Système gastrointestinal
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Etude de l’efficacité de médicaments candidats dans des modèles précliniques de cholestases génétiques
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections de virus sous anesthésie puis des médicaments candidats par voie orale ou intrapéritonéale, avant le prélèvement de leur sang, de leur bile et de leur foie. Le projet teste des molécules censées éviter ou retarder la transplantation hépatique dans des maladies rares du foie de l'enfant. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour tester in vivo l'efficacité de ces médicaments candidats.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de valider à un stade préclinique l'efficacité de médicaments candidats à améliorer la condition d'animaux mimant des maladies hépatiques humaines rares et sévères appelées Cholestases Intrahépatiques Familiales Progressives de type 2 et 3 (PFIC2/3 en anglais). Les molécules candidates qui seront testées chez les animaux auront été sélectionnées au préalable sur la base de tests effectués sur des cultures cellulaires. Afin de mettre en évidence l'efficacité des molécules testées, la composition de la bile d'animaux traités avec ces molécules sera comparée à celle d'animaux contrôles non traités. Ainsi, la molécule la plus pertinente sera considérée comme un médicament candidat, alternative à la transplantation hépatique, procédure lourde et compliquée par le manque de greffons, requise pour la majorité des patients atteints de PFIC2/3.
Bénéfices attendus
La majorité des patients atteints de maladies hépatiques rares et sévères telles que les PFIC (Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis) ont besoin d'une transplantation hépatique avant l'âge adulte, du fait de la faible efficacité des traitements actuellement proposés. Ce projet est une étude préclinique qui vise à évaluer l'efficacité de médicaments candidats à améliorer les paramètres hépatiques d'animaux mimant ces pathologies humaines. Si l'efficacité de ces nouvelles molécules est confirmée, leur transfert vers le patient sera envisagé afin d'éviter, ou au moins de retarder, la transplantation hépatique pour ces malades.
Procédures
Les seules nuisances que les animaux devraient subire sont liées à des injections. Les souris subiront deux injections de virus à intervalle de 7 ou 14 jours sous anesthésie générale, chaque intervention (anesthésie + injection) ne devant pas dépasser une durée de 10 minutes. Les médicaments candidats seront administrées soit par voie orale (30 secondes maximum par animal), soit par injection intrapéritonéale après anesthésie locale (20 minutes maximum par intervention). L'administration des médicaments candidats se fera pendant trois jours avec au maximum deux traitements par jour. Suite à ces traitements, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les échantillons biologiques.
Impact sur les animaux
L'injection des particules virales et des molécules candidates ne devraient pas engendrer d'effets indésirables notables, sur la base de la littérature existante et de nos données obtenues au préalable dans nos modèles cellulaires. Suite à ces injections, les animaux seront suivis afin d'identifier une éventuelle détresse telle que la peur, le stress ou la douleur. Si de tels effets indésirables sont observés, une attention particulière sera apportée afin de limiter au mieux ces nuisances, comme par exemple en modifiant l'environnement et/ou l'enrichissement dont les animaux bénéficieront.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. Dans ce projet, le recours à l'euthanasie est indispensable dans le but de prélever et d’étudier les fluides (sang, bile) et tissus (foie) impliqués dans les maladies que nous cherchons à traiter.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet d'étude préclinique, il n’existe pas de méthode alternative pour remplacer l'expérimentation animale, notre objectif étant de tester in vivo l'efficacité de médicaments candidats.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Le nombre d’animaux a été évalué à 8 pour chaque groupe, sur la base de nos analyses statistiques préalables. ce qui permettra d'obtenir des résultats suffisamment fiables pour ne pas avoir à effectuer de nouvelles expériences. Par ailleurs, les conditions expérimentales testées ont été réduites au maximum afin d'utiliser le moins d'animaux possible sur l'ensemble de ce projet.
Raffinement
Les animaux seront anesthésiés pour les injections ainsi que pour la procédure finale (prélèvement et euthanasie). L’environnement sera enrichi, la nourriture et l’eau seront disponibles à volonté. Si l’animal atteint un niveau de souffrance important, il sera tout d'abord soulagé par l’administration d’un analgésique ; et si les symptômes persistent ou sont trop sévères, l'animal sera euthanasié. Les animaux seront examinés quotidiennement par du personnel qualifié. Les souris seront accueillies dans une animalerie au statut sanitaire strict et prises en charge par du personnel formé et qualifié.
Choix des espèces
L'utilisation de modèles animaux, en particulier les souris, est très référencée dans la littérature scientifique pour la validation préclinique de médicaments candidats. Leur petite taille permet d'héberger un grand bombre d'animaux dans l'espace confiné d'une animalerie, permettant ainsi l'analyse de nombreuses conditions expérimentales tout en maintenant une importante puissance statistique. De plus, la littérature scientifique rapporte des approches similaires à ce projet dans le cadre de la thérapie génique (injection de virus), soulignant ainsi la pertinence du modèle choisi dans le cadre de notre projet. Les souris utilisées seront de jeunes adultes de 6 à 8 semaines pouvant supporter au mieux la procédure. Les souris seront euthanasiés au plus tard à l'âge de 12 semaines.
Décrypter le vieillissement intestinal accéléré dans un modèle murin de Progéria ou syndrome de Hutchinson-Gilford
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles portent un modèle de progéria, une maladie de vieillissement accéléré, et subissent biopsie de la queue, gavages et prélèvements sanguins sous anesthésie pour l'étude du vieillissement intestinal. Le porteur indique que les animaux transgéniques présentent un vieillissement accéléré, la gravité sévère concernant 750 des 790 souris. Il décrit le recours au modèle animal comme "essentiel", tout en signalant avoir développé des "mini-colons" in vitro pour en limiter le nombre.
Objectifs
Le syndrome de Hutchinson-Gilford (HGPS) également appelé progeria est une maladie génétique pédiatrique conduisant à un vieillissement accéléré. Les enfants atteints présentent des retards de croissance, des malformations cutanées et osseuses et des anomalies cardiovasculaires, réduisant fortement leur espérance de vie. Cette maladie conduit à la production d'une protéine toxique appelée progerine difficilement détectable dans les tissus. La progérine est responsable d'un vieillissement cellulaire précoce et accéléré notamment au niveau des cellules souches. L’impact de la maladie sur le vieillissement intestinal n’a à ce jour jamais été caractérisé. Notre projet vise à caractériser lce viellissement dans un modèle de souris transgénique reproduisant la maladie et à l’élaboration d’un modèle murin facilitant la détection de la progérine dans les tissus.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'explorer les perturbations profondes qui se produisent dans le tissu intestinal chez les enfants atteints de cette maladie génétique. Nous allons également créer un tout nouveau modèle tissu- et cellule-spécifique pour étudier les effets du vieillissement dans le contexte de la maladie progerique. Cette avancée pourrait nous permettre de développer des thérapies innovantes, et ainsi leur offrir la possibilité d'accroitre leur espérance de vie.
Procédures
Le génotypage des souris se fera par une biopsie caudale en quelque secondes. Nous évaluerons la qualité de la permeabilité de la barrière par l'administration par gavage d'un composé non toxique de quelques minutes. Le gavage sera réalisé chez le même animal à la phase précoce, intermédiaire et tardive de la maladie progérique. Le prelevement sanguin pour detecter le composant se fera sous anesthésie générale brève de quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de la maladie progérique vont présenter une viellissement accéléré. Le genotypage des souris nécessite une biopsie caudale dont la douleur est prévenue par l'application d'anesthésique cutané. Le gavage intestinal est une source de stress et nécessite une expertise afin d'éviter des fausses routes. Le prélèvement sanguin peut générer douleur et stress qui seront prévenus par une brève anesthésie générale .
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure du projet pour des analyses post-mortem des tissus. Cette analyse permettra de déterminer l’impact de la maladie sur l’homéostasie du tissu intestinal.
Remplacement
L'étude de la physiopathologie du tissu intestinal, en renouvellement permanent, et en particulier dans un syndrome de veillissement accéléré, ne peut pas être réalisée en dehors du contexte d'un organisme complet, à l'issue d'un processus de développement et de viellissement caractéristique des mammiféres. Le modèle animal est donc essentiel à la compréhension de cette maladie.
Réduction
Nous utiliserons un nombre maximum de 360 animaux porteurs de la maladie progérique. Les animaux non utilisés pour cette caractérisation seront sinon éliminés avant l'apparition des premiers signes cliniques de vieillissement. Nous avons réduit le nombre d’animaux nécessaires à cette étude en développant un modèle de « mini-colons » in vitro dans tous les cas où cela semble possible. Ces mini-colons sont produits à partir de cellules souches intestinales prélevées après la mise à mort des animaux et pourront être utilisé pour des traitements in vitro. Enfin, la production de souris hétérozygotes portant la mutation de cette maladie et présentant un phénotype de vieillissement plus modéré sera privilégiée si les résultats scientifiques démontrent sa pertinence par rapport à la maladie humaine.
