Système immunitaire

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur déclenche un asthme allergique par cinq administrations intranasales d'extraits d'acariens, administre les molécules à tester, puis ouvre la trachée sous anesthésie pour mesurer la fonction pulmonaire avant un lavage bronchoalvéolaire. Il décrit surtout un stress lié aux instillations et à l'anesthésie et une biopsie pour le génotypage. Ce projet vise à établir une "preuve de concept" sur le rôle de certains lymphocytes, présentée comme une base pour de futurs essais cliniques, et le porteur juge le modèle murin "nécessaire" pour accéder aux cellules pulmonaires.

Objectifs

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des bronches qui se caractérise par des crises récurrentes. Les symptômes sont toux, sifflements, essoufflement et/ou oppression thoracique. Cette pathologie peut être allergique ou non-allergique, et impliquer différents types d’inflammations. Récemment, un nouveau type de cellules lymphoïdes ont été impliquées dans l'inflammation pulmonaire. L'objectif de cette étude est de déterminer dans un modèle d'asthme allergique expérimental les mécanismes par lesquels ces lymphocytes contribuent à la sévérité de l'asthme afin de pouvoir proposer dans le future des nouvelles thérapies. Ce projet est multisite car il comporte des étapes nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire sera ajouté.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes par lesquels une nouvelle population des lymphocytes influencent la sévérité de l'asthme allergique. Les résultats obtenus serviront de preuve de concept pour poser les bases de futurs essais cliniques chez l'homme.

Procédures

Le protocole d’asthme est réalisé par 5 administrations intranasales des extraits d’acariens ou le contrôle, d’une durée de 30 secondes. Les animaux subissent l'administration des molécules à tester par voie intrapéritonéal (6 administrations) d’une durée de 30 secondes. L’ouverture de la trachée est réalisée pour mesurer les fonctions pulmonaires grâce à un appareil dédié sur souris anesthésiées (d’une durée de 20 minutes), suivi d’un lavage bronchoalvéolaire (d’une durée de 50 secondes). Biopsie de la queue ou de l’oreille pour génotypage d’une durée de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les administrations intranasales peuvent entrainer un stress, une modification de la respiration ainsi qu’un changement de comportement. Les anesthésies peuvent entrainer un stress et le génotypage un stress ainsi qu’une douleur légère. Le stress dû au transport, lorsque les animaux sont déplacés d'une animalerie à l'autre.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses de l'inflammation pulmonaires : histologie, cellules immunes présentes dans le tissu.

Remplacement

L'asthme est une pathologie complexe et hétérogène. Pour déterminer le rôle des lymphocytes que nous nous proposons d'analyser dans l'asthme sévère, il est nécessaire d'utiliser un modèle murin d'asthme pour avoir accès aux cellules présentes dans les poumons. L'étude sur la souris est donc une étape nécessaire, qui ne peut être remplacée par des expériences in vitro, pour valider une preuve de concept qui pourrait ensuite déboucher sur des essais cliniques impliquant ces lymphocytes.

Réduction

Le nombre de souris utilisé a été déterminé sur la base de nos travaux, des travaux publiés et d’une analyse sur logiciel statistiques approprié permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables.

Raffinement

Toutes les souris inclues dans ces différentes procédures seront suivies quotidiennement par les animaliers pour des signes de souffrance ou de difficultés respiratoires. La surveillance de l’état des animaux (poids, mobilité, comportement) sera faite 1 à 2 fois/semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Un enrichissement des cages composé de maisonnettes en carton et de cotons d’enrichissement est prévu afin de diminuer le stress des animaux. Des seringues adaptées sont utilisées pour les injections. En cas de signes de souffrance, les animaux seront traités par injection d'antalgique.

Choix des espèces

Les modèles d’asthme induit par les extraits d’acariens chez la souris sont très bien décrits dans la littérature et miment certains symptômes de la pathologie humaine dont les atteintes pulmonaires. La souris est ainsi un modèle de choix pour étudier les mécanismes immuns impliqués dans la sévérité de l’asthme. Les souris utilisées auront entre 4 et 18 semaines. A 4 semaines les souris seront génotypées. Le protocole expérimental sera appliqué à des souris âgées de plus de 6 semaines car, comme décrit la littérature, à cet âge le système immunitaire est complétement développé.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'inhibiteurs et de molécules inflammatoires, dont une instillation intra-rectale par cathéter provoquant une inflammation intestinale, et un prélèvement de sang, pour tester des inhibiteurs des NADPH oxydases dans des modèles d'inflammation chronique. Le porteur annonce une douleur modérée, une perte de poids et des selles molles. Il évoque des systèmes de co-cultures capables d'imiter certaines fonctions d'organes, tout en les jugeant limités par l'absence de flux sanguin.

