Système gastrointestinal

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de 15 jours, elles reçoivent un agent génotoxique puis, pendant douze semaines, des injections de tétrachlorure de carbone deux fois par semaine et un gavage hebdomadaire de dioxine, pour induire un cancer du foie sur fond de fibrose. Le foie et le sang sont prélevés après mise à mort. Le porteur affirme qu'il n'existe aucun moyen de remplacer une telle étude, la réponse étudiée mettant en jeu plusieurs types cellulaires.

Objectifs

Dans ce projet, nous étudierons les mécanismes par lesquels la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) favorise le développement du carcinome hépatocellulaire avec une attention particulière sur la contribution des cellules endothéliales dans ce processus. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de carcinome hépatocellulaire (CHC) qui consiste à administrer un agent génotoxique, le N-nitrosodiéthylamine (DEN), à des souriceaux mâles âgés de 15 jours puis à administrer du tétrachlorure de carbone (CCl4) 2 fois par semaine pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines. Ce modèle permet le développement de tumeurs hépatiques (induites par le DEN) sur un foie avec une fibrose (induite par le CCl4). L’effet de la TCDD sur la carcinogenèse hépatique sera évalué en exposant les souris à une administration chronique de TCDD ou son diluant (nonane) par gavage une fois par semaine à partir de l'âge de 8 semaines jusqu'à 20 semaines.

Bénéfices attendus

Si la toxicité d’une exposition chronique à de faibles doses de 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) sur la santé humaine est largement reconnue, elle reste encore mal caractérisée, notamment d’un point de vue moléculaire et cellulaire. Ce projet permettra de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent les effets délétères de la TCDD sur le développement du carcinome hépatocellulaire. Plus largement, ce projet apportera une meilleure compréhension de l'impact des polluants environnementaux et de la voie d’aryl hydrocarbone (AhR) sur la santé humaine.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection unique de dihétylnitrosamine (DEN) ou son diluant (NaCl) en ip 15 jours après la naissance ; deux injections par semaine de tétrachlorométhane (CCl4) ou son diluant (Huile) en ip à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines ; une administration de TCDD par semaine en gavage à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 15 secondes par souris et les gavages de 30 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le modèle DEN / CCl4 induira le développement de tumeurs hépatiques.

Devenir

Les animaix seront euthanasiés à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de la TCDD.

Remplacement

Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique étudiée met en jeu plusieurs types cellulaires (hépatocytes et cellules endothéliales)

Réduction

Le nombre de souris a été réduit à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait son euthanasie anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est l’espèce couramment utilisée dans ce protocole de carcinogenèse hépatique. De plus, ce modèle présente l'avantage qu'il nous permet de travailler avec des souris génétiquement modifiées. En effet, nous disposons de souris invalidées pour le gène du récepteur aux hydrocarbures dans les cellules endothéliales, il s'agit de souris transgéniques qui expriment le gène codant la Cre recombinase sous le contrôle du promoteur VE-cadhérine (Cdh5) et présentent le gène AhR floxé (souris Tg Cdh5-CreERT2/+: AHRflox /flox). Pour le protocole d'induction d'un CHC sur foie cirrhotique, le protocole consiste en une injection unique de N-nitrosodiéthylamine (DEN), un agent génotoxique, à 25 mg/kg ou son diluant (NaCl) à des souriceaux mâles âgés de 15 jours. En effet, la forte prolifération des hépatocytes à ce stade permet d'induire des mutations dans des cellules en prolifération ce qui permettra le développement de tumeurs hépatiques. Six semaines après l’injection de DEN (8 semaines de vie), les souris recevront une injection de CCl4 (dose à 0,2ml/kg d’une solution de 10% )ou de son diluant (huile) qui seront faites en intrapéritonéal 2 fois par semaine pendant 12 semaines. Les souris seront exposées à une administration chronique de TCDD ou son diluant (nonane) par gavage une fois par semaine à partir de l'âge de 8 semaines jusqu'à 20 semaines.

