Système gastrointestinal

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime enrichi en graisses pendant cinq semaines, reçoivent des injections quotidiennes pendant onze jours, un antibiotique dans l'eau puis un gavage de bactéries isolées de patients atteints de la maladie de Crohn, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélèvement du tube digestif. Le porteur indique attendre une perte de poids et une inflammation intestinale légère à modérée, suivies au moyen d'une grille de souffrance notée sur quinze points. Il juge le recours à la souris "nécessaire" pour étudier l'infection dans un "organisme entier", à partir de résultats obtenus jusque-là in vitro.

Objectifs

La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin qui touche plus de 2,5 millions de personnes en Europe. Cette maladie digestive, pour laquelle aucun traitement curatif n’existe à ce jour, altère considérablement la qualité de vie des malades. Des facteurs génétiques, environnementaux et bactériens sont impliqués dans le développement de cette maladie. Notamment, des bactéries particulières sont anormalement retrouvées dans le tube digestif des patients. Les mécanismes menant à l’implantation des bactéries dans l’intestin des patients sont encore méconnus. Cependant, il semblerait que d’autres facteurs soient impliqués dans le développement de cette maladie tels que des facteurs épigénétiques. Aux vues de dérégulations épigénétiques observées chez les patients, nous avons émis l’hypothèse que certains acteurs épigénétiques (HDAC), dérégulées par un régime alimentaire enrichi en graisses, joueraient un rôle dans cette susceptibilité accrue des patients à être colonisés par les bactéries. Ainsi, ce projet a pour but de valider des résultats obtenus dans des modèles de cellules en culture dans un modèle in vivo de souris. Dans ce projet, des souris seront nourries avec un régime enrichi en graisses et infectées avec des bactéries provenant de patients afin de déterminer si ce type de régime dérégule les HDAC et de valider le rôle des HDAC lors de l’infection intestinale par les bactéries. Cette étude permettra également de tester des molécules potentiellement d’intérêt thérapeutique pour traiter les patients atteints de maladie de Crohn.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de confirmer les résultats obtenus in vitro dans des modèles de cellules en culture où il a été observé que les HDAC régulaient l’entrée des bactéries dans les cellules de l’hôte. Il est attendu que les résultats confirment le rôle majeur joué par ces HDAC au cours de l’infection et qu’ils permettent de déterminer si un facteur environnemental tel qu’un régime alimentaire enrichi en graisses peut déréguler ces HDAC. Ce protocole expérimental permettrait également de démontrer un potentiel bénéfice des molécules testées. À plus long terme, l’analyse des différents échantillons recueillis au cours du protocole permettrait de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’infection dans un contexte de régime alimentaire enrichi en graisses ce qui pourrait mener à la découverte des nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour les patients.

Procédures

Les animaux suivront un régime alimentaire enrichi en graisses tout au long du protocole soit 5 semaines. Ils seront également traités par injection intra-péritonéale avec les molécules à tester tous les jours durant 11 jours. Les souris recevront un antibiotique à faible dose via l’eau de boisson durant 2 jours et l ’infection des animaux avec les bactéries isolées de patients se fera par voie orale, via un unique gavage intragastrique (durée contention + gavage estimée < 1 min). Un prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital sera également réalisé, une seule fois, sur animaux anesthésiés (durée contention + prélèvement estimée < 2 min).

Impact sur les animaux

À partir des travaux antérieurs menés sur souris infectées par ces bactéries les effets indésirables attendus sont une perte de poids légère dans les jours suivant l’infection (environ 5%) et le développement d’une inflammation intestinale légère à modérée. Les symptômes liés à l’inflammation intestinale sont relativement légers mais une surveillance quotidienne (y compris dimanches et jours fériés) des animaux par un personnel formé sera réalisée dans le but de détecter tout comportement douloureux. La souffrance des animaux sera évaluée à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation digestive et le comportement (score sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Devenir

À l’issue de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés par inhalation à l’isoflurane puis euthanasiés par dislocation cervicale car différentes sections du tube digestif seront prélevées et les bactéries associées aux muqueuses seront dénombrées. De cette manière, les bactéries adhérentes aux muqueuses seront quantifiées précisément et spécifiquement.

