25 à 34) et adulte (procédure 3 de PND70 à 89).

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre à sept injections intrapéritonéales d'un inhibiteur d'enzyme (BAPN) ou d'un placebo, avant d'être tuées pour prélever la cornée sur tissu frais. Le porteur précise que cette expérience répond à une demande d'examinateurs pour finaliser la publication de travaux déjà réalisés. Il n'anticipe "pas de souffrance ou de douleur" sur la courte durée des injections et présente la souris comme "essentielle" pour étudier le devenir des cellules souches in vivo.

Objectifs

Le but de ce projet est de mesurer l’impact de la rigidité matricielle de la niche du limbe de la cornée sur le destin des cellules souches. L’expérience proposée ici est une demande d'examinateurs afin de finaliser la publication de nos travaux . L’effet fonctionnel a déjà été évalué sur des limbes de cornée prélevés sur souris wild type. Il faut maintenant évaluer la rigidité du tissu en question (mesure par microscopie à force atomique). Pour cela, il s’agit de répéter la modulation de la rigidité du limbe par injection intrapéritonéale d’un inhibiteur d'une enzyme de modification de la matrice extracellulaire (lysyl oxidase LOX) et d'effectuer un prélèvement d’organe après sacrifice. La mesure AFM doit effectivement etre realisé sur tissu frais.

Bénéfices attendus

Le destin des cellules souches de s'autorenouveler ou de se différencier dépend en grande partie de l'environnement extracellulaire, en particulier de l'élasticité de leur niche. Néanmoins, le rôle de la rigidité de la matrice dans la formation de cette niche et dans les fonctions souches in vivo est mal connu. Nos données montrent que la rigidité matricielle du stroma module ce destin en générant des compartiments fonctionnels différents. Ce projet vise à mesurer la rigidité de la matrice du stroma du limbe par microscopie à force atomique AFM, comme demandé par les examinateurs. En effet, nous avons montré, dans ce manuscrit, de manière fonctionnelle que c’est en compartimentalisant l’environnement que la matrice contrôle le destin souche.

Procédures

Les animaux seront soumis soit à 4 traitements par injection intrapéritonéale (lot 1 BAPN et lot 2 PBS ) soit à 7 traitements par injection intrapéritonéale (lot 3 BAPN et lot 4 PBS). Une injection intrapéritonéale prend environ 2 minutes par souris à réaliser (soit un total de 2minutes x 4= 8 minutes maximum réparti sur 5 jours pour les lots 1 et 2, et 2minutes x 7= 14 minutes maximum réparti sur 7 jours pour les lots 3 et 4).

Impact sur les animaux

Sur la base de l'expérience antérieure de nos collaborateurs avec les injections de BAPN ou le gavage oral, nous n'anticipons pas de souffrance ou de douleur chez les animaux. Le BAPN est un inhibiteur des enzymes LOX et devrait atténuer la rigidité tissulaire. Ce n'est qu'après des traitements plus longs (comme un mois, i.e. beaucoup plus long que les 4 ou 7 jours max. d'injection proposé ici) que des phénotypes dommageables peuvent apparaitre.

Devenir

La totalité des animaux sera sacrifiée à l’issue de l'unique procédure expérimentale de ce projet. En effet, la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement d'organes prévu pour répondre à la question scientifique posée.

Remplacement

Une importante partie de ces travaux a été réalisée in vitro sur cellules en culture, en particulier l’aspect des mécanismes moléculaires impliqués. Cependant, l’étude de l’impact de l’environnement matriciel sur le destin fonctionnel des cellules souches n'est que limitée sur des cellules en culture, et c’est pour cela qu’il est essentiel de réaliser cette expérimentation sur la souris.

Réduction

Chaque souris ayant deux yeux, le nombre de prélèvements pourra être légèrement réduit. De même, les mâles et les femelles seront utilisés limitant donc le nombre de portée et d’animaux générés (début procédure à P13). Néanmoins, afin de préserver la qualité statistique des données, 12 souris par groupe et par traitement sont prévues.