224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nés sans flore intestinale, ils reçoivent par gavage le microbiote de volontaires humains, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires, un passage isolé de 24 heures en chambre respiratoire et une contention en tube pour mesurer leur composition corporelle, avant autopsie. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel et le gavage sont sources de stress, tout en les présentant comme brefs. L'objet du projet est de comparer l'effet sur la santé de yaourts et fromages issus d'élevages "agro-écologique ou intensif", et il affirme un "recours absolu" au modèle animal.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer si des produits laitiers fermentés (yaourts et fromages affinés) fabriqués à partir de lait de vaches élevées en système agro-écologique ou intensif, impactent différemment la santé du consommateur

Bénéfices attendus

Le projet vise à faire la preuve de concept de la divergence de qualité de différents produits laitiers (fromages affinés ou laits fermentés) fabriqués à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif et des conséquences positives ou négatives respectives sur la santé du consommateur

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, 3) Le passage dans les chambres respiratoires, qui permet de mesurer les gaz excrétés par les animaux (H2, CO2 et CH4), est réduit à son minimum de 24h et enfin 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.

Impact sur les animaux

Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de ce projet des volontaires sains, l'alimentation est, de plus, adaptée, n'entrainant pas de troubles digestifs ou de croissance. La supplémentation, basée sur des produits laitiers fermentés de consommation courante, n'entraine pas non plus de nuisance ou d'effets indésirables pour les animaux. Cependant le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Le placement des animaux en cage individuelle peut occasionner un stress lié à la découverte d'un nouvel environnement et à l'absence de congénaire. Bien que les animaux s'adaptent rapidement, une surveillance accrue sera mise en place pendant toute la durée de la procédure pour détecter d'éventuels signes de mal être. Si des signes apparaissent et persistent pendant les 3 premières heures du passage en chambre respiratoires, les animaux retourneront dans leurs hébergements d'origine. Ce stress est limité par le temps de passage dans les chambres respiratoires réduit à son minimum (24h) et des enrichissements type Sizzle Nest sont également ajoutés à l'environnement pour permettre la réalisation de nid par les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.

Remplacement

L’évaluation de l’impact santé de produits laitiers fermentés étudiés (yaourts et fromages produits à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif) nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ces produits sur l’intégrité intestinale (perméabilité, immunité) et la santé cardio-métabolique (masse grasse, tissus adipeux et hépatiques) chez l’homme. Ceci nécessite en effet une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.

Raffinement

Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles et le passage en chambre respiratoire. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles. De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 8 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 8 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont isolées quinze jours puis placées en cages métaboliques, le porteur reconnaissant que l'isolement et le passage en analyseur de masse corporelle provoquent un stress modéré. L'étude vise à caractériser le comportement alimentaire et la dépense énergétique de souris porteuses d'une mutation liée à l'obésité. Le porteur affirme que l'exploration du métabolisme énergétique ne peut se faire que sur un "organisme entier".