Remplacement

Les modèles de cellules en culture in vitro ne permettent de travailler que sur une ou deux lignées cellulaires à la fois. À l’inverse, un modèle de souris in vivo va permettre d’étudier l’interaction entre les bactéries et l’intestin dans un organisme entier, complexe composé du microbiote intestinal et du système immunitaire de l’hôte. Le recours à un modèle murin est donc nécessaire pour notre projet pour étudier l’impact d’un régime alimentaire enrichi en graisses associé à différentes molécules sur la colonisation intestinale par les bactéries et sur l’inflammation intestinale afin de pouvoir conclure pleinement sur le bénéfice des molécules testées pour une potentielle utilisation chez les patients atteints de maladie de Crohn.

Réduction

Le nombre de 7 animaux par lot a été déterminé lors de précédentes études d’infection avec les bactéries. Ce nombre d’animaux devrait permettre d’obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement significatifs. Les expériences ont été conçues de manière à ne pas démultiplier les lots témoins. Le nombre d’animaux pour ce projet a été réduit au minimum (140 animaux) sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de bactéries présentes dans les fèces des souris reflètent le nombre de bactéries associées à la paroi intestinale. Ainsi, la quantification des bactéries au cours du temps dans les fèces des animaux réduit le nombre d’animaux à euthanasier à différents temps post-infection pour comptabiliser les bactéries présentes dans l’intestin. Aussi, un maximum de prélèvement sera réalisé sur les animaux lors de l’euthanasie ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d’éviter le surpeuplement qui est une source de stress, les souris de chaque lot seront séparées dans des cages de 530 cm² (3-4 animaux/cage), soit > 80 cm² pour des souris de 25-30 g. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les conditions d’hébergement seront : température 20-24°C, hygrométrie 50 ± 10%, cycle 12h/12h, éclairage 350/450 lux. Un enrichissement leur sera proposé sous la forme de maison et tube en polycarbonate teinté rouge afin de diminuer le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité à l‘animal. Les injections par voie intra-péritonéale, l’infection par voie orale ainsi que le prélèvement de sang seront réalisés par des personnels témoignant de la qualification nécessaire. Lors du prélèvement sanguin via le sinus rétro-orbital, les souris seront anesthésiées afin de réduire stress et douleur potentiellement générés par cet ace. Les animaux peuvent développer une inflammation intestinale légère à modérée lors de ce projet. Les animaux seront donc surveillés quotidiennement (y compris dimanches et jours fériés) par un personnel formé pour évaluer leur souffrance à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation intestinale ou le comportement (sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle d’étude choisi est la souris. Il s’agit d’un des modèles le plus utilisé et les expériences antérieures pour étudier l’infection intestinale par les AIEC ont été réalisées sur des modèles murins également. Cela permettra ainsi de comparer les résultats obtenus avec de précédentes études. L’étude sera réalisée sur des animaux de 8 à 10 semaines, âge auquel les études antérieures de colonisation par les AIEC sur modèle murin ont été réalisées.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent par des cages de calorimétrie qui mesurent le métabolisme sans intervention invasive, mais isolées, avant d'être mises à mort par dislocation cervicale pour prélèvement de sang et de tissus. Le porteur reconnaît que l'isolement empêche l'animal de préserver sa température en groupe et peut accroître l'anxiété. Il classe pourtant la gravité en modérée et affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour étudier le métabolisme de façon intégrée.