Objectifs

Les maladies inflammatoires sont des causes majeures de mortalité dans le monde développé. Au cours de la réponse inflammatoire pathologique, c’est-à-dire lorsque la réponse inflammatoire est non résolue, devient prolongée et chronique, les cellules du microenvironnement produisent de manière accrue des dérivés toxiques de l’oxygène. Ces dérivés sont des substances chimiques qui sont formées à partir de l’interaction de l’oxygène avec d’autres composés et peuvent endommager les cellules car ils sont toxiques. La production excessive de ces dérivés peut donc entraîner des lésions tissulaires contribuant à la progression des maladies inflammatoires chroniques. Dans l’organisme, les dérivés toxiques de l’oxygène sont produits principalement par une famille de protéines spécialisées appelées NADPH oxydases (NOXs). Le dysfonctionnement ou l’expression anormale de ces protéines pourrait donc contribuer aux maladies inflammatoires. Pour de nombreuses maladies inflammatoires chroniques, les solutions thérapeutiques restent insuffisantes. C’est dans ce contexte de santé publique que se tient notre projet d’étude qui visera à valider in vivo, c’est-à-dire dans un organisme vivant, les NOXs comme cibles thérapeutiques clés pour le traitement des maladies inflammatoires, et à évaluer in vivo, dans des modèles murins d’inflammation chronique l’action anti-inflammatoire de nouvelles molécules qui inhibent les NOXs ou leurs voies d'activation que nous avons récemment identifiées in vitro.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra d’identifier de nouvelles molécules capables d’inhiber in vivo la progression des maladies inflammatoires chroniques apportant ainsi la preuve du concept. Elle permettra d’envisager des essais cliniques chez des patients atteints de maladie inflammatoires chroniques.

Procédures

Les principaux types d’interventions auxquels les animaux seront soumis sont : des injections intra-péritonéales (administration directement dans la cavité abdominale) et sous-cutanées à l’aide d’une aiguille fine, une instillation (administration lente goutte à goutte) de molécules inflammatoires à l’aide d’un cathéter fin par voie intra-rectale, et un prélèvement de sang par ponction au niveau de la queue avec une aiguille fine. Excepté le prélèvement de sang qui sera effectué une seule fois sur tous les animaux à la fin de l’expérience, le nombre des interventions variera selon les modèles expérimentaux (3 modèles expérimentaux). Dans le 1er modèle expérimental, d’une durée de 3 jours, les souris vont subir: 1 injection en sous-cutanée pour l’anesthésie, 2 en intrapéritonéales pour l’administration de l’inhibiteur (substance qui a la capacité de bloquer un processus biologique spécifique, ici l’inflammation), 1 en intra-rectale pour l’administration de la molécule inflammatoire. Dans le 2ème modèle expérimental d’une durée de 11 jours les souris vont subir uniquement 4 injections en intrapéritonéales pour l’administration de l’inhibiteur, la molécule inflammatoire est ajoutée dans la boisson. Finalement dans le 3éme modèle expérimental d’une durée de 8 jours, les souris vont subir 2 injections en intrapéritonéales pour l’administration des molécules inflammatoires et 4 injections en intrapéritonéales pour l’administration de l’inhibiteur.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation utilisés dans cette étude sont des modèles de sévérité modérée. L’animal sera susceptible d’éprouver une douleur modérée de courte durée et son bien être pourra être impacté de façon modérée. Les animaux pourront présenter une perte de poids, les fèces pourront apparaître inconsistantes. Ils pourront également présenter une mobilité réduite. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés (état général, poids, consistance des fèces, mobilité). Un analgésique sera administré si nécessaire toutes les 12 heures. Si l’animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les tissus seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude in vivo ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire qui fait intervenir plusieurs types cellulaires, ce qui nous oblige à travailler à l'échelle d'un organisme. Il sera cependant possible d’envisager des systèmes de co-cultures entre les cellules immunitaires et des structures tridimensionnelles cultivées en laboratoire pouvant imiter certaines caractéristiques et fonctions d'organes humains ou animaux tel que l’intestin. Ces co-cultures pourront reproduire les interactions entre les différents types cellulaires au cours de la réponse inflammatoire de la même manière que dans un organisme vivant. Cependant ce modèle reste limité par le fait de l’absence de flux sanguin ou de déformations mécaniques (modification de la structure d’un organe en réponse à des forces mécaniques) qui sont essentiels pour la modélisation des maladies.