Objectifs

Lors des dernières décennies, l'obésité et le surpoids ont atteint les proportions d’une épidémie mondiale impactant 1.9 milliard d’adultes en surpoids et plus de 650 millions d’obèses en 2016. Plusieurs études ont clairement montré que les voies de l’immunité innée sont impliquées, notamment via leur activation par les bactéries du microbiote intestinal, dans la mise en place de l’obésité et des maladies métaboliques qui y sont associées. Récemment une nouvelle voie de l’immunité innée a été identifiée. Cette voie implique un récepteur intestinal. Chez l’homme, des mutations du gène de ce récepteur ont été associées à l’obésité, à la prise de poids et au diabète de type 2. Une lignée de souris mutées pour ce récepteur a donc été développée afin de mieux caractériser les effets de cette voie de signalisation sur la mise en place de l'obésité et afin de comprendre les mécanismes sous-jacents liant cette voie à l’obésité. Par rapport à des souris contrôles issues de la même fratrie, la prise de poids de ces souris en réponse à un régime riche en lipides est réduite de 20%. Cependant aucune mesure de la structure détaillée des repas ainsi que des données sur la balance énergétique ne sont disponibles à ce jour. Or il a clairement été montré que la structure des repas (quantités d'aliments ingérés, taille, heure et fréquence des repas) ainsi que le statut de la balance énergétique sont déterminants dans la prise de poids. Afin d’identifier les mécanismes liant ce récepteur et la prise de poids il est nécessaire de caractériser précisément la structure des repas, de même que la dépense énergétique des animaux et leur composition corporelle précise. L’ensemble de ces paramètres peuvent être obtenus de manière non invasive via l’utilisation de cages métaboliques et d'un analyseur de la composition de la masse corporelle.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes régulant le comportement alimentaire et la dépense énergétique est essentiel dans le cadre de la lutte contre les maladies métaboliques telles que l’obésité. En effet l’obésité, pandémie mondiale aux conséquences médicales et économiques multiples et dévastatrices, est une pathologie résultant d'une dérégulation de la balance énergétique et implique notamment une dérégulation de la prise alimentaire et/ou de la dépense énergétique. Le modèle de souris portant une modification du recepteur intestinal, compte tenu de la résistance à l'obésité qu'elles développent indique que l'étude de cette voie de signalisation et de son lien avec le comportement alimentaire et/ou la dépense énergétique peut permettre la découverte de nouvelles cibles therapeutiques utiles dans la lutte contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à un isolement durant 15 jours. L’analyse métabolique ( 8 jours) n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne necessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélévement n'auront lieu sur animal vigile. Les animaux seront monitorés tous les jours, ils seront pesés: 1 fois/ jours (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition coporelle analysée (3 minutes/animal) de maniére non invasive 1 fois au debut de l'individualisation puis à l'entrée, lors du changement de régime et à la sortie des cages calorimétriques, soit 4 fois durant l'expérience.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré susceptible d'apparaitre durant la totalité de l'expérimentation. La durée totale de l'isolement des animaux est de 15 jours. De même les souris seront placées pendant 2 minutes dans un analyseur de masse corporelle. Cette technique bien qu'étant non invasive peut entrainer un stress modéré durant le temps de l'analyse. Aucune douleur n'est attendue durant le protocole. Le poids et la prise alimentaire de ces animaux sera surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 10% du poids initial. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal.

Devenir

Aprés que les animaux sont retirés des cages métaboliques, leurs poids et leurs composition corporelle évaluées. Il n 'y a pas de nécéssité de conserver les animaux, ainsi les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les interactions entre immunité innée/régime alimentaire et comportement alimentaire/dépense énergétique/composition corporelle. Enfin, l’exploration du métabolisme énergétique et des comportements attenants ne peut se faire que sur un organisme entier, en raison de l’organisation et de la coopération des tissus métaboliques actifs.

Réduction

Afin de réduire de nombre d'animaux nous proposons dans cette étude d'étudier le comportement alimentaire, la dépense énergétique et le composition corporelle sur les mêmes animaux. D’après les études de comportement déjà menées en laboratoire, nous estimons que 8 souris par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80% ) compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. La lecture métabolique effectuée sur plusieurs jours permettra de réduire la variabilité intrinsèque de l’animal et inter animal, et limite le nombre d’animaux utilisés. Enfin le changement de régime au cours de l'analyse et sur les mêmes animaux permettra aussi d'évaluer les capacités adaptatives de l'animal lors d'un changement de régime.