Raffinement
Nous garantirons la protection du bien-être des animaux porteurs du transgène, par la mise en place de mesures de raffinement spécifiques et adaptées : alimentation ramolie au sol, protection des nouveaux-nés contre l’hypothermie, points limites spécifiques basés sur le système de score reconnu pour ce modèle (pelage, démarche, activité, poids). Une surveillance quotidiennement par les zootechniciens et l'enrichissement de leur environnement seront assurés.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix reproduisant cette maladie pédiatrique et permettra d'identifier, grâce à l'expression de rapporteurs conditionnels, les types cellulaires produisant la protéine toxique progérine au sein des tissus. Les animaux étudiés dans ce projet sont tous adultes car la protéine toxique progerine responsable du vieillissement accéléré ne s'exprime pas dans les stades précoces de vie.
Étude du rôle de MLKL, effecteur de la nécroptose, dans les maladies hépatiques sur des modèles murins (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent des maladies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires imposés pendant huit à seize semaines, avec gavages, injections intrapéritonéales, mises à jeun et prélèvements sanguins répétés. Le projet vise à tester l'effet de l'inhibition de la mort cellulaire dans la cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non alcoolique. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier" et attend de l'étude une simple preuve de concept.
Objectifs
La cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique sont des maladies ne disposant d’aucun traitement pharmacologique formel validé. La stéatose hépatique non-alcoolique va devenir la première cause de transplantation hépatique et la cholangite sclérosante primitive est une maladie dont les mécanismes moléculaires sont très mal caractérisés, il est dit d’elle que c’est la dernière boîte noire de la médecine qui s’intéresse à l’étude du foie. Ce projet a donc pour objectif de mieux caractériser rôle de la mort des différentes populations cellulaires dans le développement de ces maladies. Il permettra d’identifier et de cibler des populations clés dans le développement de la maladie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques dans ces pathologies pourra constituer la base d’un dépôt de brevet. La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons réaliser une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux caractériser des maladies du foie sans traitement pharmacologique disponible actuellement. D’un côté la cholangite sclérosante primitive, maladie rare mais grave exposant au risque de cirrhose et de cancer. Actuellement, le seul traitement efficace de cette maladie est la transplantation hépatique. Or ce traitement est réservé aux patients avec une maladie avancée et n’est pas toujours possible en cas de cancer. Il est donc primordial d’étudier d’autres pistes thérapeutiques. De l’autre côté, la stéatose hépatique non alcoolique est la maladie hépatique la plus commune car elle suit la courbe de progression de l’obésité. Bien que sa prévalence explose, aucun traitement n’est disponible à ce jour, et le nombre de patients au stade terminal de la maladie (c’est-à-dire cirrhose) nécessitant une transplantation hépatique est en croissance perpétuelle. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique de l’inhibition de la mort cellulaire sur le développement de ces maladies.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de pathologies hépatiques et à leurs traitements. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Injections intrapéritonéale (1x/j/pendant 5 jours/5 sec animal vigile)+Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime)+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 2-Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime) )+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.
Impact sur les animaux
La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. L’induction de ces pathologies est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet et trouver des thérapies innovantes. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies du foie étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les molécules sont bien tolérées par les souris. Les administrations par gavage, les injections intra-péritonéales, et les prélèvements sanguins nécessaires durant les tests métaboliques peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. De façon extrêmement rare, ils peuvent induire des microlésions ou des irritations. Les tests métaboliques effectués peuvent également induire un stress pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun ou encore l’isolement en cas d’utilisation de cage métabolique. De même, le transport des animaux qui pourra être mis en œuvre sera également source de stress pour les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=720) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures. L'euthanasie sera pratiqué au sein de l'établissement d'origine des animaux. En effet, pour rappel, la présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons réaliser une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.
Remplacement
L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de la cholangite sclérosante primitive ou la stéatose hépatique non-alcoolique, la complexité cellulaire ne pouvant être répliqué in vitro. Nous avons besoin étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de nos gènes d’intérêts dans un type cellulaire donnée, sur les autres types cellulaires dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
Un total de 720 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui sont malheureusement nécessaires pour mener à bien ce projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les inhibiteurs sont bien tolérés par les souris. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : Le projet a pour objectif d’étudier le rôle de la nécroptose dans les processus physiopathologiques aboutissant à la cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique. Afin de répondre à cet objectif, l’expression de certains gènes d’intérêts dans les modèles animaux utilisés doit être altérée génétiquement dans des types cellulaires choisis, ce qui justifie le choix de cette espèce (souris). Justification des stades : Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 et 8 semaines pour chaque procédure. Cela correspond à l’âge adulte, deux semaines après le temps du sevrage. De plus, les variations entre les souris sont minimales ce qui permet de diminuer la variabilité (aspects métaboliques) entre animaux avant le début des traitements. Cet âge de départ permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Justification du sexe : Nous favoriserons l’utilisation des deux sexes (idéalement 50/50) afin de ne pas introduire un biais dans nos études notamment lors des tests d’inhibiteurs pharmacologiques dans le développement des maladies étudiées. En effet, il est maintenant établi que lors des expérimentations et autres tests médicamenteux, les souris mâles sont plus exploitées que les souris femelles. Cela introduit donc un énorme gap puisque les femelles peuvent réagir différemment sur le plan de toxicité, du métabolisme ou encore de la biodisponibilité. Étant donné que notre but est de proposer de nouveaux traitements, il nous apparait essentiel d’analyser les deux sexes afin que les résultats puissent être transposés à l’homme.
Impact d’interventions nutritionnelles sur les structures du microbiote digestif et les réponses immunes associées en condition basales, de dysbiose et inflammatoires.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 350 d'entre elles, modéré pour 200 et sévère pour 700. Elles subissent des colites provoquées chimiquement par le DSS ou le TNBS, avec douleur, perte de poids, diarrhée et saignements digestifs, associées à des gavages et des prélèvements sanguins, pour évaluer des interventions nutritionnelles et vaccinales sur le microbiote intestinal. Le porteur indique que l'effectif est un maximum estimé pour les projets et contrats à venir du prochain quinquennat, prestations industrielles comprises. Il affirme qu'il n'est pas possible de remplacer la souris comme modèle intégré de physiologie digestive.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans une thématique générale d’évaluation de multiples interventions susceptibles de moduler l’homéostasie générale des muqueuses et les réponses immunes locales et systémiques, en conditions basales et divers contextes physio-pathologiques chez la souris. L’étude permettra de renseigner sur l’efficacité de traitements préventifs ou thérapeutiques ainsi que la compréhension des mécanismes associés aux protections mises en évidences, en particulier en modifiant transitoirement ou durablement la structure du microbiote intestinal et/ou l’immunité de l’individu. Il s’agit d’un projet intégré combinant plusieurs procédures distinctes, rassemblées ici, et ayant pour la plupart déjà fait l’objet d’autorisations antérieures, en vue d’un renouvellement. Les interventions préventives ou thérapeutiques envisagées comprennent (i) des conditions nutritionnelles, consistant en l’apport de microorganismes de qualité alimentaire (vivants, inactivés ou sous forme de fractions), de matrices alimentaires, prébiotiques (fibres de nature polysaccharidique et/ou substances protéiques), vitamines ou minéraux, acides biliaires et analogues, seuls ou en combinaisons, tous considérés comme sans dangers (microorganismes de classe I) ; (ii) d’immunisations par microorganismes vivants, inactivés ou sous forme de fractions purifiées. Les divers contextes physio-pathologiques modélisés sont (i) des colites expérimentales induites chimiquement (DSS pour sodium de dextran sulfate) et TNBS pour trinitrobenzène d'acide sulphonique), mimant les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ; (ii) des colonisations intestinales par différents microorganismes non pathogènes, issus du microbiote murin ou humain (Escherichia coli, Enterobactéries spp., levures, bactériophages) ou isolées d'un écosysteme alimentaire (produits fermentés). Ces études documentent ainsi les potentialités anti-inflammatoires et homéostatiques de stratégies nutritionnelles ciblées (probiotiques, prébiotiques, métabolites alimentaires) et vaccinales, en considérant le rôle du microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Identifier les potentialités anti-inflammatoires et homéostatiques de molécules ou microorganismes (probiotiques, prébiotiques, métabolites alimentaires), en considérant le rôle du microbiote intestinal ;
Procédures
Seuls des gavages non invasifs/non traumatisants sont réalisés sur animaux vigiles; les différents prélèvements sanguins uniques sont réalisés sous anesthésie ou post-mortem;
Impact sur les animaux
La sévérité des colites expérimentales implique potentiellement douleur, perte de poids, diarrhée, saignement digestif d’une durée moyenne variable de 5 jours dans les modèles aigus (DSS, TNBS), et 3 fois 10 jours (altérnés de périodes de rémission) dans les modèles chroniques. Cette sévérité est ici relative car les modèles sont déclinés pour autoriser des colites de faible intensité, permettant d'objectiver les potentialités thérapeutiques.
