Système gastrointestinal

300 animaux sur 3 990 pourront être gardés en vie et renvoyés en hébergement hors étude après avis vétérinaire, les autres seront tués pour le prélèvement d'organes et de fluides. 3 300 rats et 690 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer les effets de candidats-médicaments commandés par des donneurs d'ordre. Certains reçoivent un cathéter intraveineux implanté à demeure sous anesthésie, portent une veste à capteurs jusqu'à dix-neuf heures, passent jusqu'à sept heures trente dans une enceinte respiratoire ou jusqu'à six heures dans une enceinte à diurèse sans eau ni nourriture, et subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins par séance. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne permet de mesurer ces effets sur un "organisme entier" et revendique la "nécessité" d'accéder à l'animal dans son entièreté.

Objectifs

Les études de pharmacologie de sécurité chez les rongeurs visent à évaluer les effets d'un candidat-médicament en développement sur les grandes fonctions physiologiques et sont des prérequis réglementaires précliniques permettant à un donneur d’ordre d'initier des études cliniques pour un candidat-médicament destiné à l'Homme. Selon le candidat-médicament, l’établissement utilisateur évalue la procédure à effectuer, sachant que plusieurs procédures peuvent être combinées au sein d’une même étude (par exemple : étude combinant l’évaluation des fonctions respiratoire et neurologiques). Chaque animal est traité par un placebo ou une dose de candidat-médicament selon la voie d'administration prévue chez l'Homme. Les effets du candidat-médicament sont évalués sur une fonction physiologique données (neurologique, respiratoire, gastro-intestinale, rénale ou cardiovasculaire) à l'aide de capteurs et de logiciels enregistrant, en continu, le signal physiologique (fonctions respiratoire et cardiovasculaire), de tests spécifiques (fonctions neurologiques) ou de prélèvements d'organes/fluides biologiques (fonctions gastro-intestinale et rénale) effectués à un ou plusieurs temps après traitement, et dont l'analyse génère des valeurs quantitatives caractérisant la fonction étudiée. Les valeurs des paramètres mesurés à chaque dose de candidat-médicament sont ensuite comparées à celles mesurées en placebo et permettent ainsi d'évaluer l'impact du candidat-médicament sur la fonction étudiée. Pendant la durée de la procédure, de la réception des animaux à leur sortie d'étude, leur état de santé est suivi quotidiennement a minima, leur poids est mesuré périodiquement et l'atteinte de points limites est étroitement surveillée, avec prise de décision vétérinaire rapide et appropriée en cas d'altération du bien-être animal. Des dispositions, compatibles avec l'atteinte des objectifs de l'étude, sont prises pour limiter tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile, par l'utilisation d'habituation à l'environnement expérimental et aux dispositifs d'enregistrement des fonctions physiologiques, de protocoles anesthésiques et analgésiques appropriés, ou par décision vétérinaire d'appliquer des soins, de diminuer les doses de candidat-médicament ou d'arrêter le traitement. En fin de procédure, selon les prérequis du protocole d'étude, les animaux peuvent être gardé en vie ou euthanasiés.

Bénéfices attendus

L'évaluation des effets fonctionnels d'un candidat-médicament en développement par un donneur d'ordre dans les études de pharmacologie de sécurité chez le rongeur est conduite selon des recommandations ("lignes directrices") internationales, et constitue une étape réglementaire avant la conduite d'essais cliniques avec ce candidat-médicament chez des volontaires sains ou des patients. Ces études visent à définir le profil des effets pharmaco-toxicologiques de candidats-médicaments sur certaines fonctions physiologiques (incluant les fonctions vitales) qui surviennent généralement dans les heures à jours suivant leur administration. L'identification des fonctions modifiées par le candidat-médicament - s'il est considéré par le donneur d'ordre comme pouvant progresser dans les phases cliniques - permettra la mise en place de procédures de suivi de ces mêmes fonctions ("monitoring") chez l'Homme (ex.: mesure de l'électrocardiogramme, de la tension artérielle ou de la fréquence respiratoire; examens neurologiques) et donc, de rendre les essais cliniques plus sûrs pour les volontaires ou les patients y participant. En relation avec les données collectées dans les études de toxicologie réglementaire, celles issues des études de pharmacologie de sécurité permettent aussi de définir la dose qui sera testée (avec une marge de sécurité) pour la première administration à l’Homme. Au final, ce projet contribuera au développement de nouvelles solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques sûres pour les patients. Il est envisagé que, sur une durée de 3 ans, entre 25 et 35 candidats-médicaments pourront être évalués.

