Biologie du développement

Une souris qui présente démangeaisons, dermatite ou conjonctivite après l'ovule au lyral, un odorant que le porteur sait allergisant, est retirée de l'expérience et mise à mort. 640 souris Swiss CD1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour tester une contraception non hormonale. Avant l'accouplement, l'expérimentateur introduit avec le pouce un ovule de la taille d'un grain de blé dans le vagin de la femelle, geste de deux minutes trente répétable jusqu'à trois fois, accompagné d'un massage destiné, selon le porteur, à "apporter du bien être à l'animal". La souche est retenue pour ses portées de plus de 10 souriceaux, et ces souriceaux sont immédiatement mis à mort. Les femelles retournent ensuite dans le pool pour d'autres accouplements, sans que le résumé dise ce qu'elles deviennent à la fin du projet.

Objectifs

La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Il a été montré qu’un odorant, le bourgeonal, modifiait in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes humains et que le lyral, un autre odorant, modifiait lui aussi in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes de souris. Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif, nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.

Bénéfices attendus

Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.

Procédures

L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement la souris est maintenue, sans contrainte par la base de la queue afin de permettre à l'expérimentateur d'accéder à la région vulvaire. L'ovule est introduit délicatement avec le pouce. L'expérimentateur maintient une légère pression avec son pouce sur la région génitale afin d'éviter une sortie de l'ovule et exerce un massage doux de la zone pour faciliter l'introduction complète de l'ovule et apporter du bien être à l'animal pendant ce geste. Le temps d'introduction complète est d'environ 2m30s et l'animal ne montre aucun signe de douleur ou de stress (pas de morsure, de réaction de fuite...) Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.

Impact sur les animaux

Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.

Devenir

Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.

Remplacement

Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience. Par ailleurs, rappelons que les ovules sont de qualité pharmaceutique, fabriqués par une société pharmaceutique avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris mâles et femelles utilisées auront entre 8 à 48 semaines.

5120 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées dans les cinq jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections hormonales de superovulation, une partie subissant en plus une amputation de la dernière phalange pour génotypage, avant d'être tuées pour prélever leurs embryons à divers stades. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable en dehors des gestes eux-mêmes et tue tout animal montrant des signes de douleur. Il présente le recours à la souris comme "indispensable", aucun système cellulaire ne reproduisant selon lui l'activation du génome au tout début du développement embryonnaire.

Objectifs

L'expression de gènes contrôlés par l'ARN polymérase II requiert la formation d'un complexe multiprotéique (PIC) sur les promoteurs. Cet assemblage est favorisé par l'action d'autres complexes protéiques qui modifient la structure de la chromatine et facilitent le recrutement du PIC. L'expression active des gènes s'arrête au cours de la formation des gamètes, des ovocytes en particulier, et ne reprend qu'après le démarrage du développement embryonnaire, bien après la fécondation. La nature des complexes protéiques qui permettent le redémarrage de la transcription dans l'embryon (activation du génome zygotique ou ZGA) n'est pas connue. Nos objectifs sont i) d'analyser la présence des protéines composant les différents complexes protéiques associés à la transcription au moment de la ZGA et ii) de tester l'importance de différents gènes codant pour certaines de ces protéines.

Bénéfices attendus

Les connaissances que nous avons des mécanismes d'expression des gènes reposent historiquement sur des modèles cellulaires comme les cellules cancéreuses et des organismes unicellulaires comme les levures. Ces modèles ne sont pas représentatifs de la diversité cellulaire qui existe chez les animaux ni des transitions qui existent au cours du développement et de la différenciation. Notre projet permettra de caractériser une étape essentielle du développement embryonnaire des mammifères.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux injections intrapéritonéales rapides (moins de 5 secondes par injection) à 48 heures d'intervalle. Pour une partie des animaux seulement, la partie distale d'une phalange sera rognée pour identification et génotypage (moins de 5 secondes).

Impact sur les animaux

La superovulation nécessite une série de deux injections intrapéritonéales et une partie des animaux seront identifiés et génotypés par rognage de phalange. Aucun effet indésirable en dehors de l'acte n'est attendu chez les animaux.

