Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle du facteur de transcription PLZF dans l’inflammation et le vieillissement du système hématopoiétique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Une partie est irradiée puis greffée de moelle osseuse et reçoit des injections de molécules pro-inflammatoires, tandis que les reproducteurs sont mis à mort après six mois d'accouplement et les animaux au génotype non recherché également éliminés. Le projet étudie le rôle du facteur PLZF dans le vieillissement du système sanguin, ou "inflammaging". Le porteur affirme que le dialogue entre cellules souches et microenvironnement ne peut être reproduit et rend le "modèle murin" impossible à remplacer.
Objectifs
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines (dans un processus appelé hématopoïèse) subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d'hémopathies. Dans le cadre d’un précédent projet, nous avons montré que le facteur de transcription PLZF est impliqué dans la régulation du vieillissement du système sanguin. PLZF participe à la régulation du compartiment des cellules souches hématopoiétiques (qui sont à l'origine de toutes les cellules du sang) et est associé à l'augmentation de certaines sous-populations que nous avons identifiées comme des cellules préactivées dans des voies de signalisation impliquées dans l'inflammation. Ces résultats suggèrent que PLZF pourrait être un acteur clé dans le vieillissement du système sanguin lié à l'inflammation chronique. Notre projet propose d'élucider le rôle de PLZF dans la physiologie du vieillissement des cellules sanguines soumises à des processus inflammatoires. Nous souhaitons donc étudier en détail les effets d’une inflammation chronique sur les différents types de cellules hématopoïétiques (notamment les cellules souches et les progéniteurs) ainsi que leurs altérations moléculaires et fonctionnelles dans des modèles murins où l'expression de PLZF est altérée.
Bénéfices attendus
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines, subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d'hémopathies. Le vieillissement du système sanguin est notamment lié aux inflammations subies tout au long de la vie de l'individu, processus connu sous le nom d'"inflammaging" qui favorise l'émergence d'hémopathies malignes. Nous souhaitons élucider certains mécanismes responsables de ce processus, pour mieux comprendre les causes du développement des hémopathies et cibler les acteurs clés de ce phénomène.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d'environ 6-7 minutes. La greffe de cellules de moelle osseuse qui s'ensuit est réalisée sous anesthésie gazeuse d’une durée de 3 à 4 minutes. Les animaux seront soumis à des injections de molécules pro-inflammatoires (durée 1 à 4 semaines, injection 3 fois par semaine) nécessitant chacune quelques secondes d'intervention sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. Les animaux recevront des traitements par des molécules inflammatoires. Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation suivie d’une transplantation de moelle osseuse sous anesthésie gazeuse. L'irradiation est réalisée au sein d'un appareillage bruyant, ce qui peut être source de stress. Lors de ces transferts adoptifs, l'irradiation et le délai de reconstitution entraînent une période de fragilité immunitaire des animaux récipients, que nous compenserons par l'administration d'une antibiothérapie maintenue sur une durée de deux semaines à 1 mois après la greffe. Les animaux seront soumis à des observations et pesées quotidiennes, qui peuvent être source de stress.
Devenir
Ce projet nécessitera 456 souris. Les animaux reproducteurs sont mis à mort à l’issue de la période de 6 mois d’accouplement qui permet de générer les animaux de génotype d'intérêt. Les animaux ne présentant pas les génotypes d’intérêt sont également mis à mort. Les animaux d'intérêt utilisés dans ce projet sont mis à mort à l'issue des procédures à des fins d'analyse.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre le vieillissement des cellules souches hématopoïétiques, lequel implique des mécanismes largement dépendants d'une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux (cytokines, molécules d’adhésion). Ce dialogue permanent entre la cellule souche hématopoïétique et son microenvironnement nécessite d’avoir recours aux modèles murins qu’il n’est donc pas possible de remplacer actuellement.
Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre d'animaux grâce à l’utilisation des techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre expérience passée nous a permis d'estimer le nombre d'animaux nécessaires à l'obtention d'un nombre suffisant de cellules souches et progéniteurs (populations rares) pour les analyses pré-citées, et nous permet d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage et en mettant à disposition de la nourriture humide. Tous les gestes techniques sont réalisés par du personnel compétent et expérimenté, le cas échéant sous anesthésie gazeuse (injections et prélèvements sanguins).
Choix des espèces
L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, à partir de 6-7 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures. Les greffes par transfert adoptif s'effectuent sur des animaux receveurs C57BL6/J Ly5.1 âgés de 7 à 8 semaines, qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe .
Production in vivo d’un anticorps monoclonal dirigé contre un marqueur de l’hémostase destiné à l’industrie du diagnostic in vitro
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
34 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane puis d'hybridomes qui déclenchent une tumeur et une accumulation de liquide d'ascite dans l'abdomen, décrite comme source de détresse, avant un prélèvement terminal. Le projet produit in vivo un anticorps monoclonal destiné à des kits de diagnostic industriels, le porteur affirmant que la production in vitro n'a pas été validée et concluant à une "nécessité incontournable". Le recours à 34 000 souris pour produire un anticorps par la méthode d'ascite ressort comme l'élément marquant de ce projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire in vivo chez la souris un anticorps monoclonal (Mab) ultra-spécifique d’un produit terminal de la dégradation de la fibrine. Ce Mab entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs IVD exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique et la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif.
Bénéfices attendus
L’obtention in vivo de cet anticorps monoclonal permettra le maintien de la production de kits de diagnostic essentiels à la définition d’un statut clinique. Cet anticorps entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs de diagnostic in vitro (IVD) exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique avec la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. Il est à noter que ces kits, ont joué un rôle clé dans la crise sanitaire liée à la maladie à coronavirus (COVID-19). Les instances scientifiques ont permis de définir un lien entre le taux du produit de dégradation de la fibrine dosé par les kits dépendant de cet anticorps et la gravité de la maladie COVID-19 (mauvais pronostic pour le patient).
Procédures
Mise en quarantaine des souris dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation Après respect d'une semaine de quarantaine, à J1 les souris reçoivent une injection d’un agent d’amorçage. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de cet agent est précédée 30 minutes avant par l’injection en sous-cutanée d’un antalgique. A J22, après expansion clonale, les hybridomes sont injectés en IP unique à raison de 4.106 cellules/souris. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. Suivi quotidien des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort sont euthanasiés et ponctionnés de manière éthique. Récupération unique et terminale d’ascite par paracentèse dès apparition. Injection IP ou SC, durée de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Chez l'animal, une douleur et une détresse peuvent résulter de l'injection intrapéritonéale (IP) de l'amorce (pristane), de l'inoculation IP des cellules tumorales, et de la croissance des cellules tumorales dans la cavité abdominale (effets primaires) sous forme de plaques péritonéales qui s'infiltrent dans la paroi abdominale ou les organes abdominaux. Plus précisément, il semble que l'injection par voie IP produit un niveau de détresse modéré; on décrit que la production d'ascite et la croissance de tumeurs causent de la souffrance chez les patients humains. De plus, les changements pathophysiologiques et pathologiques complexes peuvent provoquer une détresse chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont concernés, les souris sont toutes euthanasiées en fin de protocole. L’ensemble des animaux inclus dans un cycle de production sont euthanasiés avant paracentèse.
Remplacement
L’alternative la plus logique pour la production de cet anticorps serait une production in vitro. Malheureusement, à ce jour, l’anticorps n’a pu être caractérisé techniquement et validé cliniquement que sur des lots issus de production en condition in vivo. L’ensemble des résultats concernant la capacité de certains clones à produire in vitro les mêmes anticorps selon le même cahier des charges requis pour les dispositifs IVD concernés, démontre la nécessité incontournable de poursuivre la production de ce Mab en condition in vivo (incapacité des hybridomes à tolérer un transfert en extension d’échelles notamment de rendement de production et ou de qualité fonctionnelles des anticorps obtenus). Les besoins de santé publique de ces dispositifs IVD exploitant cet anticorps, et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. La société nous demandant de réaliser des productions d'anticorps in vivo, est consciente de l’aspect éthique de l’expérimentation animale et s'engage à ne recourir à la production in vivo que dans des cas de stricte nécessité. En parallèle, de ce protocole, les essais de passage en in vitro se poursuivront notamment via la mise en œuvre d’essai de tris des clones présentant les taux de sécrétion d’immunoglobulines les plus élevés. Il est également à noter que pour les nouvelles versions de cette gamme de produit, les anticorps utilisés seront fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro » (développement en cours)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. Nous pourrons nous baser sur l’expérience acquise sur les anciens protocoles réalisés sur ces clones. L’utilisation de souris anciennes reproductrices permet également de ne pas utiliser d’animaux jeunes spécifiques au projet, mais d'utiliser des souris qui étaient vouées à être euthanasiées. Les expériences de sélection des clones possédant les meilleures capacités de sécrétion, devraient permettre à minima de réduire le nombre d’animaux engagés par protocole. La dernière demande d’autorisation concernait 21000 souris par an, la nouvelle demande impliquerait 17000 individus annuellement, soit une diminution d’environ 19%. A ce jour 1 souris permet la réalisation de 1400 tests.