Procédures

Ces études consistent généralement en une administration unique du candidat-médicament, pendant une durée de quelques secondes pour des administrations par les voies orale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse rapide, ou de quelques minutes pour les administrations par la voie intraveineuse dites en "bolus lent". Certaines administrations par voie intraveineuse peuvent également durer plusieurs dizaines de minutes à quelques heures, et nécessitent l'implantation chirurgicale, sous anesthésie générale gazeuse profonde et avec un protocole analgésique péri-opératoire adapté, d'un cathéter laissé en place de manière permanente dans une veine périphérique. Ce cathéter est relié à un dispositif externe de perfusion adapté aux rongeurs, permettant de connecter la seringue délivrant le candidat-médicament, tout en laissant l'animal libre de ses mouvements. Ce dispositif de perfusion intraveineuse est implanté sous anesthésie générale profonde, à une seule occasion, pendant la période d'acclimatation. Les administrations de candidats-médicaments sont suivies d’évaluation de leurs effets sur les paramètres neurologiques (évalués individuellement pendant un maximum de 15 minutes, à différentes heures après traitement), respiratoires (avec placement de chaque animal dans une enceinte dédiée jusqu'à 7,5 heures), urinaires (avec placement de chaque animal dans une enceinte à diurèse jusqu'à 6 heures). Les animaux dont la fonction cardiovasculaire est évaluée portent une veste avec capteurs intégrés jusqu'à 19 heures. Si requis par le protocole d'étude, un ou plusieurs prélèvements sanguins seront effectués, par ponction d'une veine superficielle chez l'animal vigile, suivant des modalités et un nombre définis par les besoins de l'étude (jusqu'à 2 occasions par étude, avec un maximum de 8 prélèvements par occasion), tout en respectant les recommandations éthiques de l'établissement utilisateur. Si le protocole d'étude requiert un prélèvement sanguin unique d'un volume dépassant ces recommandations, ce prélèvement est effectué chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié. Si requis par le protocole d'étude, une ponction de liquide céphalo rachidien unique est effectuée chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent inclure (variables selon les individus) : Stress, inconfort ou douleur brève (quelques minutes) lors des administrations, prélèvements sanguins ou euthanasie au gaz carbonique. Les injections intraveineuses lentes peuvent nécessiter une contention en tube, après une période d'habituation. Sensation de chaleur et stress lors du placement en enceinte chauffante utilisée pour prélèvements de sang ou injections intraveineuses ne nécessitant pas de pose de cathéter à demeure. Anesthésie de quelques minutes - avec risque d’incoordination motrice au réveil - , pour prélèvements de sang ou autres fluides biologiques. Anesthésie suivie d’une douleur légère à modérée pendant quelques jours après la pose de cathéters intraveineux à demeure. Port d’un harnais ou d’un bouton métallique permettant la perfusion prolongée par voie intraveineuse sans contention, pouvant provoquer gêne à l'ambulation et au toilettage, grattage et/ou frottements. Connexion à un dispositif de "joint tournant" lors des perfusions intraveineuses de 30 min à 24 heures/jour, pouvant limiter les déplacements dans la cage d'hébergement. Restriction d’espace et absence d’aliment (eau disponible) dans l'enceinte dédiée aux mesures respiratoires jusqu’à 7,5 heures. Restriction d’espace sans accès à l’eau ni à l’aliment dans les enceintes pour collectes urinaires (jusqu’à 6 heures) ou les arènes d’observations comportementales (jusqu’à 10 min). Stress lié à l’hébergement individuel, notamment chez les souris mâles et les animaux porteurs de dispositifs de perfusion intraveineuse implantés à demeure. Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés des candidats-médicaments.

Devenir

Si le protocole d'étude prévoit des prélèvements de tissus et d'organes pour analyses métaboliques, de biologie moléculaire, d'évaluations histopathologiques ou de prélèvements terminaux de fluides biologiques, une fraction ou la totalité des animaux nécessaire à ces analyses sera euthanasiée. Si le protocole d'étude ne prévoit pas de prélèvements nécessitant l'euthanasie des animaux, ceux-ci pourront être gardé en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la nature et l'amplitude des effets pharmacologiques de candidats-médicaments sur un organisme entier. Dans les études de pharmacologie de sécurité visant essentiellement à évaluer les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques interdépendantes (en particulier, les fonctions vitales (neurologique, respiratoire et cardiovasculaire), il est nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices édictées dans des recommandations réglementaires internationales.

Réduction

Lorsque la pharmacocinétique et/ou le mécanisme d'action du candidat-médicament le permet, les mêmes animaux peuvent être utilisés dans une même étude, dans le but d'évaluer, soit simultanément, soit séquentiellement, plusieurs fonctions physiologiques. Dans le cadre d'application de procédures de manière séquentielles, l'inclusion des animaux dans la seconde procédure suivant la première sera effectuée après un temps d'élimination du candidat-médicament de l'organisme suite à l'administration au cours de la première procédure, et après un examen clinique confirmant la capacité des animaux inclus dans la première procédure, à être inclus dans la seconde. Si l'étude requiert des prélèvements sanguins sur animal vigile et que la méthode analytique le permet, des microprélèvements de quelques dizaines de microlitres seront effectués chez les animaux en exploration fonctionnelle, évitant ainsi l'utilisation d'animaux satellites. S'il n'est pas attendu de différences pharmacologiques ou pharmacocinétiques notable entre mâles et femelles, et sauf avis contraire du protocole d'étude, ou justification d'une indication thérapeutique limitée à un seul sexe chez l'Homme, les études de pharmacologie de sécurité sont effectuées chez des mâles.

Raffinement

Rats mâles et femelles et souris femelles sont hébergés en groupes sociaux (sauf incompatibilité comportementale ou avec la procédure expérimentale) en cage sur litière, avec enrichissement adapté, augmenté en cas d’hébergement individuel. Les techniques limitant stress et inconfort seront privilégiées; les actes pouvant les engendrer seront réduits en nombre et durée au minimum nécessaire et réalisés sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Les rongeurs sont observés au moins une fois par jour pour rapidement détecter des signes cliniques et limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas d'atteinte du bien-être, un vétérinaire prendra des mesures rapides et appropriées (soins, arrêt momentané ou définitif du traitement…). Le stress de la manipulation est réduit par la procédure de gestion de faible stress. Etudes d'évaluation de la respiration par pléthysmographie: une habituation à l'enceinte de mesure en Plexiglas transparent (permettant aux animaux de voir et d'entendre leurs congénères et leur environnement) est effectuée par placement des animaux pendant 1 à 2 heures avant traitement (et en période de prétraitement, si requis au protocole d'étude). Etudes d'évaluation cardiovasculaire par veste connectée: en prétraitement, un fragment du tissu de la veste est déposé dans la cage d'hébergement pendant au moins 24 heures, puis les rats sont équipés de la veste seule (sans capteurs) jusqu'à 5 heures. Administration IV lente > 5 minutes: l'habituation au tube de contention est faite au moins 2 fois avant le premier traitement. Administration par voie orale et prélèvement sanguin en veine jugulaire chez rongeurs âgés ou peu manipulés: l'habituation à la manipulation est mise en place avant le premier traitement. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Si compatibles avec les objectifs de l'étude, des microprélèvements sanguins seront effectués, limitant ainsi le stress et facilitant la récupération. Le design de chaque étude sera détaillé dans le protocole d’étude et une évaluation éthique sera réalisée avant le démarrage. Le pH et l'osmolarité seront mesurés (ou communiqués par le donneur d'ordre) avant toute première administration par voie parentérale. Enfin, les volumes d'administration et de prélèvement de sang ont été établis selon des recommandations internes, elles-mêmes basées sur des recommandations éthiques (Diehl et al. (2001); J. Appl. Toxicol.).