Raffinement

Afin de reduire le risque potentiel de perforation des organes fixes ou de consistance plus dure (estomac, cæcum, foie...) par l'injection intrapéritopneale, le site d'injection choisi est le quadrant abdominal inférieur droit de la cavité péritonéale de l’animal en regard de la cuisse (c'est à dire autour des anses intestinales, organes lâches, qui se rétractent sous l’injection). De même, afin de réduire la douleur, l'aiguille utilisée est de très petit diamètre et le volume injecté de moins de 50 microlitres. Bien entendu, une fiche de score avec point limite bien défini (site d'injection, état général et comportement de l'animal) sera utilisée.

Choix des espèces

La réalisation du projet présenté permettra d’acquérir des connaissances fondamentales sur les processus biologiques régulant le devenir des cellules souches in vivo. La souris apparaît comme un excellent modèle pour étudier ces mécanismes car le modèle est parfaitement décrit et déjà utilisé et le traitement BAPN a déjà été testé, validé et partiellement publié par un membre de la collaboration. De plus, nous proposons ce projet dans le cadre du manuscrit en cours de révision pour lequel notre collaborateur a utilisé un modèle de souris génétiquement modifiées (LOXOE, enzyme LOX OverExpressed). Ainsi, en utilisant des souris, nous pourrons comparer nos données sur souris wild type injectées au BAPN et les données sur souris transgéniques. Ce projet sera développé dans le cadre de réponse aux reviewers sur des expériences déjà réalisées. Ainsi, la procédure sera réalisée sur des souris jeunes P13 uniquement.

310 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un test de nage à contre-courant croissant jusqu'à ce qu'elles ne puissent plus se maintenir à la verticale et soient plaquées contre une grille, puis pêchées et mises à mort. Le projet cherche à savoir si une faible proportion de muscle rouge, recherchée par sélection génétique pour la vente en tranches fumées, réduit les capacités de nage. Le porteur présente aussi l'étude comme visant le "bien-être" des poissons, alors que l'enjeu affiché est d'abord "agronomique et économique".

Objectifs

La production de truite arc en ciel en France s’oriente de plus en plus vers des poissons de grande taille destinés à la fumaison et vendus sous forme de tranches fines. La présence du muscle rouge, facilement repérable par sa couleur brune est fortement préjudiciable pour la vente. En effet, outre l’aspect visuel, le muscle rouge riche en lipides s’oxyde rapidement conduisant à des défauts de flaveur. C’est pourquoi certains cahiers des charges imposent aux transformateurs d’éliminer ce muscle. Ce niveau de parage élevé (élimination du muscle rouge) entraîne une perte en matière première et donc une perte économique pour les producteurs et les transformateurs. Il y a donc un enjeu agronomique et économique à maîtriser la croissance de ce muscle. C’est pourquoi les professionnels étudient la possibilité de diminuer la proportion de muscle rouge par sélection génomique. La musculature des poissons est très majoritairement (>90%) constituée d’un muscle blanc à contraction rapide et d’un muscle rouge à contraction lente. D’après la littérature, le muscle blanc avec un métabolisme anaérobie est surtout sollicité par le poisson pour la nage rapide alors que le muscle rouge avec un métabolisme aérobie est principalement sollicité pour la nage lente. Chez le zebrafish, l’absence totale de muscle rouge dans les stades précoces entraîne une forte mortalité résultant d’une incapacité à s’alimenter (Li et al 2019). Alors que les études sur la croissance du muscle blanc sont nombreuses et que l’impact des facteurs externes est bien connu, les facteurs qui influencent la proportion de muscle rouge chez les poissons sont très mal connus. Parmi les différents facteurs d’élevage, l’exercice modéré semble stimuler la croissance du muscle rouge sans modifier significativement la taille des fibres lentes (Davie et al 1986). Cependant, l’impact de l’exercice sur la taille des fibres du muscle rouge de truite reste controversé puisque certaines études rapportent une augmentation de 25 % du diamètre moyen des fibres (Greer-Walker et al 1978), alors qu’une autre n’observe aucun effet (Davie et al 1986) L'objectif du projet est de déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Il s'agit notamment de vérifier si une proportion faible de muscle rouge n’entraîne pas de défauts dans la capacité de nage ce qui pourrait nuire au bien-être de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Il s'agit notamment de vérifier si une proportion faible de muscle rouge n’entraîne pas de défauts dans la capacité de nage ce qui pourrait nuire au bien-être de l’animal. Étant donné que le muscle rouge est décrit comme étant principalement sollicité pour la nage lente, il s'agit de vérifier si les poissons avec une faible proportion de muscle rouge n’ont pas une capacité de nage limité ce qui pourrait nuire à leur bien-être. Il se basera sur l’utilisation d’un modèle biologique tout à fait pertinent, deux lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle : lignée grasse (LG) et lignée maigre (LM), ainsi que des lignées isogéniques. En effet, des travaux préliminaires ont montré qu'il existait une variabilité de la proportion de muscle rouge entre différentes lignées de truites : Lignées A02 (faible), N38 (forte), AB1 (moyenne) et lignée grasse (très faible) et maigre (moyen).

