Biologie du développement

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est induit et un traitement au tamoxifène est administré, sans recours à l'analgésie ni à l'anesthésie que le porteur écarte pour ne pas perturber le développement embryonnaire, afin d'étudier les malformations cardiaques chez des souris génétiquement prédisposées. Le porteur indique que le tamoxifène peut être délétère voire mortel pour les femelles gestantes et provoquer des défauts de développement des embryons. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Objectifs

Lors de la grossesse, le tabac, le diabète, l’obésité et l’âge de la mère sont associés à un risque accru d’avoir un enfant présentant une malformation cardiaque. Les mécanismes sous-jacents sont encore mal compris. Les facteurs épigénétiques induits par les changements environnementaux influent profondément sur l’occurrence et le spectre des malformations chez l’homme et les modèles animaux. Par conséquent, une compréhension détaillée de ces facteurs et les altérations génétiques sous-jacentes est cruciale pour un meilleur diagnostic. Les 3 formes d’hyperglycémie maternelle (diabète de type I, II, gestationnel) sont associées à diverses malformations cardiaques congénitales notamment des anomalies de latéralité (hétérotaxie), des anomalies de type conotroncale (ventricule droit à double issue, transposition des grandes artères, tronc artériel commun, ventricule unique), des défauts de septation des cavités cardiaques et d’hypertrophie cardiaque. Ce projet a pour but d’étudier l’effet du diabète pre gestationnel sur le développement embryonnaire de souris génétiquement prédisposées aux malformations cardiaques.

Bénéfices attendus

Le diabète prégestationnel chez la mère augmente le risque de malformations cardiaques chez l'enfant de 5 fois. La prévalence du diabète prégestationnel (type 1 et 2) a d'ailleurs presque doublé au cours des dernières années avec une tendance à augmenter encore plus. Cependant, les mécanismes par lesquels les altérations de l'homéostasie du glucose maternel perturbent le développement cardiaque reste encore largement incertain. Par conséquent, le but de ce travail proposé est d'acquérir une meilleure compréhension des processus compromettant le développement cardiaque dans les cardiopathies induites par le diabète. Cette connaissance nous permettra d'avoir une meilleure prédiction des risques et la possibilité d'identifier des cibles thérapeutiques pour des thérapies individualisées et de prévention. De plus, en utilisant le modèle de méthylation de l'ADN dans le sang, nous serons en mesure de présenter une gamme plus large d'outils de diagnostic pour l'identification et la quantification des facteurs environnementaux contribuant à un développement cardiaque perturbé.

Procédures

Les animaux seront soumis aux suivantes : injection sous cutanée et prélèvement sanguin de 10 microlitres au niveau de la queue..L’induction du modèle sera réalisée par une injection sous cutanée de tamoxifène (médicament bien connu) qui devrait engendrer peu de douleurs aux animaux. Dans cette étude, nous n’avons pas recours à l’administration d’analgésiants et anesthésiants, une procédure pouvant impacter sur le développement embryonnaire compte tenu de l’interaction gènes-environnement et des effets épigénétiques sous-jacents. Dans le cas d’une souffrance légère, la surveillance de l’animal sera renforcée avec une observation bi journalière. L’eau sera remplacée par une eau enrichie en pyruvate 1% jusqu’à la fin du protocole expérimental. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 ul par animal et réalisés au niveau de la queue. Ceci est rendu possible par l’utilisation de glucomètre à bandelettes réactives.

Impact sur les animaux

Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’injection de Tamoxifène peut avoir un effet délétère voir potentiellement mortel pour les femelles gravides si l’administration a lieu en début de gestation. L’administration de Tamoxifène durant la gestation est associée à des défauts de développement du placenta avec pour conséquences des défauts de formation des embryons. Des défauts embryonnaires peuvent aussi être directement liés à l’exposition au Tamoxifène. Bien qu’aucun défaut cardiaque n’ait été décrit à ce jour nous prévoyons d’inclure des groupes supplémentaires afin d’exclure l’impact du Tamoxifène sur l’apparition d’anomalies du coeur et n’envisageons pas d’administration pendant la gestation mais prévoyons une seule injection 7 jours avant la mise en accouplement, à ce stade d’injection le tamoxifène n’aura pas d’effet délétère.

Devenir

Tous les animaux entrant dans cette procédure seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude d’une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. 810 (540 en procédure 1, 270 en procédure 2) correspond au nombre minimum d’animaux à utiliser afin d’obtenir des données scientifiquement robustes sans augmenter inutilement la souffrance infligée aux animaux. Il s’agit d’une analyse de biologie fondamentale visant à observer l’apparition potentielle d’un phénotype dans un contexte donné et de caractériser ce phénotype. Nous n’utilisons donc pas d’approche statistiques.