Raffinement
Les recommandations (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris seront appliquées. L’unique paracentèse sera réalisée après euthanasie de l’animal, afin de limiter les manipulations de l’animal toujours sources de stress. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de l’agent d’amorçage est précédée 30 minutes avant par l’injection d’un antalgique. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 2 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion…) et signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 3 niveaux : normal, souffrance légère mise en œuvre d’antalgies à envisager, souffrance sévère arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les animaux bénéficient d'un hébergement, d’un environnement, d'une certaine liberté de mouvement, de nourriture, d'eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Afin de faciliter la sociabilité des souris, elles ne sont pas isolées dans une cage et des objets d'enrichissement sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont euthanasiés et prélevés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore.
Choix des espèces
Les hybridomes concernés ont été obtenus par fusion de splénocytes de souris et de myélome de souris, selon la méthode de Milstein et al (1975). Les clones obtenus n’ont jamais pu être produits autrement que chez la souris. Le Mab obtenu et validé dans les dispositifs IVD concernés, est un Mab obtenu et produit chez la souris. Les souris doivent être de même souche (syngéniques) à la fois pour l'immunisation en vue de la création du clone d'hybridome et pour la production subséquente de Mab, de sorte que les tissus utilisés soient histocompatibles. Les souris Balb/c représentent le meilleur choix puisque les cellules myélomateuses parentales employées dans le processus de fusion proviennent de cette souche. Les souris utilisées préalablement pour la reproduction présentent l’avantage pour la production de l'ascite parce que leur musculature abdominale a déjà été étirée (Falkenburg, 1998). Les animaux utilisés sont de préférence des femelles adultes Balb/C (anciennes reproductrices), car elles présentent une prédisposition physiologique favorisant une dilatation de leur paroi abdominale en diminuant le risque de compression d‘organe (respect des 3R).
Caractérisation de l’impact d’un virus respiratoire sur la progression tumorale de cellules KP KO pour les protéines adaptatrices recrutées par les TLR et de l’IFNAR1 dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires puis une infection nasale par le virus Influenza sous anesthésie, avant des traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie, la croissance tumorale pouvant provoquer détresse respiratoire et perte de mobilité. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et justifie le choix de la souris parce que "toutes les études similaires sont menées chez cet animal". Les bénéfices avancés pour les patients atteints de cancer du poumon restent une meilleure connaissance des facteurs de résistance aux traitements.
Objectifs
Nous souhaitons caractériser l’impact d’un virus respiratoire sur la progression tumorale de cellules tumorales pulmonaires et comprendre les mécanismes mise en oeuvre lors de la reconnaissance virale. Pour ce faire, nous utiliserons des lignées cellulaires présentant ou non des adaptateurs moléculaires impliqués dans le processus de reconnaissance du virus respiratoire Influenza A. Nous nous interessons également à la réponse aux différents traitements.
Bénéfices attendus
Les traitements actuellement préconisées dans le cadre d'un cancer pulmonaire sont la radiothérapie ou la chimiothérapie et éventuellement en association avec l'immunothérapie ou thérapie ciblée. Cependant, il est nécessaire de poursuivre des recherches pour mieux connaître les facteurs pouvant impacter la progression tumorale et la résistance au traitements. C'est pourquoi, nous souhaiterions déterminer le rôle des adaptateurs ou récepteurs de la reconnaissance virale en combinaison avec de la chimiothérapie ou immunothérapie.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, la durée de l'expérience est de 1 mois. Les animaux recevront une injection de cellules tumorale (2250 animaux) par voie intraveineuse avec au préalable une anesthésie générale. La durée de l'acte est de quelques secondes à une minute. De plus, avant l'infection respiratoire, les souris sont anesthésiées à l'aide de cette même préparation puis l'infection par voie nasale (2250 animaux) peut avoir lieu. Le temps nécessaire une infection est de 20 minutes maximum. Nous testerons également la résistance aux médicaments et la voie d'administration du traitement (chimiothérapie ou anti-monoclonal) est une injection intra-veineuse (1800 animaux) et l'acte prend moins de 10 secondes. Les souris recevront une anesthesie gazause. Lors des traitements par chimiothérapie : deux à 5 injections sont prévues pour les sels de platine. Enfin, lors du traitement par immunothérapie, 5 injections d'anticorps seront réalisées. De plus, lors de l'imagerie du petit animal, nous utilisons un anesthesique gazeux pendant 10 min (2250 animaux).
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse peut causer une douleur ou un inconfort d’où l’utilisation d’une anesthésie injectable. Les souris peuvent souffrir de faim ou de soif lors d’une infection virale et lors d’une croissance rapide de la tumeur instillée, l’animal peut présenter des signes de souffrances, d’une détresse respiratoire et une diminution de la mobilité de l’animal. De plus, les effets indésirables liés à l’infection virale peuvent être multiples. Lorsque nous procédons à une infection virale par voie nasale, il est nécessaire d’endormir les souris à l’aide d’une anesthésie injectable pouvant entrainer une hypothermie. Enfin, l’administration de médicaments se fait par voie intra-veineuse Et, l’animal recevra une anesthésie gazeuse pour limiter toute souffrance, et ensuite, l’injection intra-veineuse peut être entrepris.
Devenir
Les souris sont euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les poumons dans le but d’analyser par des techniques multiparamétriques, l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral et la réponse virale.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. En effet, les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de progression tumorale et l’infiltrat immunitaire dans sa globalité
Réduction
Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous avons établi 15 souris/groupe. Nous utiliserons un pied à coulisse pour mesurer le volume tumoral aux cours du temps et des techniques d'imagerie non invasive pour l’apparition des métastases. Le nombre d’animaux impliqué dans l’étude est de 2250. Nous utiliserons un test statistique permettant de comparer les moyennes des souris instillées par rapport aux contrôles.
Raffinement
Raffiner, la méthodologie utilisée, ce qui implique la notion de points limites, si des signes de souffrances sont visibles. De plus, les animaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne et seront gardés en groupes de 5 et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris. Notre stratégie d’observation consiste en une surveillance quotidienne par les animaliers d’une part et nous assurons en plus une surveillance suivi d’un contrôle 3 fois par semaine dès que les souris ont été infectée par injection intra-nasale avec recherche de signes d’altération de l’état général (souris recroquevillée, amaigrissement (3 pesées hebdomadaires) et de difficultés respiratoires. Lors des injections de cellules tumorales pulmonaires et au moment de l’infection intra-nasale, les animaux seront sous anesthesie générale. Afin d'éviter que les animaux ne soient en hypothermie, nous les plaçons sur un tapis à 37°C. En cas de signe de souffrance les souris seront euthanasiées. Nous utiliserons une anesthesie gazeuse afin d’observer l’apparition des tumeurs par une technique d’imagerie pour éviter d’euthanasier l’animale. Nous utiliserons également de l’anesthesie gazeuse lors des injections intra-veineuses.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour conduire nos expériences avec avant tout dans un souci d’intégration de nos recherches dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Il s’agit d’une espèce pour laquelle notre animalerie est parfaitement adaptée, qui se manipule facilement. Nous utilisons des souris C57Bl/6 albinos qui est une lignée de souris dont la mutation provient d’une mutation spontanée dans la lignée C57Bl/6. Cette lignée est couramment utilisée pour les expériences de bioluminescence. Les animaux commerciaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature.
Etude de la réponse immunitaire suite à une vaccination nasale ou systémique de souris contre le paludisme
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois prises de sang et, pour deux tiers d'entre elles, deux vaccinations par voie nasale ou sous-cutanée contre le paludisme. Le porteur décrit un stress de contention, des hématomes possibles et une gêne nasale, et prévoit la mise à mort à J31 pour étudier les réponses immunitaires, notamment hépatiques. Il affirme qu'aucun modèle de remplacement ne reproduit la complexité du système immunitaire, cette étude étant présentée comme une preuve de concept.