Choix des espèces

Le choix de l'espèce animale dans les études visant à étudier les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques est basé sur les recommandations réglementaires édictées dans des lignes directrices internationales, les informations concernant la distribution et l'élimination des candidats-médicaments dans l'organisme, leur mécanisme d'action après liaison à leur cible biologique, les données de la bibliographie scientifique, et les analogies des fonctions physiologiques entre l’animal et l'Homme. Selon les fonctions physiologiques susceptibles d'être modifiées par le candidat-médicament et de la population concernée par celui-ci, l’âge le plus adéquat sera sélectionné, cet âge pouvant varier de l’âge juvénile jusqu’à l’âge de maturité sexuelle. Ce choix de l'âge répond à l’ensemble des études réglementaires conduites chez l'animal et nécessaires à la conduite des essais cliniques avec un candidat-médicament chez l’Homme.

Une solution censée améliorer la digestion des fourrages chez les ruminants, les lapins et les chevaux d'élevage passe d'abord par 144 souris. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gavées par sonde orogastrique pendant 21 jours, avec des prélèvements de selles deux fois par semaine. Chacune est hébergée seule, en cage sur grille, pour permettre la mesure individuelle de ce qu'elle ingère et excrète. Toutes seront tuées puis autopsiées, et le porteur affirme que les effets du produit ne s'évaluent que sur un organisme "pris dans sa globalité".

Objectifs

L’objectif général du projet est l’amélioration de la digestibilité des fibres chez les monogastriques ainsi que chez les polygastriques. En effet, ce processus, réalisé par un microbiote spécialisé hébergé dans le tractus digestif des individus mono ou polygastriques est essentiel à la nutrition et au bien-être digestif de l'hôte. Les fibres, apportées sous forme de fourrages frais (herbe pâturée), secs (foin) ou ensilés sont un composant essentiel des rations ingérées dans une grande diversité de systèmes d’élevage quel que soit le modèle animal ciblé (ovins, bovins, caprins, equins, lapins...). Le microbiote responsable de cette digestion est remarquablement efficace du fait de la production d’une large gamme d’enzymes (cellulases, hémicellulases) capables d’hydrolyser les polysaccharides complexes présents dans les fourrages, permettant la conversion en composés énergétiques majeurs (acides gras volatils ou à chaine courte) utilisables par l’animal hôte. Cependant, de nombreux facteurs (composition de la ration, stress environnemental…) peuvent réduire la capacité de ce microbiote à assurer sa fonction fibrolytique. Notre objectif est donc basé sur le développement de stratégies nutritionnelles permettant d’améliorer la digestibilité des fibres afin de compenser ce déficit.

Bénéfices attendus

Ce travail doit permettre de mettre en évidence le bénéfice de l'apport d'une fraction microbienne sur l'augmentation de la capacité de leur hôte à dégrader et digérer les fibres issues de sa ration.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 types d'intervention au cours de ce projet : 1) Le gavage orogastrique et sa répétition (21 jours) pendant le développement du projet peuvent être source de stress, lié à la contention de l'animal et de blessure lors de l'introduction de la sonde d'intubation. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute) ainsi que le risque de blessure, 2) le prélèvement de selles chez l'animal qui peut, également, être source de stress lié à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (2 fois pas semaine) et la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités.

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet étant d'optimiser le potentiel de dégradation fibrolytique de l'animal, l'apport fractions microbiennes provenant de bactéries connues pour cette activité de dégradation fibrolyitque et exemptes de bactéries vivantes, n'entrainera aucune nuisance pour la santé de l'animal cependant, le geste technique du gavage orogastrique et sa répétition pendant le déroulé du projet peuvent être source de stress, lié à la contention de l'animal et de blessure lors de l'introduction de la sonde d'intubation. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute) ainsi que le risque de blessure. De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (2 fois par semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Enfin, l'hébergement en cage individuelle et sur grille peut également source de stress pour les animaux, cette situation fera l'objet d'une évaluation attentive et sera atténuée par la capacité conservée de l'animal à visualiser/sentir ses congénères et par des grilles adaptées pour les souris . Pour toutes ces interventions, un arbre décisionnel est appliqué lorsqu'un point limite apparait.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.

Remplacement

L’impact de l'apport de fractions microbiennes sur l'augmentation des capacités fibrolytiques des herbivores mono et polygastriques nécessite le recours à un modèle in vivo pour atteindre notre objectif. Les effets bénéfiques potentiels de ces produits ne peuvent être évalués que sur un organisme pris dans sa globalité et dans un premier temps sur un modèle murin.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. Les animaux utilisés sont des souris mâles et femelles conventionnelles, qui seront hébergées dans les conditions réglementaires au sein de l'installation. 3 séries d’expérimentations seront réalisées sur ce modèle murin. Chaque expérience sera constituée de 2 lots de 24 souris conventionnelles (12 femelles et 12 mâles par lot) : - un lot de 24 souris TEST qui recevra par gavage orogastrique les fractions microbiennes - un lot de 24 souris TEMOIN qui recevra par gavage orogastrique l'équivalent en volume d'un tampon isotonique. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non préalablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus. Ainsi, 144 souris au total seront utilisés pour ce projet

Raffinement

Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques ainsi que les prélèvements de selles. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvements de selles). De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse.

Choix des espèces

Les souris seront agées de 10 semaines à leur arrivée au sein de l'établissement utilisateur, ce stade de développement, jeune adulte, est optimal pour des études de digestibilité des fibres et correspond aux animaux cibles de la stratégie nutritionnelle (stade adulte)

Jusqu'à trente gavages et cinq privations d'eau de quinze heures trente en cinq jours : 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une prise de sang et jusqu'à trois injections sur animal vigile, un isolement quotidien d'environ une heure pour mesurer la prise de boisson, et deux passages en pot de plastique jusqu'à ce que l'animal défèque. Le projet cherche à savoir si les souris qui absorbent mal le fructose en boivent moins par aversion, et si leur microbiote en est la cause. Toutes seront tuées pour prélever le cæcum et son contenu.