Réduction

Dans ces différents modèles le taux de mortalité est faible (moins de 10%), nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaires et suffisants dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats statistiquement exploitables à 6 par sous-groupe. Cette démarche a été validée lors de la demande d’autorisation de projet utilisant des animaux à des fins scientifiques précédente.. Les organes (intestins, pattes, plasma) seront conservés de façon adéquate pour des études ultérieures en cas de besoin sans avoir à recourir à de nouvelles expérimentations animales.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes et le stress imposées aux animaux : hébergement en groupe, portoirs ventilés, période d’acclimatation d’au moins 5 jours dans les mêmes conditions environnementales que celles qui prévaudront lors du protocole expérimental afin de stabiliser les animaux au point de vue physiologique et comportemental et de diminuer leur stress. Un enrichissement sera proposé aux animaux tout au long de l’expérience (coton et lanières cartonnées pour la confection de nids). Des critères comportementaux, physiologiques et cliniques seront observés pour définir le point limite précoce adapté. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés (état général, poids, consistance des fèces, mobilité). Un analgésique sera administré si nécessaire toutes les 12 heures. Si l’animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie de l’inflammation intestinale et de l’arthrite induite dans cette espèce animale est proche de celle de l’homme. De plus la taille et le poids limité de l’animal permet de restreindre les traitements à administrer et de nombreux outils biologiques sont disponibles pour caractériser l’inflammation chez la souris. L’espèce souris est donc la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants. Les souris âgés de 8 à 12 semaines seront utilisés car les publications ayant validé les différents modèles utilisés, ont montré que ces stades sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (souris adultes de poids suffisant).

1 926 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections de lymphocytes et d'anticorps, des gavages et des prélèvements de sang, pour étudier l'épuisement des lymphocytes T anti-tumoraux. Le porteur indique ne prévoir aucun analgésique ni anti-inflammatoire, y compris morphinique, au motif qu'ils interféreraient avec l'inflammation étudiée. Il affirme que la complexité de l'environnement tumoral ne peut être reproduite in vitro et impose un organisme intégré.

Objectifs

En France le cancer représente la première cause de mortalité, c’est pourquoi de nombreuses stratégies thérapeutiques ont été mises en place pour un meilleur traitement des cancers parmi lesquelles se trouve l’immunothérapie. L’immunothérapie repose notamment sur l’utilisation de lymphocyte T (LT) modifiés génétiquement (Cellules chimeric-antigen-receptor T ou CAR-T) et sur l’utilisation d’anticorps dans le but de redynamiser les LT anti-tumoraux fonctionnellement “épuisés” qui ont perdu leur capacité à tuer les cellules tumorales. Le phénomène d’épuisement lymphocytaire est un obstacle majeur pour l’efficacité des réponses immunitaires contre le cancer et constitue la cible principale des nouvelles immunothérapies du cancer. Ce projet vise à une meilleure compréhension des mécanismes qui régissent le phénomène d’épuisement des LT dans des modèles de tumeurs implantées et en particulier du rôle joué par deux régulateurs de l’expression des gènes appelés Id2 et Msc. En effet nos résultats préliminaires suggèrent que ces deux molécules pourraient réguler l’épuisement des LT anti-tumoraux. Les objectifs de ce projet de recherche consistent à : 1.) Évaluer le potentiel thérapeutique sur la croissance tumorale de la manipulation de l'expression de Id2 et Msc dans les LT anti-tumoraux. 2.) Déterminer si et comment Id2 et Msc contrôlent le programme génétique d’épuisement des LT.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet contribueront à l’optimisation de nouvelles approches thérapeutiques visant à améliorer l’efficacité des immunothérapies contre le cancer et aussi potentiellement pourraient permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris subiront 1 injection sous-cutanée sur le flanc d’une lignée tumorale (mélanome, Lymphome, adenocarcinome) ou dans le coussinet graisseux mammaire (lignée tumorale mammaire), une injection intraveineuse de lymphocytes T, des injections intrapéritonéales d'anticorps (1 injection tous les 3-4 jours pour un maximum de 4 semaines), des gavages (1 par jour pour un maximum de 4 semaines) et des prélèvements de sang mandibulaire (1 par semaine-maximum de 3 semaines). Toutes les injections ne durent que quelques secondes et s'effectuent sur animaux anesthesiés à l'exception des injections intrapéritonéales et des gavages qui s’effectuent sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et des gavages ainsi que des prélèvements de sang. Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et de manière très transitoire (secondes) . Certaines tumeurs sous-cutanées peuvent se nécroser dans ce cas les animaux sont euthanasiés, occasionnellement les animaux peuvent subir une perte de poids. La thérapie ICB peut induire un peu de diahrée et une perte de poids transitoire. Dans le cas des tumeurs mammaires des métastases pulmonaires peuvent être observées à un temps tardif pouvant engendrer un deficit d'oxygénation.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de cette pathologie humaine. L’utilisation de modèles expérimentaux intégrés est essentielle à ce projet. En effet, l’environnement tumoral et l’organisation tri-dimensionnel de la tumeur sont des paramètres clés qui régulent le recrutement, l'activation et les fonctions des LTs anti-tumoraux. A ce jour, cette complexité ne peut être entièrement reproduite in vitro. De même les différents acteurs du système immunitaire, cellules dendritiques et cellules T patrouillent par voie sanguine dans l’ensemble de l’organisme et leur recrutement dans la tumeur est défini par l’anatomie de la tumeur. Cette régulation de l'adressage tissulaire des cellules immunitaires, n'est à ce jour pas reproduit fidèlement par les systèmes de microfluidique.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux nous utilisons des modèles de tumeurs transplantées robustes dans des conditions expérimentales optimisées pour une prise de tumeur chez plus de 90% des animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos experiences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations expérimentales et les variations inter-individus. Les tests statistiques varient suivant les expériences et sont réalisés avec le module statistique de Prism.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage); et tous les deux jours-trois jours par l'expérimentateur qui vérifiera leur poids et apportera une aide à l’alimentation en cas de besoin (ajout dans la cage d'aliment et d'eau sous forme de gelée (gel-diet et water-gel)), et qui évaluera le développement de la tumeur, et l'état de santé globale des animaux (comportement, prostration, plaies) . L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Si immédiatement après ou le lendemain d’un gavage ou d’une injection s.c., i.p. ou i.v., un animal cesse de s’alimenter et devient prostré, il sera euthanasié. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices.