Raffinement

L'analyse calorimétrique et la mesure de la composition corporelle sont deux analyses non invasives. -L’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2) dans le système de calorimétrie indirecte. -Les animaux bénéficieront d’un enrichissement, un abri en propylène rouge ainsi que deux carrés de coton et une nacelle pour faire leur nid. -les capteurs sont encastrés dans le couvercle de la cage et ne gênent pas l’animal, -l’air des cages est renouvelé à un taux de 2litres/min (débit calibré pour une mesure précise de la consommation de O2 et la production de CO2). Le mal-être a des conséquences directes sur les paramètres de la balance énergétique (prise alimentaire, activité locomotrice, dépense énergétique) et in fine sur la qualité et la validité des données obtenues. Pour cela, les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle plus suivi de la prise alimentaire et hydrique et du gain de poids). Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés et calculés quotidiennement au moyen du système de calorimétrie, le tout est effectué de manière automatique, de jour comme de nuit et sans intervention de l’opérateur. Des points limites et des critères d'arrêt de l'expérience ont été prévu en cas d'anomalie de comportement ou d'alimentation. Si un de ces paramètres affiche une valeur anormale, l'opérateur/responsable en recherchera l'origine.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est le seul modèle de souris transgéniques disponible qui permet d’étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude du métabolisme et est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation. de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris et du transport intestinal du fructose sont un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les animaux adultes (entre 10-12 semaines) seront utilisés. c'est à dire à l’âge adulte : (1) lorsque toutes les structures cérébrales sont stabilisées pour ne pas impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au cours du temps ; (2) la masse de l’animal est plus stable à l’âge adulte ce qui permet une analyse fiable et robuste durant le temps de l’expérimentation.

104 cochons vont être utilisés, 26 truies et 78 porcelets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les animaux étant gardés vivants dans l'élevage expérimental à l'issue. Les truies subissent des prises de sang au lasso nasal, des collectes de fèces après stimulation anale et des traites précédées d'une injection d'ocytocine, les porcelets étant séparés de leur mère quarante minutes avant chaque prélèvement. Le projet décrit les oligosaccharides du lait de truie pour la filière porcine, avec l'objectif affiché de réduire les troubles digestifs des porcelets au sevrage. Le porteur reconnaît la contention comme stressante et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour des animaux de ce poids.

Objectifs

Les oligosaccharides sont des composés du colostrum et du lait, présentant une grande diversité de structure, non digérés par les jeunes mammifères mais utilisés par les bactéries intestinales. Dans l’espèce humaine, ils auraient des effets bénéfiques sur le microbiote intestinal des bébés (effet prébiotique), contre des pathogènes, bactéries, virus et parasites (effet anti-adhésion) et sur l’activité des cellules intestinales épithéliales et immunitaires. Leurs effets dépendraient de leur structure. Chez les animaux d’élevage, cependant, leurs bénéfices sont peu ou pas connus. En élevage porcin, les porcelets sont très susceptibles aux troubles digestifs (diarrhées notamment), qui sont généralement traités par des antibiotiques. Dans l’enjeu de démédication des élevages et d’amélioration du bien-être des animaux, il est impératif de développer des stratégies préventives qui permettent d’améliorer la santé des porcelets. Dans ce contexte, le projet vise d’abord à décrire les oligosaccharides du lait de truie et leur diversité de structure et ensuite à étudier les liens entre ces profils en oligosaccharides du lait et le microbiote intestinal et la santé des porcelets.

Bénéfices attendus

A court terme, les données sur les oligosaccharides du lait de truie, quantité et diversité de structure, alimenteront une base de données multiespèce qui sera mise à disposition dans un répertoire public. Le projet apportera aussi des connaissances nouvelles sur le lien entre les profils d’oligosaccharides et la santé intestinale des porcelets allaités. A plus long terme, ces connaissances permettront de tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets, en étudiant les effets d’oligosaccharides spécifiquement identifiés comme potentiellement bénéfiques. Nous fournirons ainsi des pistes à la filière porcine pour développer un aliment premier âge pour porcelet allaité qui serait enrichi en oligosaccharides bénéfiques, aliment qui permettrait de réduire les problèmes digestifs des porcelets au sevrage, une phase critique en élevage.