Objectifs

Le fructose est un sucre très présent dans notre alimentation et mal absorbé lorsqu’il est consommé en excès, on parle de malabsorption du fructose. Cette malabsorption, très fréquente chez les enfants et les jeunes adultes, cause des symptômes gastrointestinaux (production excessive de gaz, diarrhées, douleurs abdominales) et peut induire une sensation de satiété. Nous étudions ce phénomène à l’aide de modèles de souris qui présentent les mêmes difficultés d’absorption du fructose que les humains. Nous avons constaté que le fructose, consommé lors d’un repas ou sur le long terme : augmente une hormone digestive pouvant jouer un rôle dans les douleurs intestinales et la prise alimentaire, modifie la composition du microbiote intestinal, et change le comportement alimentaire des animaux : ils mangent moins pendant les deux premiers jours d’exposition au fructose, puis reviennent à la normale à partir du sixième jour. Nous voulons comprendre si dans ce contexte de mauvaise absorption du fructose, ces changements de comportement alimentaire traduisent un phénomène d’aversion (réaction négative ou ressentiment fort qui pousse à éviter ou à rejeter quelque chose) puis d’habituation suite à la consommation ponctuelle ou répétée à ce sucre et identifier les médiateurs biologiques impliqués. Nous souhaitons savoir si ces modifications de la prise alimentaire sont liés aux changements du microbiote et si ce dernier en est la cause directe. Pour cela, nous comparerons des souris normales à des souris qui absorbent mal le fructose, traitées ou non par des antibiotiques déplétant le microbiote. Elles recevront un régime sans fructose, puis seront soumises à un test visant à évaluer leur préférence ou leur refus de la solution de fructose par rapport à une solution neutre telle que l’eau, un test d’aversion lors d’une exposition ponctuelle, dite « aigüe » (5 min) ou répétée, dite « chronique » (10 jours) à ce sucre. Ce test a pour but de comparer le volume de fructose ingéré sous forme liquide dans la boisson à celui de l’eau afin d’évaluer la préférence de boisson des animaux et ainsi leur potentiel refus (aversion), vis-à-vis de ce sucre. Nous analyserons aussi le microbiote et marqueurs biologiques potentiellement liés à ces modifications du comportement alimentaire. L’objectif est de mieux caractériser la malabsorption du fructose et les mécanismes associés en clarifiant le lien entre le fructose, le microbiote, la douleur viscérale et la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier les mécanismes impliqués dans les changements de comportement alimentaire observés chez les souris qui n’absorbent pas bien le fructose, suite à une exposition répétée ou ponctuelle à ce sucre. En effet, cela permettra de mieux comprendre la mise en place de ce phénomène et de déterminer s’il existe un lien entre ces changements de comportements alimentaires, la douleur intestinale, et les changements du microbiote. En effet, l’identification des médiateurs biologiques impliqués dans l’établissement de ces symptômes de malabsorption du fructose, pourraient permettre de développer à terme, de meilleures stratégies alimentaires ou thérapeutiques et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes atteintes. De plus, on retrouve des symptômes similaires dans le syndrome de l’intestin irritable (SII), qui est le désordre intestinal le plus fréquent, avec 14,4 à 22 % des patients atteints qui n’absorbent pas bien le fructose. Ainsi, compte tenu de la forte prévalence du SII dans le monde, et d’un pourcentage non négligeable de malabsorption du fructose parmi les patients atteints de SII, il semble crucial d’en décrypter les mécanismes sous-jacents.

Procédures

Les animaux seront soumis à un et/ou deux tests comportementaux ayant pour objectif d’évaluer leur réaction (refus ou préférence) vis-à-vis du fructose via la mesure de sa consommation dans la boisson. Au cours de ce protocole qui durera au total 5 jours, les souris seront soumises à 5 périodes de restriction d’eau de 15h30, à un hébergement individuel (de courte durée (1h05/jour) nécessaire pour mesurer la prise hydrique, à un prélèvement sanguin (moins de 20 secondes) à l’état vigile, à maximum 3 injections (moins de 20 secondes/ injection) à l’état vigile, à maximum 30 gavages (moins de 20 secondes / gavage) à l’état vigile ainsi qu’à de la contention (quelques secondes) à l’état vigile. Les animaux seront soumis à deux prélèvements de fèces au total, au cours desquels les animaux seront placés dans un pot transparent, le temps (maximum 10 minutes) qu’ils évacuent deux fèces.

Impact sur les animaux

Les animaux seront susceptibles d’être seront susceptibles d’être soumis : A un stress et une potentielle déshydratation, lors des périodes de test de préférences et de mesure de la prise hydrique, nécessitant une période de restriction d’accès à l’eau. • A un stress lors de l’hébergement individuel de courte durée, nécessaire pour mesurer la prise hydrique au cours des tests d’aversion, lors de la récolte de fèces impliquant le placement de la souris dans un pot en plastique afin qu’elle émette des selles et lors du prélèvement de sang, nécessitant une contention de moins de 20 secondes. Au cours de ce prélèvement et des injections prévues, les animaux ressentiront une légère douleur due à la piqûre, de l’ordre de quelques secondes.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus (caecum et contenu de caecum).

Remplacement

À ce jour, aucun modèle ou technique in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire les interactions complexes entre le fructose, le microbiote et l’axe intestin-cerveau. Le recours à des animaux est donc indispensable pour intégrer et analyser de manière globale les données génétiques, physiologiques, du microbiote et de l’alimentation ainsi que les informations biologiques obtenues à partir des dosages hormonaux dans le sang et des analyses des tissus intestinaux et cérébraux.

