Biologie du développement

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles développent spontanément des cancers lymphoïdes, avec biopsie de la queue pour le génotypage et mise à mort à l'apparition de symptômes ou au plus tard à douze mois, pour étudier les voies de réparation de l'ADN. Le porteur indique une dégradation de l'état général et des difficultés à respirer, et surveille l'apparition de grosseurs ganglionnaires. Il affirme que les études in vitro ont "montré leurs limites" et que la souris est l'"organisme approprié" pour ce projet.

Objectifs

Les cassures doubles brins de l’ADN (DSBs) sont des lésions cellulaires toxiques qui doivent être réparées efficacement pour maintenir la stabilité du génome et prévenir le cancer. Dans les cellules de mammifères, deux voies principales de réparation existent pour détecter et ligaturer les DSBs : la recombinaison homologue (HR) et le « non-homologous end-joining » classique (NHEJ). Une troisième voie, moins bien définie, porte le nom de NHEJ alternatif (aNHEJ) et a été tout d’abord identifiée comme un système de "secours" capable de réparer les DSBs dans des cellules génétiquement déficientes pour un (ou plusieurs) facteur(s) essentiel(s) pour le NHEJ. Les cellules cancéreuses présentent fréquemment des mutations somatiques entraînant une altération des voies canoniques de réparation de l'ADN, ce qui provoque une instabilité génomique et favorise l'apparition et l'évolution des tumeurs. Dans ce projet, nous avons pour objectif d’étudier les mécanismes impliqués dans la promotion du développement tumoral en l’absence de NHEJ. Pour cela nous utiliserons des modèles murins qui développent spontanément de l’instabilité génomique et des cancers lymphoïdes proches de ceux observés chez l’Homme. Ces modèles présenteront différentes combinaisons de mutations au niveau de gènes impliqués dans la signalisation des dommages de l’ADN, (i.e. p53, ATM) et dans la voie NHEJ (i.e. Xrcc4, Shld1). Nos récents travaux in vitro indiquent que la polymérase Theta (Pol Theta), un facteur du aNHEJ, promeut la survie de lignées cellulaires lymphoïdes tumorales en l’absence de Xrcc4 et p53. Des animaux présentant en plus une déficience en Pol Theta seront donc générés afin de tester son rôle dans la tumorigénèse in vivo. L’analyse du développement tumoral et des échantillons leucémiques obtenus dans ces différents animaux nous permettra de mieux comprendre l’origine des leucémies et lymphomes humains et potentiellement de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre l’implication relative des différentes voies et facteurs de réparation de l’ADN dans l’apparition de l’instabilité génomique et la transformation cellulaire au niveau de l’organisme. A plus long terme, il pourrait nous permettre d’élargir le répertoire des stratégies thérapeutiques et d’améliorer le traitement des cancers.

Procédures

Pour l’ensemble des groupes d’animaux, une biopsie de queue sera parfois effectuée sur animaux vigiles pour vérifier le génotype. Ce geste dure quelques secondes et ne sera effectué qu’une seule fois au cours de la vie de l’animal. Pour l’ensemble des groupes d’animaux, la mise à mort sera effectuée soit par dislocation cervicale soit par exposition croissante à du CO2. Le prélèvement des échantillons leucémiques et des organes lymphoïdes sera effectués sur les animaux après la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales peuvent conduire à une dégradation de l'état général et de l’état corporel, et des difficultés à respirer.

Devenir

La procédure consiste à prélever des échantillons leucémiques et des organes lymphoïdes nécessitant la mise à mort de tous les animaux.

Remplacement

Des analyses expérimentales in vitro (protéines purifiées, extraits cellulaires, etc....) et dans des lignées cellulaires humaines, murines ou de hamster (knock-down, surexpression, transfection de mutants, etc....) ont été bénéfiques à la compréhension des mécanismes de réparation de l‘ADN et de la fonction des protéines impliquées. Cependant, ces études ont montré leurs limites pour comprendre in vivo les conséquences de la dérégulation de ces processus sur l’apparition de l’instabilité génomique et la transformation cellulaire. Pour ce faire, nous avons besoin d’une approche génétique dans un système biologique proche de celui du système immunitaire et lymphoïde humain. De ce fait, la souris est l’organisme approprié pour conduire ce projet.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduction maximale possible en se basant sur des résultats déjà publiés et suivant le test statistique log-rank test.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un environnement protégé pour réduire le risque d’infection. Elles seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Les animaux seront surveillés trois fois par semaines et seront mis à mort dès l’apparition de symptômes indiquant une condition générale de l’animal amoindrie telle que la dégradation de l’état corporel, isolement de l’animal, difficulté à respirer, position courbée, signe de stress, apparition visible d’une grosseur susceptible d’être d’origine tumorale (dans le cas de tumeurs lymphoïdes non solides : gros ganglion(s) au niveau du cou, de l’aisselle ou de l’aine, visible même sans palpation).

Choix des espèces

Mus Musculus est un modèle unique pour les travaux de recherche car il peut être génétiquement modifié, ce qui permet une analyse fonctionnelle in et ex vivo d’un gène ou d’un mécanisme donné dans un environnement génétique stable. Ce modèle permet d’étudier les effets combinés de plusieurs gènes. L’étude de chacune des lignées mutantes établies dans ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes de réparation de l’ADN et des anomalies menant à l’instabilité génomique. L’étude des voies et lésions oncogéniques des différents types de cancers lymphoïdes qui apparaitront dans nos modèles murins permettra une meilleure compréhension de l’oncogénèse des cellules lymphoïdes B et T. L’analyse de ces tumeurs et leur comparaison avec les données de séquençage des tumeurs humaines permettra la découverte potentielle de nouveaux gènes et/ou bio-marqueurs des cancers lymphoïdes. Le développement des tumeurs se fait entre 1 mois et 6 mois suivant le génotype des souris. Les tumeurs seront prélevées en respect des points critiques. Si aucune tumeur n’apparaît à 12 mois d’âge, les animaux seront mis à mort et sujets à une analyse phénotypique (autopsie).