Objectifs

Le métabolisme énergétique se traduit globalement par une adaptation équilibrée du comportement alimentaire et de la dépense énergétique, comprenant différents paramètres tels que l’activité musculaire, le maintien de la température corporelle et le métabolisme de base, chacun dépendant du statut de l’individu (veille, sommeil) et des conditions environnementales (température, présence ou absence de nourriture). Un élément majeur dans la régulation de la balance énergétique est la capacité de l’organisme à: transformer les nutriments ingérés afin de les stocker, de signaler au reste de l’organisme le statut des réserves énergétiques, et enfin, de mobiliser ces réserves le moment voulu. Jusqu'à récemment, l'évolution a favorisé la capacité à stocker efficacement les nutriments sous forme de graisse pendant les périodes d’abondance tout en développant des stratégies pour se prémunir contre les périodes de disettes intermittentes. Cependant, cet avantage sélectif est devenu délétère dans notre société moderne, caractérisée par la sédentarité et l’abondance de nourriture riche, propice au développement de maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type 2. Pour cela nous nous intéressons à une protéine clef du métabolisme énergétique, impliquée dans la transformation du sucre en gras, et reconnue dans le développement de la stéatose hépatique inflammatoire, de l’obésité, et du diabète de type 2. L’objectif de ce projet est d’étudier au moyen de cages calorimétriques (un outil non-invasif et complètement automatisé), le métabolisme énergétique et la capacité adaptative au cours de la journée des lignées de souris vigiles génétiquement invalidées pour le gène codant cette protéine clef du métabolisme énergétique de façon globale ou ciblée (dans le foie, le tissu adipeux et l’intestin) dans le but de mieux comprendre les processus métaboliques et moléculaires impliqués dans le devenir des nutriments, leur stockage et l’implication des trois organes. Il s’agit de remettre en perspective les caractéristiques (Prise alimentaire, dépense énergétique, utilisation des nutriments et comportement) de l’animal vigile des différentes lignées , au regard 1) du métabolisme de l'animale de nuit (période active) comme de jour (période de repos), et 2) dans différentes conditions environnementales de température et d’accès à la nourriture.

Bénéfices attendus

Les différents paramètres évalués au moyen de l’analyse calorimétrique permettent de caractériser les mécanismes biologiques de l’animal in vivo reliant la prise alimentaire, la balance énergétique, la capacité d’utilisation des aliments, et les comportements de l’animal. L’analyse statistique combinée des 4 différentes lignées permettra, au regard de chaque paramètre analysé, d’évaluer l’importance de cette protéine clef du métabolisme énergétique de manière tissu spécifique et son impact sur les fonctions des autres tissus. In fine, ce projet permettra une meilleure compréhension des maladies métaboliques (obésité/diabête/stéatose hépatique). Les tests d’adaptations permettent de mettre l’animal dans une situation physiologique qui implique les différents paramètres impliqués dans la régulation de la balance énergétique (La prise alimentaire et hydrique, la consommation d’oxygène et la production de dioxyde de carbone, le quotient respiratoire indicatueur du type nutriment utilisé, La dépense énergétique globale de l’animal issue de l'activité locomotrice, de la thermogénèse et du métabolisme de base, l’activité locomotrice spontanée ) selon l'absence ou la présence de la protéine d'intérêt dans les différents organes (foie, le tissu adipeux et l’intestin). Ceci permettra d'effectuer une analyse croisée des paramètres génétiques, des tests d’adaptations, le tout en fonction du temps. Exemple : L’absence de nourriture induit une diminution de la dépense énergétique, une mobilisation des réserves lipidiques (tissu adipeux), une plus grande activité métabolique de conversion au niveau du foie. A l’inverse la reprise alimentaire fait appel aux capacités ; d’ingestion au niveau de l’intestin et de stockage au niveau du tissu adipeux. Ce projet sera donc un apport important dans la compréhension du rôle de cette protéine dans le stockage, l’utilisation des nutriments et l’implication des trois organes.

Procédures

L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal et n'est pas invasive. Aucun prélévement n'aura lieu sur animal vigile. Les animaux seront monitorés tous les jours, ils seront pesés: 1 fois/ jour lors de l'individualisation (7 fois), puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition corporelle analysée (3 minutes par souris) de manière non invasive 1 fois au début de l'individualisation puis à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques (soit 3 fois par souris).