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental et par génotype afin d’obtenir des résultats fiables et significatifs. Ce nombre a été déterminé en prenant en compte la variabilité des mesures de prise hydrique et des dosages ainsi que la variabilité connue des réponses du microbiote et de son adaptation au fructose. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des méthodes statistiques adaptées, en fonction du type de données recueillies, pour garantir des conclusions solides et précises. Dans cette perspective de réduction, nous prévoyons de n’inclure qu’un seul groupe contrôle, valable pour l’ensemble des groupes tests.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place : • Un enrichissement du milieu de vie : Les souris disposeront de papier sopalin pour construire leur nid, d’un bâton à ronger, d’un abri en propylène rouge, ainsi que de deux hamacs pour réduire les risques de bagarres. • Les animaux seront en groupe ; • Une habituation à la contention : Les animaux seront habitués à la contention et à l’expérimentateur afin de minimiser leur stress pendant les manipulations expérimentales ; • Cages des souris placées côtes à côtes sur le même portoir dans des cages transparentes lors de l’hébergement individuel nécessaire au test de préférence et de mesure de la prise hydrique d’aversion ; • Une surveillance et une pesée seront réalisées quotidiennement pendant la période du test d’aversion, pour contrôler l’état des animaux et s’assurer de leur bien-être tout au long du test et pouvoir intervenir ; • Des points limites seront définis et appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé dans les recherches sur les maladies gastro-intestinales, en raison de sa pertinence scientifique. Nous disposons de données préliminaires sur ces modèles génétiques originaux, qui sont disponibles uniquement chez la souris et indispensables pour notre étude. De plus, la souris possède les mêmes transporteurs et enzymes impliqués dans le métabolisme du fructose que l’humain ce qui renforce sa pertinence pour cette étude. Enfin, la malabsorption du fructose observée chez l’homme l’est également chez la souris et fait intervenir chez l’un comme chez l’autre, une altération dans la voie du métabolisme du fructose. Les groupes de souris seront testées pour l’aversion au fructose à 7 semaines d’âge, ce qui correspond chez l’humain à environ la tranche d’âge « 18-25 ans », groupe démographique étant le plus grand consommateur de fructose dans la population humaine.

Quatorze prélèvements sanguins en vingt-quatre heures, répétés sur un maximum de seize journées de cinétique : 20 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal subit d'abord une chirurgie de trois heures pour la pose de cathéters permanents et d'une canule jéjunale, puis reste hébergé seul pendant toute l'étude pour contrôler sa prise alimentaire. L'objectif est d'évaluer des formulations pharmaceutiques humaines et de caler des modèles in vitro sur les données animales. La mise à mort sert un prélèvement terminal de muqueuse intestinale.

Objectifs

Nous abordons la mise au point et le développement de formes pharmaceutiques spécifiques (forme galénique) et la biopharmacie de manière intégrée, depuis la conception des formulations et la libération des principes actifs jusqu’à leurs effets sur l’absorption, la biodisponibilité et le microbiote intestinal, dans une perspective d’optimisation des stratégies thérapeutiques et nutritionnelles. Le projet vise à évaluer l’impact de formulations galéniques innovantes humaines sur la biodisponibilité de substances actives modèles. L’objectif est de démontrer le rôle de ces formulations dans l’amélioration de différents paramètres pharmacocinétiques. Les résultats obtenus chez l'animal (in vivo) permettront d’établir des corrélations in vitro–in vivo, entre des données obtenues sur un animal vivant par rapport à des données obtenues par des techniques de laboratoire dans un environnement artificiel (in vitro), afin d’identifier les outils in vitro les plus prédictifs de la performance in vivo pour ces formulations innovantes. Par ailleurs, les données générées in vivo serviront de base à la construction de modèles pharmacocinétiques de modélisation informatiques (in silico),destinés à mieux comprendre et prédire le comportement in vivo à partir des expérimentations in vitro.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer et évaluer de nouvelles formes galéniques innovantes, en démontrant leur efficacité à l’aide d’un modèle préclinique adapté, le mini-porc. Les bénéfices attendus sont multiples : (i) contribuer à la mise au point de formulations améliorant la biodisponibilité des substances actives, (ii) renforcer la transférabilité entre les données in vitro et in vivo, en améliorant la prédictivité des modèles in vitro, (iii) identifier les outils expérimentaux les plus pertinents pour évaluer la performance des formulations et, à terme, de réduire le nombre d’expérimentations animales nécessaires au développement galénique.

Procédures

Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale pour la pose de cathéters permanents et de canule jéjunale (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours sera observée , entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 8 cinétiques maximum par étude avec un maximum de 2 études, d’une durée de 24 h suivie d’une période de récupération de 3 jours minimum entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment une des formes à tester. Des prélèvements de sang seront réalisés dans le cathéter selon la cinétique de 14 prélèvements sanguins étalés sur une journée de 24 heures. Pour chacune des journées de prélèvements, 2,7 ml de sang seront prélevés pour chaque point de cinétique. Le volume total prélevé sera de 37,8 ml par cinétique (moins de 7,5% du volume sanguin de l'animal).

Impact sur les animaux

Les substances actives utilisées dans le cadre de ce projet sont des composés déjà commercialisés chez l’Homme, ne présentant aucun effet néfaste connu, comme cela a été démontré lors de leur utilisation clinique. En effet, ils sont autorisés par les différentes autorités de santé. De plus, l’ensemble des excipients employés dans ces études sont reconnus comme sûrs et ne présentent aucun risque pour la santé ou le bien-être des animaux utilisés lors des expérimentations. La piqûre d’aiguille pour l’injection de la pré-anesthésie avant l’intervention chirurgicale peut provoquer une douleur légère et de courte durée. La procédure chirurgicale elle-même entraîne une douleur abdominale modérée, prise en charge par des antalgiques et limitée dans le temps. Enfin, l’hébergement en cages individuelles après la chirurgie entraîne un isolement temporaire des animaux et restreint certains comportements sociaux. L’isolement dure toute la durée du projet (habituation, post-op et prélèvement), les animaux étant appareillés ainsi que pour maitriser et contrôler leur prise alimentaire individuellement, il n’est pas possible de les héberger collectivement.

Devenir

En fin d’expérimentation ou en cas d’atteinte d’un point limite grave, les animaux seront mis à mort par injection intraveineuse d’une surdose de barbiturique intracardiaque sur animaux anesthésiés conformément à la réglementation en vigueur. Cette mise à mort est justifiée afin de réaliser des prélèvements terminaux de muqueuse intestinale pour compléter les résultats sanguins de l'étude.