940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intramusculaire d'un composé myotoxique sous anesthésie pour léser le muscle, certaines des injections de tamoxifène et un suivi par imagerie, avant mise à mort par surdose d'anesthésique et perfusion d'un fixateur. Le porteur étudie la régénération musculaire et les dépôts fibro-adipeux des myopathies, avec des retombées thérapeutiques présentées comme potentielles. Il décrit des méthodes in vitro de réduction, cellules immortalisées et mini-muscles humains, mais conclut qu'une validation in vivo reste "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes impliqués dans le processus de régénération du muscle squeletique sain ou pathologique chez la souris. Le muscle adulte est capable de régénérer suite à des lésions, grâce aux cellules souches musculaires (cellules satellites), ainsi qu’à l’action coordonnée des plusieurs autres cellules, parmi lesquels les macrophages, les vaisseaux sanguins, et des cellules que nous appelons « progéniteurs fibro-adipogéniques » (ou FAPs), composants clés du tissus-conjonctif musculaire. Chez un individu adulte sain, ce processus permet de maintenir la masse musculaire en réparant les microlésions liées à l’activité musculaire normale ou les lésions aigues induites par des blessures physiques. Le processus de régénération est dysfonctionnel dans divers pathologies du muscle, conduisant à une fonte musculaire accompagnée d'infiltrations de tissus fibreux et adipeux. Ces infiltrations résultent d’un comportement anormal des FAPs, qui prolifèrent en exces et se transforment en fibrose ou en adipocytes. Cette multiplication des FAPs et la transformation fibroadipeuse sont normalement inhibées dans un muscle sain, et cette protection est perdue dans certaines myopathies (comme la dystrophie Duchenne, ou la dystrophie facioscapulohumérale (FSHD)). Nous cherchons à identifier les molécules participant à cette protection naturelle. Partie 1 : Nous explorerons la contribution à ce processus du gène FAT1, dont nous avons précédemment identifié l’influence clé sur la croissance et la forme de sous-groupes de muscles pendant l’embryogénèse, et dont nous avons montré que le dysfonctionnement se produisait dans la FSHD. Nous examinerons comment l’inactivation du gène FAT1 dans les FAPs chez la souris perturbe la régénération musculaire induite par une lésion, et evaluerons si elle conduit à l’apparition de dépots fibro-adipeux. Partie 2 : Grace à une recherche de candidats basée sur des données publiées issues de modèles humains et murins de dystrophies musculaires, nous avons identifié des molécules caractéristiques des FAPs, produites en quantité augmentées ou réduites dans les pathologies musculaires avec infiltrations fibro-graisseuse. La liste de candidats sera complétée avec les résultats de la partie 1. Nous testerons l’implication de ces candidats dans les formations fibro-adipeuses, en etudiant leurs fonctions a) in vitro dans des cultures primaires de FAPs de souris ; puis b) in vivo chez la souris.

Bénéfices attendus

L’apparition de dépots fibro-adipeux dans les myopathies marque un stade de non-réversibilité des symptomes. Ces dépots changent les propriétés physiques du muscle, et compromettent l’efficacité du processus régénératif, non seulement spontanné, mais aussi thérapeutique, en empêchant de nouvelles fibres de s’intégrer ou même de se contracter. Ainsi, il est essentiel d’identifier les moyens de bloquer l’apparition ou la progression des dépots fibro-adipeux, afin de retarder l’évolution des symptomes chez les patients, et leur permettre de bénéficier de thérapies inovantes. Partie 1 : L’identification d’un gène tel que FAT1, régulant le développement et la régénération des muscles, et dont nous suspectons que le dysfonctionnement participe à l’apparition des symptomes de la FSHD, a fourni une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Divers éléments permettent d’anticiper que l’inhibition de FAT1 dans les FAPs sera détrimentaire au fonctionnement normal des FAPs, pourrait empecher une bonne régénération et favoriser l’apparition de dépots fibro-adipeux dans les muscles lésés. En confirmant cette hypothèse et clarifiant les mecanismes, nos résultats feront émerger de nouvelles options thérapeutiques qui pourraient à terme, bénéficier aux patients. Partie 2 : Le projet permettra d’identifier, parmi les protéines présentes dans les FAPs et produites en quantités anormales dans les pathologies avec dépots fibro-adipeux, ceux qui sont responsables de la formation de tels dépots. Nous obtiendrons dans un premier temps la preuve de principe que reproduire un changement observé dans les pathologies est suffisant pour induire ces dépots. Dans un deuxieme temps, nous déterminerons si corriger une ou plusieurs anomalies dans les modèles de pathologies (in vitro, puis in vivo) est suffisant pour empêcher, retarder ou ralentir la formation des dépots fibro-adipeux. Pour toute molécule remplissant ces deux critères, la correction (deuxième étape) est susceptible d’améliorer les symptomes musculaires chez les patients, et de maintenir les muscles dans un état leur perméttant de bénéficier de thérapies innovantes favorisant la formation de nouvelles fibres saines et fonctionnelles.

Procédures

Le projet comporte 3 procédures, impliquant de 2 à 4 étapes. La procédure de lésion par injection intramusculaire (concerne toutes les souris) est une chirurgie faite sous anésthésie générale, et permettant une injection intramusculaire ciblée d'un composé myotoxique. Elle dure environ une heure, et ne sera effectuée qu'une seule fois pour chaque animal, sur tous les animaux impliqués dans le projet. Etapes ne concernent que des sous-groupes d'animaux. - injection en IP de Tamoxifen (modèles inductibles), une à 5 injection par animal, une fois tous les 2 jours (ou une seule injection lorsque pratiquée à P1). - suivi longitudinal par imagerie non invasive (étape sous anesthésie, procédure 3, répétée 3 à 5 fois pour chaque animal), - Mise à mort par surdose d’anesthésique suivi d’une perfusion intracardiaque de PFA : procédure sans réveil faite sous anesthésie profonde, une seule fois par animal. Gestes visant à réduire la souffrance : Anesthésie (injection IP), injection sous-cutanée d’antalgiques ou d’anesthésie locale. Ces gestes sont pratiqués en préparation de la chirurgie/Lésion, ainsi qu’avant la procédure de mise à mort par perfusion.

