Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
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- Multisystémique
- Oncologie
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- Système cardiaque
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- Système immunitaire
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- Système nerveux
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- Système urogénital
Cathétérisation de la veine et artère fémorale chez le rat dans le cadre d’un développement de radiotraceur pour l’imagerie
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
120 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie d'environ 30 minutes pour poser des cathéters dans la veine et l'artère fémorales, suivie de 60 à 120 minutes d'imagerie, avec un risque d'hémorragie. L'objectif est de mettre au point un modèle mathématique de la cinétique de traceurs radioactifs pour l'imagerie TEP, en vue d'un passage ultérieur chez le primate puis chez l'humain. Le porteur affirme que ce type d'étude ne peut pas être remplacé par une méthode in vitro, l'objectif final étant d'utiliser les mêmes traceurs en clinique.
Objectifs
Le projet vise à réaliser des expérimentations permettant d’évaluer la fonction d’entrée artérielle chez le rat afin de mettre au point un modèle mathématique (cinétique plasmatique) de différents traceurs fluorés et ainsi permettre de quantifier les images Tomographie par Emission de Positons. La TEP (Tomographie par Emission de Positons) est une méthode d'imagerie scintigraphique médicale qui permet de mesurer en trois dimensions l'activité métabolique d'un organe grâce aux émissions produites par les positons issus de la désintégration d'un produit radioactif injecté au préalable. L’apparition des traceurs radioactifs à visée diagnostique constitue une avancée majeure en imagerie Tomographie par Emission de Positons (TEP) et accroît de façon significative les performances du diagnostic en clinique. L’imagerie TEP apporte des informations (qualitatives et quantitatives) fonctionnelles en plus des informations morphologiques.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons ainsi visualiser et quantifier en temps réel la fonction d’entrée artérielle chez le rat afin de mettre au point un modèle mathématique (cinétique plasmatique) des différents traceurs radioactifs afin de poursuivre ce projet vers la cinétique des traceurs chez le primate non humain et chez l’humain.
Procédures
Cette procédure durera environ 2h30, elle sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à une chirugie d'environ 30 minutes pour la mise en place des cathéters à la veine et l’artère fémorales. Les rats seront ensuite imagés pendant 60 à 120min.
Impact sur les animaux
Hémorragies après la chirurgie pendant l’imagerie. L’ensemble du plan expérimental étant sans réveil aucun autre critère ne sera être déterminant. Cependant toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce type d’étude ne peut être substitué par une méthode alternative in vitro ou sur cellules car l’objectif final est d’utiliser ces mêmes traceurs en imagerie clinique.
Réduction
Les effectifs ont été choisis sur la base d’étude précédemment menées au laboratoire sur l’évaluation de fonctions d’entrées artérielles et sur la base des images obtenues en imagerie TEP avec le traceur radioactif de la neuroinflammation. Tous les scans réalisés seront moyennés afin d’avoir un cerveau moyen de fixation du traceur radioactif des animaux témoins et des animaux ayant été injectés avec différents radiotraceurs développés par l’équipe. Communément aux études que nous avons déjà publiées, des analyses seront ensuite réalisées pour comparer les groupes d’animaux à l’aide d’un test statistique. Le nombre d’animaux est réduit d’environ 50% : le système dédié pour évaluer la cinétique du traceur permet d'obtenir des mesures toutes les secondes. Sans ce système, du sang devrait être prélevé toutes les secondes ce qui conduirait à une instabilité hémodynamique. Cette instabilité induirait une diminution de la perfusion du radiotraceur dans le sang et donc modifierait sa cinétique réelle. Ces facteurs font qu'il est difficile de répéter les prélèvements sanguins pour générer la fonction d’entrée artérielle chez un même animal. Il faudrait répéter le nombre d’expériences. Pour cette étude nous aurons besoin de 120 animaux pour l’ensemble du projet sur 5 ans.
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle d’expérimention pour diminuer le stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les rats seront observés une à 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle. Les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane et placés sur le dos dans un masque à anesthésie sur un tapis chauffant. Une protection oculaire sera appliquée. Une dose d'analgésie sera induite en sous cutanée avant la chirurgie et un analgesique sera mis en application localement. Un bolus de réhydratation chauffé à 37°C sera injecté à l’animal en sous cutanée . De plus, les animaux seront hébergés par deux par cage en présence d’un enrichissement comprenant un tunnel en plastique et du papier absorbant. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthesie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce la plus adaptée pour cette étude notamment en raison de son gabarit permettant la pose du shunt artério-veineux. Pour cela, nous réalisons une cathéterisation sur la même patte, l'artère et la veine fémorale. Cette artère et cette veine sont reliées entre elles par une tubulure, cela correspond à un circuit en boucle fermée. Donc la circulation sanguine continue de se faire entre la veine et l'artère de la patte concernée mais la circulation sanguine ne se fait plus dans 'la partie de la patte" en dessous de la cathétérisation. Nous utiliserons des rats mâles de 8 semaines et des femelles 12 semaines. Les femelles de 12 semaines seront utilisées pour avoir le même poids que les mâles à 8 semaines.
Étude des effets d’une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, sur le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique durant la gestation chez le rat Sprague Dawley.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Nourries pendant 9 à 17 semaines d'un régime riche en sucre et en graisses, des rates subissent jusqu'à la mise bas un gavage de glucose chaque semaine suivi de deux heures de mesures de glycémie, et une goutte de sang est prélevée à leur queue jusqu'à cinq jours par semaine, pour vérifier qu'elles sont devenues intolérantes au glucose. 636 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, afin d'étudier si l'O-GlcNAcylation, une modification des protéines, explique l'hypertrophie du cœur chez les enfants de mères diabétiques. Le porteur affirme pourtant qu'"aucune étude n'a démontré une modification délétère du phénotype des animaux nourris avec cette diète". Tous sont tués, au stade embryonnaire, à la naissance, à 12 ou à 60 jours, les nouveau-nés par décapitation et les petits de 12 jours par dislocation, une anesthésie n'étant prévue que pour les mères et les rats de 60 jours.
Objectifs
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. L’O-GlcNAcylation est une modification protéique qui est augmentée lors d’hyperglycémie et qui a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiomyocytaire. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation associée à l’hyperglycémie, pourrait être un facteur pathogénique de l’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication de l’O-GlcNAcylation dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse (2) Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par l’hyper O-GlcNAcylation.