Remplacement

La biodisponibilité des molécules actives contenues dans des formulations galéniques innovantes fait intervenir de nombreux processus biologiques et chimiques complexes (digestion, absorption, métabolisation), qui, à ce jour, ne peuvent pas être entièrement reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l’homme, ce qui en fait un modèle fréquemment utilisé pour les études pharmacocinétiques. Le mini-porc, en particulier, permet de travailler sur des adultes à stabilité pondérale et d’une taille compatible avec l’expérimentation animale. Il présente également l’avantage de posséder un système digestif très proche de celui de l’homme.

Réduction

Dans le cadre de la règle des 3R, le recours à 10 mini-porcs par étude permet de garantir la puissance statistique tout en minimisant le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au minimum, dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs scientifiques du projet. L’effectif prévu dans le schéma expérimental (10 animaux) tient compte de la variabilité du principal paramètre mesuré, à savoir l’apparition de la substance active dans le sang, estimée à partir d’études antérieures. Cette variabilité est liée non seulement aux différences interindividuelles entre les animaux, mais également à la qualité des prélèvements et à la précision des analyses biochimiques. Ces aspects sont parfaitement maîtrisés par les expérimentateurs du projet, qui possèdent une longue expérience dans ce domaine. L’utilisation d’un schéma expérimental permet de diminuer significativement le nombre d’animaux, chaque animal servant de témoin pour lui-même. L’équipe de recherche dispose d’une expertise reconnue dans l’utilisation d’animaux porteurs de canules digestives et de cathéters sanguins, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d’animaux et de limiter les processus douloureux.

Raffinement

L’approche développée sera peu invasive et vise à réduire au maximum la douleur et le stress des animaux. La douleur ressentie pendant l’expérimentation est principalement liée à l’acte chirurgical, qui se déroule sous anesthésie générale avec surveillance des constantes vitales. Les animaux recevront un traitement analgésique et spasmolytique, et après la période de récupération, la gêne reste mineure. Pendant cette phase, les animaux sont surveillés régulièrement tout au long de la journée. L’évaluation de la douleur et de l’inconfort est réalisée par observation du comportement des animaux, notamment la reprise de l’alimentation, du transit intestinal, la posture, les vocalises, la réactivité et la température corporelle. Durant toute la période expérimentale, les animaux seront hébergés dans des cages de taille réglementaire, avec des parois latérales en plexiglas permettant aux animaux de se voir et d’interagir entre eux. Leur environnement sera enrichi avec des jouets en caoutchouc adaptés aux porcs, la pièce sera à température régulée, et les animaux auront un libre accès à l’eau.

Choix des espèces

Le porc présente de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec l’homme, ce qui en fait un modèle fréquemment utilisé pour les études de biodisponibilité. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes à stabilité pondérale et d’une taille compatible avec l’expérimentation animale. Il présente également l’avantage de posséder un système digestif très proche de celui de l’homme. Ce modèle est reconnu par la communauté scientifique comme pertinent pour les études de biodisponibilité, avec une bonne transférabilité vers la physiologie humaine. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'expérimentation.

Identifiées par un poinçon à l'oreille, traitées aux antibiotiques par quatorze gavages puis recevant des selles humaines par douze gavages supplémentaires, 60 souris vont être utilisées pour étudier l'effet du microbiote humain sur le foie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés, les pesées et le prélèvement sanguin à la queue provoquent stress et douleurs passagers. Toutes sont tuées à l'issue pour collecter leur sang et leurs tissus. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit les interactions entre microbiote transplanté et métabolisme du foie.

Objectifs

Des travaux précédents ont mis en évidence que : -chez l’Homme, plus l’accumulation de graisse dans le foie est sévère, plus le taux sanguin d’un métabolite, appelé ici X, est élevé ; -chez la souris, le métabolite X, lorsqu’il est administré par gavage, peut à lui seul provoquer l’accumulation de graisse dans le foie. Comme ce métabolite X est produit par le microbiote intestinal, nous souhaitons comprendre si le microbiote humain est directement responsable de sa production et donc de l’accumulation de graisse dans le foie. Pour répondre à cette question, nous allons réaliser des transplantations fécales chez la souris. Cela consiste à transférer le microbiote de donneurs humains (personnes en bonne santé ou patients atteints de foie gras, présentant soit de faibles soit de forts taux de métabolite X dans le sang) dans des souris dépourvues de leur propre microbiote. L’objectif est de vérifier si le microbiote humain suffit à reproduire chez la souris des taux sanguins similaires de métabolite X (faibles ou élevés) et s’il peut entraîner, selon l’origine des selles, une accumulation plus ou moins importante de graisse dans le foie. L’expérience comportera plusieurs étapes : 1. une phase d’acclimatation des animaux ; 2. une élimination du microbiote intestinal des souris grâce à un traitement antibiotique d’une semaine ; 3. la transplantation fécale, 4. un prélèvement de sang sous anesthésie pour mesurer les concentrations du métabolite X, suivi de la collecte des tissus nécessaires aux analyses.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de déterminer si le microbiote de patients avec la maladie du foie gras ayant des taux élevés de métabolite X peut, à lui seul, augmenter ce métabolite et provoquer une accumulation de graisse dans le foie chez la souris, comparé à des microbiotes de sujets sains ou de patients présentant de faibles taux. Cela établira un lien direct entre certaines bactéries, le métabolite X et les atteintes du foie. À plus long terme, ces résultats pourront guider le développement de stratégies visant à réduire les bactéries responsables de la surproduction du métabolite X, ouvrant la voie à de nouvelles approches pour prévenir ou traiter la maladie du foie gras.