Devenir

Toutes les femelles superovulées seront euthanasiées dans un délai maximum de 5 jours après la première injection dans le but de récupérer les embryons à différents stades de développement.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe pas de système cellulaire qui permette de récapituler le stade de l'activation du génome zygotique qui correspond au démarrage de la transcription du génome embryonnaire; l'emploi d'un modèle animal est donc indispensable. Il n'est pas possible de remplacer le modèle murin par un autre modèle animal parce que, bien que le développement de tous les animaux passe par une étape d'activation du génome zygotique, il y a des différences fonctionnelles fondamentales entre ce qui se passe chez les mammifères (développement plus lent) et chez les autres animaux (développement plus rapide).

Réduction

Le nombre d'animaux déterminé tient compte de l'efficacité de la procédure de superovulation (variabilité du nombre d'embryons obtenus par femelle, du nombre de femelles pour lesquelles la stimulation hormonale n'a pas été efficace et du nombre de femelles non fécondées) et du nombre minimal d'embryons à collecter pour pouvoir réaliser nos analyses et pour pouvoir conclure. En particulier, une partie des animaux sera utilisée pour produire des embryons en vue d'optimiser des techniques ce qui permettra de réduire le nombre d'embryons (et donc de femelles) pour l'analyse de l'importance de 7 gènes candidats.

Raffinement

La procédure de rognage des phalanges n'est pas susceptible de générer une gêne majeure pour l'animal vers 10 jours: en cas de saignement, un point de compression sera effectué. La procédure de superovulation est rapide et limitée à 2 injections intrapéritonéales à 48 heures d'intervalle. Les points d'injection seront alternés et suivis jusqu'à l'euthanasie. De plus les femelles sont euthanasiées au plus tard 5 jours après la première injection. Ces procédures sont rapides et ne nécessitent pas de dérogation aux conditions règlementaires d'élevage, d'enrichissement et d'interaction sociale. En cas de signes de douleur (inflammation, prostration, poil hérissé ou dos vouté), les animaux concernés seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La superovulation étant efficace sur des femelles jeunes, nous n'utiliserons que des femelles entre 3 et 5 semaines d'âge ce qui correspond à la période optimale de réponse à la stimulation hormonale. Le choix du modèle murin repose sur la possibilité qu'offre ce modèle pour générer des mutants et sur le fait que c'est un modèle mammifère proche de l'homme. L'activation du génome zygotique (ZGA) chez les mammifères est différente de celle qui se passe chez d'autres modèles vertébrés ou non vertébrés. En effet, le développement mammifère est plus lent et la ZGA est initiée juste avant la 1ère division, environ 12 heures après la fécondation, alors que chez le poisson zèbre, le xénope ou la drosophile, la ZGA est plus rapide mais intervient après plusieurs divisions cellulaires. De plus, les acteurs et les mécanismes moléculaires de la ZGA ne sont pas conservés entre les mammifères et les autres modèles.

480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les rates reçoivent une supplémentation nutritionnelle pendant la gestation, une injection d'eau marquée, un prélèvement de lait sous anesthésie et des prélèvements de sang, leurs petits des prélèvements d'urine, un test de tolérance au glucose et un prélèvement de sang, avant une mise à mort par ponction cardiaque pour prélever la glande mammaire. Le porteur teste des acides aminés censés augmenter la production de lait maternel, une éventuelle étude chez la femme renvoyée au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la mise en place de la lactation.