Bénéfices attendus
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent 1 unique procédure qui correspond à une alimentation standard ou riche en sucre et lipides sur une période de 9 à 17 semaines. Entre la 12ème semaine et jusqu’à la mise bas, 1 fois par semaine, des tests de tolérance au glucose oral ainsi que des mesures de glycémie seront réalisées afin de valider l’intolérance au glucose. Le test de tolérance au glucose orale consiste en un gavage oral de glucose et au suivi de la glycémie sur les 2 heures suivantes. Les mesures de glycémie sont réalisées grâce à un glucomètre avec prélèvement d’une goutte de sang à la queue des animaux. 1 goutte de sang sera prélevé quotidiennement pour un maximum de 5 jours par semaine. Le temps de prélèvement pour 1 goutte est d’environ 1 minute. L’étude de l’impact structurel et fonctionnel du diabète + ou - O-GlcNAcylation sera réalisée via une échocardiographie (Vevo 3100-Visual Sonic, MX201 10-22 MHz) et un électrocardiogramme (IOX EMAK technology®) sur les animaux J60 (Basé sur les précédentes études réalisées au sein l’équipe, le temps estimé de chaque examen est de environ 20 minutes). A la fin de cette période, les animaux sont sacrifiés afin de prélever les différents organes (cœur, aorte, rein, poumons, foie, sang). Le sacrifice et le prélèvement dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
L’alimentation riche en sucre et gras utilisée dans ce projet est une alimentation très bien décrite dans la littérature. A ce jour, aucune étude n’a démontré une modification délétère du phénotype des animaux nourris avec cette diète.
Devenir
A la fin de la procédure (procédure sans réveil), l’ensemble des animaux seront sacrifiés. Après sacrifice, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses.
Remplacement
Le développement cardiaque est un processus complexe et intégré faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et l’O-GlcNAcylation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 636 animaux.
Raffinement
Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Lors du sacrifice des animaux, et lorsque cela est possible (sacrifice des mères, des animaux à 60 jours), une couverture anesthésique (isoflurane ; induction : 5 pourcent, débit d’air : 1L par min ; maintien : 3 pourcent , débit d’air 0,6L par min) sera mise en place. Le sacrifice des animaux à 12 jours et à la naissance (J0) ne peut être réalisé respectivement que par dislocation et décapitation. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recourt et qui les maitrise.
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque, différents stades de développement sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux au stade embryonnaire E15,5 et E20,5 (soit 15,5 et 20,5 jours après l’accouplement) ; à la naissance (J0), à 12 et 60 jours post naissance (J12 et J60), permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque embryonnaire et post-natal.
Adaptation des poissons plats au changement global (température, nourriture et polluants)
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
3 216 poissons plats, des soles au stade embryo-larvaire, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les larves sont exposées à des microplastiques contaminés par des hydrocarbures, un filtre UV et des composés perfluorés, ainsi qu'à une hausse de température et à un déficit de nourriture, pour caractériser les effets combinés du changement global. Le porteur indique que ces expositions provoquent une perte de croissance, un retard de métamorphose et des défauts comportementaux, même à faibles doses. Il affirme que le remplacement n'est "pas possible" et tue les animaux en fin de procédure pour des mesures de longueur et de poids.
Objectifs
Caractérisation des effets de facteurs de stress, individuels et combinés, causés par trois composantes du changement global : la pollution, l’augmentation de la température et la diminution de la productivité marine sur la physiologie des poissons plats.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront la fourniture de données essentielles à la construction d'un modèle bioénergétique prédictif des effets individuels et combinés précités.
Procédures
Expositions à des microplastiques contaminés par des composés organiques tels qu'hydrocarbure (benzo-a-pyrène) et filtre UV (Benzophénone 3) et à des contaminants émergents tels que des retardateurs de flamme per- et polyfluoroalkylés incluant l'acide perfluorooctanesulfonique. Expositions à des températures au dessus de l'optimum thermique (+4°C) et à des quantités de nourriture suboptimales. Les expositions seront stoppée à 35 jours post éclosion, durée maximale des expériences car la métamorphose est achevée pour la plupart des larves en température optimale.
Impact sur les animaux
Perte de croissance, retard de métamorphose, défauts comportementaux liés aux expositions aux polluants même à doses faibles et environnementales.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure afin de procéder à des mesures de longueur complémentaire et de poids sec.
Remplacement
Le Remplacement n'est pas possible dans le cas présent car nous étudions les effets des microplastiques contaminés par des polluants organiques et d'un retardateur de flamme et leurs interactions avec la quantité de nourriture et la température d’élevage sur des fonctions intégratives (croissance, métamorphose).
Réduction
Les effectifs ont été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour assurer une puissance de détection suffisante des effets escomptés.
Raffinement
Pour réduire la souffrance et l'angoisse, les animaux ne seront pas manipulés pour toutes les mesures individuelles qui seront faites par observation dans les puits des plaques. Les larves seront d'abord élevées en groupe dans des structures d'élevage adaptées et pour l’application des expositions, elles seront transferées en microplaques.
Choix des espèces
Les espèces de poissons plats, Solea solea et S. senegalensis, sont des espèces benthiques (vivant près du fond) d’intérêt commercial. Elles ont un cycle de vie complexe avec des changements progressifs d'habitat tout au long de l'ontogenèse. Chez les deux espèces, la température est le principal signal environnemental déclenchant la ponte de centaines de milliers d'œufs avec de faibles taux de survie (
Impact des fongicides sur l’établissement de l’unité neurovasculaire au cours du développement cérébral
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
3 678 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nouveau-nés reçoivent des injections sous-cutanées, 2 400 subissent une perfusion intracardiaque sous anesthésie sans réveil, et les géniteurs comme leur descendance sont exposés à des fongicides via l'eau de boisson jusqu'à des stades allant de 5 à 60 jours. Le porteur relie ce travail à la hausse des troubles du spectre autistique, mais situe les retombées thérapeutiques dans l'espoir d'identifier de nouvelles cibles, alors que les prélèvements de cerveaux, eux, sont certains. Sur le remplacement, il affirme que le modèle murin est "essentiel" et qu'"il n'existe pas non plus d'autres modèles" pour répondre à ses questions.
Objectifs
Depuis quelques années, une augmentation du risque du trouble du spectre de l'autisme (TSA) est retrouvée chez les enfants. Si la plupart des gènes responsables du TSA sont identifiés, l'implication de la composante environnementale reste peu étudiée. Pourtant les femmes enceintes et qui allaitent consomment quotidiennement des pesticides (dont font partie les fongicides); et les effets d'une expostion prénatale à ces produits sur le neurodéveloppement restent à déterminer. La recrudescence de cas de TSA pose la question de l'impact de ces fongicides dans la prédisposition au TSA et le développement cérébral. Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de neurones mais également de cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers permettent la communication entre le sang et les neurones. La majorité des études sur le TSA se focalisent sur les neurones, cependant le rôle des astrocytes et de leur interface avec les vaisseaux sanguins cérébraux sont importants et largement méconnus. C'est pourquoi notre étude portera sur ces deux composantes. La prévalence au TSA, ainsi que les symptômes, se trouvent être différents entre les femmes et les hommes. Nous réaliserons donc cette étude dans des modèles murins chez les deux sexes, afin d’évaluer l’impact des fongicides dans le développement cérébral selon le sexe. Notre étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des fongicides sur le développement cérébral et plus particulièrement sur la composante vasculaire et gliale grâce à des techniques de biologie moléculaire et biochimique (PCR, western-blot, RNA Seq) et des techniques d’imageries (microscopie confocale, à feuille de lumière). Pour cette étude un nombre total de 3678 animaux.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des fongicides sur le développement cérébral de souriceaux nouveau-nés sains et prédisposés génétiquement aux TSA, dans l’espoir d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter au plus tôt contre les malformations cérébrales induites par les pesticides, même à faibles doses.
Procédures
Trois interventions seront utilisés dans ce projet. 1) Injection sous-cutanée chez des nouveau-nés de 1 jour et dure 1 minute au maximum (temps d'injection et délai avant de retirer l'aiguille pour que la solution ne sorte pas). Elle est sans douleur et ne nécessite pas d'anesthésie. Nombre d'animaux concernés : 600 animaux. 2) Perfusion intracardiaque : réalisée sous anesthésie générale est sans réveil. Cette procédure dure 20 minutes maximum entre l'induction (anesthésique/analgésie) et la perfusion. Nombre d'animaux concernés : 2400 animaux. 3) Exposition aux fongicides des géniteurs et de leur descendance : exposition via l'eau de boisson. Cette procédure dure 4 mois pour les femelles génitrices, 2 mois pour les mâles géniteurs. Nombres d'animaux concernés : 198 animaux. Pour la descendance, les animaux sont exposés jusqu'au stade de devéloppement d'étude souhaité (5, 15, 30 ou 60 jours). Nombre d'animaux concernés : 3000 animaux.
Impact sur les animaux
Certains lots de souris subiront des interventions (injection de tamoxifen) qui peuvent entraîner des effets modérés (irritation au site d'injection). Les lots d'animaux traités avec les fongicides seront exposés à des doses retrouvées dans l'eau potable et autorisées par l'UE (directive 80-778-EEC) et considérées comme non nuisibles pour la santé. Le but de notre étude est de déterminer les effets nocifs qui peuvent découler de cette exposition.
Devenir
Les animaux utilisés pour les accouplements seront mis à mort par lorsque qu'ils seront trop âgés pour continuer la reproduction. Les animaux utilisés pour les différentes études (histologiques, biochimiques, transcriptomiques, de contractilité des vaisseaux) seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et de faire nos analyses.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. En raison de l’ignorance de l’impact des fongicides sur la fertilité, le nombre de couple reproducteur a été volontairement surestimé par rapport à une situation sans fongicide, mais qu’il sera revu autant que possible à la baisse. Pour l’ensemble des questions il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque génotype, à chaque stade et pour chaque condition de traitement. Ce nombre de 5 est un minimum pour intégrer dans notre étude la variabilité entre les animaux. C’est un prérequis dans l’ensemble des publications de travaux scientifiques.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux sera mise en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront co-administrés pour limiter toute souffrance à l’animal. En plus du mix kétamine/xylazine, de la buprénorphine est injectée aux animaux subissant une thoracotomie ‘perfusion intracardiaque). Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Pour les accouplements, les animaux seront utilisés à partir de P60. Pour répondre aux différentes problématiques posées dans ce projet, les animaux exposés in utero/post-natal aux fongicides, seront utilisés à 5 stades de développement : P3, P7, P21, P60 et P120.
Rôle de CD44 sur les fonctions des lymphocytes T au cours des complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles sont soumises à un régime gras ou à une alcoolisation, avec des injections intrapéritonéales pour induire une fibrose hépatique et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle de la glycoprotéine CD44 dans les complications hépatiques liées à l'obésité et à l'alcool. Le porteur indique que l'alcoolisation peut provoquer une détresse respiratoire et des signes d'ébriété, et que les injections peuvent entraîner rougeur, infection ou nécrose au point d'injection. Il affirme qu'une étude in vivo est "nécessaire" car les cultures cellulaires ne reproduisent pas les interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Une consommation chronique d'alcool conduit au même spectre d'altérations hépatiques qui vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, qui peut progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux dont le gène CD44 est non-fonctionnel, dans les cellules immunitaires, et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 dans la souffrance hépatique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, d’une part, la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8, dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise régulière d’alcool. D’autre part, de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. De plus, l’invalidation spécifique de CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou dans les lymphocytes CD8 permettrait de mettre en lumière de nouveaux mécanismes moléculaires.
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Le sang des animaux soumis à un régime alcoolisé sera prélevé en fin de procédure et ce prélèvement ne durera pas plus d'une minute. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. L'alcoolisation peut entraîner des signes de détresse respiratoire, des signes d’ébriété chez les animaux suivis d’un endormissement. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour les procédures 2 et 3 (souris mâles ou femelles), la mise sous régime alcool sera effectuée à environ 12-13 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 20g. Pour la procédure 4 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour étudier le vieillissement hépatique (procédure 5), les animaux ne seront utilisés qu’à un stade très avancé de leur développement et seront donc maintenus jusqu’à l’âge de 22 mois maximum.
Etude du taux de néomutations sur des embryons bovins produits selon différentes biotechnologies
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- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
9 génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes à l'issue. Chacune subit des synchronisations hormonales, des collectes d'embryons et des ponctions ovariennes répétées sous anesthésie épidurale, jusqu'à six à huit ponctions pour la condition d'édition du génome. Le projet mesure le taux de mutations dans des embryons produits selon trois biotechnologies de la reproduction, dont l'édition génétique. Le porteur affirme qu'aucune autre espèce ni aucun modèle ex vivo ne peut se substituer aux génisses pour cette étude liée à la sélection des bovins.
Objectifs
Depuis plusieurs dizaines d’années, différentes biotechnologies de la reproduction sont développées chez les bovins, principalement pour augmenter le progrès génétique annuel réalisé dans le cadre des schémas de sélection. Encadrés par l’Etat, ces programmes d’amélioration génétique des bovins ont permis d’améliorer considérablement les performances des élevages selon les critères souhaités par la Société (limités initialement aux critères de production, ces critères s’élargissent à la durabilité des systèmes de production intégrant des notions de faible impact environnemental, de bien-être et de longévité des animaux…). Ces biotechnologies de la reproduction comprennent notamment (1) la production d’embryons in vivo consistant en la récupération d’embryons présents dans le tractus femelle 7 jours après insémination d’une femelle donneuse, (2) la production d’embryons in vitro consistant en la récupération d’ovocytes en vue de leur fécondation et de leur développement in vitro ainsi que (3) la technologie d’édition du génome permettant d’effectuer des modifications génétiques ciblées, en particulier dans l’embryon. Si certaines de ces technologies sont utilisées à des fins agronomiques (production d’embryons in vivo et in vitro), d’autres ne sont aujourd’hui étudiées qu’à des fins expérimentales (édition du génome). Les potentialités de cette dernière sont énormes dans le domaine médical ou l’élevage mais son utilisation fait débat, tant sur le plan éthique qu’en termes de biosécurité. En particulier, des questions se posent quant au risque de générer des néomutations hors cible. Au-delà des développements techniques pour améliorer leur efficacité, il convient d’étudier les conséquences de ces technologies plus finement et notamment leurs impacts sur l’intégrité de l'ADN. Le projet présenté vise à étudier le taux de néo-mutations post-zygotiques dans des embryons produits selon trois technologies différentes : in vivo (condition 1), in vitro (condition 2) et in vitro avec édition du génome (condition 3).
Bénéfices attendus
Le projet présenté ici permettra l’acquisition de connaissances fondamentales nécessaires au développement raisonné de ces technologies.
Procédures
La production des embryons selon les 3 biotechnologies nécessitera la répétition, pour chaque génisse du projet, de 1 à 2 collectes d’embryons pour la condition 1, de 1 à 2 ponctions ovocytaires pour la condition 2 et de 6 à 8 ponctions ovocytaires pour la condition 3. Ces collectes d'embryons et d'ovocytes nécessitent un ensemble d'interventions sur les animaux: synchronisation des chaleurs (pose et retrait de dispositifs vaginaux, injection intra-musculaire), ponctions ovariennes mutliples sous contrôle échographique, traitement de superovulation (injections intramusculaires répétées), inséminations animales et lavage non invasif de l'utérus (condition 1 uniquement). Les ponctions ovariennes et le lavage de l'utérus seront effectuées sur animaux vigiles anesthésiés. es productions d'embryons selon les 3 conditions se feront selon un dispositif en carré latin, le premier lot de femelles produisant les embryons selon les conditions 1, 2 puis 3 alors qu'en parallèle, le deuxième lot produira les embryons selon les conditions 2, 3 puis 1 et enfin le 3ème lot selon les conditions 3, 1 puis 2.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale utilisée dans le cadre de ce projet comprend des biotechnologies de la reproduction couramment utilisées (collectes d'embryons et d'ovocytes) par les entreprises de sélection dans le cadre des schémas d'amélioration génétique. De ce fait, le projet présenté n'est susceptible d'engendrer qu'une douleur légère et très ponctuelle chez les génisses. Les collectes d'embryons et d'ovocytes seront réalisées sous anesthésie épidurale. Les animaux seront suivis de façon journalière. En cas d’atteinte du point limite (posture de compensation, station prolongée debout ou couché, difficulté pour manger et boire, modification comportementale induite par stimulation de la zone douloureuse, lésions, modifications neurovégétatives ou physiologiques), la décision sera prise d’euthanasier l’animal en concertation avec le vétérinaire sanitaire de l’élevage. Dans ce cas de figure, l’euthanasie sera effectuée par le vétérinaire sanitaire par injection lente par voie intraveineuse d’une surcharge de barbituriques après une sédation préalable.
Devenir
Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.
Remplacement
Compte tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre d’embryons à produire à partir d’un mâle (afin contrôler la variabilité introduite par le père, dont le statut physiologique peut influer sur le nombre de mutations germinales mâles) pour étudier la fréquence de néo-mutations post-zygotiques. En effet, si l’on considère qu’il est attendu environ 50 néomutations naturelles (i.e. en condition vivo) et que l’on souhaite détecter une augmentation de 10% (soit 5 néomutations supplémentaires) induite par l’un ou l’autre des conditions expérimentales, il est nécessaire de produire 30 embryons par catégorie pour atteindre le seuil de significativité fixé. L’utilisation de 9 génisses permet de limiter le nombre d’intervention sur chaque animal.
Raffinement
L’étude est mise en place sur 9 génisses qui seront ainsi hébergées dans une stabulation libre avec aire paillée intégrale, facilité d’accès à l’auge et à l’eau. Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...). De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement aux collectes d’embryons et aux ponctions ovocytaires. Enfin, dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés, seau de mélasse à lécher,....) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention pour les collectes d'embryons et d'ovocytes.
Choix des espèces
Compte tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon sur le terrain. Afin de produire les embryons du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères et âgées de 14 à 18 mois. Le modèle génisse a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….).
Développement chez la souris d’une nouvelle méthode contraceptive non hormonale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Pour tester une contraception sans hormone, des femelles reçoivent dans le vagin un ovule chargé de lyral, une molécule odorante censée perturber l'orientation des spermatozoïdes, avant d'être mises à l'accouplement. 640 souris Swiss CD1, choisies parce que leurs portées dépassent souvent dix souriceaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une même femelle pouvant recevoir l'ovule jusqu'à trois fois, tenue dans la paume une trentaine de secondes. Le lyral étant allergisant, les souris sont observées chaque jour pendant deux à trois semaines, et celles qui feraient une réaction allergique seraient retirées de l'expérience et mises à mort par dislocation cervicale ou au CO2. Après chaque accouplement, les adultes retournent dans le pool pour d'autres accouplements et les souriceaux nés sont mis à mort immédiatement, sans que le résumé dise ce que deviennent les adultes à la fin du projet.
Objectifs
La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Par ailleurs il a été montré que le bourgeonal, l’un des ligands de hOR 17-4, OR exprimé à la surface des spermatozoïdes humains modifiait in vitro le chimiotactisme de ceux-ci. En parallèle, il a été montré que le récepteur olfactif MOR23 était présent à la surface des spermatozoïdes de souris et que le lyral modifiait lui aussi in vitro le leur chimiotactisme Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide à 0.04% (40 microlitres, 10-5 M) dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris SWISS CD1, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif (test de Fischer), nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.
Bénéfices attendus
Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.
Procédures
L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement alors que la souris sera maintenue dans la paume de l'expérimentateur pendant un temps n'excédant pas 30 secondes pour limiter le stress. Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience et euthanasiées par dislocation cervicale ou par inhalation de CO2 à l'aide d'une chambre d'euthanasie. Par ailleurs, rappelons que les ovules fournis par NextPharma sont de qualité pharmaceutique, fabriqués avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris seront utilisées dès qu'elles sont en âge de se reproduire. Les mâles sont sexuellement matures dès l'âge de 8 semaines et les femelles dès l'âge de 6 semaines.
Création de lignées transgéniques murines pour des gènes impliqués dans l’infertilité humaine
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
960 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 90 réutilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les femelles reçoivent des stimulations hormonales puis sont tuées pour prélever leurs ovocytes, les mâles subissent une vasectomie chirurgicale et les femelles pseudo-gestantes une réimplantation embryonnaire, pour créer des lignées reproduisant des mutations liées à l'infertilité humaine. Le porteur indique que la préhension, les chirurgies et la mise à mort génèrent du stress et que les lignées au phénotype dommageable seront euthanasiées. Il affirme qu'aucune culture in vitro ne permet d'obtenir des gamètes matures et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L'infertilité touche 186 millions de personnes dans le monde (48 millions de couple) et représente donc un problème de santé majeur. Cette infertilité peut etre causée par une déficience au niveau des gamètes aussi bien chez l'homme que chez la femme. Trouver les gènes causals impliqués dans cette infertilité est donc une nécessité afin de pouvoir mieux comprendre leurs mécanismes d'action et proposer des thérapies. L'étude de cohortes de patient(e)s infertiles permet de pointer des gènes potentiellements impliqués. L'objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes ou reproduisant les mutations identifées afin de valider les gènes candidats.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de générer des souris déficientes pour les gènes identifiés par séquencage exomique des cohortes de patient(e)s infertiles et donc de valider les gènes candidats. A court terme, les gènes pourront être utilisés comme facteurs diagnostiques. A plus long terme, selon le phénotype occassionné, une thérapie ciblée pourra être proposée au patient.
Procédures
Injection pour les stimulations hormonales (2 par souris femelles). Chirurgie sur les males pour la vasectomisation (30 minutes par souris, une chirurgie par souris). Chirurgie pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes (20 minutes par souris, 1 par souris).
Impact sur les animaux
Stress au moment de la préhension pour les injections et pour la mise à mort. Stress engendré par la chirurgie, meme si réalisée sous analgésie et anesthésie. Les males vasectomisés et les femelles réimplantées pourront perdre du poids et une inflammation pourra apparaitre au niveau de la plaie.
Devenir
La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons soit d'euthanasier la lignée.
Remplacement
L'étude de la fertilité nécessite l'utilisation d'animaux reproduisant les phénotypes observés chez l'homme. Il est donc compliqué de les remplacer. Il n'existe aucun système de culture in vitro permettant d'obtenir des gamètes matures et fécondables (femelle) ou fécondantes (male).
Réduction
Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an.
Raffinement
Les souris seront placées en conditions de température régulée, nourriture et eau ad libitum. Les animaux seront maintenus le moins de temps possible afin d'injecter les hormones nécessaires à la stimulation ovarienne et aux injections d'analgésiant/anesthésiant. La mise à mort des animaux sera effectuée dans une pièce différente de celle de l'hébergement. La chirurgie des mâles est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les femelles ont leurs ovocytes prélevés après euthanasie. Suite à la chirurgie, en cas d'inflammation de la plaie, un traitement antibiotique sera mis en place.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour générer des animaux transgéniques. Les souris femelles seront utilisées dès 3 semaines pré-puberts et pas au delà de 12 semaines pour la récupération d'ovocytes. En effet, après 12 semaines, les souris répondent moins bien à la stimuation hormonale et le nombre d'ovocytes récoltés décroit. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines.
SNSC – Importance du système neurosécréteur caudal dans l’homéostasie des téléostéens.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
5 940 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie sert à créer des lignées génétiquement modifiées, l'autre subit des variations rapides de température, de salinité, de pH ou d'oxygène, ou la destruction de neurones par un antibiotique. Le porteur indique que ces modifications peuvent altérer la croissance ou la reproduction, et que les reproducteurs sont tués à deux ans quand leurs capacités déclinent. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'étudier un "organisme entier", ce système caudal n'ayant selon lui pas d'équivalent chez les mammifères.
Objectifs
Notre projet est d’étudier les fonctions d’un organe neuroendocrinien situé dans la queue du poisson et appelé système neurosécréteur caudal. Ce système est formé de neurones situés à l’extrémité caudale de la moelle épinière des poissons. Ces cellules produisent différentes hormones qui sont libérées dans la circulation sanguine. Sans doute parce que ce système ne semble pas avoir d’équivalent chez les mammifères, ses fonctions restent très peu connues. Les quelques études disponibles suggèrent une implication dans l’adaptation des poissons aux variations de certains paramètres de leur environnement (température de l’eau, salinité, pH, niveau d’oxygène dissous). Pour notre projet, nous allons utiliser l’organisme modèle poisson-zèbre (Danio rerio). Nos objectifs sont de : 1) Décrire précisément comment ce système est organisé et se met en place au cours du développement du poisson. 2) Déterminer précisément les fonctions de ce système. En particulier, nous allons chercher à identifier quelles hormones sont produites par ce système lorsque le poisson fait face à des variations de son environnement. Puis, nous testerons l’importance de ces hormones dans la réponse physiologique du poisson à ces variations de l’environnement.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre le développement et les fonctions du système neurosécréteur caudal, un organe peu connu des poissons. Les quelques données disponibles suggèrent que cet organe est impliqué dans l’adaptation physiologique des poissons aux variations de leur environnement. Les poissons représentent non seulement une part importante de la diversité des vertébrés mais aussi un élément essentiel pour la biodiversité des écosystèmes aquatiques ainsi qu’une source de nourriture importante pour l’humanité. Les changements climatiques liés à l’activité humaine vont impacter particulièrement les environnements aquatiques en affectant notamment la salinité, le pH, l’oxygène et la température et vont impacter l’ensemble des composantes de ces écosystèmes, en particulier les poissons. Nous pensons que mieux comprendre la physiologie de ces animaux, notamment leurs mécanismes d’adaptation à des variations environnementales, sera utile pour comprendre et anticiper l’influence de ces bouleversements climatiques sur ces animaux. Ceci devrait avoir des implications pour définir les stratégies pour la préservation de ces animaux et de ces écosystèmes ainsi que pour l’élevage et l’aquaculture.
Procédures
Quatre types d’interventions sont utilisés dans ce projet : 1. Création de lignée d’animaux génétiquement modifiés. Des œufs sont obtenus par accouplement naturel de poisson-zèbre reproducteurs élevés et maintenus au laboratoire dans une animalerie confinée et agrémentée. Ces œufs sont injectés à l’aide d’une micro-aiguille contenant les éléments permettant l’ajout d’un gène ou l’introduction d’une mutation inactivant un gène). Les animaux issus de ces œufs sont élevés et utilisés comme reproducteurs. 2. Production d’animaux dépourvus de certaines hormones ou du récepteur à ces hormones. Des reproducteurs génétiquement modifiés sont utilisés pour produire des poisson-zèbre dont le gène permettant la production d’une hormone d’intérêt, ou son récepteur, est inactivé et qui sont donc incapables de les produire. 3. Des expériences consistant à faire subir à des poissons des variations d’un paramètre de l’eau (température, salinité, pH ou niveau d’oxygène dissous). Ces variations sont contenues dans des gammes que l’animal peut rencontrer dans son environnement naturel et durent de quelques heures à quelques jours. 4. Suppressions neurones du système neurosécréteur caudal. Des poissons génétiquement modifiés, dont les neurones du système neurosécréteur caudal sont sensibles à un antibiotique, sont traités avec cet antibiotique ce qui entraîne la mort de ces cellules.
Impact sur les animaux
- La création de lignée OGM est généralement sans effet car les modifications du génomes obtenues sont maintenu à l’état hétérozygote (un seul des deux chromosomes parentaux est affecté). Néanmoins, elle est susceptible d’entraîner des malformations congénitales non souhaitées. De telles malformations sont détectées dès les stades embryonnaires et seuls des animaux ne présentant pas de malformation sont mis en élevage. - Les expériences de variations rapides des paramètres de l’eau sont susceptibles d’entraîner un stress ponctuel des animaux, mais ces variations étant contenues dans des gammes proches de celles pouvant être rencontrées dans le milieu naturel, les stress induits devraient être modérés. - L’inactivation des gènes codant pour les hormones produites par les neurones du système neurosécréteur caudal ou de leurs récepteurs, et la suppression de ces cellules, pourraient entraîner des modifications de la physiologie des animaux engendrant une modification de leur croissance ou de leur capacité à se reproduire. Cela devrait également impacter leurs capacités à s’adapter à des variations des paramètres de l’eau, et pourrait entraîner des stress plus forts ou prolongés lors des challenges.
Devenir
Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Ces animaux sont euthanasiés à 2 ans, car à cet âge les capacités de reproduction diminuent fortement. Dans le cadre des challenges et de la production d’animaux dépourvus de SNSC ou de certaines hormones et récepteurs, les animaux sont euthanasiés à l’issu du challenge pour pouvoir prélever les différents tissus qui feront l’objet d’analyses histologique et moléculaire.
Remplacement
Les processus développementaux et physiologiques tel que ceux étudiés dans ce projet sont complexes et impliquent des interactions entre différents organes et parties du corps. Pour étudier ces processus, il est nécessaire de recourir à des organismes entiers. Des alternatives ont été envisagées, notamment la culture in vitro des neurones du système neurosécréteur caudal étudiés. Néanmoins, l’objectif de ce projet et de pouvoir étudier les fonctions des hormones produites par ces neurones sur l’organisme ce qui n’est pas possible avec les alternatives envisagées.
Réduction
Une partie des animaux utilisés dans ce projet permettra la création de lignées génétiquement modifiées et l’autre partie subira des challenges (variations rapides des paramètres de l’eau) afin de déterminer le rôle du système neurosécréteur caudal et des hormones qu’il produit. Le nombre d’animaux envisagé pour la création des lignées génétiquement modifiées est basé sur notre expérience de ce type d’approche. L’optimisation des protocoles nous permet d’utiliser le moins d’animaux possible. En particulier l’utilisation d’un marqueur visible nous permet de sélectionner les œufs porteurs d’un transgène d’intérêt. Pour notre projet, 16 lignées génétiquement modifiés seront nécessaires. Pour chacune, 50 animaux seront utilisés. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour garantir l’obtention des lignées souhaitées. Pour les expériences de variations des paramètres de l’eau, 10 animaux seront utilisés pour chaque paramètre de l’eau étudié (4 paramètres en tout), à 3 valeurs différentes, pendant 3 durées différentes et à 3 stades différents. Ces expériences seront réalisées sur des animaux sauvages (non génétiquement modifiés) et des animaux génétiquement modifiés. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour pouvoir prélever les tissus d’intérêt afin de réaliser des analyses moléculaire ou histologique. Notre expérience de ce type d’analyse montre qu’un nombre de 10 animaux par condition est nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats qui soient statistiquement significatifs. Pour chaque expérience de variations des paramètres de l’eau, des contrôles adaptés ont été prévus et les données obtenues seront analysées à l’aide de tests statistiques adaptés. De plus, pour chaque animal euthanasié, différents tissus seront prélevés et les échantillons seront conservés afin de pouvoir être utilisés pour différentes analyses sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. D’une façon générale, ce projet a été conçu et organisé de façon à pouvoir, à chaque étape, sélectionner rigoureusement les lignées à produire et les expériences à mettre en œuvre afin de répondre à nos objectifs. Le nombre de lignées et d’expériences prévus, et donc le nombre d’animaux, ont été optimisés afin de répondre au mieux aux objectifs de ce projet, notamment en termes de tests statistiques.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans une animalerie confinée et agrémentée, dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés très régulièrement. Les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche pour assurer une croissance optimale ainsi que de la nourriture vivante (larves d’artémia, rotifères) pour permettre un enrichissement du milieu et sont maintenus à une densité adaptée, y compris pendant les expériences de variations des paramètres de l’eau, afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Pour la création des lignées génétiquement modifiées la sélection des embryons concernés se fait sans avoir recours à des biopsies. De plus, l’observation attentive de ces embryons permet de n’élever que des animaux dépourvus de malformation. Dans le cadre des expériences de variations des paramètres de l’eau et de la production d’animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones, les animaux font l’objet d’un suivi particulier (horaire ou quotidien) par du personnel formé afin de surveiller l’éventuelle apparition d’un trouble locomoteur ou comportemental. Des points limites, définis à l’avance, permettent d’interrompre l’expérience de variations des paramètres de l’eau si nécessaire.
Choix des espèces
L’étude dynamique des processus développementaux et physiologiques n’a de sens qu’à l’échelle d’un organisme entier. Ces processus ne peuvent être reproduits totalement in vitro et nécessitent de recourir à des organismes modèles animaux. Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude génétique. Sa relative facilitée d’élevage, son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités d’édition du génome (production de lignées génétiquement modifiées porteuses d’un transgène ou d’une mutation d’intérêt) en font un modèle de choix pour la recherche. Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Les animaux sont donc utilisés de la fécondation jusqu'à l'âge adulte. Les études physiologiques sur les animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones seront réalisées sur de jeunes larves (2 semaines), des juvéniles (8-10 semaines) et des adultes (4-6 mois) afin d’en tester l’impact en fonction de l’âge des animaux.
Utilisation de modèles de souris Tshz3 pour comprendre les bases cellulaires et moléculaires des troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
99 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de niveau léger. Les femelles gestantes reçoivent une ou deux injections intrapéritonéales de marqueurs cellulaires puis sont tuées, et leur descendance est mise à mort à P30 par perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau, afin d'étudier des interneurones du striatum dans les troubles du spectre autistique. Le porteur classe la procédure comme légère avec peu d'effets, mais décrit une mise à mort par dislocation cervicale ou CO2 en cas de problème détecté. Il affirme que les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l'"organisme entier" en raison de l'isolement des neurones hors de leur contexte.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'utiliser des modèles de souris pour mieux caractériser la contribution des interneurones cholinergiques du striatum dans les troubles du spectre de l'autisme.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de caractériser les substrats cellulaires et moléculaires des défauts de comportement liés aux troubles du spectre de l'autisme ceci afin d’envisager des actions thérapeutiques permettant de corriger ces comportements.
Procédures
Ce projet comprend un seul type d’intervention : injection intra péritonéale de BrdU et/ou de EdU. Chaque intervention dure moins de 5 minutes. Les femelles utilisées pour la production d’embryons, seront sacrifiées par injections intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes reçoivent en intrapéritonéale soit une injection de 5-bromodésoxyuridine (BrdU) soit une injection de BrDU, suivie d’une injection de 5-Ethynyl désoxyuridine (EdU). Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires dans le monde entier. Cette procédure est considérée comme légère avec peu d'effets indésirables (stress lié à la contention, éventuel douleur lié à la 2ème injection intra-péritonnéale). La mise à mort des animaux par perfusion intra cardiaque se fera sous anesthésie générale précédée d’une injection pré-opératoire sous-cutanée de bupréborphine pour limiter la douleur. Ceci étant, le personnel animalier surveille différents paramètres (fourrure ébouriffée, pelage terne, yeux clos, posture voutée, manque d’activité, blessure…). Si un animalier détecte un problème, il prévient par mail ou téléphone le responsable de projet, le chef d’équipe et par mail les membres du SBEA de l’institut. Après un diagnostic réalisé avec le vétérinaire de notre institut, le responsable du projet pourra appliquer des soins adaptés ou devra euthanasier l’animal par dislocation cervicale ou par inhalation de CO2. L’animalier ayant signalé le problème et les membres du SBEA seront informés par mail de la décision prise concernant l’animal.
Devenir
Toutes les femelles gestantes (19) injectées avec du BrdU et/ou EdU seront euthanasiées. Tous les autres animaux (les F1 à P30) seront perfusés en intracardiaque sous anesthésie générale profonde sub létale (voir 3.3.3) pour prélever les cerveaux.
Remplacement
Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus la possibilité d’utiliser des animaux génétiquement modifiés est très utiles pour la visualisation des cellules d’intérêt, leur traçage (« Birth-dating ») et l’analyse des processus cellulaires mis en jeu pendant la morphogenèse des tissus et organes.
Réduction
Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Le nombre d’animaux nécessaires a été estimé sur la base d’expériences antérieures.
Raffinement
Notre établissement possède un agrément pour l’expérimentation animale (Statut EOPS). Les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence d’objets, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Les animaux sont examinés quotidiennement afin de prévoir l’apparition éventuelle de douleur/mal être et veiller à ne pas dépasser des points limites. Après les accouplements, les femelles gestantes seront isolées des males et placées en milieu enrichie. Ce projet de recherche mobilisera toutes les ressources humaines (4 chercheurs statutaires et un doctorant). Tous les statutaires sont d’ores et déjà formés à l’expérimentation animale (formation niveau 1 ou «concepteurs »), le doctorant à suivi les formations et notamment celle de chirurgie. Le personnel formé (4 animaliers) s’occupe de l’entretien des animaux et contrôle quotidiennement l’absence d’anomalies chez les animaux ou dans leur environnement. Conformément à la réglementation, l’ajout de nouveaux objets (en alternance chaque semaine) permet d’enrichir le milieu pour le bien être des souris. Enfin, le laboratoire possède tout l’équipement nécessaire à la bonne réalisation du projet.
Choix des espèces
Les comportements caractéristiques des troubles du spectre de l'autisme (TSA) ne peuvent être étudiés qu’in vivo et les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus les études chez l’animal permettent de caractériser et d’étudier les types cellulaires impliqués dans les TSA. La souris est un modèle de choix car son utilisation par de nombreux laboratoires dans le monde entier pour étudier les TSA donne accès à de nombreuses informations et permet de comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature. Dans ce projet, nous souhaitons mieux caractériser la contribution des interneurones cholinergiques du striatum dans les TSA. Nous utiliserons des embryons controles ou mutants à différents stades du développement pour mieux caractériser le développement de ces cellules et de jeunes adultes (P30) controles ou mutants pour étudier la distribution de ces interneurones dans le striatum postnatal.
Rôle de la microglie dans la période critique (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant du sans réveil au niveau modéré. La microglie de la descendance est altérée in utero, puis les petits subissent une occlusion d'un œil, une imagerie du cortex visuel après incision du cuir chevelu et une perfusion intracardiaque sous anesthésie, les 40 mères étant tuées par dislocation cervicale. Le projet cherche à savoir si la microglie participe à l'établissement de la période critique de plasticité cérébrale. Le porteur renvoie au conditionnel les retombées thérapeutiques, rouvrir un jour la plasticité chez l'adulte, et affirme qu'aucune culture cellulaire ni simulation ne peut remplacer l'enregistrement d'un cerveau intact.
Objectifs
La plasticité cérébrale décrit la capacité du cerveau à remodeler ses connexions en fonction de l'environnement et des expériences vécues par l'individu. Cette plasticité est élevée peu après la naissance et diminue chez l’adulte. Elle est maximale au cours d’une période limitée dans le temps, appelée « période critique », pendant laquelle les circuits neuronaux sont particulièrement susceptibles d’être remodelés en réponse à un changement de l’environnement. Ainsi, une pathologie touchant par exemple la vision pendant la période critique aura des impacts irréversibles sur la perception visuelle par le cerveau. Comprendre les mécanismes permettant la mise en place des périodes critiques est donc essentiel pour espérer un jour rouvrir chez l’adulte une forte plasticité et recouvrer, après un handicap ou un environnement inadéquat pendant leur mise en place, des réseaux neuronaux optimaux. Cependant, nos connaissances sur ces mécanismes restent profondément incomplètes, et le présent projet a pour objectif d’étudier si la microglie participe à l’établissement de la période critique. La microglie est en effet une population de cellules du cerveau dont le rôle est d’assurer la défense immunitaire grâce à ses capacités phagocytaires. Des données préliminaires ont montré qu’une altération du niveau de microglie chez l’embryon de souris induisait une modification profonde des circuits neuronaux après la naissance. En particulier, certains de ces circuits neuronaux sont connus pour être des régulateurs importants de l'ouverture de la période critique. Cela suggère donc un rôle majeur de la microglie dans l’établissement de la période critique. Le but de ce projet est maintenant de tester si des changements de plasticité ont lieu in vivo dans le but de confirmer ces résultats préliminaires et de caractériser ainsi les conséquences de modifications prénatales des microglies sur la période critique.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, nos connaissances concernant le rôle de la microglie dans l’établissement des périodes critique est profondément incomplet. De plus, la compréhension des mécanismes qui sont impliqués ouvre donc des perspectives thérapeutiques de pouvoir réinstaller une plasticité neuronale chez l’adulte et rétablir des connexions corticales normales suite à une pathologie pendant l’enfance.
Procédures
Pour les animaux dont la microglie aura été altérée in utero: 3 procédures distinctes seront réalisées sur le site demandeur. Les animaux subiront d'abord une occlusion monoculaire (environ 20 min, classe légère). La plasticité induite par cette occlusion sera évaluée dans le cortex visuel par imagerie (environ 2h, classe modérée) suivie d'une perfusion intracardiqaue (environ 30 min depuis l'analgésie initiale, classe sans réveil). Pour les mères: Aucune intervention ne sera effectuée sur le site demandeur.
Impact sur les animaux
Pour les animaux dont la microglie aura été altérée in utero: La procédure d'occlusion est rapide (environ 15 minutes, une seule fois) et de classe légère. Néanmoins, cela peut mener à un inconfort dans les jours suivants et une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte et présente une plaie autour de l’œil. Pour l’enregistrement par imagerie intrinsèque (environ 2h, une seule fois), la peau au-dessus du crâne sera incisée ce qui peut engendrer une douleur. Pour les mères aucune nuisance particulière n'est attendue.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés: Par dislocation cervicale pour les mères ayant servies à altérer l'expression de la microglie in utero ou par perfusion intracardiaque pour les autres.
Remplacement
Des données préliminaires obtenues in vitro par l'équipe partenaire indiquent que les circuits neuronaux impliqués dans la période critique sont modifiés suite à une altération de la microglie in utero. La prochaine étape consiste à tester directement cette hypothèse in vivo au sein d'un organisme complexe. Il n’est pas alors possible de remplacer les enregistrements du cerveau intact par des simulations ou par des cultures de cellules du cerveau.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, la taille de chaque lot a été optimisé pour pouvoir utiliser le test statistique approprié. Nous estimons à 10 animaux la taille optimale par lot, ce qui porte à 520 le nombre d'animaux total (480 animaux seront enregistrés, auxquels s'ajoutent 40 mères qui accompagneront les animaux en plus bas âges)
Raffinement
Pour les animaux dont la microglie aura été altérée in utero: Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Suite à l'occlusion monoculaire, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant 3 jours et une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte et présente une plaie autour de l’œil. Dans ce cas, nous procéderons à une désinfection de la zone opérée et, à l’application d’un anesthésique local (lidocaïne). Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris opérées pour détecter tout inconfort et un analgésique (Metacam) pourra être injecté si besoin. Pour l'expérience d'imagerie, pour pallier à la douleur induite par l'incision de la peau au-dessus du crâne, de la lidocaïne sera injectée avant. De plus, la technique d'imagerie utilisée pour l’enregistrement de l’activité cérébrale est minimalement invasive et ne nécessite pas de chirurgie lourde. Pour les mères un suivi sera effectué en même temps que leur progéniture pour déceler des changements dans leur comportement et leur apparence. Tous les animaux seront logés à plusieurs dans des cages enrichies à l'aide de coton pour faire leur nid et boisson et nourriture à volonté.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin qui est un modèle idéal puisque son développement est proche de celui de l’homme. La souris est l’espèce animale la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd’hui. Elle permettra une meilleure reproductibilité́ des résultats et une meilleure comparaison avec ceux publiés dans la littérature. De plus, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Ces animaux seront testés soit à P21, P28, P50 et P100. Ces âges constituent des âges remarquables pour la plasticité visuelle chez la souris car : - La période critique pour la dominance oculaire chez la souris est maximale vers P28. - A P21, la période critique commence à s’ouvrir. - A P50, la plasticité est largement réduite - A P100 la période critique est totalement fermée.
Étude du développement neuronal chez la larve de Xénope pour un projet éducatif
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
90 femelles xénopes vont être utilisées, réutilisées ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une injection d'hormone pour induire la ponte, dont les œufs servent à familiariser des étudiants de master au développement neuronal précoce. Le porteur revendique un "bénéfice d'enseignement" et affirme qu'une vidéo, déjà testée, ne suffit pas et qu'il est "indispensable" que les étudiants observent les larves en travaux pratiques. Il souligne que le xénope évite d'avoir à tuer les femelles pour récupérer les œufs, ce qui en ferait selon lui la "meilleure alternative animale".
Objectifs
L’objectif du projet est la formation d’étudiants en Master dans le domaine des neurosciences développementales et les familiariser aux modèles expérimentaux les mieux éthiquement adaptés selon les questions scientifiques posées. Spécifiquement notre objectif est d'initier les étudiants du Master 2 aux approches expérimentales qui ont permis de découvrir les bases moléculaire et cellulaire de 1- l'induction des axes embryonnaires ; 2- L'induction neurale ; 3- La détermination identitaire des territoires neuraux ; 4- la signalétique impliquée ; 5- la migration cellulaire ; 6- la production d'organoïdes chez amphibien. Il a aussi pour objectif de familiariser les étudiants avec les modèles d'études in vivo.
Bénéfices attendus
Bénéfice d'enseignement.
Procédures
Un seul geste technique consistant à réaliser une seule injection d’hormone de croissance chez des femelles de xénope (quelques secondes par animal).
Impact sur les animaux
Nuisance set effets indésirables minimes, restreints à la contention et l’injection.
Devenir
Après induction de la ponte, les femelles retournent en élevage dans les animaleries. Au préalable, les expérimentateurs s’assurent que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général sur une période de 24h.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un cours de Neuroscience et vise à montrer aux étudiants certains mécanismes moléculaires de développement précoce, en utilisant un modèle vertébré : la grenouille Xenopus Laevis. L’utilisation de vidéo a déjà été testée pour d’autres aspects du cours dans le contexte de pandémie et de distanciation et il est apparu clairement qu’il est indispensable que les étudiants observent les larves et suivent les étapes développement en travaux pratiques et de façon la plus intéractive avec l’enseignant. Les étudiants travaillent uniquement sur des oeufs et des larves de Xenope laevis. Dans le cadre d’un enseignement, le modèle Xénope est particulièrement bien adapté car c'est l'une des espèces modèles les plus robustes ce qui garantit une réussite expérimentale. Il présente une cinétique de développement rapide permettant d’observer le développement dès l’étape de fertilisation sur œufs, les stades précoces de développement et l’apparition de la plaque neuronale en quelques heures, dans des conditions externes à l’animal producteur. Nous induisons la ponte de manière non invasive (sans chirurgie). Une seule injection sous-cutanée d’hormone aux femelles Xenopus laevis est nécessaire et n'entraîne aucune réaction de la femelle. La récolte des œufs est faite en mimant le geste d’amplexus du mâle, i.e. en saisissant la femelle de façon à la maintenir en contention tout en dirigeant le cloaque vers une boite de pétri pour déposer les œufs. Les xénopes adultes ne sont pas manipulés par les étudiants, mais uniquement par l’encadrant chercheur spécialiste de ce modèle. Le choix de cette espèce est la meilleure alternative animale étant donné les nuisances très limitées et la survie des femelles car permettant l’étude de stades précoces au développement externe et non au sein d’une cavité utérine comme cela serait le cas pour d’autres espèces animales. Le choix des xénopes permet de ne pas avoir à euthanasier les femelles pour récupérer les produits de la fécondation, et représente donc en soit la meilleure alternative animale pour répondre aux objectifs du projet. Les xénopes adultes ne sont pas sacrifiés en fin d’expérience et seront réutilisés en laboratoire de recherche fondamentale. Le transport des xénopes entre laboratoires tel qu’effectué et de très courte durée, n’affecte aucunement la survie des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus pour le projet est calculé par rapport au nombre d’embryons nécessaires à la réalisation d’expériences pour un groupe de 20 étudiants par session annuelle (18 animaux pour 20 élèves). Les animaux pourront être ré-utilisés pour d'autres projets externes.
Raffinement
L'injection et la contention (geste qui mime le geste d’amplexus du mâle, i.e. en saisissant la femelle de façon à la maintenir en contention tout en dirigeant le cloaque vers une boite de pétri pour déposer les œufs) sont réalisés par le concepteur qui a une longue expérience. Dans les deux cas le geste est fait en maintenant fermement la femelle et en lui cachant les yeux ce qui diminue son stress. Quand le geste est bien fait l'animal ne réagit pas. En cas de réaction intempestive le geste est arrêté.
Choix des espèces
Dans le cadre d’un enseignement, le modèle Xénope est particulièrement bien adapté car c'est l'une des espèces modèles les plus robustes ce qui garantit une réussite expérimentale. Il présente une cinétique de développement rapide permettant aux étudiants d’observer le développement dès l’étape de fertilisation sur œufs collectés, les stades précoces de développement et l’apparition de la plaque neuronale en quelques heures, dans des conditions externes à l’animal producteur. Les études sur cette espèce ont été à la base de découvertes majeures en biologie du développement du système nerveux. C'est une espèce sur laquelle il est possible de générer facilement des organoïdes. Il s’agit d’animaux adultes ayant atteints la maturité sexuelle pour qu’ils puissent produire des oeufs afin que les étudiants d’étudient les stades très précoces du développement (dès fécondation).