Procédures

Les truies seront soumises à une prise de sang (à 109 jours de gestation), une collecte de fèces (à 6 jours de lactation), une collecte de colostrum à la mise bas et 3 collectes de lait à 6, 20 et 27 jours de lactation. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. Si une stimulation anale légère est nécessaire pour stimuler la défécation, celle-ci ne dure pas plus d’une minute. La traite pour collecter le colostrum et le lait dure entre 5 et 15 minutes. Les porcelets seront soumis à 3 prises de sang et 3 collectes de fèces à 6, 20 et 27 jours d’âge. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes et celle de la collecte de fèces est limitée à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La prise de sang par ponction dans la veine jugulaire nécessite de tenir la truie au lasso nasal afin qu’elle soit la plus rapide et la moins douloureuse possible. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. Cette contention, même brève, est stressante pour la truie. A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative approuvée et utilisable de manière systématique sur des animaux de cet âge, de ce poids et de cette force. Les truies sont récompensées par un morceau de pomme à l’issue de la procédure. La collecte de fèces est réalisée à la défécation naturelle ou après stimulation anale légère, donc sans stress ni douleur. La collecte de colostrum n’entraine pas de douleur et tout au plus une gêne de la truie à l’approche des expérimentateurs. Par contre, chaque prélèvement de lait nécessite de séparer les porcelets de leur mère pendant 40 minutes avant le prélèvement. Les porcelets sont alors placés dans une caisse placée à proximité de leur mère afin de réduire le stress engendré chez les porcelets et la truie. Cette séparation est requise pour que le lait s'accumule dans la mamelle, elle facilite la traite. Les porcelets sont remis avec leur mère dès la fin du prélèvement. Le prélèvement de lait nécessite aussi une injection préalable d’ocytocine en intramusculaire afin d’induire l’éjection du lait, engendrant la douleur de la piqure. Les porcelets seront soumis à 3 prises de sang et 3 collectes de fèces à 6, 20 et 27 jours d’âge. La prise de sang est faite dans la veine jugulaire avec un dispositif de type Vacutainer en maintenant les porcelets immobilisés en décubitus dorsal. L’immobilisation ne dépasse pas 5 minutes et la durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. La collecte de fèces est réalisée sur des porcelets allaités. Le lait étant très digestible, l'obtention de quelques grammes de fèces peut être difficile, notamment à 6 et 20 jours d’âge. Elle nécessite de tenir le porcelet et de faire une stimulation anale avec un thermomètre tout en appuyant sur l’abdomen. Mais cette étape ne sera pas nécessaire pour tous les porcelets car la collecte se fait au moment de la prise de sang qui favorise la défécation. La durée de contention de chaque porcelet est limitée à 5 minutes.

Devenir

Le projet sera mené sur des truies et leurs porcelets jusqu'à la fin de la période d'allaitement. Les porcs sont ici l'espèce cible du projet qui consiste à apporter des éléments scientifiques sur le lien entre des composés spécifiques du lait, les oligosaccharides, et le microbiote et la santé intestinale des porcelets. Les connaissances serviront de base pour tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets sous la mère qui permettrait de réduire les problèmes diggestifs des porcelets au sevrage. En élevage porcin, le sevrage est une phase critique pour les porcelets. Truies et porcelets poursuivent leur carrière dans l'élevage expérimental.

Remplacement

Les deux objectifs du projet sont de décrire les profils en oligosaccharides du colostrum et du lait de truie et d’étudier les liens entre ces profils et le microbiote intestinal et la santé des porcelets. Le projet porte donc sur le continuum truie-sécrétions lactées- porcelets et nécessite d’être réalisé sur des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus est de 104 au maximum ; il correspond à 26 truies et 78 porcelets (3 porcelets/portée x 26 portées). Le nombre de truies (26 truies à la mise bas pour au final 20 truies avec un jeu de données complet) est suffisant et nécessaire pour décrire les profils en oligosaccharides du lait et leur variabilité au sein de truies d’un même génotype, d’un même élevage et conduites de la même façon. Il est suffisant aussi pour suivre la cinétique d’évolution de ces profils sur 4 semaines de lactation. Pour les porcelets, seul un nombre limité de porcelets par portée seront soumis aux interventions invasives. Ils seront représentatifs des porcelets de poids moyen dans la portée. Le choix de 2 et 3 porcelets pour les collectes de sang et de fèces permet d’évaluer l’effet de la mère dans les analyses. Deux ou 3 porcelets sur 20 portées (au final) permettent aussi de suivre la cinétique d’évolution du microbiote fécal et des indicateurs de santé des porcelets pendant leur phase d’allaitement. Ce choix est basé sur nos expériences précédentes, validées. Les cinétiques seront étudiées par analyse de variance comportant l’effet temps de prélèvement et l’effet truie.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel expérimenté et en respectant des points limites afin de réduire la souffrance et la douleur des animaux. Les mesures de raffinement consisteront à réduire le plus possible l’intensité et la durée de la douleur ou du stress que peuvent engendrer les interventions. La durée des contentions des truies et des porcelets sera limitée à 5 minutes. Les prises de sang seront stoppées au bout de 2 minutes. Les collectes de fèces seront aussi interrompues si sans succès au bout de 5 minutes. Truies et porcelets seront particulièrement surveillés après chaque intervention invasive.