Impact sur les animaux

L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. En effet, l’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2) dans le système de calorimétrie indirecte. La seule nuisance pouvant entrainer une modification du comportement de l'animale et du comportement d'espèce est que la mesure en cage de calorimétrie ne peut se faire que sur animal isolé. L'animal préserve mieux sa température corporelle lorsqu'il est en groupe, pour remédier à cela l'animal aura à sa disposition tout le matériel nécessaire à la confection d' un nid. L'interaction sociale (hiérarchie, diminution de l’anxiété, routine journalière) entre animaux de la même espèce est reconnue, l’individualisation peut avoir une incidence comme un surcroit d’anxiété. L'observation régulière de l'animal est primordiale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure par dislocation cervicale. Le sang et différents tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques et transcriptomiques

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique de manière intégrée. Elle ne peut se faire que sur l’animal vigile. L’étude des différents paramètres métaboliques impactés par une modification d’expression du gène cible dans des organes précis nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en tenant compte des impératifs de l’analyse statistique. La lecture métabolique effectuée sur plusieurs jours permettra de réduire la variabilité intrinsèque de l’animal et inter animal, et limite le nombre d’animaux utilisés. Le choix de l'analyse statistique est déterminant. l'ANOVA, ANCOVA ou une ANOVA avec mesures répétées entre les lignées et leurs contrôles respectifs seront prioritaires. Enfin à l’issue de cette étude une analyse en composante Principale (CPA) sera menée en intégrant les 4 lignées en interaction avec les tests d'adaptation (Jeun, reprise alimentaire et thermoneutralité) afin de ranger en ordre (avec sa probabilité) l'importance de chaque organe (dont le facteur de transcription aura été invalidé) dans les paramêtres mesurés, le tout en fonction du temps.

Raffinement

L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive et limite au maximum le stress de l’animal. La mesure en calorimétrie indirecte s’effectue dans des cages d’hébergement classiques. L'animal aura à sa disposition tout le matériel nécessaire à la confection d' un nid. Pour rappel, les conditions d’hébergement et les caractéristiques de la cage métabolique sont les suivantes : - l’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2), conforme à la directive 2010/63/EU : 371 x 189 x 126 mm (LxlxH). - différents enrichissements sont présents dans la cage (roue d’activité, carré de coton). - les capteurs sont encastrés dans le couvercle de la cage et ne gênent pas l’animal dans ses déplacements - les cages sont non-hermétiques et sont soumises à un flux d’air calibré de 2litres/min. En cas de problème technique, un échange d’air (passif) avec l’extérieur est maintenu. Des points limites et des critères d'arrêt de l'expérience ont été prévus en cas d'anomalie de comportement ou d'alimentation. Le tout est effectué de manière automatique, de jour comme de nuit et sans intervention de l’opérateur. L’analyse ne peut se faire que sur l’animal individualisé.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est le seul modèle de souris transgéniques (KO) disponible qui permet d’étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques permet une étude approfondie de l'étiologie de maladie métabolique comme le diabête de type 2, la stéatose hépatique, et l'obésité en général. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris doivent être âgées au minimum de 12 semaines, c'est à dire à l’âge adulte : (1) lorsque toutes les structures cérébrales sont stabilisées pour ne pas impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au cours du temps ; (2) la masse de l’animal est plus stable à l’âge adulte ce qui permet une analyse fiable et robuste durant le temps de l’expérimentation.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées pendant 115 jours au dioxyde de titane, additif alimentaire E171, avec gavages et prélèvements de fèces réguliers, pour évaluer ses effets sur l'intestin et le métabolisme. Le porteur affirme attendre un léger surpoids, une perméabilité et une inflammation intestinales, et présente le recours à l'animal comme "difficilement remplaçable" pour reproduire les échanges entre organes sur une longue durée. Il indique que les résultats doivent aider industriels et autorités à décider du maintien de l'autorisation du E171.

Objectifs

Les particules minérales manufacturées sont abondantes dans les produits de la vie quotidienne (cosmétiques, textiles, matériaux de construction), dont l’alimentation. Parmi ces particules, le dioxyde de titane (TiO2) est un additif alimentaire utilisé comme colorant/opacifiant et agent de brillance dans les confiseries, les aliments transformés, les sauces et le glaçage. En Europe, l'utilisation du TiO2 alimentaire (référencé E171) est autorisée sans établissement d'une dose journalière acceptable. L'autorité européenne de sécurité sanitaire des aliments (EFSA) a estimé les niveaux d'exposition journalière au E171 entre 0,9 et 10,4 mg/kg de poids corporel (p.c)/jour chez l’enfant et entre 0,3 et 6,8 mg/kg p.c/j chez l’adulte. Face à ces niveaux élevés de consommation, les conséquences pour l’homme d'une exposition chronique aux particules de TiO2 soulèvent des questions de santé publique. Les craintes vis-à-vis de cet additif composée de particules micro- et nanométriques reposent sur des effets génotoxiques, de stress oxydant et inflammatoires des nanoparticules de TiO2 observés sur cellules intestinales. Cependant, la toxicité orale du TiO2 est encore peu étudiée et les autorités sanitaires ont conclu à la nécessité de tests pour évaluer les risques pour la santé des additifs alimentaires contenant des nanoparticules, particulièrement avec le E171. Dans les pays occidentaux, l'augmentation de la prévalence de l'obésité associée à des désordres métaboliques suggère des facteurs de risque liés au mode de vie. Parmi ces facteurs, l'ingestion chronique de particules inorganiques a été proposée. Le but de ce projet est d'étudier le lien entre l'exposition orale chronique au E171 et l'apparition et/ou l'aggravation de désordres métaboliques et intestinaux.

Bénéfices attendus

Outre l'apport de données inédites sur les effets d'une ingestion de TiO2 alimentaire sur le développement de désordres intestinaux et métaboliques, ce projet aidera les parties prenantes et les industriels dans leur décision de maintenir ou non l'autorisation et l'utilisation du E171 dans les aliments. Ce projet pourrait également permettre d'établir un lien potentiel entre facteurs environnementaux (ici ingestion d'additif alimentaire) et augmentation exponentielle dans les pays occidentaux de désordres métaboliques. En conclusion, ce projet fournira des données précieuses pour l'évaluation des risques chez l'Homme d'une exposition au TiO2 alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage avec du Dextran-FITC à J94 pour évaluer la perméabilité intestinale et à un gavage avec du glucose à J108 pour réaliser le test de tolérance au glucose. Des prélèvements de fèces seront réalisés tout au long de l'expérimentation (1 fois toutes les deux semaines).

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux exposés au E171 développent un léger surpoids accompagné d'une perméabilité inestinale, d'une inflammation intestinale a bas bruit ainsi que d'une intolérance au glucose. Toutefois ces désordres intestinaux et métaboliques devraient être d'une intensité inférieure a celle observé lors d'un traitement des animaux avec un régime riche en graisse. Nos données préliminaires n'indiquent aucune altération de comportement et de prise alimentaire chez les animaux exposés au E171 incorporé aux croquettes à la dose testé dans cette étude.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réasliser différents prélèvements de tissus sur l'animal en fin d'expérience.

Remplacement

Le projet étudie les effets du E171 (nanomatérieux alimentaires) après une période d'exposition chronique de 115 jours. De plus, l'étude portera sur les impacts sur l'axe microbiote-intestin-foie. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues inter-organes sur une période aussi longue. Le recours à l'animal est donc nécessaire et difficilement remplaçable par des modèles in vitro ou ex-vivo.

Réduction

Les régulations attendues, principalement concernant les tests de tolérance au glucose peuvent être assez fines. Ainsi, chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris pour que les résultats soient statistiquement exploitable, après analyse avec des tests statistiques adaptés. De plus, les procédures de notre projet seront réalisées 2 fois pour pouvoir générer suffisamment d'échantillons pour nos différents end points.

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux, la coupure effectuée au niveau des queues de souris nécessaire pour la mesure de perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose seront réalisé sous analgésie locale. De plus, de l'enrichissement sera disposé dans les cages, sous la forme d'une maisonnette et de dispositif de nidification. Le bien-être des animaux sera assuré par une observation quotidienne et également par un suivi de poids et prise alimentaire hebdomadaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Les souris utilisées seront âgées de 5 semaines afin de faire des observations sur des souris adultes et matures.

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.