Objectifs

L’Organisation Mondiale de la Santé recommande l’allaitement exclusif jusqu’à 6 mois. Le taux d’allaitement exclusif, en France, de l’ordre de 65% à la naissance, chute à 35% dès la fin du premier mois. La raison invoquée est évidemment le retour des mères au travail ; toutefois, la perception d’une production insuffisante de lait maternel est souvent citée mais repose soit sur une impression subjective, soit sur une mesure indirecte et imprécise de la production de lait, qui consiste à peser les enfants, avant et après tétée. Nous avons mis au point une méthode plus précise, basée sur la méthode d’enrichissement isotopique. Cette méthode requiert l’administration à la mère d’une dose d’eau marquée au deutérium, isotope stable de l’hydrogène, puis de suivre la diffusion de ce traceur chez le petit allaité. L’eau du lait maternel étant la seule source d’eau ingérée par le petit, on peut en déduire le flux de lait entre la mère et le petit. Nous avons utilisé cette méthode pour quantifier la production de lait maternel chez un modèle de petite taille (rongeur, rat), largement utilisé pour la recherche périnatale du fait de son cycle court de reproduction. Dans l’idée de tester des stratégies pour améliorer la lactation par des interventions nutritionnelles chez des femmes allaitantes, nous allons utiliser cette méthode pour explorer, sur un modèle animal rongeur, des molécules « galactologues » susceptibles d’améliorer la production de lait maternel. Ces molécules seront testées pendant la gestation, qui est la période de croissance in utero du fœtus et aussi la période de préparation de la glande mammaire à la lactation. C’est une période de vie qui mérite d’être mieux étudiée avec un objectif d’améliorer la lactation. Les molécules galactologues qui nous intéressent sont deux acides aminés, arginine et citrulline, qui participent au contrôle de la lactation. L’arginine, est un acide aminé semi-essentiel, seul précurseur endogène de l’oxyde nitrique (NO). L’arginine supplémentée pendant la gestation et la lactation augmente le flux de lait de 20% chez la rate allaitant une portée de 12 ratons sous régime normo-protéique alors que l’effet est nul lorsque l’arginine est supplémentée pendant la lactation seule. La citrulline est un acide aminé non essentiel qui échappe à l'absorption hépatique, n'est pas incorporée dans les protéines, et est absorbée par les reins où elle est transformée en arginine.

Bénéfices attendus

La supplémentation du régime alimentaire de la mère sera testée pendant la gestation de façon à étudier cette période de vie. La période de gestation, en particulier le dernier trimestre chez la femme, est d’abord la phase de croissance in utero du fœtus, mais elle correspond également à la période où les glandes mammaires se préparent à la lactation, avec l’initiation de leurs mécanismes physiologiques. Nous avons donc décidé de la considérer pour étudier ses effets potentiels sur la lactation. Les bénéfices attendus sont une meilleure initiation de la lactation, dès les premiers jours après la naissance, et au final, une meilleure production de lait maternel, tout au long de la lactation. Le meilleur indicateur en termes de bénéfice serait, à terme, une amélioration du taux d’allaitement. Si les résultats de cette supplémentation s’avéraient positifs sur ce modèle de rate, nous pourrions aller vers une étude clinique chez la femme pendant la grossesse. Si les bénéfices en termes de lactation sont positifs chez la rate, rien ne prouve qu’il en serait de même chez la femme et seule une étude clinique permettrait de le prouver. Supplémenter le régime maternel avec un acide aminé, uniquement en fin de gestation, serait envisageable puisque les doses en arginine et citrulline sont celles déjà testées chez l’homme adulte, sans que des effets indésirables n’aient été observés. La prise en considération de la vulnérablité accrue de la femme en période de grossesse serait évidemment à considérer.

Procédures

Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle durant la gestation (15 jours), à une injection d’eau deutérée en intra-veineuse pendant la lactation (10 min/femelle), à 1 prélèvement manuel de lait (30 minutes), et à des prélèvements de sang (2 min/animal). Leur descendance sera soumise à des prélèvements d’urine pendant la lactation (2 min/petit) et à un test de tolérance orale au glucose (120 minutes) et des prélèvements de sang à la veine caudale à 150 jours de vie (2 min/animal).

Impact sur les animaux

Pour les animaux, l’évaluation de la douleur sera faite à l’aide d’observations physiologiques (poids), comportementales (consommation de nourriture, fuite ou défense de l’animal à la manipulation, activité) et en fonction de l’apparence de l’animal (poil, posture). Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Les animaux seront observés tous les jours y compris le Week-end. De la douleur et/ou du stress peuvent être ressentis par l’animal, pendant l’injection d’eau deutérée (mère), et les prélèvements de sang (mères et ratons). Du stress peut être ressenti par l’animal pendant le prélèvement de lait (mère), et le prélèvement d’urine et le gavage du glucose lors du test de tolérance orale (ratons).