Choix des espèces

La possibilité de générer des modèles soit sur-exprimant (transgénèse) soit déficient (KO) pour une molécule d’intérêt font des souris un modèle de choix pour mieux comprendre les interactions entre le système immunitaire et les tumeurs naissantes. Par ailleurs, les modèles murins pré-cliniques ont montré leur pertinence dans la découverte et le développement de nouvelles immunothérapies. La disponibilité d'anticorps spécifiques d'un nombre conséquent de molécules permet d'analyser finement les différentes composantes du sytème immunitaire et de leur environnement par cytométrie en flux ou par imagerie. De plus, nombre de ces anticorps sont des agonistes ou antagonistes des voies de signalisations induites par ces récepteurs, ils peuvent donc être utilisés afin de moduler le système immunitaire ou de préciser les mécanimes impliqués dans le processus biologique étudié. Des souris adultes, agées de 2 mois seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système immunitaire mature. Les souris sont considérées comme adultes entre 6-8 semaines d’âge. Avant toute procédure elles auront une semaine d’acclimatation.

510 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections répétées, intratumorales, intramusculaires ou intrapéritonéales, et des gavages sur animal vigile, pour tester des immunothérapies contre des tumeurs rhabdoïdes de l'enfant. Les retombées annoncées pour les patients restent formulées comme des perspectives de soins cliniques. Le porteur affirme que l'étape chez la souris est "indispensable" pour évaluer l'efficacité de ces traitements avant une application humaine.

Objectifs

Les tumeurs rhabdoïdes (RT) sont des cancers rares mais très agressifs, qui touchent les nourrissons et les jeunes enfants, et se développent dans une grande variété d'organes, tels que le rein, le foie et le cerveau. L'agressivité de ces tumeurs nécessite aujourd'hui des traitements chirurgicaux, de chimiothérapie et de radiothérapie très intenses, qui ne sont efficaces que pour une minorité de patients et sont associés à des effets secondaires très graves. Ce scénario démontre un besoin urgent de développer des thérapies innovantes. Il a été récemment démontré que l'immunothérapie, un traitement qui renforce les défenses immunitaires naturelles de l'organisme, peut améliorer le contrôle tumoral d'un grand nombre de cancers. Cependant, elle n'a pas été testée sur les RT car, jusqu'à récemment, on pensait que ces tumeurs étaient invisibles pour les cellules immunitaires. Nos résultats préliminaires suggèrent que les RT peuvent être reconnues par les cellules immunitaires et que certaines stratégies d'immunothérapie pourraient être efficaces dans le contrôle de ces tumeurs. Ce projet a pour but d'explorer quelles molécules de la tumeur sont reconnues par les cellules qui défendent notre corps et ainsi, de développer des immunothérapies combinatoires pour renforcer les réponses anti-tumorales sans générer des effets secondaires graves. Ce projet sera développé par une équipe multidisciplinaire qui implique des pédiatres, des bioinformaticiens, des experts en chimie et en immunologie, ce qui nous permet de disposer des meilleurs outils pour mener à bien cet objectif.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier les mécanismes d’action de certains traitements par immunothérapie ciblant différentes populations de cellules immunitaires et de plus, les résultats obtenus seront importants pour des applications en soins cliniques des patients atteints de ce cancer rare. Ils pourraient également ouvrir de nouveaux champs de recherche pour d'autres cancers pédiatriques partageant des caractéristiques similaires.