Procédures

Identification : les 60 souris recevront un unique petit poinçon au niveau de l’oreille pour permettre leur identification (durée : < 30 s, contention comprise). Traitement antibiotique : les 60 souris seront traitées pendant 7 jours consécutifs par un cocktail d’antibiotiques administré deux fois par jour (à 8 h d’intervalle). Chaque animal recevra donc 14 gavages (durée : ~30 s par gavage, contention comprise). Transplantation fécale : les 60 souris recevront des suspensions de selles humaines par gavage 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs (lundi, mardi, mercredi), et ce durant 4 semaines, soit 12 gavages par animal (durée : ~30 s par gavage). Pesées : les 60 souris seront pesées 2 fois par semaine sur toute la durée de l’étude, soit 10 pesées par animal (durée : ~30 s par manipulation). Analgésie et anesthésie : les 60 souris recevront une injection d’antidouleur (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie), suivie 30 minutes plus tard d’une injection d’anesthésiant (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie). Jeûne : les 60 souris seront soumises à un jeûne nocturne avant la mise à mort afin de stabiliser les paramètres métaboliques et permettre au mécanisme identifié par lequel le métabolite induit un stockage de lipides de se mettre en place. Prélèvement sanguin : les 60 souris subiront une petite incision (< 1 mm) au bout de la queue permettant de recueillir quelques gouttes de sang (durée : ~1 min pour l’incision et le prélèvement).

Impact sur les animaux

L’identification par poinçonnement de l’oreille peut provoquer une douleur légère et transitoire. Le traitement antibiotique d’une semaine est susceptible d’entraîner une légère perte de poids. Les gavages induisent un stress et un inconfort temporaires. Les pesées génèrent un stress léger. Les injections nécessaires à l’anesthésie et à l’analgésie provoquent une légère douleur momentanée. La période de jeûne nocturne peut entraîner un inconfort supplémentaire, et le prélèvement sanguin à la pointe de la queue s’accompagne d’une douleur passagère. Aucun effet indésirable n’a été observé lors de protocoles similaires menés dans notre laboratoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de collecter le sang et les tissus nécessaires aux analyses.

Remplacement

L’objectif du projet est d’évaluer la capacité d’un microbiote humain à induire la production du métabolite X et à déclencher l’accumulation de graisse dans le foie. Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre le microbiote transplanté, l’absorption intestinale, le métabolisme du foie et la régulation du métabolite X. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser le transfert des métabolites, la dynamique hôte–microbiote ni les conséquences. Le modèle souris reste donc le seul modèle pertinent pour établir un lien causal entre composition du microbiote, production du métabolite X et altérations du foie.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique, en utilisant des données issues de protocoles antérieurs menés chez des patients atteints de la maladie du foie gras pour lesquels le métabolite X a été mesuré en circulant. Ce calcul indique qu’un effectif de 20 animaux par groupe est nécessaire pour détecter une différence significative entre groupes. Par ailleurs, un maximum de tissus sera prélevé et conservé lors de la mise à mort, afin d’être utilisés pour des analyses complémentaires ou partagés dans le cadre de collaborations, permettant ainsi d’éviter la répétition inutile d’expérimentations animales.

Raffinement

Les animaux seront surveillés cinq fois par semaine, avec un suivi individuel du poids à J0 et deux fois par semaine et une mesure de la consommation alimentaire deux fois par semaine par cage. Ces suivis réguliers permettront d’identifier précocement tout signe de perte de poids excessive. Les gavages seront réalisés exclusivement par du personnel expérimenté, afin de garantir un geste précis et rapide minimisant stress et inconfort. Une sonde souple sera utilisée pour les gavages pour réduire le risque d’irritation ou de lésion de l’œsophage. Après chaque gavage, chaque animal sera observé durant au moins 5 minutes pour vérifier l’absence de douleur ou de détresse. Les volumes administrés par gavages seront strictement limités au minimum compatible avec la procédure pour réduire l’inconfort. Un enrichissement supplémentaire des cages sera mis en place durant la semaine de traitement antibiotique, ainsi que pendant la nuit de jeûne, afin d’atténuer le stress et maintenir un comportement normal. Les antibiotiques seront administrés par gavage plutôt que dans l’eau de boisson, afin de préserver une prise alimentaire et hydrique optimale et d’éviter une perte de poids excessive durant la phase d’antibiothérapie. Une seule incision de moins de 1 mm à l’extrémité de la queue sera réalisée pour recueillir les quelques gouttes nécessaires à l’évaluation du métabolisme du sucre. Les volumes injectés pour l’anesthésie et l’analgésie seront réduits au strict minimum efficace. Avant le prélèvement sanguin final, les animaux seront anesthésiés par injection avec analgésie complémentaire. La mise à mort sera ensuite réalisée par dislocation cervicale. Enfin, des points limites prédéfinis et adaptés au modèle seront appliqués afin d’interrompre la procédure dès l’apparition de signes précoces de souffrance ou de détérioration de l’état général.

Choix des espèces

La souris constitue l’espèce la plus appropriée pour répondre à la question scientifique posée. En effet, elle permet de réaliser des transplantations fécales dans des conditions contrôlées et reproductibles, tout en offrant une physiologie de l’intestin et du foie bien caractérisée et comparable à celle de l’Homme. Les modèles souris sont de référence pour étudier les interactions hôte–microbiote, la production de métabolites d’origine bactérienne et leurs conséquences. De plus, les procédures de traitements avec les antibiotiques et de transplantation de selles humaines sont validés dans cette espèce, rendant la souris le modèle le plus fiable pour établir un lien causal entre microbiote humain, métabolite X et altérations du foie. Des souris âgées de 10 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux ont terminé leur phase de croissance, présentent une physiologie stable et offrent une meilleure homogénéité des réponses. Par ailleurs, des souris de cet âge tolèrent bien les traitements antibiotiques nécessaires à l’élimination du microbiote, ce qui garantit la fiabilité et la reproductibilité du protocole.

Pour savoir si la chaleur aggrave la toxicité d'une mycotoxine présente dans près de la moitié des céréales, 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles sont exposées quatre semaines à cette toxine par l'alimentation et placées dans une armoire chauffée à 32-35 °C, avec des mesures de glycémie après douze heures de jeûne. Le RNT décrit une baisse de poids, une respiration accélérée et une activité réduite sous l'effet combiné de la chaleur et du contaminant. La mise à mort sert à prélever le foie et l'intestin pour comparer les réponses des mâles et des femelles.