Devenir

Si aucun évènement n’a justifié la mise à mort prématurée des animaux, ils seront mis à mort aux temps de prélèvements de tissus préalablement établis dans les procédures expérimentales. Pour la procédure 1, les rates sont suivies jusqu’à l’involution (J21), temps auquel elles sont mises à mort, notamment pour un prélèvement de glande mammaire. Les ratons à J21 sont séparés en 2 : les ratons non sevrés (8 sur 12 par portée) sont mis à mort à ce même temps, pour un prélèvement de sang intracardiaque, les ratons sevrés (4 sur 12 par portée) sont suivis jusqu’à 150 jours, temps auquel ils sont mis à mort. Pour la procédure 2, les mères sont suivies jusqu’à J18 (date de fin de mesure du flux de lait par méthode d’enrichissement à l’eau deutérée), temps auquel elles sont mises à mort, notamment pour un prélèvement de glande mammaire. Tous les ratons (toute la portée) sont également mis à mort à ce temps car aucun suivi n’a été prévu à long terme: Un prélèvement de sang intracardiaque sera alors effectué sur ces animaux. Tout animal sera exclu du protocole et mis à mort si un comportement anormal de l’animal (prostration, poil hérissé, refus d’alimentation, courbe de prise de poids anormale) est observé.

Remplacement

Il s’agit d’une étude in vivo visant à évaluer des stratégies nutritionnelles sur la production de lait maternel. Il n’existe donc pas de modèle in vitro permettant le remplacement de l’étude animale. Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place de la lactation, pendant la phase de gestation.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 6 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 2 ratons mâles et 2 ratons femelles par mère pour tenir compte d’un effet sexe et d’un effet « portée ». Si un galactologue ne montre pas d’effet significatif sur la production de lait ou la croissance de la portée par rapport au contrôle dans le protocole 1, la procédure 2 ne sera pas réalisée pour ce galactologue.

Raffinement

Des mesures sont mises en place lors des différents prélèvements de sang, avec une analgésie locale de lidocaïne 2% qui sera appliqué 15 min avant l’incision. Pendant le prélèvement de lait, les femelles seront gardées sous anesthésie avec induction en boite (mélange isoflurane 4 à 5%/L d’oxygène), puis maintien au masque (mélange isoflurane 2.5 à 3%/L d’oxygène). Les rattes sont placées sur un tapis chauffant pendant pendant toute la durée du prélèvement jusqu’à leur réveil. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel agréé et seront pesés 3 fois par semaine ce qui permettra de surveiller une éventuelle perte de poids et de vérifier leur état général. Les rats sont hébergés dans des portoirs ventilés avec différents enrichissements de milieu (frisottis, tunnels, morceau de bois) afin de réduire leur stress. Les points limites de cette procédure qui conduiront à la mise à mort de l’animal seront les suivants : Pour les mères : - anomalies détectées lors de l’observation générale de l’animal : posture (dos vouté, ventre rétracté) ou masque (yeux plissés, museau gonflé) suggérant une douleur sévère ; Pour les petits : - incapacité à téter ; absence prolongée d’interaction avec la mère et l’environnement ou de réponse aux stimulations ; dégradation de l’état du poil ; perte de poids 2 jours consécutifs Pour les mères et les petits : - anomalies détectées à l’examen clinique : baisse significative du poids corporel (plus de 20% persistant pendant 72 heures) ou arrêt de la croissance pour les petits ; déshydratation sévère ; signes de défaillance des organes (détresse respiratoire, dilatation du ventre…).

Choix des espèces

L'avantage du modèle rat sur le modèle porcin utilisé dans certaines références bibliographiques est la petite taille des animaux (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures) et la rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Les mères seront commandées gestantes auprès du fournisseur (J1). Les rates seront utilisées pendant la gestation et la lactation puisque la gestation est la période au cours de laquelle la supplémentation du régime alimentaire sera testée et la lactation est la période de mesure du flux de lait. La descendance sera utilisée pendant l’ensemble de la période de lactation. Afin de déterminer l’impact des galactologues sur le métabolisme de la descendance à long terme, 2 mâles et 2 femelles par mère seront sevrés et suivis jusqu’à l’âge adulte (5 mois maximum)

720 ombles chevaliers vont être utilisés dans des procédures classées en gravité légère, 660 tués à l'issue et 60 géniteurs remis en liberté. Les géniteurs sont anesthésiés pour prélever gamètes et un fragment de nageoire, et la descendance subit des mesures de respirométrie avec un jeûne de 44 heures et un isolement temporaire. Le porteur justifie la mise à mort par le stress et la souffrance potentiels de l'expérimentation elle-même. L'objectif déclaré est d'évaluer le potentiel d'adaptation de l'espèce à une hausse de la température de l'eau.

Objectifs

Les salmonidés lacustres sont emblématiques de l'Amérique du Nord et de l'Europe. Ce sont des espèces qui ont une forte importance économique (pêche professionelle et amateur), patrimoniale et un fort interêt écologique de part leur position dans le réseau trophique. Néanmoins, les populations connaissent de nombreuses fluctuations. Les données relatives aux captures de pêche montrent des variations interannuelles fortes et irrégulière, due à plusieurs facteurs telles que la température ou l’eutrophisation. Le réchauffement climatique est l’une des principales causes pouvant expliquer ce déclin. En effet, la température influence directement la physiologie, le développement et le comportement des individus. L’objectif de ce projet sera de quantifier l’adaptation phénotypique de populations face au réchauffement climatique lors des premiers stades de vie des salmonidés. En effet, les effets de la température peuvent notamment être dépendent de l’origine des poissons, certaines populations présentant une sensibilité plus faible à une augmentation de la température, laissant apparaitre une possible adaptation. Ainsi, les études sur le réchauffement climatique suggèrent que certains organismes peuvent mettre en place des stratégies évolutives et plastiques afin d’y faire face. Spécifiquement, ce projet testera si la population d’origine et la température d’incubation (4° et 9°) influencent le phénotype des individus. Les observations seront réalisées à deux pas de temps (180 jours et 300 jours après la fécondation) sur le développement (croissance) et le phénotype (morphologie, comportement et physiologie). Ces analyses permettront d'évaluer le potentiel d'adaptation des salmonidés.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances essentielles quant au mécanismes d’adaptation des salmonidés face aux réchauffement climatique. Les résultats de ce projet détermineront la pertinence d’étudier à plus large échelle l’adaptation potentielle des organismes ayant différentes histoires évolutives. Ces connaissances pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer une aide stratégique pour la gestion du repeuplement de salmonidés.

Procédures

Les géniteurs seront anesthésiés avant le prélèvement des gamètes et de tissus (nageoire) afin de réduire le stress et empêché toute sensation de douleur. Les nageoires des poissons peuvent repousser et c’est ainsi un prélèvement non invasif. Pour la descendance, les animaux seront mis dans deux bacs (2 x 5L) connéctés afin d'être filmés (mesure comportementale). Ensuite, des mesures respirométriques seront effectué dans un récipient hermétique (200ml) pendant 20h environ ce qui limiteras sensiblement leur mouvement (la petite taille des poissons aux stades de développement étudiés, la contrainte physique due à la taille des chambre respirométrique sera limitée). Ces mesures impliqueront un jeun de 44h (mis à jeun pendant 24h avant la mesure + 20h de mesure) qui ne devrait pas impacter le développement des poissons. Un léger stress pourra être ressenti dû à l’isolement des poissons. L’eau y sera renouvelée toutes les 10min pour s’assurer que la qualité de l’eau reste bonne durant le test. Enfin, ils seront anesthésiés afin d'être placés sous un objectif photo et d'être pris en photo. Après leur réveil, ils seront ensuite replacés dans leur aquarium.

Impact sur les animaux

Durant les actes expérimentaux, le stripping sur les géniteurs induira un leger stress physique. Le prélèvement d’une petite section de nageoire sera effectué entrainant une légère lésion physique. Sur la descendance, la prise de photo pour mesurer la morphologie et vidéo pour le comportement n’impliquent qu'une légere peur dû à la manipulation physique (à l’aide d’une épuisette) des animaux pour les placér sous l’objectif photo. Les mesures métaboliques impliqueront un jeun court (léger stress alimentaire 24h de jeun + 20h de mesure), une faible contrainte de déplacement et un isolement temporaire des congénères.

Devenir

Pour pallier au stress et souffrances potentiels dû à l’expérimentation, les individus sont mis à mort à la fin de la procédure. Les géniteurs qui auront pu être manipulés sur le terrain sans être ramenés au laboratoire seront remis en liberté.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre la diminution des effectifs dans les populations de salmonidés. L'objectif est d'évaluer les effets d’une augmentation de la température en milieu sauvage dans un contexte de réchauffement climatique en prenant en compte une espèce sujette à l’augmentation de la température. Ces effets sont, de plus, problématiques d’un point de vue économique et écologique. En effet, cette étude permettra de comprendre la sensibilité au changement climatique d'une espèce avec une forte importance économique (pêche professionelle et amateur) et également écologique (prédateur). Le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il répond a une problématique spécifique. De plus, chaque espèce répond différemment aux variations environnementales, ainsi il n’est pas remplaçable ni substituable.

Réduction

Cette expérimentation prévoit 2 traitements de température (4 et 9°C) chez 3 populations avec 10 familles chacune. 20 géniteurs issus de chacun des 3 lacs ( = 3 populations) seront nécessaires pour obtenir les gamètes. Les analyses statistiques envisagées seront notamment des analyses de variances (ANOVA) et des modèles linéaires à effets mixtes (GLM). L’effectif de 10 individus par famille permet d’avoir un effectif de qualité pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses et évaluer la plasticité des traits, et les 100 individus (10ind * 10 familles) suivis dans chaque populations permettent prendre en compte la répétabilité de la variabilité interindividuelle dans chaque traitement ainsi que la variabilité entre les séries (facteur aléatoire), tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). Au total 720 individus seront utilisés à la fin de l’étude : (2 traitements * 3 populations * 10 familles * 10 individus) = 600. 600*0.1(mortalité anticipée) + (20 géniteurs * 3 populations) = 720 individus.

Raffinement

Tout au long de l’expérimentation, les structures et conditions expérimentales évolueront avec la croissance des animaux (litrage, nourriture, lumière). Les aquariums disposeront d’un couvercle afin de limiter le stress dû à la lumière. Les animaux seront visités 3 fois par jour en semaine et 1 fois par jour le week-end. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (pH, oxygène) seront vérifiés quotidiennement. Avant les mesures morphologiques, les individus seront anesthésiés afin de limiter le stress due à la manipulation. Lors des mesures comportementales, une cachette sera disposée dans l'aquarium de test afin de limiter le stress. Les géniteurs seront anesthésiés avant le stripping et le prélèvement de tissus (1/5 de la nageoire pelvienne) afin de réduire le stress et prévenir toute sensation de douleur. Les nageoires des poissons peuvent repousser et c’est ainsi un prélèvement non invasif.

Choix des espèces

Les salmonidés sont en déclin depuis plusieurs décennies, ayant des conséquences économiques, sans que les raisons de ces pertes d’effectifs ne soient complètement comprises. Bien que le réchauffement climatique soit l’une des causes de ce déclin, certaines populations se maintiennent, suggerant que certains individus puissent s’adapter. Ce projet apportera des connaissances essentielles quant au potentiel d’adaptation des salmonidés face au réchauffement climatique. Les résultats de ce projet détermineront la pertinence d’étudier à plus large échelle l’adaptation potentielle des organismes avec différentes origines. Ces connaissances pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer une aide stratégique pour la conservation des salmonidés. Pou obtenir des gamètes des animaux au stade adulte sont nécessaires, puis des poissons au stade larvaire et stade juvénile pour les mesures de morphologie, comportement et métabolisme. Ces premiers stades de vie devraient présenter des phénotypes différents selon les traitements des fluctuations de température subit durant le développement embryonnaire.