Procédures

L’ensemble des procédures vise à évaluer l’effet de traitement sur la progression tumorale, donc l’ensemble des animaux seront greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée intervention inférieure à 10 min). Puis, dans une première procédure, les animaux seront traités tous les 2 jours avec 3 injections au total par voie intratumorale ou intra-musculaire sur animaux vigiles (durée du geste inférieur à 10 sec). Dans une seconde procédure, les animaux seront traités avec un produit tous les 2 jours pour 3 injections au total par voie intratumorale (durée du geste inférieur à 10 sec), et avec un autre produit chaque jour pendant 7 jours par voie intrapéritonéale, sur animaux vigiles (durée du geste inférieur à 10 sec). Dans une dernière procédure, les animaux seront traités avec un produit tous les 2 jours pour 3 injections au total par voie intratumorale (durée du geste inférieur à 10 sec). En parallèle ils seront traités avec un autre produit 2 fois par semaine tout au long de l’expérience par voie intrapéritonéale, ou chaque jour pendant 21 jours par voie intrapéritonéale (durée du geste inférieur à 10 sec), sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les animaux sont greffés avec des tumeurs par voie sous-cutanée dont la croissance sera suivie par des mesures régulières. Les nuisances seront associées à celles d’une petite ouverture du plan cutané (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet découle de résultats préliminaires déjà obtenus d’une part in vivo démontrant l’efficacité d’une immunothérapie sur ce type de tumeur et d’autre part de l’analyse bioinformatique de gènes exprimés par les tumeurs et des gènes exprimés par les cellules immunitaires infiltrant la tumeur. Après ces étapes ayant permis de démontrer l’intérêt de moduler le système immunitaire pour traiter ces tumeurs, et étant donné que la tumeur interagit avec l'ensemble de son environnement in situ (plusieurs types de cellules immunitaires avec des activités parfois contraires, vascularisation, stroma…) pour se développer, l'évaluation pré-clinique des traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours grâce à la culture et aux tests fonctionnels in vitro, l’étape chez la souris est indispensable pour évaluer l'efficacité et le mécanisme d'action de ces types de traitements combinés avant d'envisager une application clinique chez l'Homme en thérapie anti-cancéreuse.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans les conditions réglementaires et sont surveillées régulièrement dont 2 fois par semaine pour mesurer la taille des tumeurs. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux Les animaux sont mis à mort lorsque les points limites énoncés dans la grille de score sont atteints. La greffe des tumeurs est réalisée sous anesthésie accompagnée de l’administration d’un anti-douleur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies anti-tumorales, notamment car la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés. Les souris seront utilisées à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire adulte.

4 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ingèrent une molécule qui endommage la barrière de l'intestin et reçoivent un agent qui provoque des tumeurs, développant diarrhée, douleur viscérale, saignements et perte de poids, avec prélèvements de sang répétés et traitements deux fois par jour. L'objet est de tester des molécules anti-inflammatoires et anticancéreuses contre les maladies inflammatoires de l'intestin et le cancer du côlon, y compris sur des souris au système immunitaire humanisé. Le porteur qualifie ces modèles d'"indispensables" tout en reconnaissant que la réponse immunitaire de la souris diffère de celle de l'humain.

Objectifs

Les deux principales formes de maladies inflammatoires de l'intestin, la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn, sont des troubles inflammatoires chroniques récidivants du tractus gastro-intestinal. L'étiologie est très probablement une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux favorisant la désintégration de la barrière épithéliale intestinale et la dérégulation de la réponse immunitaire au microbiote intestinal. Rien qu'en France, on dénombre plus de 200 000 patients atteints de MICI. Les cancers de l’intestin, notamment le cancer colorectal, peuvent être associés à la forme chronique des MICI et/ou aux traitements associés. N’ayant pas de traitement efficace pour les maladies inflammatoires de l’intestin ou le cancer colorectal, de modèles pré-cliniques sont nécessaires afin de tester l’efficacité de produits candidats à visée thérapeutique. L'un des modèles les plus utilisés pour étudier les maladies chroniques de l’intestine est le modèle d'inflammation intestinale induite par le DSS (Dextran Sulfate Sodium). Afin de modéliser le cancer du colon, l’injection d’azoxymethane (AOM) associé au modèle chronique de DSS est ainsi un outil indispensable. Les modèles précliniques sont donc indispensables pour tester l'efficacité des médicaments à cet égard. Les modèles murins d’inflammation intestinales sont couramment utilisés pour l’étude de la fonction de la barrière intestinale ainsi que le microbiote. En revanche, on craint de plus en plus que les mécanismes immuno-pathogènes observés dans les ces modèles ne soient pas les mêmes que ceux que l'on pense observer chez l'homme. Nombreuses études ont démontré que la réponse immunitaire murine différencie en structure et en fonction dans des nombreux cas de celles de l’homme, ce qui peut expliquer les taux d’échec dans l’utilisation des données précliniques prometteuses en nouveaux traitements en clinique. Cette réalité inconfortable a incité un certain nombre de chercheurs à entreprendre une série d'études visant à humaniser le système immunitaire murin par le transfert adoptif de cellules progénitrices lymphoïdes ou hématopoïétiques dans une nouvelle génération de receveurs immunodéficients. Ainsi, les souris humanisées au niveau du système immunitaire permettront de comprendre l’interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et également avec les tumeurs.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, le projet validera les doses de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d'AOM (azoxymethane), avant de tester l'efficacité de nouveaux candidats thérapeutiques (anti-inflammatoires et anticancéreux) en utilisant différents modèles/stades de pathologies intestinales. En outre, ce projet évaluera ces maladies intestinales dans un modèle de souris au système immunitaire humanisé. Ces souris recevront des cellules souches humaines capables de se différencier en cellules immunitaires humaines. Il s'agit d'un modèle innovant, car peu étudié à ce jour, et qui répondra à la crainte de plus en plus exprimée vis-à-vis des modèles murins traditionnels : la réponse immunitaire humaine diffère de la réponse murine, donc les souris humanisées au niveau du système immunitaire (NXG-HIS) seront un atout comme modèle préclinique pour l'étude de ces maladies, où la composante inflammatoire et le système immunitaire jouent bien évidemment un rôle primordial. Ce modèle nous permettra également de comprendre l'interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et avec les tumeurs.

Procédures

Pour induire l’inflammation intestinale chez la souris, de l’eau de biberon contenant du DSS (Dextran Sulfate Sodium-une molécule capable d’endommager la barrière intestinale) sera donner aux animaux pendant 7 jours (modèle aigu) ou 5 jours (modèles chroniques) en 3 cycles. Pour l’induction de la tumeur au niveau du côlon, une injection d’azoxymethane (intrapéritonéale) sera donnée avant les cycles de DSS. Les animaux auront des prélèvements de sang en avant l'induction de l'inflammation intestinale ou de la tumorigenèse. Le prélèvement sera fait à la veine maxillaire (en vigile) ou au sinus retro orbitaire (sous anesthésie). D’autres prélèvements au cours de l’étude sont prévus : 1 fois après 15 jours d'intervalle pour le modèle aigu et 3 fois avec un intervalle de 12 jours entre chaque prélèvement pour les modèles chroniques. Le volume à prélever sera de maximum 10% du volume total de sang circulant de l'animal par prélèvement (64mL/kg). Les animaux seront quotidiennement traités par une des voies suivantes : orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, deux fois par jour en respectant le volume journalier à être administré. Pour le DAI (l’indice d’activité de la maladie), les fèces seront récoltées quotidiennement (pendant 12 jours, en modèle aigu et 60 jours, en modèles chroniques) afin de vérifier la présence de sang et sa consistance. La récolte est faite par isolement de l’animal dans une cage propre et sans enrichissement, nourriture et l’eau pendant maximum 30 minutes/jour. A la fin de la phase expérimentale, les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement maximal de sang par ponction cardiaque. Ensuite, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’effet attendu du DSS (Dextran Sulfate Sodium) est l’inflammation intestinale qui perturbe la digestion et l’absorption des nutriments dû à l’altération de la barrière intestinale. Les effets du DSS sur la santé de l’animal seront la diarrhée, la douleur viscérale, le saignement, la perte de poids et l’apathie, principalement. Le score de l’indice d'activité de la maladie qui consiste en évaluer la perte de poids corporel, la diarrhée et le saignement) est mesuré tous les jours pendant la phase expérimentale et permettra rapidement de connaître l’avancement de la maladie et la détérioration de l’état de santé de l’animal. L’objectif du modèle est d’avoir des animaux malades, mais pas dans un état sévère d’inflammation. L’AOM (azoxymethane) est un mutagène qui induit la formation des tumeurs. Il est donc attendu que les souris perdent du poids, aient de la diarrhée, des douleurs abdominales et deviennent apathiques. On attend le développement des tumeurs au niveau intestinal, sans pour autant induire la mort des animaux. Les effets secondaires des candidats thérapeutiques à tester ne sont pas connus, ni leur nature. De ce fait, il nous est impossible de prévoir les nuisances pour les animaux. En ce qui concerne la souris humanisées et son phénotype, celui-ci n’est pas dommageable pour la souris, c’est-à-dire cela n’augmente pas la sévérité des pathologies étudiées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les modèles in vitro, tels que les organoïdes intestinaux ou simplement des lignées cellulaires, ne peuvent pas mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En revanche, ces modèles permettent de sélectionner au préalable des molécules d’intérêt avant de passer dans un modèle pré-clinique in vivo. Ensuite, une fois les pilotes in vivo faites et le screening in vitro réalisés, des tests peuvent être fait en nombre réduit d’animaux à une quantité relevant pour garantir la puissance statistique.