Procédures

Les animaux seront soumis à un test de nage qui consiste à exposer les poissons à un courant de plus en plus fort dans un bassin expérimental avec une accélération graduelle jusqu'à 2 longueurs par seconde. Ce bassin de test de nage sera constitué d'un tunnel de nage de 300 cm de long, 70cm de large et 32 cm de haut représentant un volume de 680 L environ. Il sera alimenté en eau d’élevage par deux pompes équipées de variateur de tension afin d’assurer un renouvellement d’eau suffisant et augmenter progressivement le courant d’eau. Dès que le poisson n’arrive plus à se maintenir en position verticale dans le courant d’eau et qu’il est plaqué sur la grille disposée à la fin du tunnel de nage pendant quelques secondes, il est pêché et mis à mort. Le test doit durer 2 heures. Un test avec 10 poissons sera réalisé en préambule pour valider la fonctionnalité du système de test., Puis 5 tests avec 60 poissons seront réalisés.

Impact sur les animaux

Les poissons utilisés dans ce projet subiront un stress modéré généré par un test de nage où l’on va mesurer le temps au bout duquel ils ne parviennent plus à se maintenir en position verticale dans le courant d’eau et qu’il est plaqué sur la grille à la fin du tunnel de nage pendant quelques secondes, il est retiré du bassin de test. Pour limiter le stress, les groupes de poissons seront constitués entre 3 et 4 semaines avant le test de nage et placés dans un bac d’élevage proche du bassin de test. Les animaux seront mis à jeun avant le test afin d'éviter qu'ils ne soient malades et transférés avec une épuisette dans le bassin de test la veille pour s’habituer à ce bassin.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet ou par les responsables du projet eux-mêmes. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés. Tous les éléments justifiant leur mise à mort sont conservés et transmis à la SBEA de l'établissement et au vétérinaire référent de l'établissement, ainsi qu’au responsable du projet.

Remplacement

Les objectifs du projet étant de déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage des poissons ce qui ne peut se faire que sur animaux vivants.

Réduction

D'après notre expérience et la variabilité de la réponse au test de nage, il est indispensable de réaliser le test sur au moins 60 truites de chaque lignée. Nous utiliserons pour cela au total 310 animaux : 10 animaux pour adapter le test, et 60 animaux de chaque lignée (60*5 lignées) qui possède des proportions différentes de muscle rouge (faible, moyenne et forte) ce qui nous permettra d'obtenir des mesures précises et fiables de la proportion de muscle rouge et des capacités de nage. Cet effectif nous permettra d’avoir une puissance statistique suffisante (test du khi2, test t, ANOVA) et pour mettre en évidence un impact de la proportion du muscle rouge sur les performances de nage.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, nourriture, enrichissement). Pour limiter le stress, les groupes de poissons seront constitués entre 3 et 4 semaines avant le test de nage et placés dans un bac d’élevage proche du bassin de test. Les animaux seront mis à jeun avant le test afin d'éviter qu'ils ne soient malades et transférés avec une épuisette dans le bassin de test la veille pour s’habituer à ce bassin. Pendant les procédures la manipulation des animaux sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Les animaux seront anesthésiés puis mis à mort dès la fin du test.