Devenir
Les animaux sont mis à morts pour prélèvements multiples post-mortem
Remplacement
Il n'est malheureusement pas possible de remplacer le modèle intégré de physiologie digestive, nutritionnelle et immunitaire que représente la souris. Toutefois nous développons actuellement au laboratoire des méthodologies alternatives utilisant des invertébrés tels que le nématode Caenorabditis elegans ou encore Galleria
Réduction
Le nombre prévisionnel d’animaux dépend des projets et contrats de recherche ; il sera reconsidéré à la baisse aux vues du quinquennat précédent lors du renouvellement de la demande d’autorisation. Par ailleurs, l’intensité des colites étant variable selon les lots d’animaux et les périodes de l’année (probablement dûe aux variations de microbiote intestinal), nous testons maintenant dans une expérience préliminaire de 4 à 5 jours sur quelques animaux (3 à 5) une dose de Sulfate de dextran sodium (DSS) orale ou de Trinitrobenzene sulfonic cid (TNBS) intrarectale pour chaque nouveau lot de souris commandé. Ceci permet d’évaluer l’intensité moyenne de la colite induite et d’anticiper la dose optimale ; une colite trop faible ou générant une mortalité inattendue étant ininterprétable. Cette methodologie épargne substantiellement des animaux (3R) et limitent une surmortalité; le developpement de la modélisation in vitro d'organoïdes intestinaux permet également de réduire en amont le nombre des animaux utilisés. Pour chaque série d'experience de colite expérimentale (DSS ou TNBS), un maximaum de 5 groupes expérimentaux de n=10 animaux sont comparés entre eux en regard d'un groupe controle positif d'induction de la colite sans traitment (n=10) et d'un groupe controle négatif sans inductiuon de colite (n=8 à n=10); Cette puissance statistique est nécessaire et suffisante pour conclure evec certitude sur l'efficatioé ou non d'un traitement, s'appuyant sur la dispersion des valeurs des différents paramètres étudiés (expression de gènes pro-inflammatoires, scores histologiques, perte de poids des animaux cf point 2.4.10. Ces effectifs de n=10 par lots sont unanimement reconnus et validés par de nombreuses publications scientifiques, autorisant des test non paramétrique de type Mann & Withney et Kruskall-Wallis, appropriés à la comparaisons de 5 à 6 groupe de petits echantillons (n
Raffinement
L'amélioration de l'enrichissement et des conditions d'hébergement sont des soucis constants de la logistique et du comité du bien-être animal et des utilisateurs de notre plateforme d'animalerie, incluant la formation initiale et continue du personel. S'il n'est pas possible d'uiliser des molécules anti-inflammatoies pour ne pas interferer avec l'objet de l'expérimentation, l'observation bi-quotidienne des animaux permet de définir les points limites (cf procédures) et de recourir le cas échéant à une mise à mort pour épargner d'éventuelles souffances aux animaux. Cest points limites concenent l'observation et l'inteprétaton gaduée des signes de mal-être par la prise alimentaire et de boisson /masse pondérale, la posture, la vocalisation et l'espect du pelage.
Choix des espèces
La souris représente le modèle le plus accessible et le plus pertinent pour modéliser la physiologie digestive des vertébrés supérieurs à sang chaud. En particulier, le systême immunitaire complexe et la diversité des microbiotes sont relativement proches. Les animaux utilisés sont adultes, âgés de 6 à 8 semaines, offrant une physiologie digestive mâture (absorption intestinale et intégrité épithéliale) et des systèmes intégrés de détoxification, immunologiques et de stress oxydatifs optimaux.
Etude pré clinique d’une biothérapie innovante dans les maladies mucosales inflammatoires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 144 d'entre elles, modérés pour 80 et sévères pour 520. On leur provoque une colite ou une cholangite, notamment par une chirurgie d'ouverture de l'abdomen avec ligature du canal cholédoque, puis on leur inflige des injections intrapéritonéales quotidiennes d'anticorps, l'animal développant diarrhées, saignements et perte de poids. Le porteur indique arrêter la procédure dès qu'un point limite est atteint, sans en détailler les seuils. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'une colite et présente la souris comme "le plus petit animal adapté" et un "prérequis indispensable".
Objectifs
L'effet thérapeutique potentiel d'anticorps spécifiques susceptibles d'exercer des effets anti-inflammatoires et /ou régénératifs applicables à l'homme ne peut être évalué qu'in vivo sur des modèles validés de colite. L'efficacité des anticorps (spécificité, affinité, etc...) sera préalablement testée in vitro afin de sélectionner les plus performants dans la reconnaissance de leur cible et leur effet bloquant anti-inflammatoire
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étude sont doubles : 1- valider expérimentalement l’effet thérapeutique de l’anticorps candidat sur les maladies inflammatoires intestinales et sur la cholangite. Cette étape cruciale quant à l’efficacité du traitement, sera le point de départ du second bénéfice à savoir la production à visée médicale de l’anticorps et à plus long terme son entrée en phase clinique.
Procédures
Procédure 1 Evaluation de l'efficacité des anticorps : Injection intrapéritonéale de 2 secondes 1fois). Administration orale avec une sonde 3 secondes 1fois. Procédure 2 Pharmaco-cinétique de l'anticorps candidat : Injection intrapéritonéale de l’anticorps candidat 2secondes 1seule fois. Procédure 3 Effet curatif d'un anticorps sur la colite : Injection intrapéritonéale quotidienne d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Procédure 4 Effet curatif des anticorps sur la colite : Instillation par voie anale avec une sonde de gavage souple 1 minute une seule fois. Injection intrapéritonéale quotidienne d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Procédure 5 Effet pro-régénératif de l'anticorps sur la reconstruction de l'épithélium intestinal post colite : Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection pendant 14 jours ou 21 jours. Procédure 6 Effet anti-fibrosant de l’anticorps candidat dans un modèle de fibrose intestinale induite par une colite chronique : Injection intrapéritonéale de l'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection pendant 28 jours et 66 jours 3 fois par semaine. Procédure 7 Effet de l'anticorps sur la cholangite : Cholangite induite par l’alimentation : Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Cholangite induite par la ligature du canal cholédoque : Chirurgie comprenant laparotomie et ligature du canal cholédoque 20 minutes. Injection sous cutanée d’analgésie 2secondes 1fois à deux fois par souris en fonction de la récupération des animaux post opératoire. Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection.
Impact sur les animaux
Les souris seront surveillées quant à leur comportement et aux signes indicateurs de colite (diarrhées, saignements dans les selles, prostration, poils hérissés et perte de poids) et seront pesées quotidiennement à partir de l'apparition des premiers signes cliniques.
Devenir
Dès qu'un points limite est atteint nous procédons à l'arrêt de la procédure et les organes d'intérêts seront annalysés par immunohistologie.
Remplacement
IL est impossible d’évaluer l’effet thérapeutique d'anticorps sur un modèle in vitro ou in silico. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire la complexité d’une colite, et seul le modèle animal permet de conduire ce projet. La souris est le plus petit animal adapté à ce travail avec une littérature validant ce choix
Réduction
L’effectif proposé tient compte de la mortalité possible liée à l’induction de la colite et du fait qu’un effectif plus faible ne permettrait pas de démontrer une différence statistique significative.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes de mieux/mal être). Les effets du traitement seront contrôlés par des pesées et une surveillance selon un score standardisé de colite clinique. Ce score correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'anesthésiant pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux : l’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).
Choix des espèces
Le modèle murin de colite inflammatoire dans les conditions de ce protocole est largement validé et décrit dans la littérature. Son utilisation est un prérequis indispensable à l'élaboration d'un anticorps à visée thérapeutique de la maladie de Crohn. L'effet thérapeutique potentiel d'anticorps spécifiques susceptibles d'exercer des effets anti-inflammatoires et /ou régénératifs applicables à l'homme ne peut être évalué qu'in vivo sur des modèles validés de colite. L'efficacité des anticorps (spécificité, affinité, etc...) sera préalablement testée in vitro afin de sélectionner les plus performants dans la reconnaissance de leur cible et leur effet bloquant anti-inflammatoire. Les protocoles seront réalisés avec des souris de 6-7 semaines. Notre expérience des traitements pour une colite inflammatoire ou de la cholangite montre que l'âge des animaux influe fortement sur leur réactivité et sur la reproductibilité de la colite induite. L'inflammation colique génère des diarrhées qui participent à la perte de poids des animaux. Des souris utilisées à un âge trop jeune sont plus sensibles et sont susceptibles d'atteindre très rapidement les points limites que nous nous sommes fixés avant la fin de l'expérience. Des souris plus âgées sont moins sensibles et de facto déclenchent des colites plus contrôlables limitant les décès inopportuns pour des résultats similaires.
Étude de l’origine immunologique de l’hépatite auto-immune dans un modèle murin préclinique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
6 048 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère (4 320 modéré, 1 728 sévère). Réparties sur neuf protocoles, elles subissent jusqu'à quatorze actes (prélèvements sanguins, injections intrapéritonéales, intramusculaires et intraveineuses), dont une injection hydrodynamique d'un volume proche de 9 % du poids corporel qui provoque dilatation du foie, montée de pression et arythmie. Le porteur estime lui-même que cet acte sévère peut tuer jusqu'à 5 % des animaux concernés. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier le foie in vivo, le diagnostic humain de l'hépatite auto-immune étant trop tardif.