Choix des espèces

Le projet sera mené sur des truies et leurs porcelets jusqu'à la fin de la période d'allaitement. Les porcs sont ici l'espèce cible du projet qui consiste à apporter des éléments scientifiques sur le lien entre des composés spécifiques du lait, les oligosaccharides, et le microbiote et la santé intestinale des porcelets. Les connaissances serviront de base pour tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets sous la mère qui permettrait de réduire les problèmes diggestifs des porcelets au sevrage. En élevage porcin, le sevrage est une phase critique pour les porcelets. Le projet porte sur la transmission d’éléments de la truie aux porcelets via le colostrum et le lait. Il utilise donc des truies en lactation et des porcelets allaités par ces truies.

1 088 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un surdosage de paracétamol par injection pour provoquer une atteinte du foie, puis sont tuées par dislocation cervicale afin de prélever foie, rate et reins. Le porteur affirme que le surdosage entraîne un inconfort mais aucune douleur dans les vingt-quatre heures. Sur le remplacement, il affirme que l'intoxication au paracétamol est un processus complexe non modélisable in vitro et une étape préclinique "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de trouver de nouveaux traitements de l'insuffisance hépatique induite par le paracétamol.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait aboutir à la mise en place de nouveaux traitements de l'intoxication au paracétamol basés sur l'utilisation de la N-Acétyl Cystéine et d'inhibiteurs de nécrose régulée.

Procédures

Deux injections intrapéritonéales pour procédure 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs", une injection intrapéritonéale et une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie isoflurane pour procédure 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse", et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale avant sacrifice par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Le traitement par un surdosage contrôlé de paracétamol entraine certes un inconfort des animaux mais il n’est pas accompagné de douleurs dans les 24h qui suivent son injection (actions antalgique et antipyrétique du paracétamol).

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie après la procédure n° 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs" (soit 960 souris) ou la procédure n° 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse" (soit 128 souris). Tous les animaux (1088 souris) sont mis à mort après la procédure n°3 "Prélèvement du sang par voie rétro-orbitale" afin de prélever les différents organes (rate foie et reins) pour les analyses.

Remplacement

S’il est vrai que certaines questions peuvent être abordées grâce à la culture d’hépatocytes, celle posée dans notre projet cherche à identifier le rôle protecteur d’une molécule vis-à-vis d’une pathologie, l’intoxication au paracétamol qui implique un grand nombre d’évènements moléculaires et cellulaires. Cette pathologie est un processus complexe non modélisable in vitro. Enfin, cette étude préclinique est une étape pré-requise indispensable avant de futures études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris engagées (1088) dans ces expériences a été réduit au minimum pour permettre une validation des résultats statistiques par des tests non paramétriques Kruskal-Wallis, Mann et Whitney et Spearman.

Raffinement

L’étude a été raffinée au mieux en privilégiant un traitement de courte durée permettant à la fois la mesure des paramètres d'évaluation de l'hépatite et limitant le développement de douleurs et malaise induits par le traitement. Enfin nous avons anticipé l’étude de tous les organes pertinents (3) qui permettront une étude complète de la pathologie et des molécules pour un maximum d’informations.

Choix des espèces

Cette espèce permet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de petites molécules chimiques pour la prévention et/ou thérapie de la pathologie. Adulte de 9 semaines pour avoir des animaux avec une fonction hépatique normale et pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes.