Système immunitaire

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour ce volet multisite d'une étude sur les lymphocytes dans l'asthme allergique. Elles reçoivent des extraits d'acariens par voie nasale pour induire l'asthme, puis des injections de molécules à tester, avant une ouverture de la trachée sous anesthésie et un lavage des bronches. Le porteur annonce une mise à mort en fin de procédure pour analyser l'inflammation pulmonaire et signale un stress lié au transport entre animaleries. Il affirme que le recours à la souris est une étape "nécessaire", non remplaçable par des expériences in vitro.

Objectifs

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des bronches qui se caractérise par des crises récurrentes. Les symptômes sont toux, sifflements, essoufflement et/ou oppression thoracique. Cette pathologie peut être allergique ou non-allergique, et impliquer différents types d’inflammations. Récemment, un nouveau type de cellules lymphoïdes ont été impliquées dans l'inflammation pulmonaire. L'objectif de cette étude est de déterminer dans un modèle d'asthme allergique expérimental les mécanismes par lesquels ces lymphocytes contribuent à la sévérité de l'asthme afin de pouvoir proposer dans le future des nouvelles thérapies. Ce projet est multisite car il comporte des étapes nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire sera ajouté.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes par lesquels une nouvelle population des lymphocytes influencent la sévérité de l'asthme allergique. Les résultats obtenus serviront de preuve de concept pour poser les bases de futurs essais cliniques chez l'homme.

Procédures

Le protocole d’asthme est réalisé par 5 administrations intranasales des extraits d’acariens ou le contrôle, d’une durée de 30 secondes. Les animaux subissent l'administration des molécules à tester par voie intrapéritonéal (6 administrations) d’une durée de 30 secondes. L’ouverture de la trachée est réalisée pour mesurer les fonctions pulmonaires grâce à un appareil dédié sur souris anesthésiées (d’une durée de 20 minutes), suivi d’un lavage bronchoalvéolaire (d’une durée de 50 secondes). Biopsie de la queue ou de l’oreille pour génotypage d’une durée de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les administrations intranasales peuvent entrainer un stress, une modification de la respiration ainsi qu’un changement de comportement. Les anesthésies peuvent entrainer un stress et le génotypage un stress ainsi qu’une douleur légère. Le stress dû au transport, lorsque les animaux sont déplacés d'une animalerie à l'autre.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses de l'inflammation pulmonaires : histologie, cellules immunes présentes dans le tissu.

Remplacement

L'asthme est une pathologie complexe et hétérogène. Pour déterminer le rôle des lymphocytes que nous nous proposons d'analyser dans l'asthme sévère, il est nécessaire d'utiliser un modèle murin d'asthme pour avoir accès aux cellules présentes dans les poumons. L'étude sur la souris est donc une étape nécessaire, qui ne peut être remplacée par des expériences in vitro, pour valider une preuve de concept qui pourrait ensuite déboucher sur des essais cliniques impliquant ces lymphocytes.

Réduction

Le nombre de souris utilisé a été déterminé sur la base de nos travaux, des travaux publiés et d’une analyse sur logiciel statistiques approprié permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables.

Raffinement

Toutes les souris inclues dans ces différentes procédures seront suivies quotidiennement par les animaliers pour des signes de souffrance ou de difficultés respiratoires. La surveillance de l’état des animaux (poids, mobilité, comportement) sera faite 1 à 2 fois/semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Un enrichissement des cages composé de maisonnettes en carton et de cotons d’enrichissement est prévu afin de diminuer le stress des animaux. Des seringues adaptées sont utilisées pour les injections. En cas de signes de souffrance, les animaux seront traités par injection d'antalgique.

Choix des espèces

Les modèles d’asthme induit par les extraits d’acariens chez la souris sont très bien décrits dans la littérature et miment certains symptômes de la pathologie humaine dont les atteintes pulmonaires. La souris est ainsi un modèle de choix pour étudier les mécanismes immuns impliqués dans la sévérité de l’asthme. Les souris utilisées auront entre 4 et 18 semaines. A 4 semaines les souris seront génotypées. Le protocole expérimental sera appliqué à des souris âgées de plus de 6 semaines car, comme décrit la littérature, à cet âge le système immunitaire est complétement développé.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier un type de lymphocytes dans l'asthme allergique. Elles reçoivent des extraits d'acariens par le nez pour déclencher l'asthme, puis des injections de molécules à tester, avant une ouverture de la trachée sous anesthésie pour mesurer les fonctions pulmonaires et un lavage des bronches. Le porteur décrit un stress respiratoire et une douleur légère liée au génotypage, et annonce une mise à mort en fin de procédure pour analyser l'inflammation des poumons. Il affirme que l'étude sur la souris est une étape "nécessaire" qui ne peut être remplacée par des expériences in vitro.

Objectifs

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des bronches qui se caractérise par des crises récurrentes. Les symptômes sont toux, sifflements, essoufflement et/ou oppression thoracique. Cette pathologie peut être allergique ou non-allergique, et impliquer différents types d’inflammations. Récemment, un nouveau type de cellules lymphoïdes ont été impliquées dans l'inflammation pulmonaire. L'objectif de cette étude est de déterminer dans un modèle d'asthme allergique expérimental les mécanismes par lesquels ces lymphocytes contribuent à la sévérité de l'asthme afin de pouvoir proposer dans le future des nouvelles thérapies. Ce projet est multisite car il comporte des étapes nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire sera ajouté.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes par lesquels une nouvelle population des lymphocytes influencent la sévérité de l'asthme allergique. Les résultats obtenus serviront de preuve de concept pour poser les bases de futurs essais cliniques chez l'homme.

Procédures

Le protocole d’asthme est réalisé par 5 administrations intranasales des extraits d’acariens ou le contrôle, d’une durée de 30 secondes. Les animaux subissent l'administration des molécules à tester par voie intrapéritonéal (6 administrations) d’une durée de 30 secondes. L’ouverture de la trachée est réalisée pour mesurer les fonctions pulmonaires grâce à un appareil dédié sur souris anesthésiées (d’une durée de 20 minutes), suivi d’un lavage bronchoalvéolaire (d’une durée de 50 secondes). Biopsie de la queue ou de l’oreille pour génotypage d’une durée de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les administrations intranasales peuvent entrainer un stress, une modification de la respiration ainsi qu’un changement de comportement. Les anesthésies peuvent entrainer un stress et le génotypage un stress ainsi qu’une douleur légère. Le stress dû au transport, lorsque les animaux sont déplacés d'une animalerie à l'autre.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses de l'inflammation pulmonaires : histologie, cellules immunes présentes dans le tissu.

Remplacement

L'asthme est une pathologie complexe et hétérogène. Pour déterminer le rôle des lymphocytes que nous nous proposons d'analyser dans l'asthme sévère, il est nécessaire d'utiliser un modèle murin d'asthme pour avoir accès aux cellules présentes dans les poumons. L'étude sur la souris est donc une étape nécessaire, qui ne peut être remplacée par des expériences in vitro, pour valider une preuve de concept qui pourrait ensuite déboucher sur des essais cliniques impliquant ces lymphocytes.

Réduction

Le nombre de souris utilisé a été déterminé sur la base de nos travaux, des travaux publiés et d’une analyse sur logiciel statistiques approprié permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables.

Raffinement

Toutes les souris inclues dans ces différentes procédures seront suivies quotidiennement par les animaliers pour des signes de souffrance ou de difficultés respiratoires. La surveillance de l’état des animaux (poids, mobilité, comportement) sera faite 1 à 2 fois/semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Un enrichissement des cages composé de maisonnettes en carton et de cotons d’enrichissement est prévu afin de diminuer le stress des animaux. Des seringues adaptées sont utilisées pour les injections. En cas de signes de souffrance, les animaux seront traités par injection d'antalgique.

Choix des espèces

Les modèles d’asthme induit par les extraits d’acariens chez la souris sont très bien décrits dans la littérature et miment certains symptômes de la pathologie humaine dont les atteintes pulmonaires. La souris est ainsi un modèle de choix pour étudier les mécanismes immuns impliqués dans la sévérité de l’asthme. Les souris utilisées auront entre 4 et 18 semaines. A 4 semaines les souris seront génotypées. Le protocole expérimental sera appliqué à des souris âgées de plus de 6 semaines car, comme décrit la littérature, à cet âge le système immunitaire est complétement développé.

716 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles sont irradiées, reçoivent des injections répétées de cellules humaines et de vésicules pendant quinze jours, avec des prélèvements de sang hebdomadaires, dans un modèle de réaction du greffon contre l'hôte. Sur le remplacement, le porteur se limite à indiquer que des résultats in vitro prometteurs l'encouragent à valider l'effet dans un système plus complexe qu'un puits de culture. La justification du recours à l'animal tient en une phrase, sans examen d'alternatives.

Objectifs

Le but de cette étude est d’évaluer in vivo le rôle protecteur de vésicules extracellulaires (EV) issues de cellules humaines régulatrices et des cellules régulatrices elles même dans un modèle de réaction du greffon envers l'hôte. In vitro, nous avons déjà validé le pouvoir immunomodulateur de ces EV (autologues et allogéniques) et avons validé que cet effet est efficace pendant 4j. Ces expériences préliminaires ont permis de préparer au mieux cette demande d’autorisation d’expérimentation et respectent ainsi la règle des 3R et notamment la réduction du nombre d’animaux à utiliser. Afin de valider ces observations in vivo, nous utiliserons des souris immunodéprimées (NSG).

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus avec ces expériences réalisées chez la souris nous permettront ou non d'avancer vers une utilisation thérapeuthique chez l'homme des EV-Reg ou des cellules régulatrices que nous sommes en capacité de produire in vitro. Si nous démontrons que ces stratégie contrôlent l'activation du système immunitaire, elles pourraient être appliquées cliniquement chez des patients transplantés afin de prévenir le rejet de greffe.

Procédures

Les souris vigiles seront irradiées, une seule fois. Durée de l'intervention 3 min. Les souris anesthésiées seront injectées en i.v. à J0 puis tous les 3j pendant15j. Durée de l'intervention 2 min. Certaines souris seront injectées i.p. tous les jours de J0 à J7. Durée de l'intervention 10 sec. Enfin, un prélèvement sanguin sera réalisé une fois par semaine tant que les souris sont gardées en vie. Durée de l'intervention 1 min.

Impact sur les animaux

Effet lié à l’irradiation sur les souris => stress lié au changement de cage. Effet lié à l’injection i.v. et aux prélèvements sanguins sur les souris => stress lié à l’anesthésie. Effet lié à l’injection i.p. => stress lié à la contention de la souris

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse des organes cible de la maladie induite.

Remplacement

Les cellules régulatrices et les vésicules extracellulaires (EV) produites par ces cellules régulatrices ont été finement étudiées in vitro. Les résultats sont prometteurs et nous encouragent à valider l'effet observé dans un système plus complexe qu'un puits de culture.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. De plus certains groupes ne seront envisagés que si les hypothèses posées sont validées dans les groupes précédents.

Raffinement

Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées, avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress et la douleur des animaux, toutes les injections i.v. se feront sous anesthésie gazeuse, sur tapis chauffant et le suivi clinique régulier des souris (surveillance du poids, aspect clinique général) nous permettra de palier à la douleur éventuelle. Le bien-être des animaux est surveillé tout au long de l’étude avec une évaluation quotidienne des signes généraux.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes (NSG) sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre et dans lesquelles peut se développer un système immunitaire humain après injection de cellules immunitaires humaines. Ces souris humanisées sont des modèles alternatifs à l'utilisation de primates pour tester des nouvelles stratégies thérapeutiques. 8-12 semaines de vie de sorte que les souris ne soient ni trop petites et ni trop fragiles. Aussi nous essayerons autant que faire se peut d’avoir des groupes homogènes en terme d’âge.

1 215 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur les immunise quatre fois par voie nasale ou intramusculaire contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2, la grippe ou le VRS, avec des prélèvements répétés de sang, de fèces et de sécrétions vaginales. Il décrit une hausse de température, une baisse d'activité et une inflammation possible au site d'injection, puis une mise à mort pour prélever poumons, tissu nasal et rate. Ce projet mesure seulement l'immunogénicité des formulations, la protection devant être testée ensuite sur d'autres animaux, et le porteur affirme que seul un "organisme entier" permet ces observations.

Objectifs

L’objectif est d’évaluer l’immunogénicité de formulations vaccinales contre des pathogènes respiratoires administrées par voie intranasale chez la souris.

Bénéfices attendus

Les vaccins contre les virus respiratoires sont actuellement peu efficaces pour induire une réponse immunitaire dans les tissus respiratoires qui permette une protection à long-terme contre les infections. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus respiratoires. Ce projet permettra de mettre en place de nouvelles formulations vaccinales administrées par voie intranasale qui induisent de fortes réponses immunitaires dans les tissus respiratoires, dont des réponses résidentes mémoire, et systémiques contre des virus respiratoires tels que SARS-CoV-2, influenza ou RSV. Ces données d’immunogénicité générées dans ce projet sont essentielles pour ensuite tester la protection induite par les formulations les plus prometteuses dans d’autres modèles de souris ou rongeurs. De plus, ce projet permettra d’apporter des nouvelles connaissances sur le développement des réponses résidentes mémoire au niveau des muqueuses. Il existe à ce jour peu d’adjuvants qui ont été testés pour l’induction des réponses mémoire. Les études d’immunogénicité sont très souvent concentrées sur les réponses IgA au niveau des muqueuses uniquement.

Procédures

1) Le marquage des souris sera réalisé à leur arrivée. 2) Les souris seront immunisées par voie intranasale (douleur modérée) sous anésthesie par isoflurane et/ou par voie intramusculaire (douleur modérée) dans le muscle d’une cuisse et sous anesthésie par isoflurane aussi. En tout, il y aura 4 immunisations soit par voie intranasale ou par voie intramusculaire. 3) Le prélèvement de sang en sous mandibulaire est un geste qui dure 30 secondes quand il est réalisé par une personne expérimentée. Ce geste sera réalisé avant chaque immunisation et avant la mise à mort sur souris vigile: 5 fois au total. 4) Les souris isolées pour le prélèvement des fèces seront maintenues dans des boîtes qui n’entravent pas leurs mouvements jusqu’à récupérer suffisamment de fèces, et ne seront pas gardées au-delà de 20 minutes dans ces boîtes. Le prélèvement se déroulera avant chaque immunisation et avant la mise à mort sur souris vigile: 5 fois au total. 5) Des prélèvements vaginaux (douleur légère) durent environ 5 min quand c'est réalisé par une personne expérimentée. Ce geste sera réalisé avant chaque immunisation et avant la mise à mort sur souris vigile: 5 fois au total. 6) Une injection intraveineuse avec un anticorps sera réalisée 3-5 minutes avant la mise à mort. Cette injection se fera à l’aide d’un tunnel fixé à la paillasse. La queue sera légèrement chauffée avec de l’eau à 37 degrés durant 2 minutes. Ensuite, la queue sera rapidement désinfectée et l’anticorps sera injecté. Cette injection sera réalisée sur souris vigile une fois avant la mise à mort. Tous les animaux subiront ces techniques sur une durée totale de 7 semaines.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables peuvent survenir chez les souris après la vaccination comme une augmentation de la température du corps et une diminution de l’activité ainsi que du poids. Si une administration par voie intramusculaire est réalisée, une inflammation au site d’administration peut aussi survenir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever des organes (poumons, tissu lymphoide nasal, rate) et des fluides muqueux comme les lavages bronchoalvéolaires et nasaux. Ces prélévements permettront d’analyser les réponses anticorps et cellulaires post-vaccination.

Remplacement

Le passage intra muqueux des antigènes avec ou sans vecteur sera aussi étudié dans des modèles in vitro de tissus respiratoires afin de sélectionner les antigènes les plus prometteurs. Cependant, il n’existe pas de méthode in vitro pour tester l’efficacité des adjuvants à induire des réponses adaptatives spécifiques. Les analyses in vitro ne permettent pas d’analyser l’effet de différentes formulations vaccinales sur les réponses immunitaires humorales et cellulaires dont les réponses mémoire. Seule l’utilisation d’un modèle animal permet d'observer ces effets sur un organisme entier.

Réduction

Le design des expériences sera optimisé afin de minimiser le nombre de souris utilisé dans les groupes contrôles. Lors de chaque expérience, nous inclurons donc le maximum de groupes expérimentaux pour un groupe contrôle, tout en se veillant que les expériences restent réalisables par les expérimentateurs vu le nombre d’analyses qui sera effectué et que ce soit robuste statistiqument. La répétition des expériences sera réalisée au maximum trois fois lorsque des résultats positifs seront observés dans un ou plusieurs groupes expérimentaux par rapport au groupe contrôle. Les résultats positifs sont définis comme des réponses immunitaires significativement plus élevées dans le groupe experimental que dans le groupe contrôle.

Raffinement

Les souris seront observées dans les heures suivant l’administration de la formulation vaccinale (examen à 3h, 24h, 48h et 72h) pour vérifier qu’il n’y ait pas d’installation d’un état de prostration et l’absence de douleur au site d’administration du vaccin par voie intramusculaire (difficulté à se déplacer, voire boitement, sensibilité importante au toucher des sites d’injection manifesté par un vif retrait de la patte). La température corporelle et le poids des souris seront suivis après chaque immunisation aux temps indiqués ci-dessus. L’immobilité, la prostration, l’apathie, une inflammation excessive au niveau des sites d’injection et/ou de prélèvements, ainsi qu’une perte de poids de plus de 20% du poids avant immunisation, seront considérées comme critères de points limites qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal par dislocation cervicale. Etant donné que l’on analyse des réponses immunitaires post-vaccination, nous ne pouvons pas donner d’analgésiques ou anti-inflammatoires qui pourraient perturber les réponses immunitaires naturelles des souris.

Choix des espèces

La souris est le modèle le mieux adapté pour évaluer les réponses immunitaires spécifiques à un candidat vaccin. Nous avons sélectionné le modèle de souris C57BL/6 qui génère de bonnes réponses anticorps mais aussi de fortes réponses cellulaires étant donné que notre but est d'étudier les réponses cellulaires mémoire. De plus, les modèles de souris qui nous permettront dans le futur de tester la protection de nos formulations vaccinales prometteuses seront dans cette meme lignée de souris. Cependant, il reste nécessaire de confirmer l’immunogénicité de notre formulation qui donne les résultats les plus prometteurs dans une autre lignée et nous avons aussi sélectionné le modèle BALB/c qui génère globalement de fortes réponses immunitaires. Les experiences d’immunogénicité seront réalisées avec des souris agées entre 7 semaines et 6 mois car avant 7 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complétement developpé et après 6 mois la réponse immunitaire risque d’être altérée. Etant donné qu’il a été démontré que l’âge pouvait avoir un impact sur les réponses immunitaires post-vaccination, certaines expériences d’immunogénicité avec la formulation la plus prometteuse chez les jeunes souris sera répétée chez des souris de plus de 2 ans.