Impact sur les animaux

L’injection dans le muscle de composés myotoxiques induit une blessure limitée dans le temps et restreinte au seul muscle injecté. Pendant 3-4 jours, une inflammation (nécessaire pour la cicatrisation) se produit au niveau du site d’injection, puis s'estompe d'elle même. L'expérience a un impact limité sur les conditions de vie de la souris, même lorsque les modifications génétiques étudiées compromettent l'efficacité de la réparation. Dès le lendemain, les souris ont récupéré une activité/locomotion normales. Le fait d'utiliser des modèles génétiques dits « inductibles » (déclenchement par le Tamoxifen) evite que les effets des modifications étudiées commencent avant le demarrage de la procédure expérimentale. Toutes les lignées nécessaires au projet sont élevées dans notre animalerie, et les cohortes expérimentales sont produites par croisements. Les lignées utilisées ne présentent aucun phénotype dommageable lorsque maintenues séparément. Lorsque ces lignées sont combinées : 1) les lignées utilisées pour visualiser les cellules mutantes (grace à un marquage par une protéine fluorescente) ou pour rendre les cellules modifiables par les adenovirus, n’ont pas d’effets dommageables car les protéines introduites n’ont pas de cibles naturelles chez la souris. 2) L’utilisation des systemes inductibles par le Tamoxiden permet que la modification génétique désirée ne commence qu’au démarrage de l’expérience. Il n'y a donc ni douleur ni souffrance avant la procédure expérimentale. L’expérience est terminée en maximum 3 semaines (les douleurs locales étant limitées aux 3 premiers jours), et est écourtée en cas de problemes inattendus. Nous n’attendons pas d’anomalies majeures ailleurs que dans le muscle. 3) Certaines souris utilisées présentent de légères anomalies de forme de certains muscles, non-dommageables car les muscles affectés ne sont pas vitaux (le diaphragme n’est pas touché). Ces souris ont une durée de vie normale, et ne présentent aucun signe de souffrance. 4) Le modèle de souris FSHD a été choisi pour son caractère inductible, limitant la toxicité de la proteine DUX4 (agent causal de la FSHD), à la durée de l’expérience. Même le Tamoxifen devait déclencher dans ces souris des anomalies en dehors du muscle, cela se produira dans le temps de l’expérience, et nous veillerons à écouter le suivi longitudinal si nécessaire, et les expériences effectuées pourraient (de par leur objectif) identifier un moyen de diminuer ces anomalies.

Devenir

La procédure se termine par une mise à mort des animaux visant à prélever les tissus (muscle lésé, ainsi que certains organes supplémentaires). Ces tissus sont soit fixés pour de l'histologie, soit dissociés afin de mettre les cellules en culture. En conséquence tous les animaux utilisés pour ce projet sont mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

1) Afin d'éviter des expériences inutiles chez l'animal, nous commençons par exploiter des données publiques déjà disponibles (analyses déjà publiées de biopsies de patients ou de modèles « souris ») pour identifier des mecanismes potentiellement responsables du remplacement de la masse musculaire par des dépots fibro-adipeux dans les pathologies musculaires. 2) Le projet implique une étape basée sur des cultures de cellules isolées à partir de souris. Afin de limiter au maximum l’étape d’isolement à partir de souris, nous développons une méthode alternative utilisant des cellules « souches » humaines (lignées déja établies par d'autres laboratoires), dont le caractère « souche » permet une utilisation répétée/prolongée. En mimant in vitro les étapes du développement du muscle, nous induirons la formation de « mini-mucles » reproduisant autant que possible le contexte physiologique. Une fois optimisée, cette approche sera une alternative efficace pour remplacer les cellules de souris et pour toutes les études-pilotes concernants la compréhension des mécanismes en jeu. 3) Une fois que nous aurons identifié in vitro des molécules susceptibles d’être responsables de l’apparition des dépots fibro-adipeux dans les muscles malades, et que nous aurons montré avec succès que contrer leur action a un effet thérapeutique, il sera néanmoins nécessaire de valider ces résultats in vivo, en passant par un modèle animal. En effet, les modèles in vitro (cellules de souris ou mini-muscles humains), aussi puissants soient ils, ne reproduisent pas l’ensemble des événements mis en jeu dans la réparation musculaire normale ou pathologique. Il est difficile par exemple de reproduire le contexte de la blessure, de l’inflammation, de l’irrigation sanguine, et l’influence du métabolisme des individus malades. Ainsi, un mécanisme efficace in vitro pourrait s’avérer inefficace chez l’animal ou chez l’homme. Il est donc indispensable de déterminer, parmi les approches validées in vitro, lesquelles sont les plus susceptibles d’être efficaces chez l’homme en passant par une étape en modèle animal. Cette validation ne portera cependant que sur des cas pour lesquels nous aurons obtenu une preuve de principe in vitro, limitant largement l’ordre de grandeur des tests in vivo.