Objectifs
L’hépatite auto-immune (HAI) est une pathologie du foie caractérisée par une attaque immunitaire contre l’organe qui peut entraîner une défaillance hépatique, des cirrhoses ou même des cancers. Les traitements immunosuppresseurs non-spécifiques (combinaison de corticostéroïdes et d’azathioprine) entraînent une rémission complète en 18 mois chez 75% des patients HAI. Cependant, ces traitements présentent de nombreux effets secondaires et 50 à 90% des patients rechutent dans l’année après l’arrêt du traitement. Par ailleurs, l’HAI est une pathologie dont l’origine reste méconnue. Les lymphocytes T CD4+ (LT CD4) constituent la population de cellules immunitaires classiquement considérée comme responsable des lésions hépatiques. Mais l’étude des LT CD4 dits spécifiques d’antigènes hépatiques, c’est-à-dire les LT CD4 qui reconnaissent des molécules présentent spécifiquement dans le foie, reste limitée chez l’Homme. De plus, le diagnostic de l’HAI n’étant que tardif dans l'évolution de la pathologie, l’étude des évènements à l’origine de la maladie n’est pas réalisable chez l’Homme. Notre équipe a mis en place des modèles murins ressemblant à l’HAI et qui permettent d’étudier le rôle des LT CD4 spécifiques d’un antigène hépatique dans les temps précoces de l’atteinte du foie. Dans ce projet, notre objectif est de décrire les signaux immunologiques impliqués dans le contrôle d’une réponse immunitaire contre un antigène hépatique et pouvant favoriser l’attaque immunitaire du foie sur le long terme. Dans cette mesure, nous souhaitons moduler l’environnement hépatique dans : (1) un modèle de tolérance de l’antigène hépatique, (2) un modèle d’hépatite aiguë transitoire et (3) un modèle d’hépatite chronique.
Bénéfices attendus
Nos travaux permettront de mettre en évidence comment l’environnement hépatique joue un rôle dans les réponses inflammatoires locales contre un antigène hépatique, ainsi que des pistes solides concernant l’origine immunologique de l’hépatite auto-immune. Les résultats de nos travaux devraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques plus spécifiques contre la pathologie. Nous espérons également pouvoir mettre en lumière une marque prédictive précoce de la sévérité et de l’évolution de l’hépatite auto-immune.
Procédures
Les animaux subiront entre 3 et 14 actes sur une période allant de 10 à 60 jours en fonction de la procédure : Procédure 1 = Les animaux recevront, sur une période de dix jours, 1 prélèvement sanguin (durée : 1 minute, animal anesthésié), 1 injection intrapéritonéale (i.p., durée : 30 secondes, animal vigile) et 3 injections intraveineuses (i.v., durée : 1 minute, animal anesthésié) à 3 jours d’intervalle. Procédure 2 = Les animaux recevront, sur une période d’un mois, 2 prélèvements sanguins, 1 injection intramusculaire (i.m., durée : 30 secondes, animal anesthésié), 1 injection i.p. et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 3 = Les animaux recevront, sur une période de cinq semaines, 3 prélèvements sanguins, 1 injection i.p., 2 injections i.m. et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 4 = Les animaux recevront, sur une période de dix jours, 1 prélèvement sanguin, 1 injection i.p. et 1 injection intraveineuse hydrodynamique (HTVi, durée : 10 secondes, animal vigile). Procédure 5 = Les animaux recevront, sur une période d’un mois, 2 prélèvements sanguins, 1 injection i.m., 1 injection i.p. et 1 injection HTVi. Procédure 6 = Les animaux recevront, sur une période de cinq semaines, 3 prélèvements sanguins, 1 injection i.p., 2 injections i.m. et 1 injection HTVi. Procédure 7 = Les animaux recevront, sur une période de douze jours, 1 prélèvement sanguin, 6 injections i.p. et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 8 = Les animaux recevront, sur une période d’un mois, 2 prélèvements sanguins, 1 injection i.m., 6 injections i.p. en douze jours et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 9 = Les animaux recevront, sur une période de cinq semaines, 3 prélèvements sanguins, 2 injections i.m., 6 injections i.p. en douze jours et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Les procédures 1, 2, 3, 4, 5 et 6 se terminent à un temps précoce ou tardif. Dans le cas d’une fin de procédure à un temps tardif, les animaux recevront un prélèvement sanguin une semaine après le dernier acte subi.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des gestes plus ou moins douloureux au cours des différentes procédures. Durant les injections intrapéritonéales, les animaux pourront ressentir un inconfort local et limité dans le temps. En fonction de la procédure, ce geste sera reproduit jusqu’à 6 fois sur une période de deux semaines. Pour les actes subis tels que l’injection intraveineuse, l’injection intramusculaire ou le prélèvement sanguin, les animaux seront anesthésiés par un anesthésique gazeux ce qui pourrait engendrer un stress chez l’animal. Du fait de l’injection intraveineuse par la veine caudale d’un grand volume de solution dans la circulation systémique, une analgésie locale sera appliquée au site d’injection. L’injection hydrodynamique d’environ 9% du poids corporel en volume, conduit à une dilatation massive mais transitoire (inférieure à 30 minutes) du tissu hépatique, une augmentation de la volémie globale, une forte augmentation de la pression sanguine et une arythmie cardiaque courte (durant 30 à 60 secondes). Du fait de la sévérité de cet acte, une perte maximale de 5% des animaux impliqués dans ces procédures est estimée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de récupérer différents tissus (sang, foie et rate) indispensables pour mener diverses analyses d’histologie, de biologie cellulaire, de biologie moléculaire, de biochimie et d’immunologie.
Remplacement
Dans ce projet, nous interrogeons l’origine immunologique de l’auto-immunité dans le foie. Cet aspect ne peut être étudié chez le patient humain car le diagnostic de l’hépatite auto-immune est très tardif et les échantillons (biopsies) sont rares. Par ailleurs, l’étude des mécanismes immunologiques dictant le développement de la pathologie n’est pas réalisable à l’échelle cellulaire et, à nos connaissances, il n’existe pas de système pertinent de remplacement. Ainsi, dans notre projet l’étude in vivo chez l’animal est indispensable car cela permet d’avoir accès à des échantillons de l’organe cible de la pathologie, le foie. Cela nous permet d’une part de mesurer les dommages hépatiques et d’autre part d’étudier l’environnement immunologique dans l’organe.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 6048 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Pour cela, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Durant le projet une réduction du nombre d’animaux pourra être envisagée en fonction des résultats expérimentaux obtenus. Nous pourrons être amenés à manipuler moins d’animaux si l’effet de certains composés s’avère significatif au cours des premières expériences. À l’inverse, si l’effet d’un composé rejette l’hypothèse émise dès les premières expériences, le composé sera exclu des prochaines expérimentations afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Dans le but d’extraire le maximum de données de chaque animal, plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les utilisateurs passeront régulièrement du temps avec les animaux avant les procédures et en dehors des jours d’expérimentation pour limiter leur stress et les habituer à être manipulés. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un symptôme réversible sera signalé, l’animal recevra les soins nécessaires. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
L’étude chez l’animal étant indispensable dans notre projet, nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. À nos connaissances, il n’existe pas de modèle pertinent pour étudier le développement de l’auto-immunité dans le foie utilisant une autre espèce animale. De plus, au cours de ce projet, nous bénéficions de souches génétiquement modifiées déjà en place au laboratoire. Nous travaillerons avec des souris adultes de 8 à 12 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. À des âges plus avancés, le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité au cours des expérimentations.
Etude de l’efficacité d’inhibiteurs de NADPH oxydases dans un modèle d’hépatite aiguë induite chez la souris par la Concanavaline A.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par voie intraveineuse une protéine qui déclenche une hépatite aiguë, avec dégradation de la fonction du foie et signes cliniques attendus, puis des traitements par gavage une à deux fois par jour, avant la mise à mort pour prélever le sang et les organes. L'objectif est de tester des inhibiteurs d'enzymes développés par la société porteuse en vue d'une future application clinique. Le porteur affirme que ce type d'interaction inflammatoire ne peut pas encore être reproduit in vitro et que ce modèle est "nécessaire".
Objectifs
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des espèces chimiques oxygénées, telles que des radicaux libres, et jouent un rôle important dans la communication entre les cellules. Leur concentration peut cependant croître significativement en période de stress, sous l'effet de la chaleur ou de l'exposition aux ultraviolets par exemples, et alors endommager les structures cellulaires, ce qu'on appelle le stress oxydant. L'augmentation nocive d'espèces réactives de l’oxygène dans les cellules est principalement due à l'activation d'enzymes spécifiques appelées NADPH oxydases (NOX) menant à l’apparition de processus pathologiques telles que la fibrose ou l’inflammation. Le but de ce projet est de tester l’efficacité d’inhibiteurs des NADPH oxydases (NOX) développés par notre société en vue d’une future application clinique hépatique. Nous souhaitons ainsi tester nos molécules dans un modèle d’hépatite induite par une protéine (la Concanavaline A) chez la souris et y tester nos inhibiteurs d'enzymes NOX. Ce modèle d’hépatite induit une inflammation et le recrutement de cellules immunitaires dans le foie, imitant l’hépatite auto-immune chez l'homme.