Choix des espèces

L'étude s'effectue sur la truite arc en ciel car c'est l'espèce piscicole utilisée pour le projet. C'est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. De plus, il s’agit d’un poisson d’intérêt économique dans le monde entier, et qui représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement étudié dans la communauté scientifique. Nous allons réaliser les tests sur des animaux de 200g qui correspond à la taille où l’on peut mesurer le plus précisément la proportion de muscle rouge ainsi que les capacités de nage.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent des injections d'alcool en fin de gestation, puis leurs souriceaux subissent des mesures cardio-respiratoires, des tests psychomoteurs et des séparations maternelles jusqu'au onzième jour de vie, avant d'être tués pour prélever leurs organes, les mères étant tuées après la mise bas. Le porteur indique que l'alcoolisation fait perdre aux femelles la coordination de la marche et que la séparation maternelle est une source de stress pour les souriceaux. Il affirme que l'étude des effets moteurs et cognitifs de l'alcoolisation foetale passe par un "organisme entier" et ne peut être évitée.

Objectifs

Dans l'altération de l’environnement fœtal, notre objectif est de caractériser l’impact d’une alcoolisation fœtale importante au dernier trimestre de la grossesse. L'alcoolisme foetale est la première cause d'handicap mental non génétique. Le placenta est perméable à l'alcool qui arrive alors au foetus dont le foie n'a pas l'efficacité pour l'éliminer. Il est ainsi exposé plus longtemps aux effets toxiques de l'alcool. Nous souhaitons évaluer et comprendre les fonctions du gène Hsf2, un gène important pour la réponse au stress dont le stress lié à l'alcool. Pour cela, nous utilisons un modèle génétique murin dépourvu de ce gène. Nous étudierons les conséquences physiologiques, motrices et cognitives dès la naissance des souriceaux issus de mères alcoolisées. Nous comparons les résultats obtenus avec les souriceaux issus de mères non alcoolisées. A ce jour, la France compte encore environ 15000 naissances avec des troubles causés par l'alcoolisation foetale. Les retombées de ce travail sont ainsi directement utiles en terme de prévention et d’implications thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Résultats attendus : Les conséquences d’une alcoolisation fœtale pourraient être plus étendues avec des atteintes précoces motrices, cognitives et physiologiques. Nous préciserons les fonctions du gène Hsf2 dans ces atteintes. Les retombées de ce travail sont directement utiles en terme de prévention et d’implications thérapeutiques.

Procédures

Sur les femelles gestantes : injection intrapéritonéale (au quart cadran inférieur de l'abdomen) d'alcool ou de solvant servant à diluer l'alcool au 15ème jour de gestation (deux fois espacés de 8h) et un fois au 16ème jour de gestation - Aucun prélèvement sur animaux vigiles - Aucune procédure chirurgicale, Sur les soucriceaux : des mesures cardio-respiratoires (30 min une fois à un jour de vie, 30 min une fois à deux jours de vie, 50 min une fois à 8 jours de vie), bilan psychomoteur de 7 à 11 jours de vie à l’aide de 3 tests distincts répétés 2 fois, chaque test dure 20 secondes, enregistrement des sons émis par l’animal (une fois à 8 jours de vie, pendant 3 min)

Impact sur les animaux

L'alcoolisation de la mère ne modifie pas la prise de poids ni la température corporelle au cours de la gestation. Ce que l'on peut constater est un retard de mise bas chez les femelles alcoolisées et dans ce cas les petits ne rentreront pas dans le protocole. La modification de ces deux variables (la modification corporelle (poids et température = variable 1) et le retard de mise bas (variable 2) constitue un signe de souffrance et/ou de modification inattendue dans la procédure et nous tenons à les prendre en compte. Titubation des femelles alcoolisées : les femelles alcoolisées perdent temporairement la coordination de la marche sous l’effet de l’alcool. Ces femelles retournent en pièce d'hébergement si et seulement si elles recouvrent une marche coordonnée normale. Nuisance post-natale : séparation maternelle (durée maximale de 50 min en condition de thermoneutralité pour les mesures physiologiques, 10 min pour le test de préférence maternelle, 3 min pour la mesure des vocalisations ultrasoniques), les souriceaux sont libres de se mouvoir pour toutes les mesures/observations effectuées.

Devenir

Les souriceaux sont maintenus en vie jusqu'à 11 jours, jour de la fin des expériences. IIs seront euthanasiés et les organses sont récupérés en post-mortem pour une étude histologique. Les mères traitées sont euthanasiées après la mise bas. Comme nous nous intéressons sur l'empreinte que peut laisser l'alcoolisation, les mères ne seront pas réutilisées, elles sont euthanasiées après la mise bas selon la methode règlementaire par un personnel qualifié.

Remplacement

L'étude préclinique concerne l'expérimentation animale et permet d'obtenir les informations de toxicité notamment dans l’alcoolisme maternel. Pour étudier les effets de l'alcoolisme foetale sur le plan physiologique, moteur et cognitif, l'utilisation d'un organisme entier est pertinente et ne peut être évitée.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. Nous privilégions une étude longitudinale c'est à dire que nous suivons les souriceaux sur plusieurs jours ce qui réduit le nombre d'animaux utilisés. Un groupe expérimental nécessite 30 souriceaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif découle de nos expériences. Toutefois, cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.

Raffinement

Nous utilisons des techniques de mesures non invasives et contrôlées (mesure moins d'une heure, température 32-33°C dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. Les cages avec les portées sont enrichies en papier absorbant doux pour le nid. La séparation maternelle n'excède pas l'heure. Une surveillance quotidienne visuelle est assurée tous les jours. Un suivi clinique est assuré les jours avec protocole de test prévu (poids, température, mobilité des souriceaux, aspect des poils). En somme, nous avons établi une liste de points limites intermédiaires basées sur le comportement et l'aspect des animaux qui conduit à la mise en place d'action adaptée et précoce permettant de diminuer la souffrance.

Choix des espèces

Choix de l'espèce souris : largement utilisée dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique, souris transgénique disponible pour étudier le rôle d'un gène, organisme entier pour étudier les conséquences de l'alcoolisation sur les descendances Stades de développement : Pour l'alcoolisation foetale, il s'agit de cibler les conséquences d'une consommation excessive d'alcool en fin de gestation. Pour les souriceaux, il s'agit de déceler précocément les modifications induites par l'alcoolisme foetale. Tests psycho-moteurs et cognitifs choisis avant l'ouverture des yeux

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux d'un jour sont anesthésiés pour recevoir de l'ADN par électroporation dans les neurones du bulbe olfactif, puis tués entre deux et vingt-huit jours plus tard par perfusion intracardiaque après surdose d'anesthésique. Le porteur affirme pratiquer cette électroporation en routine depuis une douzaine d'années sans jamais avoir observé d'effet nuisible conséquent, et juge très limité le stress de l'injection intrapéritonéale. Il indique que la culture in vitro ne convient pas et retient la souris comme seul mammifère permettant les tests génétiques recherchés, pour éclairer le rôle de mutations du gène Ago2 identifiées chez des patients.