Objectifs

Tout au long de sa vie, l’Homme est exposé à un large éventail de contaminants alimentaires d'origines diverses. Les mycotoxines sont produites par certaines moisissures et sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine étudiée se retrouve dans près de 50 % des céréales et environ 80 % des individus y sont exposés. Le changement climatique qui implique une hausse des températures, bouscule le rythme naturel des cultures et modifie les périodes où les champignons peuvent les infecter, ce qui peut, selon les régions, augmenter ou réduire la présence de cette mycotoxine. Elle perturbe le fonctionnement de l'intestin notamment en provoquant une inflammation qui pourrait jouer un rôle dans l'apparition et la gravité des maladies inflammatoires de l'intestin. Le corps garde normalement une température assez stable, même si elle peut un peu varier. Quand il fait très chaud, il subit un stress thermique: cela perturbe son fonctionnement interne et modifie l’activité de nombreuses cellules. Pour se protéger, l’organisme déclenche une réaction de défense, qui se traduit par une hausse de la température corporelle, une plus forte sollicitation du cœur et une utilisation accrue du sucre comme source d’énergie. Même si plusieurs études montrent que le changement climatique peut faire varier la présence de cette toxine, aucune ne s’est encore penchée sur la façon dont elle pourrait devenir plus ou moins dangereuse pour les organismes vivants. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de cette toxine dans un contexte de forte chaleur et de caractériser ces effets sur différents paramètres physiologiques au niveau du foie et de l’intestin. Nous chercherons à vérifier l'hypothèse que, dans des conditions réalistes d’exposition, ces effets seront différents entre les mâles et les femelles.

Bénéfices attendus

Certains consommateurs sont quotidiennement exposés à des aliments contaminés par la mycotoxine étudiée présente dans les aliments à base de farine de blé, de maïs, etc. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons in vivo chez la souris si l’exposition chronique à la chaleur potentialise les effets de cette mycotoxine. Les données expérimentales permettront d’évaluer l’impact d’une exposition combinée à la chaleur et à la mycotoxine sur le métabolisme général, ainsi que sur la santé digestive et hépatique. Les résultats attendus de ce projet présentent un enjeu important pour la santé publique, compte tenu de l’exposition chronique des consommateurs à cette toxine et de l’augmentation continue des températures associées au réchauffement climatique. Si les hypothèses sont confirmées, les données produites feront l’objet de publications scientifiques et pourront être prises en compte dans l’évaluation du risque d’exposition chez l’Homme.

Procédures

L’objectif de ce projet est d’étudier l’exposition chronique à une mycotoxine lors d’un stress thermique. Les animaux seront exposés à la mycotoxine via l’alimentation pendant 4 semaines et/ou à une chaleur plus élevée que lors d’un hébergement standard (20-24°C) dans une armoire chauffante entre 32-35°C. Les animaux seront pesés une fois par semaine, ce geste dure 15 secondes. Une mesure de la glycémie et de la cétonémie sera réalisée 2 fois au cours de la procédure après 1 et 4 semaines d’exposition. Pour cela, les animaux sont mis à jeun pendant 12h, puis une goutte de sang sera prélevée. Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. A la fin de la procédure, un prélèvement de sang sera effectué puis les animaux seront euthanasiés et des organes prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

La consommation d’un aliment contaminé par la mycotoxine peut entrainer une réduction de la prise de poids des animaux. L’exposition à une température ambiante de 32-25°C est susceptible d’induire une augmentation de la fréquence respiratoire, une diminution de l’activité locomotrice, une modification de la prise alimentaire ainsi qu’une augmentation de la consommation d’eau. Une légère perte de poids transitoire lors des 2 premiers jours ou des modifications du comportement peuvent également être observées. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention (15s) et une douleur ponctuelle liée à la piqure de l’aiguille.

Devenir

A l’issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes destinés à être analysés pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des études précédentes ont permis de montrer que la mycotoxine étudiée entraîne des perturbations intestinales et hépatiques, tandis que l’exposition à la chaleur induit un stress thermique pouvant altérer le métabolisme du foie. . En effet, des tests in vitro sur cellules ont déjà été réalisé par le laboratoire pour étudier les effets des mycotoxines. Cependant ces modèles présentent des limites car ils ne reproduisent pas la complexité d’un organisme entier avec les interactions entre organes, ne permettent pas d’évaluer correctement la métabolisation des mycotoxines et ne reflètent pas les effets globaux ou à plus long terme. Lorsqu’elle est ingérée par un organisme vivant, son devenir et ses effets dépendent notamment de son absorption intestinale et de sa métabolisation, processus qui peuvent être perturbés par un stress thermique. Ce projet nécessite donc l’utilisation d’animaux de laboratoire pour étudier les conséquences d’une exposition alimentaire à la mycotoxine dans un environnement plus chaud sur un organisme entier, impliquant l’interaction de différents tissus (foie, tissu adipeux, intestin, cerveau, muscle) et les réponses physiologiques globales du aux adaptations de l’organisme. Il est impossible de reproduire ces interactions complexes en utilisant uniquement des méthodes alternatives, telles que des cultures cellulaires.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Cet effectif a été déterminé en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Lors du suivi quotidien des animaux, nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et nous utiliserons une grille d'évaluation de leur état général portant sur l’apparence générale, le comportement, les signes cliniques et l’alimentation. Le cumul du score de chacun de ces critères permettra de décider d’un éventuel arrêt de la procédure. Les souris seront hébergées en groupe pour respecter leurs comportements sociaux et un enrichissement de type abri en inox ou un élément de nidification sera ajouté dans la cage. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress.

Choix des espèces

Les lignées de souris sont largement utilisées dans la recherche sur le métabolisme. Il est connu que la lignée utilisée dans cette étude développe des maladies hépatiques. La souris présente des similitudes avec l’espèce humaine pour ce qui est des maladies et de leurs effets sur le corps. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous avons besoin d’avoir un tractus digestif et un système immunitaire mature. Les souris sont adultes à partir de 8 semaines.