Bénéfices attendus
Dans ces circonstances, un bénéfice thérapeutique peut être obtenu par l’inhibition des enzymes NOX afin de limiter la production d'espèces réactives de l’oxygène. Moins d'espèces réactives de l’oxygène doit conduire à limiter leurs effets néfastes sur les cellules et limiter le développement de maladies inflammatoires. Un bénéfice thérapeutique dans ce projet car nos inhibiteurs des enzymes NOX devraient réduire l'inflammation dans le foie.
Procédures
induction 1 intraveineuse par une veine de la queue, sous contention - 1 minute / pesées et traitements par sonde de gavage (1 en général, 2 maximum par jour, donc par étude) - 10 secondes chacun
Impact sur les animaux
La conA sera administrée par voie intraveineuse. Après le stress physique engendré par la contention et une douleur liée à la piqûre, cela a pour effet une dégradation de la fonction hépatique. Des signes cliniques liés à cette dégradation induite, donc attendue dans ce modèle, sont généralement visibles (piloerection, manque de toilettage). Afin de s’assurer qu’ils ne présentent pas de modification du comportement lié à un sepsis et/ou à la présence de souffrance et douleur, ces derniers seront surveillés à chaque manipulation, et plus étroitement dans les premières heures après l’induction. Un traitement par voie orale sera aussi administré aux animaux 1 ou 2 fois par jour selon la molécule testée et sa pharmacologie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, permettant le prélèvement de sang et d'organes. Ceci permettra de mesurer des marqueurs biologiques pour évaluer l'efficacité de nos composés.
Remplacement
Les progrès technologiques permettent de plus en plus le remplacement des animaux par des méthodes alternatives. Ces changements sont une bonne chose et dès que cela est possible nous réalisons des expériences in vitro dans le but d’identifier les composés les plus prometteurs, pour les tester par la suite in vivo. Dans le cadre de nos recherches, nous étudions l’effet des molécules sur l’inflammation au niveau du foie afin de traiter in fine des maladies hépatiques humaines. Le système inflammatoire va interagir avec plusieurs éléments du rein mais aussi d’autres organes. Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro c’est pour cela que la recherche in vivo, et ce modèle en particulier, est nécessaire.
Réduction
Ce modèle a déjà été utilisé pour tester des inhibiteurs d'enzymes NADPH oxydase au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, des tests in vitro sont réalisés au préalable afin de tester nos composés. Les données pharmacologiques des différents composés ainsi que leur profil pharmacocinétique seront obtenus avant le début des procédures. Nous ne testerons donc que les composés les plus puissants en pharmacologie primaire et ceux présentant les caractéristiques d’un potentiel futur médicament. Des tests statistiques seront choisis pour comparer l’efficacité de notre composé par rapport à un contrôle ou comparer plusieurs molécules entre-elles. Ces différents tests nous permettrons de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou un potentiel effet-dose.
Raffinement
Afin de limiter le stress causé aux animaux, les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique est bien tolérée par les animaux, un volume maximal de 10mL/kg leur sera administré. Après réception des animaux, ils seront placés dans des cages où des carrés de ouate seront mis à leur disposition pour la construction de leur nid. Un dôme rouge au minimum sera aussi présent afin que les animaux puissent se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence d’un bâton de bois rigide par animal. La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques et vérifier l'absence de souffrance.
Choix des espèces
Ce modèle est très bien décrit pour les rongeurs, particulièrement chez les souris Balb/c. Ces animaux sont réceptifs à l’induction par la conA, à des doses peu élevées et développent une pathologie fortement similaire à l’hépatite auto-immune humaine. Nous utiliserons des souris Balb/c mâles de 7 semaines à l’induction de la pathologie, le modèle et les doses étant bien connus et validés pour ces animaux, aussi bien dans la littérature que dans notre animalerie.
Rôle des cellules du foie dans les manifestations hépatiques de la colite dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
3 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Génétiquement modifiées, elles développent une colite provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson, subissent un jeûne puis un gavage et une injection de toxine bactérienne, avant la mort pour analyse du foie. Le porteur indique des diarrhées parfois sanglantes et une déshydratation, et précise qu'aucun antidouleur n'est donné pour ne pas modifier la maladie observée. Il étudie les atteintes du foie liées à la colite et juge la souris "nécessaire" comme modèle intégré.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICIs) sont des pathologies touchant plus de 2 millions de personnes en Europe, et elles sont caractérisées par une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal. Bien que l’étiologie de ces pathologies soit encore mal caractérisée, il semblerait qu’elles soient multi factorielles (implication de facteurs génétiques, environnementaux et du microbiote). Les MICIs s’accompagnent de manifestations extra-intestinales touchant notamment le foie. Ce projet a pour but de mieux comprendre les altérations hépatiques qui se développent lors de la colite et plus particulièrement de tester le rôle des différents types cellulaires présents dans le foie dans la survenue de ces altérations. Les résultats obtenus pourront contribuer à identifier de nouveaux gènes candidats ainsi qu'à définir de nouvelles approches thérapeutiques afin de limiter les conséquences extra-intestinales de la colite. En utilisant des souris génétiquement modifiées, nous étudierons particulièrement le rôle de l’inflammation médiée par les hépatocytes, les cellules endothéliales et les cellules de Kupffer dans la survenue des conséquences extra-intestinales de la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’identifier quels sont les acteurs cellulaires responsables des manifestations hépatiques lors de la colite dans un modèle murin. La colite induite par le dextran sulphate de sodium (DSS) dans notre modèle murin étant similaire à la pathologie humaine, les résultats de cette étude apporteront à plus long terme de nouvelles opportunités pour le développement de stratégies thérapeutiques pour l'Homme visant à limiter les effets de la colite sur le foie ainsi que les diverses complications associées à cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement dans l'eau de boisson en continu pendant 7 jours au maximum induisant une colite expérimentale. Les animaux seront également soumis à un test de perméabilité intestinale 5 jours après le début du traitement. Pour cela, les animaux seront mis à jeun pendant 5h, puis gavés (1 fois, sur animal vigile) avec une solution détectable par spectrophotométrie puis un faible volume de sang sera prélevé prélevés 4 heures après gavage à la veine caudale (entaille sur la queue) à l'aide d'un capilaire hépariné (1 fois sur animal vigile, 1 min). Enfin, les animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec des toxines bactériennes (une seule injection par animal de 100ng sur animal vigile). L'ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
La colite expérimentale induite chez les animaux entraîne une perte de poids modérée en fonction de la durée du traitement. De plus, la colite expérimentale induit une perte de consistance des selles, ainsi que diarrhées, parfois sanglantes pour les formes les plus graves. Les diarrhées causées par le traitement peuvent également induire une déshydratation chez l'animal. Pour notre étude, le traitement n'excèdera pas 7 jours et entraîne une perte de poids inférieure à 20% du poids initial. Le suivi de poids effectué pour chaque animal peut occasionner un stress physique dû au contact entre animal et expérimentateur, notamment lors de la contention. Les souris seront mises à jeun lors du test de perméabilité intestinale afin de ne pas interférer avec la solution de gavage possédant une molécule qui se dégrade facilement. La mise à jeun ainsi que le gavage peut entrainer respectivement la faim de l'animal et un certain stress. La dose de toxine bactérienne injectée est très inférieure aux doses léthales pour la durée de la procédure (16 heures) et n'induit qu'une réaction inflammatoire. Les injections de toxine bactérienne peuvent engendrer des douleurs abdominales au niveau du site d'injection.
Devenir
L'analyse des phénomènes inflammatoires et métaboliques impliquant divers types cellulaires hépatiques lors de la colite nécessite l'euthanasie de l'ensemble des animaux à l'issue des procédures permettant une analyse approfondie.
Remplacement
Comme nous étudions des phénomènes inflammatoires et métaboliques affectant plusieurs organes, nous avons besoin d’utiliser un modèle intégré, tel que la souris. Cette étape est essentielle pour la compréhension du processus biologique étudié. L’évaluation de gènes candidats nécessite l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés.
Réduction
Au total, 3620 animaux sont impliqués dans ce projet. Pour chaque condition expérimentale des calculs de puissance seront effectués afin de déterminer la taille minimale des effectifs (mâles et femelles) nécessaires pour obtenir des résultats interprêtables et significatifs. Pour l'analyse statistique, divers tests seront employés afin de comparer les différents groupes entre eux. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude, permettant une réduction importante du nombre d'animaux requis pour l'étude. D’autre part, comme nous analysons plusieurs organes, nous récolterons un maximum d’organes au moment de la dissection afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés à l’animalerie pendant deux semaines et sont habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. De plus, les animaux issus des mêmes portées sont regroupés par 5 maximum. Au sein de leur habitacle, les souris disposent d'enrichissement fabriqué en papier, développé pour ressembler à des fines tiges d'herbes, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Cet enrichissement est accompagné de petites maisonnettes cartonées pour les souris mâles diminuant les risques de conflits au sein de l'habitacle. Un suivi journalier est réalisé dès le premier jour du traitement au dextran sulphate de sodium (DSS) et permettra de surveiller l’évolution de l’induction de la maladie ainsi qu'une éventuelle atteinte des points limites. Comme nous étudions les effets de l’inflammation de l’intestin sur le foie, nous ne pouvons pas utiliser de traitements analgésiques qui sont susceptibles de modifier le phénotype observé.