Objectifs

Certaines mutations du gène Ago2 chez des patients humains provoquent dans l’embryon des anomalies de formation des neurones (neurogenèse) conduisant ultérieurement à l’apparition de déficits cognitifs. Le présent projet cherche à comprendre les mécanismes qui conduisent les mutations du gène Ago2 à provoquer ces anomalies. Pour mener cette étude, nous utiliserons un modèle de neurogenèse (formation de nouveaux neurones) particulier chez la souris : la formation de nouveaux neurones dans le bulbe olfactif. Ce modèle de neurogenèse, qui perdure tout au long de la vie de l’animal, autorise la modification de l’expression des gènes au cours du processus. Ainsi, en utilisant ce modèle nous pourrons étudier les conséquences de l’expression induite des formes mutantes du gène Ago2 au cours de la neurogenèse sur les propriétés des jeunes neurones qui en sont issus.

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension des mécanismes conduisant aux anomalies de formation des neurones liés aux mutations du gène Ago2 est susceptible d’aboutir au développement de nouveaux traitements permettant d’atténuer les effets de ces mutations. Ce projet permettra aussi de mieux comprendre la fonction du gène Ago2 dans les neurones en développement.

Procédures

Pour l'étape d'électroporation, les 300 animaux de ce projet seront traités avec le même protocole: les souriceaux âgés de 1 jour seront anesthésiés et de l'ADN sera introduit par électroporation dans les jeunes neurones du bulbe olfactif en développement. L’ensemble de ces actes ne dure que 30 secondes. Les souriceaux seront réveillés progressivement en les ramenant à une température de 37°C et replacés auprès de leur mère. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l'électroporation par perfusion intracardiaque après injection d'une surdose d'anesthésique. De plus, les animaux du lot 1 recevront une injection intrapéritonéale d'une solution non dommageable 2 heures avant perfusion.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 28 jours après électroporation. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’années et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur l'état de santé et le bien être des animaux. Concernant l’injection par voie intrapéritonéale, l’acte entraine probablement un stress des animaux mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits par l'introduction de l’aiguille sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser au niveau histologique le devenir des jeunes neurones modifiées génétiquement.

Remplacement

Les jeunes neurones peuvent être cultivés in vitro. Cependant nous savons que in vivo leur prolifération et leur développement en neurones matures sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux que nous ne savons pas reproduire in vitro. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. D'autre part nous ne sommes pas capables de cultiver suffisamment longtemps les progéniteurs neuronaux et les jeunes neurones qui en découlent pour leur faire atteindre un niveau de maturité suffisant pour qu'ils puissent entrer en communication avec d'autres neurones. Or il est fortement suggéré que les anomalies chez les patients causées par des mutations du gène Ago2 soient dues, au moins en partie, à un défaut de connectivité entre neurones. Pour ces raisons, le modèle de la culture in vitro n'est pas approprié à ce projet.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des jeunes neurones directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routine depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et la variabilité entre échantillons réduite au minimum. Les résultats seront analysés par des tests statistiques dédiés aux petits échantillons (tests non paramétriques) que nous maitrisons grace aux formations en biostatistique que nous avons suivies. Les animaux des 2 sexes seront utilisés pour ces expériences.

Raffinement

Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Six personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin des animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation postexpérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises.

Choix des espèces

Le projet vise à reproduire et à étudier le mécanisme d'apparition de défauts de développement et/ou de fonctionnement des neurones exprimant une forme mutante d’Ago2. Nous privilégions donc un modèle de mammifère pour ce projet. Chez les mammifères, seule l’espèce souris permet de réaliser des tests génétiques sophistiqués tels que ceux décrits dans ce projet. Les animaux seront électroporés à 1 jour après leur naissance (stade P1) car c'est à ce stade que l'efficacité d'électroporation est optimale. Les animaux ayant subi l'électroporation seront euthanasiés pour analyse aux stades P3 (jour 3 après la naissance, les jeunes neurones électroporés sont en pleine phase de prolifération), P15 (jour 15 après la naissance, à ce stade la majorité des neurones électroporé ont atteint le bulbe olfactif mais restent immatures) ou P29 (29 jours après la naissance, les neurones électroporés sont complètement matures).