Réduction

1) La manière dont nous procédons pour l’histologie (partie 1) permet qu’un même échantillon soit réutilisé pour plusieurs analyses, réduisant ainsi le nombre d'animaux. En effet les tissus prélevés (muscles) sont divisés en plusieurs fragments congelés/stockés séparéments. Sur chaque fragment de tissus, nous réalisons des coupes alternées sur plusieurs séries de lames histologiques. Nous réalisons une base de données permettant l’optimisation de l’utilisation de ces échantillons/lames. Ainsi, un seul muscle d’un seul animal peut servir à des dizaines de tests différents. Une seule cohorte d’animaux (comprenants les souris étudiées et les controles adequats) suffit pour réaliser l’ensemble de l’étude pour un stade donné d’analyse. Les nombres d’animaux dans chaque cohorte (5-10 souris par lot (incluant males et femelles)) sont nécessaires pour l’obtention de résultats statistiquement robustes (tests statistiques considérés significatifs si p

Raffinement

1) Les souris sont hébergées en cages ventilées, avec enrichissement (dôme ou rouleau de carton + baton de papier ou carré de coton pour nidification). Elles sont suivies quotidiennement pour vérifier la nouriture et l'eau, ainsi que leur état de santé et leur bien être. 2) Pour la chirurgie, les souris sont anesthésiées par injection intra-péritonéale. Au préalable, elles recoivent des prémédications visant un effet antalgique (30 minutes avant l'anesthésie) at une anesthésie locale. La peau au niveau de la zone à opérer est rasée et aseptisée par application de solution antiseptique. 3) Nous avons défini des points limites nécessitant interruption anticipée d'une procédure: Une perte de poids dépassant 20% par rapport au poids de reference (poids à l'entrée dans la procédure) est considérée comme limite au dela de laquelle l'expérience est interrompue et l'animal est euthanasié. Par ailleurs, comme un des produits utilisés peut, dans de rares cas, liés au lot ou à la préparation, s’avérer toxique et déclencher une inflammation dans le foie, nous surveillerons le poid des animaux après injection, et fixons à 15% de perte par rapport au poids initiale la limite au dela de laquelle ces effets secondaires sont susceptibles d’interférer avec l’expérience. Dans ce cas, les animaux seront exclus de la cohorte et mis à mort. D'autres parametres d'exclusion sont: pelage hérissé; infection de la cicatrice; immobilité et indifférence à l'environnement, tremblements. 4) Nous utiliserons des tests statistiques adequats pour les comparaisons entre cohortes d’animaux (cohortes test et controles appropriés, males/femelles, differentes approches) avec 5 à 10 souris par cohorte et par stade d’analyse.

Choix des espèces

La souris est un modèle particulièrement adapté à l'étude de la regeneration du muscle. La dynamique du processus est bien connue suite à différents modèles de lésions (cardiotoxine, brulure au froid, glycerol, barium, ces modèles différant légèrement les uns des autres). La regeneration est rapide, et complete en 3 semaines, sans séquelles dans des souris sauvages. La souris permet l'utilisation de modèles génétiquement modifiés élaborés de telle sorte qu'il soit possible de definir précisément le type cellulaire dans lequel un gène est modifié et le moment à partir duquel cette modification est déclenchée. Ceci permet de limiter le dommage au seul organe/tissus considéré. L'utilisation des modèles génétiquements modifiés ainsi que des vecteurs adénoviraux permet d'explorer les mécanismes génétiques et de tester l'effet de nouvelles modifications génétiques, et d'evaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Aucun modèle cellulaire/ex-vivo humain ne reconstitue l’environnement du muscle suffisamment pour valider la pertinence in vivo d'un mécanisme ou d'une option thérapeutique. Stades d’utilisation : 1) L’Induction par le Tamoxifen (modèles inductibles) est faite soit 1 jour après la naissance (P1), soit au stade adulte, un peu avant et juste après la lésion. Pour obtenir une meilleure efficacité de recombinaison, il est justifié d'acriver la CRE au moment coincidant à un pic d'expression (nombre de cellules et intensité) de la lignée CRE utilisée, basée sur le territoire d’expression du gène PDGFRA. PDGFRA est fortement exprimé pendant la première semaine après la naissance. Chez l’adulte, PDGFRA est produit par les FAPs, mais ces derniers sont « dormants », et en faible nombre. La lésion provoque une augmentation de l’intensité d’expression, et active fortement la multiplication des FAPs. En conséquence, le meilleur moment pour activer la lignée avec le Tamoxifen est juste au moment de la lésion. 2) injection intra-musculaire (lésion/Adenovirus) : Souris Adultes (3 à 6 mois). 3) Suivi longitudinal de la lésion (par imagerie bioluminescence), à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions, pour suivre l'évolution de la régénération musculaire dans une fenetre correspondant aux résultats de la litérature, et pour évaluer l'impact des conditions expérimentales sur l'apparition d'infiltrations fibro-adipeuses. 4) mise à mort (à l’issue du suivi longitudinal ou à un stage post-lésion donné (à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On provoque une inflammation chez des femelles gestantes porteuses d'une mutation, pour observer les effets sur le développement nerveux des embryons, avec suivi par échographie. Le porteur indique que l'injection peut induire un développement anormal in utero et une mise bas prématurée. Il affirme qu'il est impossible de remplacer ce modèle muté, les retombées cliniques étant renvoyées à une meilleure compréhension des pathologies.

Objectifs

Lorsque des infections sont contractées durant la grossesse, il en résulte l’apparition de davantage de pathologies du neuro-développement (PND), autisme, paralysie cérébrale, schizophrénie etc. Ces pathologies sont dues en particulier à un développement anormal du système nerveux. De plus, les naissances prématurées qui peuvent s’y ajouter sont un facteur également aggravant. Il a récemment été montré que des anomalies de motricité apparaissent précocement, avant que les anomalies cognitives ne puissent être diagnostiquées. Des travaux récents ont mis en évidence des mutations dans certains gènes, qui jouent un rôle crucial dans le développement du système nerveux central, et qui sont impliqués dans de telles pathologies neuro-développementales. L’existence simultanée d’une inflammation placentaire accentuerait les conséquences de ces modifications génétiques. Lors d’infections au cours de la grossesse, une inflammation du placenta peut être décelée et impacter le développement des embryons. En cas de fragilités génétiques dues à des mutations chez certains embryons, le développement normal du système nerveux est perturbé, ce qui peut conduire à différentes pathologies neurodéveloppementales. Nous provoquerons une situation d’inflammation chez la souris gestante, et nous analyserons l’effet de mutations dans les embryons sur : (i) des marqueurs inflammatoires présents dans les fluides amniotiques des portées, (ii) le développement neuro-anatomique du système nerveux, (iii) de l’appareil neuro-moteur dont les masses musculaires, ainsi que (iv) le développement du placenta.