Choix des espèces
Les modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. D’autre part, la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme et elles sont faciles à manipuler. Pour notre étude, nous aurons recours a des lignées génétiquement modifiées et qui permet notamment l'exploration fonctionnelle approfondie de processus biologiques complexes. L'utilisation de lignées transgéniques pour ce projet est nécessaire car elles permettent d'étudier spécifiquement l'implication de divers partenaires protéiques, moléculaires et cellulaires impliqués dans la colite. L'étude d'un systéme immunitaire mature nécessite d'avoir recours à des souris adultes (entre 12 et 15 semaines) pour l'ensemble des expérimentations.
Evaluation de la biocompatibilité d’une matrice biologique œsophagienne décellularisée d’origine porcine chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée des plaies dans le dos pour y implanter sous la peau quatre échantillons d'une matrice d'œsophage d'origine porcine, avant de les tuer à sept ou vingt-huit jours pour analyser la réaction des tissus. Le porteur décrit une chirurgie de quinze à vingt minutes avec traitement antidouleur et des démangeaisons possibles à la plaie. Il teste la tolérance d'un futur substitut d'œsophage et affirme que la réaction immunitaire ne s'apprécie que sur un être vivant.
Objectifs
Les chirurgies pour la reconstruction de l’œsophage suite à l’ablation de l’organe chez des patients atteints de pathologies ou victimes de traumatisme sont reconnues unanimement comme très insatisfaisantes par la communauté médicale. En effet, les complications post-opératoires sont nombreuses. C’est pourquoi, le développement d’une matrice biologique œsophagienne présente de nombreux avantages afin de répondre aux besoins cliniques actuels. La disponibilité des greffons œsophagiens humains étant limitée, le porcin est le modèle animal choisi afin de développer notre matrice. Avant son implantation chez l’homme, cette matrice biologique œsophagienne doit être testée pour vérifier sa capacité à s’intégrer sans être rejetée et sans dégrader son environnement. Ces données doivent être étayées par des données scientifiques qui ne peuvent pas être obtenues in-vitro, c’est-à-dire en dehors de l’organisme vivant. C’est pourquoi, il est nécessaire d’exposer la matrice à un mammifère vivant afin d’évaluer son acceptation dans un environnement physiologique. Il sera possible d’évaluer ces critères selon des méthodes ex-vivo en laboratoires, permettant d’étudier la structure des tissus d’un point de vue microscopique. L’objectif principal de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle une matrice œsophagienne décellularisée engendre une réaction inflammatoire compatible avec son environnement physiologique.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de montrer que l’utilisation d’une matrice biologique en tant que substitut d’œsophage est acceptable en termes de tolérance en regard de la thérapie actuelle, lourde et source de complications post-opératoires, ayant pour conséquence une mauvaise qualité de vie pour les patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à la procédure chirurgicale suivante : - création des plaies cutanées au niveau de la zone dorsale - implantation des matériaux en sous-cutané. Les animaux recevront un nombre de 4 échantillons, espacés de minimum 1 cm, selon les recommandations de la norme ISO 10993-6. Cette norme spécifie les méthodes d'essai pour l'évaluation des effets locaux après une implantation de biomatériaux destinés à être utilisés dans des dispositifs médicaux - fermeture des plaies. Le temps de chirurgie est estimé à 15-20mn par animal. A cela, ajouter le temps d’anesthésie et de réveil de l’animal (ce temps est variable selon les individus). Pour gérer une éventuelle douleur, nous utiliserons un dérivé morphinique, la buprénorphine durant les 48 heures après l’opération. Le groupe 1 sera euthanasié après 7 jours d’implantation, et le groupe 2 sera euthanasié après 28 jours.
Impact sur les animaux
L’expérimentation implique la réalisation de la plaie , la pose de la matrice dans la poche, refermée avec une suture. La réaction à la chirurgie pourra provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie cutanée.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux sont réveillés et suivis cliniquement. Les animaux sont euthanasiés à 7 jours (Groupe 1) et 28 jours (Groupe 2) pour explanter la peau en vue des analyses de la réaction inflammatoire et de la cicatrisation.
Remplacement
Des tests in-vitro, c’est-à-dire en dehors de l’organisme vivant, ont été réalisés préalablement sur les matrices biologiques d’origine porcine, selon la norme ISO 10993-5 concernant l’évaluation biologique des dispositifs médicaux. Néanmoins, en raison des interactions complexes entre l'hôte et la matrice, ces systèmes ne peuvent pas reproduire de façon fidèle les conditions d’intégration ou de rejet de la matrice. La confirmation de la bonne intégration de la matrice étant indispensable avant son implantation chez l’homme, il est donc nécessaire de disposer de modèles animaux pour évaluer la réaction immunitaire qui ne peut être appréciée que sur l’être vivant, disposant d’un système immunitaire compétent Cette évaluation est faite sur des échantillons biologiques extraits de l’animal, après sa mise à mort.
Réduction
Cette étude comportera 12 rats (dont 2 en cas de mort prématurée lors du déroulé de l’étude) répartis en 2 groupes, G1 (7 jours d’implantation) et G2 (28 jours d’implantation). Chaque rat recevra 4 échantillons, ce qui fera n=12 échantillons/temps pour chaque condition selon les recommandations de la norme ISO 10993-6. En effet, la norme précise l’utilisation d’au moins trois animaux pour chaque matrice et suffisamment de sites pour obtenir un total de 10 échantillons d'essai et de 10 échantillons de contrôle pour chaque matrice et chaque période d'implantation. Le nombre de rats fixé comprend des animaux supplémentaires dans le but de conserver un nombre d’animaux et d’échantillons suffisant à l’issue du protocole, dans le cas d’éventuelles complications. Cela permettra à l'étude de s'aligner sur l'approche 3R (replace, reduce, refine) de l'expérimentation animale, réduisant ainsi le nombre d'animaux et le nombre de procédures d'expérimentation animale, en tenant compte de la recommandation ISO 10993-6.
Raffinement
- Un personnel qualifié sera mobilisé autour des animaux avant, après et pendant les interventions. Le chirurgien est chevronné. - Tous les individus seront acclimatés à leur environnement 7 jours avant l’intervention. Cela permet de réduire le stress des animaux le jour de l’implantation. - Les conditions expérimentales ne provoquent pas de contraintes pouvant affecter le bien-être des animaux : pas de diminution de la qualité de l’environnement de l’animal, pas de diminution de la socialisation, accès normal à l’eau et à l’aliment et respect des comportements normaux. - L’hébergement est réalisé en cages ventilées. Ces cages sont stérilisées. L’environnement de l’animal est adapté. S’il y a nécessité d’isoler les animaux, ce que nous éviterons au maximum, l’environnement des animaux sera enrichi (maison). - Pendant l'opération, les cages seront amenées les unes après les autres dans la salle de chirurgie qui est séparée de la zone d'hébergement des animaux afin d'éviter toute source de stress par contact visuel, olfactif et sonore des animaux opérés et des animaux à opérer. - Des protocoles précis de prémédications permettant la diminution de la douleur, l’anesthésie de l’animal et de sa mise à mort sont mis en place. Un traitement anti-douleur avant, pendant et après l’opération est mise en place à l’aide d’une injection de buprénorphine sous la peau de l’animal. - Pour gérer une éventuelle douleur, nous utiliserons un dérivé morphinique en sous cutané, durant les 48 heures après l’opération.
Choix des espèces
Cette étude ne peut en effet être réalisée directement chez le patient mais permet d’évaluer la capacité de l’étude à être transposable à une implantation chez l’homme car elle est réalisée chez le mammifère. L’utilisation du rat permet de répondre à un certain nombre de questions et d’être prédictif des résultats chez l’homme En effet, le modèle animal cherche à répliquer l’environnement biologique ainsi que la réponse biologique. Les réactions immunitaires et inflammatoires du rat sont similaires et transposables à l’homme. Ces données sont validées dans la littérature faisant du rat l’espèce de choix pour cette étude. Les rats seront âgés de 10 semaines et pèseront environ 250gr. Tous les rats auront le même âge pour une meilleure comparaison des résultats mais également pour que la taille de la plaie soit proportionnelle à la taille des rats. Des rats âgés de 10 semaines sont choisis afin qu'ils aient atteint une taille adulte pour diminuer les risques à la suite de l’anesthésie et pour faciliter l'intervention chirurgicale. De plus, le stade de développement devra permettre une cicatrisation optimale grâce à la qualité des tissus.