Réduction

L’objectif des études pilotes prévues dans ce projet est de limiter le plus possible le nombre d’animaux dans les modèles qui seront ensuite utilisés. Pour les études pilotes, le suivi quotidien et accru des animaux permettra de sélectionner la dose de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d’AOM (azoxymethane) la plus juste afin d’avoir un phénotype pathologique, sans pour autant induire la mort des animaux. En revanche, dans les modèles pré-cliniques, le fait de ne pas connaître les effets indésirables des molécules à visée thérapeutique in vivo et avec l’objectif de garder la puissance statistique, la quantité d’animaux devra être augmentée de 20% par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et plusieurs types d’enrichissement seront mis dans les cages qui hébergent les animaux (tunnel, Aspen brick, igloo et Sizzle-Nest). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence des points limites à savoir : la prostration ou absence de mouvement, la perte de poids supérieure à 20% du poids d’origine et la diarrhée liquide accompagnée d’un saignement accru. Si un animal présente un des points limites, il serait pris en charge par l'équipe zootechnique. Si son état ne s’améliore pas dans les 24h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieront. Si l’animal présente une plaie, par exemple, des soins de nettoyage et désinfection seront effectués.

Choix des espèces

Les modèles d’inflammation intestinale par DSS (Dextran Sulfate Sodium) et le modèle de cancer du colon induit par l'AOM (azoxymethane) suivi de l'inflammation chronique induite par DSS sont très bien décrits et caractérisés dans la littérature. Pour les souris normalles, non-humanisées, la maturité sexuelle est atteint pour les mâles à 8 semaines et pour les femelles à 6 semaines. Donc, pour que les animaux soient matures, ils rentreront en étude qu'à partir de l'âge de 8 semaines. En revanche, pour les animaux humanisés, dû au processus d’humanisation, les animaux rentreront en étude à partir de 15 semaines d'âge.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunisées au collagène avec un adjuvant par deux injections intramusculaires dans les cuisses, ce qui déclenche une arthrite auto-immune, avec prises de sang et mesure des chevilles au pied à coulisse deux fois par semaine. Le porteur affirme que les processus de l'arthrite ne peuvent être reproduits in vitro et écarte le modèle d'arthrite spontanée jugé trop aléatoire. Le projet vise à comprendre le rôle des neutrophiles dans le déclenchement de la maladie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un modèle murin d’arthrite qui permettra d’étudier les mécanismes d’induction de l’auto-immunité impliqués dans cette pathologie, notamment le rôle des neutrophiles ainsi que leur diversité dans le déclenchement de cette pathologie. Pour cela, il est indispensable d’avoir un évènement déclencheur (ici le début de l’immunisation) à partir duquel les processus pathologiques amenant à la maladie se développent afin de pouvoir comparer des groupes de souris et établir une cinétique d’étapes clés. Un modèle d’arthrite spontanée ne se prête pas à notre recherche, car le début d’arthrite est trop aléatoire. Un modèle d’arthrite active (induite par une immunisation) a été décrit (collagen-induced arthritis (CIA)), mais ce modèle nécessite l’injection répétée de collagène II en présence d’un adjuvant fort, qui induit des inflammations tissulaires importantes. Pour éviter l’usage de cet adjuvant, nous proposons donc d’administrer du collagène II associé à une protéine porteuse en présence d’un adjuvant alternatif pour induire une arthrite chez la souris. Cet adjuvant est une huile naturelle qui est également utilisée dans certains vaccins humains. Pour établir les meilleures conditions expérimentales, nous réaliserons dans un premier temps, une mise au point du modèle sur des souris sauvages. Ensuite nous appliquerons les conditions établies dans cette première partie à des lignées de souris chez lesquelles l’activité des neutrophiles est altérée et dans un modèle de souris pour lequel les gènes codants pour les différentes classes d’anticorps, pour leurs récepteurs et le complément sont humanisés afin d’étudier les mécanismes impliqués dans la dérégulation de l’immunité, la perte de tolérance contre le soi et le développement de l’auto-immunité. Nous étudierons les cellules sanguines ce qui nécessitera des prises de sang régulières. A la fin de l’expérimentation, les souris seront mises à mort puis autopsiées pour étudier les réponses des neutrophiles et les anticorps dans les articulations, la rate et les ganglions drainants.