Raffinement

Le modèle animal de diabète pre gestationnel qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et est un excellent modèle au regard de la pathologie humaine. Par ailleurs, le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 microlitres par animal. Afin d'assurer le bien-être des animaux, nous respecterons la réglementation européenne concernant la densité d'animaux par cage et les cycles d’éclairage diurne. Les souris seront au nombre de 5 maximum par cage de 542 cm2 afin de respecter leur instinct grégaire. L’environnement sera enrichi à l’aide de dômes en cartons et de bandelettes de kraft. Les reproducteurs ne seront pas mis en accouplement dans la semaine suivante leur déménagement de pièce ou avant 8 semaines d’âge. Les mères auront au maximum trois portées en production et nous ferons le maximum pour que ces portées ne soient pas immédiatement successives. Bien que le protocole soit relativement peu invasif, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Avant chaque procédure, nous nous assurerons que l’animal présente un bon état général. Après l’injection de tamoxifène, nous nous assurerons qu’aucun animal ne présente de signe d’infection au site d’injection. Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’animal pourra être hydraté par injection intra péritonéale de solution saline. Pour limiter leur stress, nous doublerons l’enrichissement (bandelettes de kraft et maisonnettes en carton).

Choix des espèces

Notre sujet de travail porte sur les malformations cardiaques causées par une hyperglycémie maternelle. A ce jour, les souris génétiquement modifiées sont les seuls modèles animaux permettant de mimer assez fidèlement ces pathologies. En effet, il existe une excellente homologie des gènes Kir6.2 et Nkx2.5 chez l'humain et chez la souris. Les cœurs humains et murins ont un développement anatomique remarquablement similaire. Par ailleurs, des outils génétiques robustes ont été développés chez la souris ce qui en fait l’un des meilleurs modèles d’étude pour comprendre la formation du cœur. Ce projet utilisera des femelles âgées de 12 à 14 semaines afin d’exclure l’impact de l’âge maternel sur l’apparition d’anomalies cardiaques.

524 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour modéliser l'autisme, elles apprennent une tâche comportementale de 200 essais par jour sous contention partielle de la tête, avec un accès à l'eau restreint à un hydrogel pour les motiver et une perte de poids plafonnée à 10 pour cent. Le porteur décrit ces contraintes comme brèves et réversibles et n'attend pas d'effet indésirable majeur. Il affirme qu'un modèle animal est "absolument nécessaire" pour reproduire la complexité des circuits neuronaux et écarte les approches sur cellules ou sur la mouche.

Objectifs

L’autisme est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des déficits sociaux, des comportements stéréotypés répétitifs et les réactions sensorielles atypiques. Il est estimé qu'à l'échelle mondiale, environ un enfant sur 54 est atteint d'autisme. Malgré la prévalence du trouble du spectre de l'autisme (TSA), les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les anomalies du comportement ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de la base neurobiologique des TSA est cruciale pour la gestion des symptômes des TSA et pour le développement d'approches thérapeutiques innovantes, ainsi que pour l'identification de biomarqueurs diagnostiques. L'objectif global de ce projet est de développer de nouveaux biomarqueurs physiologiques et comportementaux chez les modèles génétiques murins de TSA. Ces mesures seront ensuite utilisées pour le développement et l'élucidation de nouvelles approches thérapeutiques. Dans cette étude, nous avons choisi de nous concentrer sur une région du cerveau qui est très bien conservée entre la souris et l'homme. Pour mener à bien nos études, nous proposons de développer et d'exploiter une nouvelle tâche comportementale qui nous permettra d’identifier, à la fois les altérations comportementales ainsi que les modifications physiologiques liées à une altération du fonctionnement du cerveau des souris portant certaines modifications génétiques lié à l’autisme. Ces mesures nous permettront, par la suite, mesures physiologiques afin de mettre en évidence les mécanismes cellulaires et physiologiques associés aux altérations comportementales et cognitives liées à l’autisme. Enfin, nous testerons la capacité de cette tâche à mesurer les conséquences d'une intervention pharmacologique. Pour cette dernière, nous utiliserons une molécule expérimentale qui a déjà été testée dans des essais cliniques chez l'homme et dont le profil de sécurité et la pharmacocinétique sont bien définis.

Bénéfices attendus

Des études de dépistage à grande échelle menées aux États-Unis suggèrent que la prévalence de l'autisme est de 1 enfant sur 54. Bien qu'il n'existe pas d'études de cette ampleur en Europe, la prévalence de l'autisme est probablement similaire. Les symptômes sensoriels affectent la grande majorité des personnes atteintes d'autisme et ont des conséquences fortement négatives sur la vie quotidienne des personnes concernées, comme la capacité à s'intégrer dans une salle de classe, à tolérer certains vêtements, à manger certains aliments. Ces symptômes sont une source majeure de stress pour les familles concernées. La compréhension des processus neurophysiologiques qui sous-tendent les difficultés sensorielles peut apporter des informations importantes sur la façon dont le fonctionnement du cerveau est altéré dans l'autisme. De telles études peuvent conduire à l'élucidation des mécanismes moléculaires, cellulaires et des circuits qui sous-tendent les perturbations sensorielles, révélant ainsi de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer des symptômes tels que la surcharge sensorielle ou l'hyperréactivité sensorielle, ou de biomarqueurs permettant d'évaluer le succès de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. De telles études nécessitent des approches invasives et des manipulations qui ne sont pas possibles dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude permettra de mieux comprendre les types de cellules et les circuits impliqués dans l'altération de la perception sensorielle tactile. Elle fournira des biomarqueurs précliniques pour l'évaluation de nouveaux médicaments expérimentaux. Elle nous permettra d'évaluer l'efficacité d'un médicament expérimental existant qui a été proposé comme traitement de l'autisme. Notre étude a le fort potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la vie des personnes diagnostiquées autistes. Ces connaissances peuvent également renforcer l'autonomie et bien être des personnes autistes en leur permettant de comprendre pourquoi elles se sentent comme elles le font dans certaines situations.

Procédures

Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacent de l'autisme, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive , basé sur les récompenses, où ils subiront une session de 200 essais par jour. En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau. Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête. Cette habituation commencera par une exploration libre de la chambre d'enregistrement, puis se poursuivra par une très brève immobilisation initiale. L'habituation se poursuivra très progressivement pendant une semaine, permettant à l'animal d'apprendre que cette immobilisation sera brève et réversible. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera. Pendant cette période, chaque animal restera dans le dispositif pendant 30 minutes, une fois par jour.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effet indésirable majeur. Pour réaliser les expériences, les animaux doivent être motivés à consommer de l'eau. Pour cette raison, leur accès à l'eau pendant la journée sera limitée et uniquement sous forme d’hydrogel. Des études antérieures suggèrent que la souris est capable d'adapter son comportement et sa physiologie lorsqu'elle se trouve dans des régions arides. Nos études préliminaires n'ont montré aucune conséquence négative de cette restriction. D'autre part, les animaux seront habitués à une contention partielle (immobilisation de la tête). Cette habituation se poursuit très progressivement, permettant à l'animal de s'adapter à cette contrainte et d'apprendre que cette manipulation sera brève et réversible. Cet apprentissage très progressif est nécessaire afin de réduire au maximum le stress lié à une contention partielle et le rythme d'entraînement est adapté pour chaque animal.

Devenir

À la fin des expériences comportementales, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. L’utilisation des modèles de plus faible sensibilité neuronale (tels que la mouche à vinaigre) n’est pas adapté à notre projet, parce que cet organisme manque la structure cérébrale ciblée par notre étude.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Une première étude pilote a été réalisée pour établir les protocoles comportementaux ainsi que les protocoles techniques nécessaires au suivi des réponses neuronales. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales et physiologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Tous les animaux seront d'abord soumis à la tâche de détection tactile, puis seront entraînés à la tâche de discrimination tactile. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Ces mesures nous permettront de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Dans cette étude, nous tiendrons compte de toutes les connaissances disponibles concernant le bien-être des animaux et nous surveillerons systématiquement les animaux pour détecter tout signe de douleur, de souffrance ou de détresse. Les expériences seront conçues et menées de la manière la plus humaine possible. Des souris transgéniques seront utilisées pour explorer les déficits neurophysiologiques chez les modèles de souris de l’autisme. Aucune souffrance inhérente n'est prévue pour les souches utilisées lors de ces expériences. Le bien-être des animaux est impératif pour cette étude, car les expériences comportementales exigent que les animaux se sentent à l’aise et ne sont pas soumis à une douleur ou une détresse inutile ce qui peut être préjudiciable à l'interprétation de notre expérience. Afin de minimiser la douleur, la souffrance, l'angoisse ou les dommages durables pour les animaux, toutes les procédures seront effectuées avec une technique soigneuse et un équipement adapté, par un personnel autorisé, compétent et formé de manière appropriée. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : des tunnels de cages domestiques seront utilisés pour transférer les animaux et une fois que les animaux seront habitués à l'expérimentateur, ils seront manipulés en utilisant la technique qui prend en compte le bien- être de l’animal. Tous les animaux seront pesés quotidiennement et la ration d’eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10%. Un tube et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de s'assurer que tous les comportements normaux des animaux se poursuivent. Les animaux sont hébergés en cage collective. Les animaux seront progressivement habitués à la contention partielle afin de réduire à minimum le stress.

Choix des espèces

Ce modèle (la souris transgénique) a été sélectionné pour rester cohérent avec les études antérieures utilisant les modèles genetiques de troubles neurodéveloppementaux. Les rongeurs ont un système neuronal très développé, présentent des comportements compliqués et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant une variété de réponses comportementales. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, en routine, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. L'étiologie de l'autisme a une forte base génétique. Les modèles transgéniques impliquant la manipulation (suppression ou modification des gènes à haut risque pour l'autisme) sont considérés comme les modèles ayant une forte « valeur de construction ». 8 semaines au début de la procédure expérimentale. Justification: Conformément aux études précédentes, les animaux auront 8 à 10 semaines au début de la période de apprentissage.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent un traitement induisant chez leurs embryons des mutations qui reproduisent une carence complète en vitamine A, puis sont tuées par dislocation cervicale pour que les fœtus soient prélevés, observés et fixés, certains fœtus étant refroidis puis plongés dans un fixateur histologique. Le porteur décrit une "douleur minime" pour les femelles et reconnaît que la souffrance fœtale est "difficile à évaluer", les prélèvements étant programmés un jour avant la mort ou la naissance attendue. Il affirme que seul l'animal permet d'étudier l'organogenèse et conclut à l'impossibilité d'un remplacement in vitro.

Objectifs

Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les anomalies congénitales sont définies comme des anomalies de développement qui surviennent durant la vie intra-utérine et qui peuvent être identifiées avant la naissance, à la naissance ou plus tard dans la vie. Pour mieux appréhender la pathogénie des anomalies congénitales, nous proposons de comparer des reconstructions tridimensionnelles (3D) d'embryons de souris porteurs de mutations connues avec leurs congénères normaux, entre le début de la formation des organes (9.5 jours post-fécondation ; E9.5) et la fin de la gestation (E18.5). Pour les stades de développement compris entre E9.5 et E15.5, nous utilisons une nouvelle technologie d’imagerie, l’HREM (microscopie épiscopique haute résolution), qui génère des images comparables, en termes de résolution, à l’histologie : elle permet de visualiser les surfaces et les volumes des organes internes et des cavités, dans le système nerveux, le poumon, le cœur et les vaisseaux, l'intestin et le système urogénital. Les embryons et fœtus mutants pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara, Rarb et Rarg) développent des anomalies congénitales. Ce modèle imite un état de carence complète en vitamine A qui, pour des raisons techniques, n’avait jamais été analysé auparavant puisque cette vitamine est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères. Ces mutants seront utilisés comme modèle d’anomalie congénitale dans notre étude en imagerie.

Bénéfices attendus

Les anomalies congénitales affectent 1 nourrisson sur 30 partout dans le monde et entraînent annuellement 3 millions d'incapacités physiques, fonctionnelles et mentales. Les anomalies congénitales ne sont diagnostiquées qu'après la naissance ou, plus rarement, en fin de grossesse. Pourtant, la plupart d'entre elles sont déterminées très précocément, au cours des toutes premières semaines qui suivent la fécondation. De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de l’ensemble de ses gènes, la souris est un excellent modèle pour comprendre les maladies humaines. Les études cliniques et les approches expérimentales ont révélé que la vitamine A et ses dérivés actifs (les rétinoïdes dont l’acide rétinoïque) exercent une grande variété d'effets sur l’embryogenèse. Ces anomalies sont retrouvées chez l’un ou l’autre des mutants combinés pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara/b, Rara/g et Rarb/g) ce qui suggère une redondance fonctionnelle entre les RARs. Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension du moment propice d’action de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque pour permettre les différentes étapes de l’organogenèse. Cet objectif sera atteint en étudiant les conséquences de l’inactivation de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. Ceci sera réalisé par l’ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs.

Procédures

Les souris femelles gestantes sont traitées pour permettre la mutation (recombinaison). Une contention simple qui dure 15 à 20 secondes pour administrer avec soin le traitement. Les souris femelles sont euthanasiées par dislocation cervicale (cela prend entre 5 secondes et 5 minutes selon la méthode utilisée). Les fœtus à E18.5 sont sortis des cornes utérines en incisant longitudinalement le muscle utérin. Après une observation macroscopique, ils sont ensuite euthanasiés par administration d’un euthanasiant chimique (contention de 10 secondes pour administrer l’euthanasiant). Les fœtus à E14.5 sont sortis des cornes utérines. Après une observation macroscopique sous loupe binoculaire, ils sont rendus inconscients par le froid. Ensuite, les foetus sont euthanasiés par immersion dans le fixateur histologique.

Impact sur les animaux

Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux animaux. La souffrance des femelles gestantes est limitée à la contention pour l’administration du traitement permettant la mutation (recombinaison). Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables de nos manipulations génétiques chez la femelle gestante traitée, mais tous les animaux sont surveillés soigneusement. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort anticipée ou un jour avant la naissance.

Devenir

Tous les animaux décrits dans ce projet (Femelles gestantes et fœtus) seront euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus à E14.5 et à E18.5 sont euthanasiés pour les analyses HREM ou les analyses sur coupes. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.

Remplacement

L’organogenèse fait intervenir plusieurs types cellulaires de l’embryon. Notre étude vise à évaluer les périodes pendant lesquelles l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires dans un système physiologique. Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

La stratégie des accouplements permet d’obtenir la moitié des animaux contrôles et l’autre moitié des animaux seront mutants après le traitement utilisé pour permettre la mutation (recombinaison). La stratégie de prélèvement des embryons ou des fœtus permet aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés car les stades sont choisis à des moments clés de l’organogenèse et permettent d’éviter la dissection au hasard. Les mâles et les femelles sont utilisés pour l’étude quand l’organogenèse s’y prête. Par exemple pour les études sur le développement du crâne ou des poumons, nous pourrons analyser les deux sexes. Par contre, pour les études sur le système urogénital, nous aurons besoin d’analyser à la fois des mâles et des femelles. Les nombres d’animaux sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique. A chaque stade nous analyserons 3 embryons/foetus contrôles et 3 embryons/foetus mutants. La réduction du nombre d’animaux (2e R de la règle des 3R) est donc appliquée dans notre projet.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour le bien-être des animaux, la surveillance de l’état de santé et des actions appropriées sont réalisées à l’animalerie si nécessaires (soins, analgésie, …). Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes (traitement utilisé pour permettre la mutation par recombinaison). Le bien-être est surveillé en permanence et toute altération du comportement des animaux (souffrance, angoisse) sera immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires. Les malformations congénitales attendues suite à la mutation des gènes Rar entrainent généralement une létalité embryonnaire ou foetale. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort attendue ou un jour avant la naissance. Le raffinement (3e R de la règle des 3R) est donc appliqué dans notre projet.

Choix des espèces

De part sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal de la souris est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome; temps de génération court; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans l’organogenèse sont conservés chez l’homme. Afin d’évaluer les périodes pendant laquelle l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires (développement du crâne ou de la tête, du tractus urogénital, du tractus gastrointestinal, du système cardiovasculaire ou du système respiratoire), nous allons procéder à une ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs chez la souris. Cette ablation sera réalisée au moment où les RARs sont supposés être nécessaires aux processus de : neurogenèse, cardiogenèse, développement des bourgeons des membres, développement de l’oeil, etc.. Nous allons prélever les embryons à des stades précis pour pouvoir observer l’organogenèse. Stade traitement des femelles (Stade prélèvement embryons/foetus) E8 (E9 et E10) E8.5 (E10.5 et E11.5) E9.5 (E11.5, E12.5, E13.5 et E14.5) E10.5 (E12.5, E13.5 E14.5 et E18.5) La liste des observations qui vont être faites et qui sont énumérées ci-dessous n’est pas exhaustive : E9 à E10 = Vasculogenèse, développement des cavités cardiaques E10.5 = Trachée et arcs aortiques E11.5 = Artères iliaques, développement des poumons, de l’œil ou des cavités nasales, E12.5 = Cœur, aorte, cavités nasales, œil, rétine, E13.5 = Glandes salivaires, Vessie E14.5 = Paupières, Gonades, Canal de Muller, Rein E18.5 = Morphologie complète de l’embryon

441 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation est provoquée par injection intracérébrale d'un détergent sous anesthésie, complétée par des injections d'un marqueur de prolifération, pour étudier la régénération de la myéline dans la sclérose en plaques chez des souris génétiquement modifiées. Le porteur indique une mise à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque d'un fixateur pour prélever le cerveau. Il affirme que la myélinisation ne peut être reproduite que chez un animal vivant "dans son intégrité" et retient la souris comme modèle de référence des récepteurs de la vitamine A.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune affectant le système nerveux central (SNC). Causée par une dysfonction du système immunitaire, elle engendre des lésions de la myéline qui provoquent des perturbations motrices, sensitives, cognitives, visuelles et autres. Les traitements actuels sont insuffisants pour empêcher la progression du handicap à moyen terme. La myéline est une membrane biologique, essentiellement composée de lipides, qui forme une gaine autour des fibres nerveuses. Cette gaine est nécessaire pour une bonne conduction de l’influx nerveux. Lorsque la myéline est dégradée, son remplacement est effectué par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Toutefois, dans la SEP, la myéline est la cible du système immunitaire qui engendre une réaction inflammatoire excessive. A long terme, cette inflammation empêche les OL de reformer la myéline conduisant aux symptomes cités précedemment. Il est important de comprendre pourquoi les OL ne forment plus la myéline. En effet, une stratégie thérapeutique serait de stimuler ces OL pour qu’ils régénèrent la myéline à nouveau. Grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, nous étudierons des facteurs impliqués dans la génération des OL pour mieux comprendre comment les stimuler à régénérer la myéline. De plus, dans la SEP les cellules immunitaires du SNC, les cellules microgliales (CM), contribuent à la pérennisation de la signalisation inflammatoire mais assurent aussi l’élimination des debris de myéline pour stimuler la remyélinisation. Les déterminants moléculaires impliqués dans le contrôle de ces fonctions opposées des CM ne sont pas connus, alors que leur connaissance est critique pour le développement de nouveaux traitements. Afin de caractériser ces déterminants, nous étudierons les CM et la progression de la remyélinisation par les OL en induisant une perte minime de myéline chez des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

La myéline est une gaine biologique composée majoritairement de lipides qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine est synthétisée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL) et est nécessaire pour la bonne conduction des influx nerveux. La dégradation de la myéline est un processus physiologique naturel au cours duquel les cellules immunitaires du système nerveux central, les cellules microgliales (CM), éliminent les débris de myéline. Ceci stimule ainsi à nouveau les OL à renouveler la myéline. Toutefois, chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), la myéline est la cible du système immunitaire qui entraine une réaction inflammatoire importante. Une des conséquences de cette réaction inflammatoire est d’empêcher les OL à régénérer la myéline. Différents acteurs ont été identifiés comme facteur stimulant la formation de myéline dans la SEP, notamment des récepteurs de la forme bioactive de la vitamine A. En utilisant des souris modifiées génétiquement, nous déterminerons l’implication de ces récepteurs dans la formation des OL pour comprendre comment ceux-ci favorisent la myélinisation aussi bien en conditions physiologiques qu’en conditions pathologiques. Ceci pourrait mettre en lumière un mécanisme de remyélinisation précis qui pourrait également ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la SEP et vers de nouvelles pistes thérapeutiques impliquant la vitamine A. D’autre part, nous caractériserons comment la myéline et notamment les lipides la composant sont pris en charge par les cellules microgliales (CM) pour être éliminés en utilisant des souris génétiquement modifiées. Cette information peut orienter des stratégies thérapeutiques basées sur un apport d’acides gras spécifiques dans la SEP.

Procédures

Une injection intrapéritonéale d’un produit marquant les cellules en prolifération cellulaire sera effectuée sur 231 animaux lors de la procédure 2, et sur 120 animaux lors de la procédure 3, soit sur un total de 351 animaux. Cette injection ne dure qu’une dizaine de secondes entre le moment où l’animal est saisi et le produit injecté. Nous réaliserons également une injection intracérébrale d’un produit détergent pour induire la démyélinisation unilatéralement sous anesthésie générale. Cet acte chirurgical sera réalisé sur 90 animaux en procédure 1, et sur 231 animaux en procédure 2. Cette procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes par animal. Au total, 321 animaux recevront une injection intracérébrale une seule fois.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales vont génèrer un stress chez l’animal. Les procédures des injections intracérébrales peuvent être douloureuses et générer un stress/déconfort à l’animal. Ces procédures seront effectuées par un expérimentateur entraîné sous anesthésie générale avec des propriétés analgésiques et ne devraient pas engendrer de troubles majeurs visibles de comportement car les lésions induites par l’injection seront unilatérales et très limitées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permet de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires (de type Western Blot). D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque d’un agent fixateur sera réalisée. Ceci permet la fixation complète et homogène des tissus, y compris du cerveau. Les organes pourront ainsi être prélevés et utilisés à des fins d’imagerie.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les modèles murins par un autre modèle animal dans cette étude pour trois raisons principales : (i) la myélinisation développementale ou remyélinisation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités des types cellulaires différents et ne peut être reproduit que chez un animal vivant dans son intégrité; (ii); une analyse de remyélinisation est espèce-dépendant et la souris reste un très bon modèle de la myélinisation chez l’homme; (iii) la souris est notre modèle de référence dans la recherche sur les récepteurs des formes bioactives de la vitamine A car c’est dans ce modèle que nous avons déjà identifié les programmes moléculaires contrôlées par ces récepteurs ainsi que les traitements pharmacologiques pour les futurs développements de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, ce projet émane des nombreuses analyses in vitro réalisées sur des cultures cellulaires qui nous ont amenées à proposer ce projet et tester in vivo nos hypothèses de travail.

Réduction

Dans notre projet nous utilisons le nombre minimal d’animaux permettant d’effectuer les analyses statistiques afin de révéler les différences significatives (n=3). En effet, ces effectifs ont été déterminés à partir de données de la littérature et sont suffisants pour voir si on obtient des différences en comparant la moyenne (et autres paramètres) des différentes conditions, notamment par l'utilisation d'un test de Wilcoxon, ou de Kruskall-Wallis. De plus nous utilisons les deux sexes pour ne pas produire de façon inutile les femelles qui sont plus rarement utilisées pour ces analyses à cause d’effets possibles dus aux différences hormonales ou sexuelles au niveau des fonctions de cellules étudiées. C’est un risque dans cette étude, que nous allons contrôler par une comparaison des résultats provenant des mâles et des femelles pour chaque condition expérimentale et génotypique. Pour minimiser le nombre d’animaux nous allons injecter qu’un hémisphère pour utiliser le deuxième comme contrôle. De plus, les effets de l’intervention chirurgicale (injection de solution saline) seront évalués sur un groupe d’animaux contrôle.

Raffinement

En vue de raffiner les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales (dans des portoirs ventilés, en groupe, et avec un nid) et ils font l’objet d’un suivi adapté et régulier et de soins vétérinaires au besoin. Sont mis à la disposition des souris ad libitum des croquettes et de l’eau. La litière est renouvelée une fois par semaine. Ici, nous minimiserons la douleur chez les animaux. En effet, la dose de lysolécithine utilisée étant très faible, les dégradations de myéline seront mineures et ne devraient pas générer de troubles chez l’animal durant le suivi expérimental. Les procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale accompagnée d’analgésiques (Xylazine/Kétamine) afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. De plus, durant la chirurgie, les yeux des animaux sont protégés du dessèchement. Ils sont préservés du refroidissement provoqué par l’anesthésie par l’emploi d’isolant durant l’opération, et leur réveil se fait dans une enceinte chauffée. Les injections intrapéritonéales engendrent un stress chez l’animal. Les animaux ayant reçu l’injection seront remis en groupe en cage et surveillés. Les mises à mort des animaux seront effectuées par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

La myéline est une gaine biologique qui entoure les neurones, assurant ainsi leur protection d’une part, et la transmission des messages nerveux d’autre part. La synthèse de myéline (ou myélinisation) est assurée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Chez des patients atteints de sclérose en plaques, la myéline est dégradée par le système immunitaire. La régénération de myéline par les OL (ou remyélinisation) est très limitée voire inexistante. Par conséquent, la transmission des messages nerveux est moins efficace et les patients souffrent de différents symptomes tels que des déficits moteurs et cognitifs. Une stratégie thérapeutique serait de stimuler les OL, notamment via la vitamine A, à régénérer la myéline similairement à leur génération lors du développement embryonnaire En effet, la formation des OL se déroule durant le développement pré et post-natal. Leur formation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités de différents types cellulaires qui ne peut être reproduit que sur un animal vivant dans son intégrité. Pour comprendre comment les OL sont ainsi formés, un modèle d’étude ayant un système nerveux proche de l’Homme est nécessaire. La souris est un très bon modèle puisqu’elle récapitule très bien la formation des OL et de la myéline chez l’Homme. Bien que le rôle de la vitamine A dans la formation des OL n’est pas encore élucidé, il est nécessaire d’avoir un modèle où la vitamine A est caractérisée. La souris reste le modèle de référence sur les travaux de la vitamine A. En effet, les mécanismes d’action de la forme bioactive de la vitamine A sont très bien caractérisés chez la souris et différents traitements pharmacologiques sont déjà disponibles pour évaluer son mode d’action. Les étapes clés de la formation de myéline chez la souris ont lieu au jour de la naissance 0 (dit P0), P7, P14, P21 et à l’âge adulte (8 semaines). Pour suivre et comprendre comment la myéline est formée, nous devrons étudier des souris à ces stades de développement. Pour étudier la régénération de myéline en conditions pathologiques comme la sclérose en plaques, des souris adultes (8 semaines) seront utilisées afin d’évaluer le processus d’élimination et de régénération de la myéline.

384 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des ratons sont séparés de leur mère trois heures par jour de J2 à J12, et des rats "démonstrateurs" reçoivent dans une patte un agent inflammatoire provoquant une douleur aiguë ou un œdème persistant deux semaines, pour mesurer par un test de transfert social de la douleur l'empathie liée à un stress néonatal. Le porteur présente ce modèle comme celui d'une prématurité humaine et indique surveiller le bien-être des animaux non-humains. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reconstitue les réseaux neuronaux de l'empathie et de la douleur.