Etude du lien entre perturbations du microbiote et l’arthrite inflammatoire.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 225 d'entre elles et modéré pour 61. Elles appartiennent à une lignée transgénique qui développe spontanément une arthrite : les articulations, surtout aux pattes arrière, gonflent jusqu'à rendre la marche douloureuse, et une partie des souris reçoit des antibiotiques dès la naissance, par une voie que le résumé ne précise pas. Chaque semaine, des recueils d'urine et de selles et une prise de sang à la joue sont pratiqués, y compris sur les mères gestantes puis allaitantes, dont le lait peut aussi être extrait par massage des mamelles, et les nouveau-nés peuvent subir une biopsie dès la naissance pour vérifier leur génotype. Les souris d'élevage sont tuées à partir de 160 jours, quand l'arthrite est installée, et les souris traitées aux antibiotiques à 12 semaines au plus tard. Le porteur attend des résultats qui "pourraient influencer l'utilisation des antibiotiques chez les enfants", et affirme que "le modèle animal ne peut pas être remplacé".
Objectifs
Les rhumatismes inflammatoires correspondent à une inflammation articulaire, appelée arthrite, dans le cadre de maladies générales de l'organisme avec un risque de handicap et une baisse de la qualité de vie. Les mécanismes aboutissant aux rhumatismes inflammatoires restent mal connus. Le corps humain est l'hôte d'une communauté microbienne, dont la plus importante est le microbiote qui réside dans les intestins. Les micro-organismes présents sont capables d’interagir avec différentes cellules immunitaires, qui agissent comme des sentinelles. Des études antérieures ont montré que les traitements antibiotiques étaient associés au développement de l'arthrite chez les enfants. Néanmoins, la méthodologie de ces études ne permet pas d’établir un lien causal, et les mécanismes par lesquels ces médicaments influencent la physiopathologie de l'arthrite restent inexplorés. D'autres études ont observé que la translocation de fragments de bactéries, présentes dans l'intestin, vers le système sanguin de l'organisme était augmentée chez les souris arthritiques. Un plus grand nombre de fragments de bactéries ont également été retrouvés dans le sang de patients atteints d'arthrite. Sachant que l'un des mécanismes d'action des traitements antibiotiques est la destruction des bactéries de l’intestin, cela provoque une augmentation de fragments bactériens dans l’intestin. Nous formulons alors l'hypothèse que le traitement antibiotique peut être responsable d'une augmentation significative de fragments bactériens libres capables de pénétrer dans l’organisme et d'augmenter la sévérité de l'arthrite. Ainsi, dans cette étude, nous étudierons le rôle des antibiotiques dans la physiopathologie de l'arthrite. L'exploration complexe du lien entre le tube digestif et l'arthrite inflammatoire nécessite d’être réalisée sur des animaux puisqu’à ce jour aucun système cellulaire in vitro ne permet de reproduire ces interactions complexes. Nous utiliserons un modèle murin transgénique qui développe spontanément une arthrite ressemblant à l'arthrite humaine. Seront étudiés les effets de différents types d'antibiotiques sur la translocation de fragments de bactéries, l'activation immunitaire et le développement de l'arthrite.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir un lien mécanistique entre le traitement antibiotique à un jeune âge et le développement ultérieur d'une arthrite inflammatoire. Les résultats pourraient influencer l'utilisation des antibiotiques chez les enfants, et éventuellement guider le choix des molécules à utiliser dans les populations à risque de développer une arthrite.
Procédures
L'urine sera collectée une fois par semaine chez les mères (enceintes et allaitantes) et les nouveau-nés après le sevrage, soit après contention avec la main du manipulateur et placement d'un tube collecteur au niveau de l'urètre ; soit en isolant la souris quelques instants dans une cage séparée pour une courte durée si nécessaire (moins de 30 minutes), l'urine présente dans la cage sera alors aspirée à l'aide d'une pipette. Une fois par semaine, les selles sont recueillies en isolant les souris quelques instants dans une cage séparée (moins de 30 minutes). Des échantillons de sang sont prélevés sur la mandibule (sous-maxillaire) une fois par semaine. Il s'agit de piquer, à l'aide d'une aiguille fine, une zone de la joue de la souris connue pour avoir une veine facilement accessible. Cela permet de récupérer facilement 2 à 3 gouttes de sang, avec une cicatrisation rapide et un traumatisme limité pour la souris. La souris pourra être endormie à l'aide d'un anesthésique gazeux, afin de réduire le stress et l'inconfort de la procédure pour la souris. Conformément aux recommandations actuelles, le volume prélevé sera inférieur à 7,5 % du volume sanguin total de l'animal. Le lait maternel peut être prélevé pour l'analyse post-traitement, conformément aux procédures existantes dans la littérature. Les souris seront endormies comme décrit ci-dessus et placées sur le dos afin d'avoir accès à leur estomac et à leurs mamelles. Les souris peuvent être endormies à l'isoflurane (anesthésie gazeuse) si la procédure est inconfortable pour elles. Les mamelles seront massées pour stimuler la sortie du lait, qui sera récupéré à l’aide d’une pipette. Seule la moitié des mamelles sont utilisées, afin de laisser suffisamment de lait à la mère pour nourrir ses petits. Une biopsie peut être prélevée sur les nouveau-nés dès leur naissance, afin d'effectuer une étude génétique de la souris, pour s'assurer que la mutation génétique est toujours présente.
Impact sur les animaux
Ce projet de recherche a comme effet indésirable attendu l’augmentation de la sévérité de l’arthrite provoquant la douleur chez les souris selon les traitements reçus et leurs durées. L’arthrite évoluera par une augmentation du gonflement des articulations (principalement des pattes arrières) plus ou moins rapide et forte, pouvant devenir douloureuse lors de la marche. Les souris seront alors surveillées quotidiennement par les animaliers ou les expérimentateurs. Pour cela, une grille de score de bien-être est mise en place afin de juger l’état douloureux de l’articulation ainsi que la souffrance animale. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade soudainement ou si le score déterminé à partir de la grille est supérieur à la limite établie.
Devenir
Pour les souris en élevage, après 160 jours de vie, l’arthrite sera bien installée. Ainsi, prolonger leur durée de vie ou leur donner de nouvelles portées, risque de les rendre plus douloureuses. Pour éviter ce risque de diminution du bien-être, les souris seront euthanasiées à partir de 160 jours de vie. Concernant les souris nées sous différents traitements antibiotiques, les souris seront euthanasiées à 12 semaines de vie maximum. Les mères ayant mi-bas pourront être réintroduit dans la procédure d’élevage pour avoir une nouvelle portée, à partir de 160 jours de vie, elles seront euthanasiées.
Remplacement
Aujourd’hui, il n’existe pas de système permettant d’évaluer l’arthrite en dehors du modèle animal. En effet l’arthrite apparait selon des facteurs génétiques, environnementaux et hormonaux qui ne sont pas clairement connus et difficiles à reproduire en dehors du modèle animal. De plus, l’arthrite du modèle animal est très proche de celle retrouvée chez l’homme. Il n’existe pas non plus de modèle permettant de comprendre l’effet systémique des antibiotiques sur la sévérité. Notre modèle cherche à comprendre l’implication et l’interaction entre le système digestif et l’apparition ou le développement de l’arthrite. Il n’existe pas de méthode alternative pour comprendre l’interaction entre plusieurs organes différents. Pour cela, le modèle animal ne peut pas être remplacé.
Réduction
Le nombre d'animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type et sur notre volonté à utiliser le moins d’animaux possible tout en nous permettant d’avoir assez de résultats pour réaliser une interprétation fiable des données. Ainsi, le nombre de souris est réduit au strict minimum pour obtenir des résultats pertinents statistiquement. Ce nombre tient compte du nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi éviter des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Chaque souris aura à sa disposition du coton et/ou un abri dans sa cage pour se former un nid. Des morceaux de bois pourront être donnés à des souris isolées ou en faible effectif afin de permettre le jeu et l’exploration d’objet. Les souris seront hébergées en groupe de 6 individus maximum dans des cages sur des portoirs ventilés. Une exception existe, où les souris pourront être isolées durant leur gestation et selon les traitements. Dans ce cas, une surveillance accrue et davantage de coton et bois seront donnés à la souris isolée. En cas de souffrance d’un animal, une grille de score a été établie pour juger de l’intensité de la douleur. Ainsi, en fonction du score, des dispositions seront prises pour améliorer le bien-être. Cela peut aller de l’augmentation de l’enrichissement (coton, tunnel, buchettes), au dépôt de nourriture et d’eau dans la cage, à l’augmentation de la surveillance, arrêt de la procédure ou euthanasie de l’animal si le score de douleur est jugé trop important.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont la physiologie et le système immunitaire sont très proches de ceux de l'homme, et il existe des lignées avec des modifications conduisant à une inactivation des gènes, ce qui permet de reproduire des maladies et étudier les mécanismes sous-jacents. Les résultats expérimentaux obtenus chez la souris ont donc de fortes chances d'être transposés à l'homme. Le modèle murin d'arthrite inflammatoire chronique spontanée utilisé dans ce projet est très proche de l'arthrite observée chez l'homme. Il s'agit d'une souris chez laquelle est invalidé un gène qui empêche l'activation d'un récepteur impliqué dans l'inflammation, appelé récepteur de l'interleukine 1 (IL1). Par conséquent, ce récepteur est constamment stimulé, ce qui entraîne une suractivation de l'inflammation et la sécrétion de substances inflammatoires, tel que le l'interleukin-1. Dans le cas de ces souris, l'inflammation est présente dans les articulations, ce qui provoque leur inflammation. Dans la précédente demande d’autorisation de projets, nous avons remarqué que plus les souris recevaient des antibiotiques à un âge jeune, plus l’arthrite devenait précoce et sévère avec le temps. C’est pourquoi dans ce projet, nous donnerons des antibiotiques à des souris dès la naissance pour étudier le phénomène d’apparition de l’arthrite et les mécanismes biologiques impliqués chez l’enfant et au cours du temps. Ce projet permettra de mieux comprendre l’arthrite juvénile idiopathique (AJI) observée chez l’homme.