Bénéfices attendus

Le gène étudié permet la transmission de signaux de l’environnement en permettant notamment le développement embryonnaire du cerveau. Son étude dans des modèles de souris nous permettra d'obtenir une meilleure compréhension des signaux moléculaires et cellulaires et des facteurs multiples conduisant aux pathologies neuro- développementales dans le contexte inflammatoire de la grossesse. Elle devrait également conduire à une amelioration du pronostic des troubles précoces du développement neuro-moteur.

Procédures

Les souris seront accouplées pour déclencher une gestation. Les accouplements seront réalisés jusqu’à l’obtention de 6 souris gestantes par groupe. Les souris suivies subiront 4 examens d'imagerie non invasive pour le suivi des gestations sous anesthésie générale ne dépassant pas 20 minutes. Au cours de cette gestation, une réponse inflammatoire suite à une seule injection (durée maximale : 30 sec) sous-cutanée d’une molecule déclanchant l’inflammation sera générée pouvant entraîner des défauts de développement in utero.

Impact sur les animaux

Impact de l’agent inflammatoire sur l’état général des souris : une vigilance sera portée sur l’inflammation provoquée, même si des conséquences telles que l’hypothermie sont peu probables aux doses faibles utilisées ici (jusqu’à 40 fois moins que les doses rapportées). Il est attendu que les injections d’un composant bactérien, qui provoque de l’inflammation, induisent un développement anormal des embryons in utero et une possible mise bas prématurée.

Devenir

Mort pour utilisation des tissus : analyses anatomiques et dosages immunologiques.

Remplacement

Il est impossible de remplacer ce modèle murin porteur d’une mutation constitutionnelle pour le gène d’intérêt, mais des études en culture ont permis de montrer son rôle sur le développement de certaines structures du système nerveux. Par ailleurs, nous avons déjà identifié des toxines utilisables en culture cellulaire pour renforcer certains des résultats que nous aurons obtenus dans les souris.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe sera de 6 pour atteindre une robustesse statistique. L'échographie non invasive permettra de déterminer in utero l'apparition d'une létalité dans les portées et de préciser à quel stade elle apparaît, évitant une mise à mort séquentielle des femelles gestantes au cours de la gestation, comme cela est habituellement le cas pour les études de mortalité in utero. Ce suivi nous permettra également d’éviter d’engager une inflammation dans des femelles n’ayant pas ou trop peu de petits.

Raffinement

L'échographie non invasive permettra de caractériser in utero plusieurs paramètres fonctionnels (fréquence cardiaque, flux sanguin et résistance hémodynamique) en plus des informations anatomiques (rapport périmètre cranial / périmètre abdominal). A partir des expériences préliminaires, nous établirons rapidement le timing auquel l’injection sera réalisée (précoce ou tardive) pour n’effectuer dans un premier temps l’étude que sur le stade d’injection qui donne les résultats les plus évidents. Les échographies seront faites sous anesthesie, et nous avons établi une grille qui nous permet d’évaluer l’éventuelle détresse et souffrance des animaux et de les supprimer ou soulager et ainsi d’améliorer leur bien-être. Les conditions d’hébergement seront optimisées en évitant l’isolement des animaux et leur maintien en groups sociaux dans des cages enrichies de cylindres en carton.

Choix des espèces

Choix du modèle murin : le modèle de souris a été choisi car il permet d’étudier les conséquences durant le développement embryonnaire de l’absence d’expression d’une protéine. Modèle mammifère, adapté pour les études à visée clinique : études sur la reproduction/gestation, rôle du placenta. Reproduction rapide, fond génétique homogène, nombre important d’animaux dans une même portée, avec des génotypes différents, permettant une comparaison interne fiable. Nombre de publications ont récemment rapporté que les mutations murines introduites miment la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à pour les études anatomiques du système nerveux, la mise en place des motoneurones qui a lieu précocement et le développement des masses musculaires.

360 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit vers la naissance une électroporation du cerveau sous anesthésie, puis est tué entre deux et quinze jours plus tard pour prélèvement du cerveau. Le projet étudie les mécanismes de production des cils dans les cellules du cerveau. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'effet nuisible de cette technique et juge les cultures cellulaires insuffisantes pour reproduire ce contrôle in vivo.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la production des centrioles et des cils dans les cellules multiciliées épendymaires dans le cerveau des souris au stade postnatal. Dans ce contexte nous étudierons la fonction de protéines que nous avons préalablement sélectionnés à partir d’expériences réalisées in vitro en culture cellulaire. Des animaux de phénotype sauvage (CD1) seront utilisés pour étudier l’impact de la surexpression ou de l’inhibition de cette protéine en utilisant la technique d’électroporation in vivo de cerveaux postnataux.

Bénéfices attendus

Notre projet est d'une grande pertinence pour le domaine des cellules multiciliées (MCC) : - Un des grands défis dans ce domaine de recherche concerne le contrôle du nombre final de cils dans les MCC individuelles, qui est la clé de l'émergence de leur fonction physiologique. La réponse à cette question ne sera possible que lorsque les mécanismes de production et d'élimination des centrioles seront bien compris. Ce projet fera la lumière sur ces processus de ouvrant de nouvelles voies pour aborder la façon dont le nombre de centrioles est contrôlé. - La multiplication des centrioles dans les MCC et la duplication des centrioles au cours du cycle cellulaire font intervenir des principes de régulation communs. Ainsi, le domaine plus large de la biologie des centrioles bénéficiera à l'avenir d'études sur les MCC comme celle proposée ici. Notre projet est également pertinent pour la santé humaine : - Les maladies respiratoires chroniques, tuent plus de 4 millions de personnes chaque année. Malgré la mortalité associée à ces maladies, une compréhension de la pathogenèse reste incomplète. Nos résultats fourniront des informations importantes sur les mécanismes qui sous-tendent ces pathologies. - La compréhension des règles qui contrôlent le nombre de centrioles dans les MCCs pourrait également être tout à fait pertinente dans le domaine du cancer ou une multiplication aberrante de centrioles est parfois observé.