Objectifs

Dans le cadre de l’utilisation d’un modèle animal mimiquant les conséquences d’une prématurité chez l’humain, le but du projet est d’affiner la compréhension de l’impact d’un stress de séparation maternelle précoce (SMP) sur certains processus émotionnels associés à la douleur. L’objectif du projet est donc d’évaluer chez le rat, les conséquences d’une SMP sur les interactions sociales ainsi que sur l’empathie à la douleur à l’aide du test de « transfert sociale de la douleur » qui a été validé dans la littérature comme étant un bon indicateur de l’empathie chez ce dernier.

Bénéfices attendus

Le modèle de séparation maternelle néonatale a permis de décrypter nombre de mécanismes et d’altérations du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, cette étude permettra de mieux comprendre l’impact d’un stress néonatal non douloureux (i.e. une séparation précoce avec la mère) sur les processus cognitifs et émotionnels associés à la douleur chez un jeune individu encore en pleine maturation durant une période critique de son développement.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis au protocole de SMP et seront séparés de leur mère 3 heures par jour du deuxième au douzième jour postanal. Pour le test de transfert social de la douleur, les animaux « démonstrateurs » recevront une injection sur une patte arrière d’agents inflammatoires créant soit une douleur aigue soit une douleur prolongée sous anesthésie générale d’une durée maximale de 5 minutes. Des tests d’évaluation de la douleur (durée de 5 à 10min) et n’induisant pas de stress accru chez l’animal, seront effectués à la suite du test de transfert (test unique d’une durée de 45 min) puis à nouveau 1x/h pendant 4h pour un premier groupe expérimental et 1x/J pendant deux semaines en plus pour le deuxième groupe ainsi que le groupe contrôle. Le nombre total de tests de douleur pour le protocole "douleur aigüe" est de 10 tests. Pour le protocole "douleur prolongée", les animaux sont en plus testés 1 fois par jour durant deux semaines ce qui fait un total de 36 tests.

Impact sur les animaux

La séparation maternelle induit au niveau comportemental une anxiété accrue chez la mère. Les injections du premier agent inflammatoire provoquent une douleur temporaire, qui s’arrêtent spontanément au bout d’une heure, celles du second provoquent un œdème cutané dont la sévérité sera surveillée et qui se résorbe après deux semaines. Les tests d’évaluation de la douleur prévus sont courts (de 5 à 10min) et n’induisent qu’un stress mineur chez l’animal.

Devenir

A la fin de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les comportements sociaux, l'empathie et la douleur étant des processus intégrés impliquant différentes structures sensorielles, cognitives et émotionnelles, ce projet nécessite l’étude de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.

Réduction

Le nombre d’animaux est basé sur l’expertise de l’équipe vis-à-vis des différentes procédures et prend en compte les variabilités interindividuelles) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests utilisés pour évaluer l’impact du stress néonatal de séparation maternelle sur le comportement de contagion à la douleur chez le rat. Le projet évaluera également les différences entre les mâles et les femelles, qui ont été démontrées pour les réponses à la douleur et dans différents modèles de stress périnataux.

Raffinement

Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien-être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général (perte de poids supérieure à 10%, défaut de toilettage, plaie ouverte, blessure) ainsi qu'à l'état comportemental (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité, vocalises). Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour prendre la décision adéquate : soins, retrait de l’animal de l’étude ou mise à mort de l’animal. Durant la séparation maternelle, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Les injections des produits inflammatoires dans la patte se font sous anesthésie gazeuse afin de limiter tout stress chez l’animal. Le poids des animaux est mesuré hebdomadairement, et quotidiennement suite aux injections. Les tests nociceptifs sont effectués après une semaine d’habituation afin de réduire le stress. L’étude portant sur la douleur, celle-ci ne pourra pas être prise en charge lors des tests comportementaux. Des points limites ont été mis en place pour éviter d’éventuelles souffrance inutiles dépassant le cadre de l’étude.

Choix des espèces

Des études précédentes ayant étant réalisées sur le rat, ce modèle animal sera conservé dans le cadre de ce projet car son comportement est bien connu. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. L’étude des comportements complexes comme les comportements sociaux ou l’empathie implique que l’étude porte sur une espèce qui possèdent les fonctions et capacités cognitives nécessaire à l’expression de ces derniers, ce qui est le cas chez le rat. Afin de mesurer l’impact à long terme de cette séparation maternelle, les tests comportementaux seront ensuite effectués à l’âge adulte. Les animaux seront donc utilisés entre 2 jours et 2 mois dans cette étude.