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier les mécanismes d’auto-immunité et la perte de tolérance au soi impliqués dans l'arthrite, notamment le rôle des neutrophiles ainsi que leur diversité dans le déclenchement de cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront immunisés avec du collagène II complexé en présence d’un adjuvant par voie intramusculaire (50 uL) dans les deux cuisses arrière, par 2 injections espacées d’au minimum 1 semaine. Des prises de sang rétromandibulaires de moins de 100uL seront effectuées à trois occasions espacées d’au moins 1 semaine. Les deux types d’interventions ne prendront que quelques secondes. A partir de la première immunisation les articulations seront évaluées deux fois par semaine et l’épaisseur des chevilles mesurée à l’aide d’un pied à coulisse (caliper) (l’évaluation complète dure moins de 5 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Les animaux seront immunisés avec du collagène II complexé en présence d’un adjuvant par voie intramusculaire (50 uL) dans les deux cuisses arrière, par 2 injections espacées d’au minimum 1 semaine. L’injection intramusculaire dure quelques secondes et provoquera un léger œdème dans le muscle associé à une douleur modérée de courte durée. Des prises de sang rétromandibulaires de moins de 7,5% de leur poids (100uL) seront effectuées à trois occasions espacées d’au moins 1 semaine. La prise de sang dure quelques secondes et causera une douleur légère de très courte durée. L’immunisation induira une réaction immunitaire contre le soi, qui se traduira par le développement d’une arthrite au niveau des articulations des membres. Cette inflammation débutera avec une rougeur au niveau d’une jonction articulaire, accompagnée d’un recrutement localisé de cellules inflammatoires, qui progressivement s’étendra à d’autres articulations du membre et s’accompagnera d’un gonflement. L’inflammation des articulations se traduira par une douleur progressive, qui n’entrainera pas pour autant une réduction de la mobilité des souris. A partir de la première immunisation les articulations seront évaluées deux fois par semaine et l’épaisseur des chevilles mesurée à l’aide d’un pied à coulisse (caliper) (l’évaluation complète dure moins de 5 minutes/souris).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Une autopsie sera réalisée sur tous les animaux afin de prélever différents organes et tissues dont la rate, les ganglions drainants, et les articulations pour étudier les réponses des neutrophiles dans ces différents compartiments.

Remplacement

L’arthrite met en œuvre des processus complexes reposant sur les singularités du système circulatoire et des tissus cibles, processus qui ne peuvent pas être reproduits in vitro.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé avec l’objectif de réduire ce nombre autant que possible tout en minimisant le « bruit de fond » inhérent à la recherche biologique in vivo. Ce nombre inclut le nombre nécessaire de contrôles et la nécessité de reproduire les résultats. De plus, le recours à des lignées consanguines de souris permettra de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental.

Raffinement

Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les monitorings effectués (qui selon leurs scores déclenchent des actions à prendre) sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Nous respecterons les conditions d’élevage et de maintien établies par nos vétérinaires. Les animaliers ont la charge de la surveillance du bien-être des animaux, et inspectent les cages régulièrement, en plus de nos visites et de la visite hebdomadaire du vétérinaire. Dès la première immunisation les animaux seront observés au moins 1 fois par semaine et « scorés » selon une grille d’évaluation, prenant en compte l’arthrite, l’apparence de l’animal, les fonctions du corps et leur comportement. Des points limites ont été définis : - Pour l’arthrite : pour chaque patte un score de 4, et un score global (prenant en compte les quatre pattes) de 9. - Une perte de poids supérieur à 20% - Une immobilité persistante pendant plus que 24h - Un score clinique composite plus important que 20 Nous avons également mis en place des actions à prendre en fonction du score clinique composite : Pour un score de : - 0-3 : monitoring classique avec augmentation de la fréquence de surveillance (2 fois par semaine) - 4-7 : nourriture / gel humidifié dans la cage - 8-12 : nourriture / gel humidifié dans la cage et augmentation de la fréquence de surveillance (3 fois par semaine) - 13-20 : nourriture / gel humidifié dans la cage et augmentation de la fréquence de surveillance (tous les jours) et discussion de la conduite à tenir avec un membre de la structure du bien-être animal.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.