Procédures

Les nouveaux-nés P0-P1 anesthésiés seront soumis à une procédure d’électroporation in vivo du cerveau afin de modifier l’état génétique des précuseurs des cellules multiciliées. Cette procédure dure 1 à 2 min et sera réalisée une fois par animal sur 360 animaux.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 15 jours après. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’année et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur la santé et le bien-être des animaux. L’électropration que nous utilisons dans ce projet induit la diminution de l’ARN cible seulement dans quelques cellules du cerveau après la naissance, ce qui n’entraine aucun effet dommageable sur l’animal.

Devenir

A la fin de la procédure (P5 ou P15), les animaux seront euthanasiés pour prélèvement du cerveau et analyse des paramètres des cellules multiciliées par immunofluorescence.

Remplacement

Les modèles de lignées cellulaires de cellules multiciliées (Cellules epitheliales de trachée humaine, culture primaire de cellules épendymaires de souris, culture primaire de cellules de trachée de souris) ne récapitulent pas le contrôle sticte de production des centrioles multiples observé in vivo. Notamment le nombre de centrioles généré par les cultures de cellules ependymaires sont deux à trois plus élevé que le nombre de centriole observés in vivo. Ainsi, la production des centrioles multiples est contrôlée par des facteurs intrinsèques mais également par des facteurs extrinsèques. Ce contrôle cellulaire non autonome lié à l’environnement cellulaire ne permet pas d’utiliser des systèmes de culture cellulaire in vitro pour étudier ce processus en contexte physiologique. Il est donc nécessaire d’effectuer des approches fonctionnelles in vivo chez la souris. Avant le début des analyses fonctionnelles in vivo, la présence de nos candidats dans les structures cellulaires relevantes pour le processus de production des centrioles multiples a été évaluée par des approches biochimiques sur des lignées cellulaires.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules multiciliées dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette approche par électroporation in vivo est utilisée depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires est estimé afin d’atteindre une différence significative (p

Raffinement

Les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 6 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Pendant l’expérimentation, les souris sont traitées par des soins pré-opératoires (pommade lidocaïne) et la phase de réveil post-anesthésie se fait en condition de température optimale. Après l’expérimentation, les souris sont hébergées au calme dans une salle post- opératoire dédiée avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Ils font l’objet d’une surveillance quotidienne par les opérateurs pour vérifier la récupération dans les jours qui suivent l’application de la procédure. En cas de souffrance détectée (grille d’évaluation en Annexe 1), des antalgiques sont administrés (buprenorphine 0,1mg/kg, voie intra-péritonéale). Si les signes de souffrance persistent les animaux seront euthanasiés. Tout au long de l’expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété, agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, noter les observations faites et les actions entreprises.

Choix des espèces

La souris est le modèle mammifère utilisé par la communauté́ scientifique pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation des cellules multiciliées et qui sont conservés chez l’homme. De plus il permet des manipulations génétiques, soit par l’utilisation d’animaux transgéniques soit par modification ciblée de l’information génique des précurseurs des cellules multiciliées in vivo dans le cerveau. Les animaux seront utilisés au stade post-natal P0/P1 car Les précurseurs des cellules multiciliées ne sont accéssibles qu’aux stades P0-P1. Les animaux seront analysés à différents temps après électroporation de P5 à P15 correspondant aux différentes étapes de maturation des cellules multiciliées.

245 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale sous anesthésie avec injection de cellules souches dans les testicules, pour y induire des tumeurs et vérifier que ces cellules reprogrammées gardent leur capacité à se différencier. Le porteur indique que les sutures peuvent provoquer des blessures que l'animal s'inflige lui-même, ainsi qu'une perte de poids, et que les souris sont mises à mort au plus tard huit semaines après l'injection. Il présente les retombées pour la médecine régénérative comme "cruciales" tout en les renvoyant au conditionnel, et conclut que la démonstration ne peut être réalisée sans recours au modèle animal.

Objectifs

Au début du développement, les cellules de l’embryon ne sont pas spécialisées dans une fonction. Ces cellules dites « souches » vont ensuite acquérir des identités spécialisées et devenir par exemple des cellules du muscle ou des neurones. La possibilité de changer l’identité établie de cellules, par des procédés expérimentaux appelés reprogrammation, génère des espoirs en médecine régénérative. Il est possible de former des cellules souches induites à partir d’une autre cellule, un fibroblaste. Au cours de ce processus les cellules perdent leur identité et passent dans un état particulier qui leur permettra de devenir souches. Deux gènes ont été identifiés et semblent être impliqués dans la régulation de l’identité cellulaire au cours de la reprogrammation. Leur présence ou absence affecte l’efficacité de la reprogrammation. Nous souhaitons alors étudier comment la présence ou l’absence de ces deux facteurs dans la cellule de départ affecte l’acquisition des propriétés souches dans les cellules reprogrammées. Dans le cadre du projet différents types de cellules avec des identités spécialisées sont reprogrammées en cellules souches induites. Le potentiel souche des lignées de cellules souches induites obtenues doit être ensuite confirmé par des tests chez l’animal, qui consistent en l’injection de cellules souches induites chez la souris adulte afin d’induire des tumeurs bénignes. Ces tumeurs ne disséminent pas et sont constituées, non pas de cellules cancéreuses, mais de cellules souches induites qui auront changé d’identité. L’enjeu principal de ces tests est donc d’identifier les types cellulaires spécialisés une fois la tumeur bénigne formée, grâce à des analyses au microscope des tumeurs collectées.

Bénéfices attendus

L’identification des régulateurs de l’identité cellulaire et la compréhension de leur mode de fonctionnement au cours de la reprogrammation serait de grande importance pour la médecine régénérative. Ces connaissances seront cruciales afin de générer des cellules de haute qualité avec une bonne efficacité. De plus, les cellules souches induites contribuent largement dans le domaine de modélisation des maladies et le développement des stratégies thérapeutiques. Par ailleurs des mécanismes peuvent être conservés dans des modèles de cellules souches à l’origine de pathologies humaines telles que le cancer. En conséquence, approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent l’identité des cellules souches induites présente aussi un enjeu pour la cancérologie. Les travaux in vitro nous ont permis d’identifier deux nouveaux régulateurs limitant ou favorisant la génération des cellules souches induites en partant de différents types de cellules spécialisés. Nous sommes en train d’identifier le réseau de gènes régulé par chacun de ces deux facteurs. Pour approfondir ces résultats nous souhaiterons donc étudier in vivo comment ces gènes pourront affecter les propriétés des cellules souches induites et donc mieux comprendre leur mode de fonctionnement.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique procédure chirurgicale d'une durée de 20 min sous anesthésie générale et traitement antalgique pour éviter toute douleur. La procédure consistera en une incision au niveau de l’abdomen et une injection des cellules en suspension dans les testicules des animaux en conditions stériles. L’abdomen sera ensuite refermé et l’animal sera suivi post-réveil de l’opération ainsi que tout au long de la formation des tumeurs.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui sont attendus pour les animaux sont ceux qui peuvent découler : i) de la procédure chirurgicale (inflammation, infection et douleurs localisées), ii) de la présence de sutures cutanées qui peuvent entrainer des blessures cutanées à posteriori causes par l’animal lui-même par démangeaisons iii) de douleurs et de modifications du comportement de la souris (perte de poids) liées à la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale dès l'atteinte des points limites ou après une période maximale de 8 semaines après l'injection des cellules souches dans les testicules. Les testicules seront ensuite prelevées et une analyse histologique sera faite au sein de nos laboratoires.

Remplacement

Jusqu’à présent, le projet a complètement été mené grâce à des expériences sur cellules murines en culture, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Néanmoins, afin de pouvoir conclure sur ces résultats et pouvoir les publier, il est nécessaire de démontrer par d’autres approches, que les cellules souches induites maintiennent leur capacité de générer toutes les cellules de l’embryon. Cela ne peut être réalisé sans le recours à des modèles animaux.

Réduction

Le nombre de souris injectées sera réduit à 245 (49 groupes de 5 souris) pour les raisons suivantes : - Le choix des testicules comme site d’injection permet de doubler le potentiel de développement de tumeurs bénignes sans augmenter le nombre d’animaux. - Le résultat attendu de ce projet est l’observation qualitative de cellules/tissus spécialisés au sein des tumeurs mais nous ne recherchons pas d’effet statistique, permettant ainsi de réduire la taille des groupes d’animaux. Notre expérience antérieure nous permet de prédire que 2 souris sur 3 injectées avec des cellules souches développent des tumeurs. Ceci, combiné aux données de la littérature, nous permet de réduire le nombre de souris receveuses à 5 par condition pour obtenir un nombre suffisant de tumeurs analysables et ne pas reproduire l'expérience inutilement.

Raffinement

Durant toute la procédure, et en particulier dès le réveil post-chirurgie, les souris seront observées régulièrement (3 fois par semaine) afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées. De plus, anesthésiques et analgésiques seront utilisés avant, pendant et après la procédure opératoire.

Choix des espèces

L’ensemble du projet est focalisé sur l’étude de la biologie des cellules souches de souris. Il nous apparaît donc opportun de réaliser les expériences de formation de tumeurs bénignes chez la même espèce afin de récapituler au mieux les voies de signalisations qui vont induire la différenciation des cellules souches induites dans les tumeurs. Toutes les expériences seront réalisées avec des souris adultes de 6 à 8 semaines, qui est l'âge habituellement utilisé pour l’induction de ces tumeurs bénignes.

1 764 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie crânienne de deux heures puis une injection d'anticorps dans le cerveau, d'autres reçoivent des injections répétées de psychotrope pour reproduire des symptômes de schizophrénie, à l'âge adulte ou dès la naissance, avant des tests comportementaux d'exploration et de réaction à des sons. Le porteur teste des anticorps issus de lamas censés cibler une protéine liée au glutamate, et renvoie les retombées pour les patients au conditionnel. Il affirme que le volet comportemental force le recours à la souris et conclut que le remplacement n'est pas possible.

Objectifs

La schizophrénie est une maladie psychiatrique hautement invalidante touchant environ 1% de la population. La recherche actuelle suggère que le glutamate, messager majeur dans le cerveau, est lié à la maladie quand il est trop concentré, mais les essais jusque là ont échoué à cause d'actions mal ciblées à l'origine d'effets secondaires. Une famille de protéines permet cependant de réduire les quantités de glutamate localement, ce qui diminue les risques d’effets secondaires. Nous avons montré que des petits anticorps provenant des lamas pouvaient réduire les symptômes de la maladie chez la souris en ciblant un type de protéine de cette famille. Dans cette étude, nous cherchons à observer les effets de nouveaux anticorps ciblant un autre type de protéines de cette famille, pour potentiellement trouver des résultats similaires par une autre voie. Pour ce faire, nous les testerons chez des souris modèles reproduisant différent symptômes puis enfin sur des souris modèles ne possédant plus la cible de nos anticorps, en contrôle.

Bénéfices attendus

L'utilisation des petites molécules thérapeutiques a historiquement été limitée à cause de leur manque de précision. Nos anticorps, eux, ciblent exclusivement leur cible, ce qui en fait des agents thérapeutiques prometteurs. De plus, cibler le système du glutamate permet de s’attaquer directement à la source de la maladie, plutôt que de se limiter au traitement supericiel de certains symptômes d’hallucinations et de délires tel que le font les traitements actuels. Adresser de manière complète le problème permettrait de réduire tous les symptômes, en particulier cognitifs et/ou de l’humeur, ce qui serait un immense pas en avant pour les patients et limiterait les interruptions de traitement.

Procédures

Dans un premier temps, l’activité de nos anticorps sera évaluée après injection dans le cerveau, ce qui nécessite d'une part une chirurgie crânienne d'une durée de deux heures par animal, et d'autre part une injection unique sur vingt minutes. Si nos anticorps parviennent à passer directement dans le cerveau depuis le sang, cette procédure pourra être remplacée par une injection simple en périphérie (moins de cinq minutes). En ce qui concerne nos modèles, ils se basent sur l’injection régulière (moins de cinq minutes) de psychotrope soit sur deux semaines (une fois par jour) à l’âge adulte soit sur une semaine (un jour sur deux) chez le nouveau-né. Les tests comportementaux seront non invasifs et non douloureux avec de l'exploration d'arène et des réactions aux stimuli sonores sur deux ou trois jours, pour un total de deux heures pour chaque test, soit six heures par animal pour réaliser tous les tests. Tous les animaux à la fin des expériences seront mis à mort par injection d’anesthésique suivie d’une perfusion pour fixer les tissus et récupérer le cerveau.

Impact sur les animaux

Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. La chirurgie présente des risques de mort lors de l’anesthésie, ainsi que de gêne et de douleur suite à l’opération. Les modèles murins de schizophrénie seront mis en place par des injections répétées de psychotrope au stade adulte ou au stade nouveau-né. Outre la douleur des injections, ces modèles impliquent des difficultées de mobilité, de mémoire, et de sociabilisation (sans agressivité). D’après les données chez l'animal obtenues par nos collaborateurs, aucun signe de souffrance n’est attendu après unique injection d’un anticorps. Les anticorps qui seront évalués dans cette étude n'ont pas d'effets indésirables attendus après injection unique.

Devenir

Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau pour des analyses sur les tissus.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas possible pour cette étude. Les anticorps développés jusque-là ont une cible murine et, bien que leurs caractéristiques aient été décrites en laboratoire, les aspects les plus complexes (circulation dans le système, délai d’action, durée de l’effet) ne peuvent être reproduits. L'étude se concentre de plus sur un trouble psychique dont les mécanismes ne sont pas bien décrits, mais pour lesquels la littérature présente plusieurs modèles murins représentant bien différents symptômes de la maladie. L'aspect comportemental de ce projet, à l'heure actuelle, force l'utilisation de l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude a été déterminé afin de minimiser l'utilisation de l'animal tout en assurant la pertinence statistique des études réalisées par la suite, en prenant en compte des variabilités attendues car observées dans des travaux similaires et les risques de pertes liés à la chirurgie. Si, au cours du projet, les variabilités observées sont plus faibles, les groupes seront réduits en conséquence. Mâles et femelles seront utilisés, car les modèles murins de schizophrénie utilisés ne présentent pas de variabilité en fonction du sexe. Les nanobodies injectés auront déjà été sélectionnés pour leurs caractéristiques in vitro. Pour chaque étape, les nouveaux résultats permettront de réduire la sélection. Les mêmes animaux seront observés à travers différents tests comportementaux.

Raffinement

Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. Tous les animaux suivront une période de cinq jours d’habituation à la manipulation et aux tests afin de réduire au maximum le stress lié au contact humain et à l’environnement d’étude. Des groupes d’animaux subiront des chirurgies et seront donc endormis profondément par l'utilisation d'anesthésiques appropriés et leur douleur sera traitée avec des anti-douleurs afin de minimiser la souffrance et la mortalité des animaux. Des mesures préventives aux impacts secondaires de la chirurgie (baisse de température, déshydratation, sécheresse des yeux) seront mises en place, avec une semaine de récupération sous surveillance quotidienne. Les résultats actuels ne permettent pas d’affirmer que nos anticorps entrent dans le cerveau d’eux même, mais une étude parallèle est prévue, et si l’injection directe est possible elle sera alors favorisée pour limiter la souffrance animale. Les injections de psychotropes, outre la douleur de la piqûre, induisent des déficits de mobilité et de mémoire qui seront surveillés en fonction de l'âge de l'animal pour identifier aussi tôt que possible toute souffrance non prévue par l'étude. Les données obtenues par nos précédents collaborateurs suite à un traitement aigu avec ces anticorps ne montrent pas de signe de souffrance supplémentaire à l’introduction de l’aiguille chez l’animal. Le comportement des animaux sera évalué via une grille de score de douleur à chaque étape pour intervenir au plus tôt en cas de signes de souffrance plus importants que prévus dans le cadre des manipulations. Un score élevé nous amènera a contacter la structure de bien être animal pour prendre la décision d'utiliser des anti-douleurs ou euthanasier l'animal.

Choix des espèces

Les anticorps produits jusque-là visent des cibles murines avec une forte spécificité et les modèles d'intérêt pour la schizophrénie sont particulièrement bien documentés chez la souris. Afin d’identifier rapidement les composés ayant un potentiel thérapeutique, nous avons décidé d’utiliser d'abord un modèle rapide pour évaluer un symptôme simple de la maladie. Les composés ayant montré une capacité à atténuer ce symptôme seront ensuite caractérisés plus en profondeur dans un modèle d’exposition précoce à un psychotrope. Ce modèle, impliquant une période d’expérimentation plus longue, se veut plus proche de la maladie. Les souches déficientes pour les cibles visées sont des contrôles essentiels pour confirmer que l’activité des anticorps est propre à leur action sur la cible. Ces souris ont déjà été étudiées, et ne montrent pas de souffrance par rapport aux souris non mutées.