Impact du bypass gastrique Roux en Y sur la NASH chez des souris sauvages nourries avec un régime hypercalorique et exposées ou non à des perturbateurs endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
236 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Nourries d'un régime gras et gavées chaque semaine d'un cocktail de perturbateurs endocriniens, elles subissent une chirurgie de l'estomac et de l'intestin d'environ une heure, puis des prises de sang répétées avant d'être tuées pour prélèvement des tissus. Le porteur annonce une mortalité pouvant atteindre 20 % après l'opération et des douleurs pendant cinq jours. Il étudie l'effet de la chirurgie de l'obésité sur la maladie du foie gras et juge "absolument nécessaire" de comprendre l'effet sur l'organisme entier, faute de méthode in vitro.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du RYGB (Bypass Gastrique Roux en Y), sur la réduction de la NAFLD (stéatose hépatique)/NASH (stéatostéatique hépatique) chez des souris sauvages nourries avec un régime hyperlipidique et exposées ou non à des concentrations élevées de perturbateurs endocriniens.
Bénéfices attendus
Notre étude sur modèle animal, en améliorant la connaissance sur les effets du RYGB sur la NAFLD/NASH chez des souris exposées ou non à des PE, nous permettra de mieux cibler les indications opératoires de ces types de chirurgies selon le profil métabolique du patient et son environnement de vie.
Procédures
Chaque souris de chaque groupe sera opérée d’une chirurgie (RYGB - (Bypass Gastrique Roux en Y) ou Sham (laparotomie)) d’une durée moyennne d’environ 65 minutes. Pour ces groupes expérimentaux, un prélèvement de sang par une coupure minime à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sera réalisé à différents temps : 30 ul de sang à T0 (avant la mise sous régime) et à T+14 semaines (avant chirurgie) puis 50ul de sang à T+18 semaines (3 semaines après chirurgie) et T+20 semaines (avant la mise à mort), afin de déterminer la glycémie nourrie, la cholestérolémie et la triglycéridémie. Après 3 semaines de ce régime, les souris seront randomisées en fonction de leur poids corporel en 2 groupes distincts. Le premier groupe recevra un gavage hebdomadaire de la solution véhicule (huile d’olive) et le second un gavage hebdomadaire du cocktail des perturbateurs endocriniens . Après 12 semaines de gavage, les souris des 2 groupes seront subdivisées en 2 sous-groupes après randomisation sur le poids corporel et seront soit opérées d’une laparotomie (Sham) soit d’un RYGB. Après une semaine de récupération, les animaux seront mis en condition pour la chirurgie bariatrique.
Impact sur les animaux
En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : -Une mortalité entre 0 et 20% après chirurgie -Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée -Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Des prélèvements des tissus seront effectués post-mortem.
Remplacement
Les chirurgies bariatriques induisent de profondes modifications du métabolisme énergétique qui font intervenir des conséquences entremêlées et en cascade et sur de nombreux tissus tels que l’intestin, le foie, les tissus adipeux et le cerveau, etc… Les mécanismes moléculaires sont très mal connus et il est absolument nécessaire de comprendre l’impact physiologique dans son ensemble pour développer par la suite d’autres approches. Il n’existe pas à l’heure de méthodes ex vivo/in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
La procédure est classée sévère. Un protocole péri-opératoire a été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale par Isoflurane. Les animaux reçoivent avant la chirurgie puis pendant une durée de 3 jours de la buprénorphine, de l’amoxicilline et de métacam. Des injections de metoclopramide seront réalisées avant la chirurgie et jusqu’à J5. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse (Geldiet highfat, 10% Saindoux, 10% sucre liquide, 57% eau, Safe) de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront supplémentées en fer et en vitamines ad libitum dans l’eau de boisson jusqu’à la fin du protocole afin de prévenir l’anémie et les carences nutritionnelles. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton. Nous avons mis en place une grille de points limites (voir Annexe) pour pouvoir réagir en cas de complications au cours de l’expérimentation. Si un seul signe clinique sévère ou 3 signes notables décrits ci-dessous sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera euthanasiée sans délai.
Choix des espèces
Les conséquences physiologiques du RYGB sur des pathologies hépatiques telles que la NAFLD et la NASH impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines. Outre l’existence de nombreux modèles de souris génétiquement modifiés, ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Nous utiliserons des jeunes souris adultes de 8 semaines. Elles seront commandées pour être âgées de 7 semaines à la livraison et 8 semaines après la semaine d’acclimatation.
Etude de l’exposition orale d’un cocktail de virus dirigés spécifiquement contre des espèces de bactéries (du genre Yersinia) avant son utilisation chez l’homme.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent dans leur eau de boisson un mélange de huit virus mangeurs de bactéries (bactériophages), avec surveillance clinique et recueil de selles pendant quatre semaines, puis une prise de sang sous anesthésie, pour vérifier l'innocuité de ce produit avant un essai chez des malades de Crohn. Le porteur affirme n'attendre aucune douleur et juge les bactériophages inoffensifs pour les mammifères, mais prévoit tout de même de tuer les souris pour prélever organes et selles. Il indique que les agences réglementaires imposent cette vérification sur des organismes vivants, sans alternative possible.
Objectifs
Les bactériophages sont des virus qui possèdent la particularité de n’infecter que les bactéries et sont spécifiques de l’espèce bactérienne qu’ils attaquent. Certains bactériophages sont déjà utilisés chez l’homme sur les aliments ou à visée thérapeutique dans les infections à bactéries multirésistantes. Nous souhaitons utiliser un nouveau mélange de huit bactériophages sur l’alimentation humaine à visée de prévention des poussées inflammatoires chez les malades de Crohn. La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique intestinale qui touche environ 60.000 personnes en France et plusieurs millions de personnes dans le monde. Ce travail vise à vérifier l’innocuité de ce mélange de bactériophages chez l’animal avant de l’utiliser chez l’homme. Il comportera une surveillance clinique et une analyse du microbiote fécal (ensemble des microorganismes vivant dans les fèces) chez les souris exposées au cocktail de bactériophages dans leur eau de boisson comparées aux souris contrôles.
Bénéfices attendus
Ce travail a pour objectif de vérifier l’absence de toxicité d'un mélange de bactériophages chez l’animal avant son utilisation chez l’homme. Il permettra de mettre en place un essai clinique chez les malades atteints de maladie de Crohn. En cas de succès, ce travail permettra de réduire l’activité de la maladie avec des bénéfices directs pour le malade : réduction du nombre de poussées inflammatoires, réduction du nombre de complications et réduction d’exposition à des médicaments immunosuppresseurs. Ce travail permettra aussi de réduire le coût collectif de la maladie en termes de nombre d’hospitalisations et de coût des traitements.
Procédures
Une surveillance clinique (aspect, comportement et pesée) sera réalisée deux fois par semaine et le recueil de selles une fois par semaine pendant 4 semaines. Lors du recueil de selles, l’animal sera isolé dans une boite en plastique pendant 30 minutes maximum. A la fin de la procédure, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.
Impact sur les animaux
Aucune douleur n’est à attendre. Les bactériophages sont des virus qui possèdent la particularité de n’infecter que les bactéries et sont spécifiques de l’espèce bactérienne qu’ils attaquent. Ils sont réputés inoffensifs pour les organismes tels que les mammifères (humains, animaux).
Devenir
Afin de vérifier l’innocuité des bactériophages, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les différents organes et les selles.
Remplacement
Les bactériophages sont des organismes vivants. Les agences règlementaires en France demandent donc de vérifier leur innocuité avant leur utilisation chez l’homme. Nous ne pouvons donc nous affranchir de l’utilisation d’organismes vivants, aucune alternative de remplacement ne peut être envisagée. Cependant des techniques pour déterminer la concentration en bactériophages ont été préalablement mises au point in vitro, afin de remplacer autant que possible l'utilisation de ces animaux.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point du vue de l’analyse statistique .
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole par du personnel compétent. Tout au long de la procédure, tous les animaux seront évalués cliniquement 2 fois par semaine pour chaque animal. Ce score (prenant en compte la variation du poids de l’animal, son apparence, le changement de comportement) permettra de prendre des mesures progressives (points limites) en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, euthanasie précoce). L’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont l’anatomie et la physiopathologie de l’infection par voie orale sont suffisamment proches de celle de l’homme pour autoriser l’étude des thèmes mentionnés plus haut. La souris est l’espèce la plus utilisée par la communauté scientifique internationale dans la thématique de l’infection par voie orale. Nous utiliserons les animaux à l’âge adulte entre 6 semaines et 8 semaines d’âge car le microbiote intestinal est stable chez la souris à partir de 6 semaines.