Objectifs
Le paludisme est une maladie parasitaire responsable de 241 millions de cas et de 627 000 décès estimés dans le monde en 2020. Malgré les mesures préventives dont l'efficacité protectrice reste modérée chez les enfants, il existe un besoin urgent de développer de nouveaux candidats vaccins antipaludiques avec une efficacité protectrice d'au moins 75 % d'ici 2030 (OMS). Le paludisme a un cycle de vie complexe impliquant l'invasion et le développement à l'intérieur des hépatocytes et des érythrocytes de l'hôte mammifère. A chaque étape de son cycle de vie, le parasite à travers ses différentes formes exprime de nombreuses protéines cibles de candidats vaccins contre le paludisme. Les vaccins candidats en développement ne bloquent pas complètement la transmission et ne sont pas aussi efficaces contre les nouvelles variantes. Il est donc urgent de développer d'autres stratégies vaccinales pour induire une immunité protectrice et simplifier les conditions d'administration et de conservation. Ces dernières années, un candidat vaccin sous-unitaire contre la COVID-19, administré par voie nasale. Celui-ci induit des réponses immunitaires humorales et cellulaires aux niveaux systémique et muqueux assurant une protection contre tous les variants décrits jusqu'à présent, ce qui a conduit à une priorisation nationale pour des essais cliniques ces prochains mois. L’équipe souhaite sur la base de cette expertise développer un vaccin contre le paludisme qui induit des réponses humorales et cellulaires au niveau hépatique et systémique afin de conférer une protection contre l'infection à Plasmodium. Des travaux récents, en modèle d’hépatite B, ont montré que seule la vaccination nasale était en capacité d’induire une réponse cellulaire hépatique (lymphocytes) en comparaison d’une immunisation systémique renforçant l’intérêt de la voie nasale comme une solution pertinente. Pour ces raisons, nous proposons d'utiliser cette même technologie pour développer un vaccin nasal contre le paludisme, et valider dans un premier temps, l’induction d’une réponse immunitaire protectrice systémique et hépatique.
Bénéfices attendus
Le vaccin contre le paludisme actuellement le plus avancé montre des résultats qui sont loin de ceux attendus pour un vaccin idéal. Le vaccin a montré une efficacité d'environ 45 % pour protéger les enfants âgés de 5 à 17 mois au cours de la première année après la vaccination avec une exposition moyenne au paludisme, avec une efficacité diminuant avec le temps et jusqu'à environ 16 % dans les situations d'exposition élevée au paludisme, même dans la première année suivant la vaccination. Il est donc urgent de développer un vaccin plus efficace. Dans ce but, nous proposons d'utiliser une nouvelle plateforme vaccinale qui a montré des résultats prometteurs pour le COVID-19. La capacité du candidat vaccin à induire une forte réponse immunitaire humorale et cellulaire systémique et hépatique forte spécifique de Plasmodium pourrait être d'un grand avantage pour un vaccin antipaludique. De plus, si notre calendrier vaccinal à deux immunisations par voie intranasale montre des réponses immunitaires robustes, ce sera une grande avancée dans la recherche sur le vaccin antipaludique. En effet, le RTS,S est proposé sous la forme d'un schéma à quatre doses chez l'enfant à partir de 5 mois ce qui est une organisation difficile dans les pays endémiques (aiguille stérile, personnel médical) . De plus, cibler différentes étapes du cycle de vie du parasite pourrait aider à compléter des candidats vaccins plus avancés et permettre d'augmenter la protection si peu de parasites parviennent à échapper à l'immunité hépatique. Comme le vaccin candidat COVID-19 entrera en essais cliniques ces prochains mois, la sécurité et la toxicité de la plateforme vaccinale auront déjà été exploitées, ce qui constituera un grand avantage pour nous concentrer sur l'amélioration de l'immunogénicité et l'évaluation de la meilleure combinaison (foie + stade sanguin antigènes) du vaccin anti-paludique.
Procédures
Les animaux subiront tous 3 prises de sang à J0, J21 et J31. 1/3 subira en plus des prises de sang, 2 instillations par voie nasale à J0 et J21 et un autre 1/3 , 2 injections par voie sous-cutanée à J0 et J21. Les prises de sang et les instillations/injections ne durent que quelques secondes sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
A ce jour, aucune des expériences de vaccinations effectuées dans le laboratoire et utilisant des antigènes n'a produits d'effets indésirables sur les animaux. Les contentions engendrent du stress, les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur légère au niveau du site de prélèvement. La vaccination par voie sous-cutanée peut entrainer une infection au niveau du site d’injection et celle par voie nasale une légère gêne.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à J31 de façon à pouvoir étudier les réponses immunitaires induites par les différents types de vaccination notamment les réponses immunitaires hépatiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.
Réduction
Cette expérimentation est une preuve de concept qui permettra de récolter assez de données pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Ne possédant pas non plus de données liés au sexe, nous avons décider de constituer des lots de 10 souris composés de 5 mâles et 5 femelles.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Une surveillance accrue sera effectuée à la suite de chaque procédure afin de détecter au pls tôt les points limites définis pour chaque procédure. Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Un enrichissement positif ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid. Un dispositif de tunnel de préhension sera utilisé pour réduire le stress des animaux.
Choix des espèces
Le modèle d'étude d'un candidat vaccin administré par voie nasale est déjà établi chez la souris dans le laboratoire. De plus, la souris Balb/c est décrit dans la littérature comme le modèle de référence permetant l'étude des réponses immunitaires suite à une vaccination contre palsmodium. Tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Des souris adultes sont utilisées car leur système immunitaire est complètement développé
Mise en place d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïètiques murines dans des souris immunocompétentes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une irradiation totale du corps avant l'injection de cellules souches, avec des prélèvements sanguins toutes les deux semaines, puis pour certaines des immunisations répétées. Le porteur décrit un affaiblissement possible après l'irradiation, perte de poids, léthargie, diarrhées et suppurations oculaires liées aux injections rétro-orbitaires. Il affirme que les événements moléculaires du développement des lymphocytes B sont impossibles à reproduire in vitro et que le recours aux animaux est "indispensable", l'euthanasie servant à prélever les organes de l'immunité.
Objectifs
Les lymphocytes B sont des cellules de l’immunité adaptative sécrétrices d’anticorps dirigés contre les agents étrangers au soi. Pour produire des anticorps, le lymphocyte B doit se différencier en une cellule sécrétrice d’anticorps, aussi appelée plasmocyte. Notre laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur les évènements moléculaires qui concourent à cette différenciation. Cette dernière induit dans la cellule d’importantes modifications qui sont sous le contrôle d’un grand nombre de facteurs clés agissant pour certains sur le stress cellulaire et sur des évènements qui pourraient conduire à un cancer. Nous avons très récemment montré que des enzymes ayant les capacités de phosphorylation des protéines et jouent un rôle primordial dans ce processus de différenciation en plasmocytes. Dérégulées, ces enzymes contribuent à la survenue et au maintien de cancers issus des lymphocytes B (lymphomes) et plasmocytes (myélome). Nous souhaitons confirmer in vivo chez la souris le rôle des ces enzymes dans ce processus de différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Ce projet comporte trois volets: 1) Le premier consiste à la mise en place technique d’une transplantation de cellules de la moelle osseuse en vue d’une production nouvelle de cellules sanguines chez la souris immunocompétentes ; 2) Dans un deuxième temps nous transplanterons des cellules de moelle issues de souris modifiées génétiquement et aptes à développer des cancers; 3) Enfin, nous transplanterons des cellules préalablement modifiées avec perte des capacités à produire les enzymes d'intérêt. Les animaux ainsi modifiés permettront l’étude précise des évènements moléculaires qui participent à la différenciation en cellule normale ou tumorale, selon le cas.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension du rôle des kinases PIM dans la biologie du lymphocyte B normal ainsi que dans le développement des tumeurs induites au cours de cette différenciation, les lymphomes et le myélome.
Procédures
Notre modèle de greffe dans des souris immunocompétentes implique au préalable une irradiation totale des souris avant l'injection des cellules. Les cellules seront injectées dans le sang après une anesthésie gazeuse des animaux. L'injection sera de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes. Des prélèvements sanguins itératifs (1 fois toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés pour tous les animaux. Le prélèvement sanguin ne nécessite aucune anesthésie et n'excèdera pas 1 minute. Enfin des immunisations seront appliquées sur certains animaux (aucune anesthésie requise) dès 3 mois post-greffe pour les animaux dont la reconstitution sanguine a été jugée optimale. L’immunisation sera soit unique ou itérative (2 ou 3 injections espacées de 1 semaines à 1 mois selon les modèles), avec des injections de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes.
Impact sur les animaux
L'irradiation des animaux peut engendrer un affaiblissement notable de leur vitalité, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées quotidiennement durant la phase post-irradiation (au moins 1 semaine) pour détecter une potentielle absence de prise de greffe et apparition de signes d’affaiblissement immunitaire (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Afin de lutter contre la perte de poids (en lien avec des diarrhées induite par l'irradiation), un apport gélose pourra être utiliser pour faciliter l'absorption des aliments et la réhydratation des souris. Enfin, le développement de suppurations des yeux peut aussi apparaitre suite aux injections rétro-orbitales. Une vigilance particulière au cours du suivi quotidien des animaux en post-greffe sera donc porté sur cet effet possible.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution de toutes les cellules du sang et sur développement de la réponse immunitaire et des tumeurs.
Remplacement
Le projet est basé sur des études préliminaires in vitro ayant démontrées l'importance des kinases PIM chez l’Homme dans la différenciation normale du lymphocyte B en plasmocytes et leur implication dans le développement des cancers. Les évènements moléculaires impliqués dans le développement des cellules du système immunitaire, et tout particulièrement des lymphocytes B sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro. Le recours à des animaux est donc indispensable pour cette étude.
Réduction
Afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (organes de l'immunité, moelle osseuse et sang) afin de réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes chez la souris, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal. Enfin, la taille des groupes de souris est choisie de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valides, que l’expérimentation soit donc réalisée de façon productive et sans nécessiter d’avoir à refaire ces tests. Le nombre de 10 souris par lot est choisi assez élevé pour pallier le fait que ces expérimentations ont une reproductibilité assez faible. En effet, l'irradiation totale et la greffe subséquente de cellules sont des procédures avec une forte variabilité, et un risque non négligeable de perte d'animaux en période post-irradiation.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel.
Choix des espèces
Les souris sont de bons modèles d'étude notamment pour caractériser des mécanismes physiologiques ainsi que comprendre les processus de cancérogénèse étant donné leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murin est aussi le plus utilisé actuellement pour le développement tumoral et étudier la tumeur dans son microenvironnement. Enfin, de nombreux outils sont maintenant disponibles pour l’étude des structures anatomiques, cellules et gènes dans cette espèce (anticorps, séquence de référence) dans les modèles murins, facilitant alors l'analyse des données. Pour notre projet, les cellules de la moelle osseuse des souris donneuses seront greffées dans des souris receveuse de même fond génétique afin d’éviter le rejet de greffe. L’expérimentation sera commencée sur des animaux à partir de 4 semaines d’âge et jusqu’à 3 mois de vie. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 12 mois.
Évaluation de la réponse inflammatoire de la pulpe dentaire à un nouvel hydrogel d’acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 dans un modèle de pulpe inflammatoire chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une cavité est creusée dans leurs molaires puis laissée ouverte 24 heures pour déclencher une inflammation de la pulpe dentaire, avant l'application d'un hydrogel expérimental. Le porteur reconnaît une douleur buccale et une gêne pour s'alimenter, et prévoit l'euthanasie de groupes de six animaux à 24 et 72 heures pour récupérer les molaires. Il affirme que les expériences in vitro ne reproduisent pas les interactions cellulaires complexes de l'inflammation et que le recours au rongeur reste "nécessaire" pour valider le biomatériau.
Objectifs
La carie dentaire touche environ 98% de la population en Europe. La dent représente un environnement spécialisé où la pulpe dentaire est un tissu conjonctif mou entouré d'une barrière minérale dure faite de dentine et d'émail. Lors d’une carie, les micro-organismes pénètrent l’émail et la dentine et déclenchent ensuite une réponse inflammatoire/immunitaire dans la pulpe dentaire (pulpite). Cette pulpite peut entraîner des douleurs dentaires très aiguës (la forme la plus répandue de douleur orofaciales). Le traitement des dents en pulpite est encore controversé. Le traitement « classique » canalaire radiculaire présente un bon taux de succès (85%) : il consiste après mise en forme et désinfection à l’aide d’une solution d’hypochlorite de sodium 2,5% à obturer de manière tridimensionnelle l’intégralité de l’endodonte avec un ciment et de la gutta percha (polymère naturel). Cependant, les dents traitées sont plus cassantes que les dents non traitées ; il y a une perte des capacités de cicatrisation, et un risque de dissémination bactérienne dans l'organisme subsiste toujours après traitement radiculaire. Une approche alternative consiste à retirer uniquement la partie enflammée de la pulpe pour maintenir et préserver son potentiel de guérison. Les avantages de ces thérapeutiques sont : le maintien des mécanismes de défense, la perception de la douleur comme système d'alerte, la cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients. Malgré ces avantages évidents, cette approche alternative est encore peu pratiquée notamment parce que le résultat est difficilement prévisible en raison de l'état inflammatoire du tissu pulpaire restant. En effet, l'inflammation pulpaire est souvent trop importante et entraîne une nécrose pulpaire. L'originalité de ce projet est de contrôler la réponse immunitaire qui est le principal facteur de succès.
Bénéfices attendus
Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de ces nouveaux hydrogels d'acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 (LXA4). Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments qui ont des effets immunotoxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites (maintien des mécanismes de défense, perception de la douleur comme système d'alerte, cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients). Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.
Procédures
Le jour de la procédure, les rats seront anesthésiés. L’ouverture buccale sera maintenue par instrument dentaire. Pour induire l’inflammation, nous formerons une cavité à l'aide d'instruments dentaires sur les molaires, la cavité formée sera rincée au sérum physiologique avant d’être laissée à l’air libre durant 24h. Après 24h d’exposition, la cavité sera de nouveau rincée au sérum physiologique pour éliminer tous débris éventuels puis nous viendrons injecter dans la cavité la proposition thérapeutique (ou bien les solutions contrôles) à l’aide d’une seringue, le volume sera adapté à chaque cavité de manière à la remplir. La cavité sera ensuite refermée avec un biomatériau utilisé en dentisterie. Pour chaque groupe, 6 rats seront euthanasiés à 24h et 6 autres à 72h. Nous récupérerons les maxillaires de manière aseptique afin de procéder aux différentes analyses.
Impact sur les animaux
Ce modèle entraine une inflammation « contrôlée » et limitée du tissu pulpaire. Ce protocole de classe modérée pourrait conduire à : - Une douleur au niveau buccal après avoir exposé le tissu pulpaire à l’environnement oral - Une gêne pour s’alimenter (normalement pendant 24h) liée aux dents laissées ouvertes. Le design de l’étude permet de conserver un coté sans atteinte dentaire permettant une alimentation normale. Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.
Devenir
Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer les molaires traitées et controlatérales (qui serviront de témoins).
Remplacement
Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire. L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, et bioactivité. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Le nombre de 6 animaux par groupe est calculé à partir d’un test de puissance statistique pour une différence significative de 20%, un écart-type de 10% et un risque consenti de 5%.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi par alpha dri. Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage. Nous raffinerons également en réduisant les douleurs via : - 1. Une anesthésie réalisée localement avant toute procédure sur la dent. - 2. Des antalgiques en post opératoire. Les rats seront observés et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en oeuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. De plus, pour faciliter la prise alimentaire, l’alimentation des rats sera posée sur le sol de manière à être plus accessible. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes. Les molaires traitées et les molaires controlatérales seront prélevées pour effectuer des analyses complètes afin d'exploiter le tissu extrait dans sa totalité.
Choix des espèces
Notre choix se base donc sur l’étude de la bibliographie. Notre projet fondé sur une approche translationnelle est un préalable nécessaire à un développement préclinique sur d'autres espèces plus proches de l'Homme. Ce modèle est bien maitrisé dans notre laboratoire. Le modèle de carie induite sur la molaire de rat est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude des biomatériaux et/ou la réponse immunitaire de la pulpe dentaire tout particulièrement pour l’approche moléculaire, histologique et imagerie 3D. Nous avons choisi d’utiliser uniquement des mâles. Il existe des différences liées au sexe dans la prévalence des lésions carieuses chez l’Homme. Ces différences sont dépendantes d’un grand nombre de variables (milieu socio-économique, accès à l’éducation, accès aux soins). En revanche ces différences n’ont jamais été démontré dans des modèles animaux de caries dentaires. La réponse immunitaire est capitale dans la cicatrisation et il peut y avoir des différences de réponse entre mâles et femelles. Nous prévoyons d’utiliser que des mâles pour justement éliminer ce biais et cela correspond de plus à des publications qui nous ont servi de références pour l’élaboration du protocole. Les animaux reçus auront 7 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les rats auront donc 8 semaines au début du protocole et presque 9 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation de la pulpe dentaire.
Role des inhibiteurs ERAP dans un modèle de psoriasis chez des souris humanisées BRGSF-HIS
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
440 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Un psoriasis leur est induit par application d'imiquimod avec épilation, puis elles reçoivent par gavage ou injection des inhibiteurs candidats, avec des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur décrit une contention et des gestes générateurs de stress, et prévoit l'euthanasie pour prélever rate et peau. Il revendique un "fort besoin médical" pour le psoriasis et affirme que les modèles plus simples, invertébrés, ne permettent pas de valider l'approche.
Objectifs
Les ERAPs sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les maladies auto-immunes et autoinflammatoires. Les ERAP 1 et 2 sont des amino-peptidases intracellulaires (métalloprotéases) chargées de la transformation finale des antigènes peptidiques pour présentation par les molécules du CMH de classe I. Ils régulent ainsi la réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T cytotoxiques (LcT) et affectent l'immunodominance en impactant le répertoire peptidique global présenté par le CMH-I. Les enzymes ERAP ont des rôles complémentaires et des fonctions importantes in vivo. Un certain nombre d'haplotypes ERAP sont liés au risque de souffrir de diverses maladies auto-immunes ou auto-inflammatoires, notamment le psoriasis. Un obstacle scientifique est la disponibilité de petites molécules inhibitrices d'ERAP efficaces, sélectives et biodisponibles. Aucun inhibiteur d'ERAP n'a été évalué in vivo jusqu'à présent et les rapports sur la modulation de l'immunopeptidome par les composés ERAP ne sont pas disponibles. L'objectif du projet est d'identifier des inhibiteurs pharmacologiques d’ERAP à travers méthodes intégrés de chimie médicinale (du criblage fonctionnel de la présentation de l'antigène combiné au profilage des immunopeptidomes dans les cellules des patients) et l’évaluation préclinique de leur efficacité thérapeutique dans un modèle de psoriasis chez des souris presentant a systeme immunitaire humain (souris BRGSF-HIS).
Bénéfices attendus
Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements personnalisés des maladies autoimmunes/auto-inflammatoires. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour la psoriasis qui est maladies à fort besoin médical.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés en rétro-orbitaire, à partir de J8 et chaque 2 jours après le début du protocole de traitement avec IMQ, jusqu'au sacrifice (J16). Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%. Le volume maximal prélevé sera égal à 200μL. Pour chaque souris, le prélèvement sanguin durera au maximum 5 minutes, y compris la durée de l'anesthésie
Impact sur les animaux
Concernant les molécules candidates qui seront administrés, leur toxicité est préalablement testée par nos partenaires et leur administration tiendra compte des études de toxicité et de pharmacodynamique afin de ne pas avoir d'effets indésirables qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation. Cependant, les souris seront soumises à des procédures pouvant générer un stress, comme la contention, afin d'effectuer des traitements de gavage oral ou des ponctions intrapéritonéales ou un prélèvement sanguin sous anesthésie à l'isoflurane à 2 %.
Devenir
A l'issue de la procedure tous les animeaux seront euthanasiés sous anesthésie à l'isoflurane à 2% afin de prélever des échantillons de rate et de peau sur lesquels seront évalués tous les paramètres histologiques et biomoléculaires nécessaires pour définir l'efficacité ou non des composés testés.
Remplacement
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, le criblage d'une série d'inhibiteurs d'ERAP1/2 préalablement modélisés et synthétisés par l'équipe partenairesera réalisé sur des modèles cellulaires, par quantification LCMS-MS. De plus une évaluation de la sécurité sera exprimée sous la forme d'un rapport IC50 et CC50 (test cellulaire à haut contenu d'apoptose ou de nécrose (Caspase-3/7 activité Propidium iodure) et évalué la plateforme Equipex Imaginex. Les inhibiteurs candidats seront préalablement testés par des expériences de pharmacodynamiques afin de garantir une exposition et une voie optimale avant les tests chez les souris BRGSF-HIS
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes d'interet et les differents paramètres mesurés. Le nombre d’animaux par groupe de n= 10 est calculé par une approche statistique qui integre la dispersion des valeurs individuelles et qui a été déterminé suite à des expériences pilotes ou sur la base des précédentes publications.
Raffinement
Afin de limiter la douleur, surtout pendant la phase d'épilation, toutes les souris seront traitées avec une injection sous cutanée de buprenorphine a la concentration de 0.05 mg/Kg. Les animaux sont observés et pesés d’une manière quotidienne pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure) - une perte de poids supérieur à 15%. Les souris montrat de signe de mal-être seront euthanasiées sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%.
Choix des espèces
La souris est une espèce modèle très bien documentée dans la littérature scientifique, offrant des outils optimisés pour l’étude des réponses immunitaires et des mécanismes physiologiques intégrés. Des modèles plus simples (invertébrés) ne permettent pas de valider les approches proposées. Le modèle expérimental murin de psoriasis que nous avons choisi d’utiliser est référencé et validé scientifiquement dans de nombreuses publications. Le modèle murin est donc le plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants tout en évitant au maximum la douleur et la souffrance chez l’animal. De plus, la souris BRGSF représente le modèle le plus immunodéficient généré à ce jour, avec un défaut des compartiments lymphoïde et myéloïde murin et représente donc un modèle animal fortement adapté pour la xénogreffe su systeme immunitaire humaine. La souris BRGSF représente le modèle immunodéficient plus efficace généré à ce jour, avec un défaut des compartiments lymphoïde et myéloïde murin, et représente donc un modèle animal fortement adapté pour la xénogreffe de tumeurs humaines et/ou du système immunitaire. L'inflammation cutanée de type psoriasis induite par l'Imiquimod (IMQ) semble liée à une production de cytokines, notamment d'IL23, par les cellules dendritiques. Dans le modèle BRGSF-HIS, nous proposons un boost de cellules dendritiques en utilisant hFlt3L. Comme les souris n'expriment pas ERAP2, l'utilisation d'une version humanisée semblerait être un solution pertinent pour tester les effets des nouvelles molécules basées sur l'inhibition des ERAPs dans la psoriasis. Le souris BRGSF-HIS seront utilisée a 12 semaine de vie, qui représentent le temps pour une reconstitution optimale d'un système immunitaire humain.
Evaluation par microscopie intravitale des effets de la Photobiomodulation sur l’inflammation chronique et aiguë suivant un traumatisme de la moelle épinière
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes reçoivent l'implantation d'une fenêtre vitrée dans la colonne vertébrale, et 420 d'entre elles une section partielle de la moelle épinière qui provoque une paralysie postérieure temporaire, avec difficultés à s'alimenter et à vider la vessie. Le porteur teste ensuite un traitement par lumière et compare la récupération à celle de 300 souris non lésées, avec des prélèvements sanguins deux fois par semaine et une mise à mort par perfusion intracardiaque. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou in silico ne rend compte de la complexité du traumatisme médullaire, les bénéfices annoncés restant formulés au conditionnel.
Objectifs
Ce projet mettra en place un modèle murin de traumatisme médullaire permettant de clarifier les mécanismes neuroinflammatoires régulés par ce traitement, en vue d'accélérer et maximiser la récupération fonctionnelle. Il s'agit donc non seulement d'un enjeu de recherche fondamentale mais aussi de recherche cliniquement applicable.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’évaluer le traitement par photobiomodulation en fonction d’une application précoce, tardive ou combinée et de comparer l’évolution des densités cellulaires et de la récupération sensori-motrice post-traumatique avec celles observées pour des animaux lésés mais non traités. Ainsi nous pensons pouvoir mettre en évidence un effet anti-inflammtoire et neuroprotecteur de la PBM appliquée en phase aiguë immédiatement après le traumatisme et pendant 5 jours consécutifs. Nous pensons également pouvoir mettre en évidence un effet neurotrophique et neuro-régénératif de la PBM dans les phases chroniques grâce à une action directe sur la microglie après exposition brève pendant 5 jours à compter de la 5ème semaine post-traumatique. Si tel est le cas, la combinaison de ces deux protocoles thérapeutiques permettra d’amplifier les effets positifs de la lumière et d’accélérer, sinon de maximiser, la récupération fonctionnelle post-traumatique.
Procédures
Sur cinq ans, la totalité des 720 animaux seront soumis à une chirurgie pour implanter une fenêtre vitrée spinale permettant de réaliser des expériences de microscopie intravitale longitudinale sous anesthésie. L’implantation d’une fenêtre vitrée n’induit pas de nuisance majeure pour la locomotion et le comportement de l’animal non lésé. 420 souris seront de plus soumises à une transection partielle de moelle épinière thoracique (hémisection) de laquelle elles récupèrent spontanément au bout de 6 à 7 semaines en l’absence de traitement. 92% de ces animaux traumatisés recevront un traitement de 6 min de photobiomodulation quotidienne appliquée pour 5 jours consécutifs soit immédiatement au moment du traumatisme, soit un mois après, soit combiné (immédiat et un mois après). La durée des expériences sera limitée à 60 jours post-trauma. La réponse au traitement de ces animaux sera comparée à celle de 300 animaux non lésés. Les sessions d’imagerie intravitale ne sont pas douloureuses, ni destructives. Sur tous les animaux, la réponse musculaire réflexe sera évaluée 2 fois par semaine sous anesthésie volatile légère grâce à des enregistrements électromyographiques de la contraction musculaire induite par stimulation du nerf tibial. Sous anesthésie gazeuse également, des prélèvements sanguins seront réalisés 2 fois par semaine à raison de 50 µl par prélèvement sans dépasser un volume maximum équivalent à 7,5% de la volémie totale de nos animaux chaque semaine. Ces prélèvements n'auront lieu qu'après reprise du poids initial de l'animal. Tous les animaux seront mis à mort dans les 60 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/CSF nécessaires aux études et caractérisations post-mortem.
Impact sur les animaux
Les différentes techniques d'exploration utilisées dans ce projet sont suceptibles d'engendrer les nuisances suivantes : anesthesie, implantation de fenetre vitrée spinale, lésion de moelle épinière, gêne locomotrice : paralysie temporaire unilaterale postérieure pouvant occasionner une difficulté à la prise alimentaire, risque éventuel de difficulté de la vidange de la vessie peut-être observé dans les premiers jours, traitement quotidien par photobiomodulation non invasive, l'hébergement en cage individuelle, stress et/ou douleur, prélèvements sanguins. Des électrodes adhésives sont proposées en lieu et place d’électrodes implantées. Prelevement LCR par citerne et perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux (720) seront euthanasiés dans les 60 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem.
Remplacement
Les pathologies neurodégénératives et traumatismes médullaires sont des processus complexes impliquant l’interaction entre de très nombreux organes et systèmes physiologiques (nerveux, immunitaire, endocrinien, cardiovaculaire… ) qu’il est nécessaire d’analyser et de comprendre. Aucun modèle cellulaire ou aucun modèle in silico ne sont aujourd’hui en mesure de rendre compte de cette complexité. L'importance de l'interaction entre les axones, la myeline, les vaisseaux sanguins et les autres types cellulaires (microglie et astrocyte) rend la mise en place d'un système in vitro reproduisant toutes les composantes trop complexe et n'est pas envisageable. Le modèle d’hémisection est nécessaire pour permettre de tirer des conclusions sur les mécanismes de récupération fonctionnelle. La procédure de thérapie par photobiomodulation dans notre modèle est une étude pré-clinique visant à ouvrir la voie à des essais cliniques pour des applications dans le traitement du traumatisme de moelle sachant que celle-ci est dors et déjà appliquée sur l'humain dans le cadre d'études cliniques pour le traitement de la maladie d'Alzheimer et des contusions cérébrales chez les sportifs. Dans notre cas, un des critères principaux de l'effet du traitement est l'évolution des capacités motrices, avec et sans traitement, au cours du temps. Cette étude ne pourrait donc pas etre réalisée autre que in-vivo.
Réduction
Sur la base de nos travaux passés, les lots d’animaux sont dimensionnés au minimum pour s’assurer de la significativité statistique des quantifications in vivo et sur tranches en utilisant le test statisitque dédié aux petits échantillons. Ce test nous a permis de définir le nombre d'animaux requis pour l'étude. Ainsi il est nécessaire de réaliser la quantification in vivo pour 8 animaux par groupe à J60. Compte tenu d’une probabilité d’environ 70% d’obtenir une fenêtre claire sur deux mois post-traumatiques suivant l’expertise des expérimentateurs chirurgiens, il est prévu d’utiliser 12 animaux par groupe pour les expériences intravitales. Les expériences d’imagerie sur coupes histologiques sont moins bruitées et permettent de moyenner l’analyse sur un plus grand volume de tissus pour obtenir des résultats moins variables. Le nombre d’animaux nécessaires à chaque temps est donc de 3 au lieu de 8 in vivo. Afin de couvrir les 6 temps d’intérêts, 18 animaux seront nécessaires par groupe pour réaliser les expériences d’immunohistochimie. Le nombre de 720 animaux a donc été établi afin d'avoir un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe permettant d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences avec significativité statistique. Le modèle souris est choisi en raison de sa très bonne récupération spontanée suite à un traumatisme de moelle, récupération que nous souhaitons accélérer par une prise en charge thérapeutique de type clinique tout en étudiant dans le même temps l’implication du système immunitaire. Les mêmes animaux et les mêmes données servent ainsi à la recherche fondamentale ET à la recherche applicative.
Raffinement
Reception et adaptation de 7 jours. Après induction à l'isoflurane, injection de buprénorphine, les animaux sont anesthésiés avec injection intrapéritonéale d'une solution de kétamine et xylazine; ces doses sont augmentées de 50% avant la perfusion intracardiaque pour anesthésie profonde pré-opératoire et mis sur un tapis chauffant. Les yeux sont oints de gel hydratant, une infiltration de lidocaine est appliquée avant toute incision. Après laminectomie, Une injection sous-cutanée d'une solution d'anti-inflammatoires, dexamethasone et rimadyl, est réalisée le jour de la chirurgie puis tous les deux jours pendant 10 jours. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles respectant la surface minimale requise, avec objet d’enrichissement de l’environnement (dômes en carton ou en plexiglas ou encore coton). un accès non limité à la nourriture et l’eau, un cycle de 12h jour et 12 nuit, une température et une humidité contrôlées. Les animaux sont visités tous les jours par des personnes compétentes dans le domaine de l’expérimentation et du bien-être animal comme attesté par les autorités référentes. Pour s'assurer de la bonne vidange de la vessie le bas du ventre de chaque animal est palpé 2 fois par jours. Dans le cas éventuel où la vessie ne se viderait pas, nous appliquons des massages jusqu'a vidange de celle ci. Du gel sucré énergétique est mis à disposition au fond de la cage pendant la procédure afin de s’assurer que l’animal a les apports énergétiques dont il a besoin. Le recours à l’anesthésie a lieu aussi souvent que nécessaire pour limiter le stress ou la douleur inhérentes aux manipulations requises pour les prélèvements ou les sessions d’imagerie. Les animaux sont pesés quotidiennement les 5 premiers jours avec pour poids de référence le poids avant la procédure chirurgicale. Une variation de plus de 20% pendant plus de 3 jours, malgré la supplémentation sous-cutanée en solution sucrée, sera considérée comme un point limite. Les procédures choisies s seront accompagnées d'un suivi rigoureux des signes cliniques (score de douleur: Grimace scal Langford et al). La mise a mort de l'animal sera effectuée s'il atteint son point d'arrêt.
Choix des espèces
Nous utilisons la microscopie de fluorescence intravitale. Il est donc nécessaire d’étudier des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents. Nous disposons d’une lignée unique, établie et caractérisée depuis plusieurs années par notre équipe et dans laquelle les populations cellulaires d’intérêt sont génétiquement marquées de différentes couleurs. Le phénotype de ces cellules est aujourd’hui très bien caractérisé par nos travaux précédents. Ceci évite de perdre des animaux en mise au point de protocole. Dans le cadre du traumatisme de moelle, la souris démontre une très bonne récupération spontanée tout en impliquant des processus physiologiques fortement similaires à ceux rencontrés chez l’humain : neurodégénération et repousse de colatérales d’axones, angiogénèse et recrutement de cellules inflammatoires, gliose réactionnelle… Les observations sont donc facilement transférables au contexte clinique. Les vastes connaissances actuelles sur l’organisation de la moelle épinière chez la souris et sur son comportement en font un modèle pré-clinique de choix dans lequel les signes de douleur ou souffrance sont aisément détectables et interprétables. Tous les animaux seront de animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observée chez les patients traumatisés médullaire. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement, tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux. Les deux sexes seront utilisés pour rendre compte de la diversité des cas observés chez les patients lésés médullaires.
Génétique des maladies auto-immunes sur modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
153 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un agent chimique mutagène est injecté pour induire des mutations au hasard dans le génome, puis les descendants sont suivis pour repérer ceux dont la maladie auto-immune est modifiée, avec puçage et biopsie de la queue. Le porteur indique que l'agent chimique rend stériles 70 % des mâles et que les animaux sont tués dès les premiers signes de la maladie. Il affirme le "besoin" de recourir à la souris, aucun modèle in vitro ou in silico n'existant selon lui pour ces maladies génétiques.
Objectifs
Ce projet concerne les maladies auto-immunes qui ont une cause génétique. Le but est de caractériser les gènes impliqués en utilisant la souris comme modèle. Dans ce projet nous induirons des mutations au hasard dans le génome grâce à l’injection d'un agent chimique. Nous identifierons les mutations qui modifient les caractéristiques physiques de la maladie en suivant les descendants des souris traitées. Les mutations qui modifient de manière significative les caractéristiques de la maladie seront ainsi identifiées. Les protéines codées par les gènes identifiés seront des cibles thérapeutiques potentielles chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la maladie. Cette démarche donnera accès à de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie ainsi qu’à de nouveaux marqueurs génétiques et/ou biologiques permettant de dépister la maladie à des stades précoces. Nous prévoyons que de nouveaux gènes modifiant les caractéristiques de la maladie seront découverts.
Procédures
Chez certaines souris une injection unique intrapéritonéale sera pratiquée dans les 3 jours qui suivent la naissance (le geste dure 15 secondes) Une puce électronique sera implantée à tous les animaux de 3 semaines d’âge par voie sous cutanée. Des biopsies d’un fragment de queue seront effectuées à 3 semaines d’âge (le geste dure 15 secondes). Le projet comporte l'injection intrapéritonéale de 250 animaux avec un agent chimique 1 fois par semaine pendant 3 semaines (à 4, 5 et 6 semaines d'âge) (chaque geste dure moins de 15 secondes). Chez certaines souris un prélèvement unique de sang sera effectué à 6 semaines sous anesthésie générale (le geste dure 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les injections de l’agent chimique peuvent entraîner une infertilité chez 70% des mâles. L'injection intrapéritonéale peut en soi être à l'origine d'une douleur, les prélèvements de sang sous anesthésie peuvent être associés à une douleur à l'œil au réveil, les biopsies de queue peuvent engendrer une douleur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes biologiques de la maladie afin d'éviter toute souffrance.
Remplacement
Ce projet concerne l'étude de maladies auto-immunes qui sont d’origine génétique. Il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico pour aborder le sujet. D’où le besoin d'avoir recours aux modèles de souris dont les caractéristiques récapitulent la maladie humaine. Les expériences proposées nécessitent de comparer des individus qui ne diffèrent pas de façon majeure pour leur fond génétique ou l’environnement. C’est le cas de la souche de souris que nous proposons d’étudier.
Réduction
Pour respecter le principe de la Réduction, le nombre proposé de souris a été établi sur la base d’études statistiques permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables. La méthode utilisée permet de cumuler les individus à des temps différents de suivi en diminuant ainsi de manière très importante le nombre de souris analysées à chaque temps individuel. Pour les expériences impliquant des croisements, le nombre d’individus prévus tient compte de notre expérience dans le domaine. Par ailleurs, le protocole prévoit un nombre limité de croisements (3) pour constituer les groupes d'animaux qui feront l'objet de l'analyse génétique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour respecter le confort maximum des conditions d’hébergement, faire pratiquer les gestes nécessaires par un personnel formé et ayant de l’expérience des pratiques, réduire le stress et la douleur. Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés. Les cages sont dotées de tunnels d’enrichissement rouges et de cotons de nidification. Pour les prélèvements sanguins et les biopsies une prise en charge de la douleur sera mise en place avec des antalgiques et des anesthésiques. Une observation quotidienne avec une grille de points limites sera effectuée afin qu’en cas de besoin des mesures soient mises en place pour garantir le bien-être de l‘animal.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est une souche de souris qui développe une maladie dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie humaine correspondante. Les souris sont engagées dans les procédures dès la naissance. La maladie apparait chez les souris adultes après 12 semaines d’âge. Les souris sont suivies une fois par semaine, à partir de 10 semaines d’âge, pour détecter de manière précoce la survenue de la maladie. Les expériences seront toujours interrompues dès les premiers signes biologiques de la maladie avant que celle-ci n’ait donné lieu à des manifestations physiques entraînant une souffrance des animaux.
Evaluation de stratégies vaccinales par voies muqueuses chez la souris dans le cadre de Travaux Pratiques d’un Master.
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dans le cadre de travaux pratiques de master, elles sont immunisées trois fois par différentes voies, orale, nasale, sous-cutanée, intradermique ou sublinguale, avec prélèvements de sang, de fèces et de lavages vaginaux. Elles sont ensuite tuées pour étudier les réponses immunitaires dans la rate et les ganglions, une inflammation ou une prostration marquée entraînant une mise à mort anticipée. Le porteur affirme que cet apprentissage ne peut se faire sur un autre support qu'un "organisme entier" et que les analyses in vitro ne suffisent pas.
Objectifs
Chaque année, les étudiants devront réaliser un TP durant 2 semaines dont le but est d'évaluer les réponses immunitaires suite à l'immunisation par différentes voies muqueuses chez la souris (souche OF1).
Bénéfices attendus
Le projet permet aux étudiants Master d’observer les effets des différentes voies d’immunisation d’une formulation vaccinale sur un organisme entier. Il permet d’apprendre aux étudiants la manipulation des souris, les prélèvements de sang, sécrétions muqueuses et organes afin d’etudier les réponses immunitaires après diffférents types d’immunisation.
Procédures
Les souris seront immunisées 3 fois par voie orale, nasale, sous-cutanée, intradermique ou sublinguale. Le sang, les fèces et les lavages vaginaux seront prélevés 2 fois pour mesurer les réponses anticorps.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables peuvent survenir chez les souris après la vaccination comme une inflammation au site d’administration de la formulation vaccinale pour les voies intradermique et sous-cutanée, une augmentation de la température du corps et une diminution de l’activité des souris ainsi qu’une légère perte de poids des souris. Ces paramètres seront vérifiés 3h, 24h, 48h, 72h après chaque immunisation. Les animaux seront surveillés pour vérifier l’absence d’inflammation du site d’injection (voies intradermique et sous-cutanée) et la température corporelle sera surveillée à chaque temps à l’aide d’un thermomètre rectal. Les souris seront pesées 72h après l’immunisation. L’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou une détérioration de l’état général seront surveillés. L’immobilité, la prostration, l’apathie, une inflammation excessive au niveau des sites d’injection et/ou de prélèvements, seront considérées comme critères de points limites qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal.
Devenir
A la fin de l'expérience, tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir étudier les réponses immunitaires post-vaccinales au niveau de la rate et ganglions.
Remplacement
Cette étude permet d'apprendre aux étudiants comment on analyse les réponses immunitaires après vaccination chez la souris et comment on prélève les échantillons pour analyser ces réponses immunitaires. Cette apprentissage ne peut pas se faire avec un support pédagogique autre qu'un modèle souris. Les techniques ne peuvent pas être pratiquées et s'acquérir différemment. De plus, les étapes préliminaires d’analyse in vitro, bien qu’indispensables, ne sont pas suffisantes pour analyser l’effet des différentes voies d'immunisation d’une formulation vaccinale sur les réponses immunitaires. Les analyses in vitro avec des lignées cellulaires, ex vivo avec des cellules humaines ou murines ou des modèles 3D peuvent permettre d'analyser comment l'antigène et/ou l'adjuvant entre(nt) dans les tissus et active(nt) certaines cellules immunitaires mais il faut un organisme entier pour que tous les acteurs cellulaires soient présents et puissent se déplacer dans les sites d'induction afin que des réponses immunitaires post-vaccinales puissent étre générées. Ainsi les effets des voies d'immunisation ne peuvent pas être étudiés autrement que dans un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans cette étude est restreint afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés au cours de ce TP. Etant donné que lors de chaque promotion annuelle il y a 30 étudiants, l’utilisation de 30 souris permet à chaque étudiant de manipuler, réaliser les prélèvements et de préléver les organes d’un animal. Etant donné que l’on a 6 conditions différentes (5 voies d’administration de la formulation vaccinale et le groupe contrôle négatif), 5 souris seront utilisées par groupe.
Raffinement
Les souris seront observées dans les heures suivant l’administration de la formulation vaccinale (examen à 3h, 24h, 48h et 72h) pour vérifier qu’il n’y ait pas d’installation d’un état de prostration, l’absence de douleur au site d’administration par voie intradermique et sous-cutanée (difficulté à se déplacer, voire boitement, sensibilité importante au toucher des sites d’injection manifesté par un vif retrait de la patte).
Choix des espèces
La souris développe des réponses immunitaires très similaires aux humains. C’est la raison pour laquelle parmi les espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l'animal le mieux adapté pour évaluer les réponses humorale et cellulaire après vaccination. Les souris OF1 sont connues pour développer une forte réponse humorale et présentent donc un intérêt pour notre étude dans le cadre de ce TP. Les souris seront âgées de plus de 7 semaines pour s’assurer que le système immunitaire est mature.
Caractérisation de l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
75 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des sensibilisations cutanées hebdomadaires pendant six semaines, puis un gavage à l'éthanol trente minutes avant l'ingestion forcée de gluten, de façon à déclencher une réaction anaphylactique servant à étudier l'alcool comme cofacteur d'allergie. Certaines reçoivent aussi une puce implantée chirurgicalement dans l'abdomen, et le porteur décrit une baisse de température corporelle et des douleurs stomacales attendues. Il affirme que le modèle in vivo est "irremplaçable" pour reproduire la réaction allergique dans son ensemble.
Objectifs
Les allergies sont très répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ainsi, l’allergie est considérée comme un enjeu majeur de santé publique. Coûteuses, les allergies altèrent également la qualité de vie des patients. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. Les quelques études publiées sur la survenue de l’anaphylaxie révèlent une implication majeure de cofacteurs tels que l’effort, l’alcool et les anti-inflammatoires non stéroïdiens. Dans le cas de l’anaphylaxie induite par l’effort et dépendante du blé (cas le plus répandu), l’hypothèse soutenue repose sur une altération importante de la fonction gastro-intestinale notamment marquée par l’augmentation de la perméabilité intestinale lors de l’effort. Ces modifications favorisent ainsi le passage des allergènes dans le sang. Chez les sujets souffrant d’allergie d’origine alimentaire, la réaction et les symptômes sont alors amplifiés pouvant entraîner le décès du sujet. Il a également été admis que la réactivité IgE de certaines fractions protéiques diffère lors de la réaction anaphylactique. L’objectif de ce projet est d’établir le mécanisme impliqué dans l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé. L’alcool est considéré comme étant le deuxième cofacteur intervenant dans les réactions de l’allergie alimentaire, mais de manière surprenante les mécanismes moléculaires par lesquels l’alcool amplifie la réaction allergique n’ont jamais été élucidés. Le blé a été choisi car c’est un allergène commun et connu pour être impliqué dans la réaction allergique sévère et notamment en présence de cofacteurs. Plus spécifiquement, l’étude se focalisera sur le gluten, un complexe protéique du blé, composé des allergènes majeurs de la céréale. Aussi lors de cette étude, un examen approfondi de le barrière intestinale sera menée afin de déterminer les modifications dues au cofacteur. La symptomathie et le mécanisme de la réponse immunitaire lors de la réaction anaphylactique seront également caractérisés en détail.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme impliqué dans l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé. De ce fait, la réponse immunitaire précise de cette physiopathologie sera élucidée. Les effets de l’alcool au niveau de la barrière intestinale dans le cas d’une allergie alimentaire au blé seront déterminés. Aussi, une étude sur les fractions protéiques intervenant dans cette physiopathologie sera effectuée. A terme, ce projet a pour but de permettre une compréhension plus approfondie de l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé pour améliorer la prise en charge des sujets atteints. Des solutions préventives et thérapeutiques pourront être proposées.
Procédures
Lors de ce protocole, 5 groupes de 10 souris seront soumis à des sensibilisations percutanées hebdomadaires pendant 6 semaines. Les animaux seront alors anesthésiés tous les 7 jours pour la réalisation de la réalisation du geste. Aussi, sur ces souris, un total de 4 prélèvements de sang seront effectués avant le début des sensibilisations, après la 3ème sensibilisation, après la 4ème sensibilisation et après la 5ème sensibilisation. Elles seront effectuées 48h après les sensibilisations. Aussi, les souris subiront un gavage oral. Le groupe des 10 souris permettant d’évaluer l’impact du cofacteur seront gavées à l’éthanol 30 min avant le challenge au gluten. Quatorze souris de la procédure 1 subiront une chirurgie pour l’implantation de la puce Anipill (2 souris des groupes : CTL NA ; CTL SENS ; CTL CHAL et 4 souris des groupes : AA ; AA+EtOH). Elles seront anesthésiées par voie gazeuse, puis l’abdomen sera ouvert et une suture sera effectuée. Elles auront un suivi post opératoire.
Impact sur les animaux
Il est possible que les animaux aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués. En effet, lors des sensibilisations percutanées, une gêne peut être ressentie due à l’adjuvant utilisé (SDS) et à la répétabilité du geste (1 fois par semaine pendant 6 semaines). La phase de déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), peut également contribuer à des nuisances. Une baisse de la température corporelle des animaux est généralement observée. Aussi pour le groupe de souris étudiant l’effet du cofacteur dans l’allergie alimentaire au blé, la phase d’administration du cofacteur peut également être cause de stress et de gène au niveau de l’œsophage étant réalisé 30 minutes avant le challenge au gluten. Lors de cette étape, une baisse de la température corporelle pourra également être attendue ainsi qu’une baisse de l’état de santé général de l’animal. Les souris pourront aussi ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration d’alcool et de gluten. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le geste et peuvent persister pendant une trentaine de minutes.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, le cas de l’étude du mécanisme et de la symptomatie de la réponse allergique impliquant un co-facteur le modèle in vivo est irremplacable.
Réduction
Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur les études précédentes, le nombre de souris a été déterminé à 10 souris par groupe. Le nombre d’animaux réduit au minimum permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques de type test de Wilcoxon-Mann-Whitney ou test de Student. La valeur P-value de p
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d’analgésie et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi pour limiter l’inconfort lors de la prise de température, des puces seront placées chirurgicalement chez certaines souris (de 2 à 4 souris par groupe hormis pour le groupe contrôle alcool). Les mesures obtenues par les puces télémétriques Anipill seront comparées aux mesures prises par voie rectale pour évaluer la fiabilité des puces et pouvoir à termes favoriser l’utilisation des puces dans les protocoles. En parallèle de la procédure 1 et avant le challenge oral avec l’alcool, le groupe contrôle alcool réalisé sur un petit nombre de souris (n=10) déterminera exactement la dose d’éthanol la plus tolérable par les souris. Ainsi, cette procédure permet de limiter le nombre de groupe allergie alimentaire et cofacteur et de limiter des nuissances importantes sur les animaux.
Choix des espèces
Lors de cette étude, des souris femelles de souche Balb/c seront utilisées. Ces souches de souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l’expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. Les femelles Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et auront 5 semaines de vie au début des procédures. Cinq semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature. Pour les souris avec une implantation d’une puce type Anipill, l’intervention chirurgicale sera effectuée à 4 semaines de vie permettant aux souris d’avoir un poids corporel correct.
Caractérisation des séquences des IgG équines dans le but de définir les peptides caractéristiques des macromolécules bio-thérapeutiques ciblés lors du contrôle antidopage
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
30 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous maintenus en vie. Ils font l'objet de prélèvements de sang et d'urine quatre fois par an, sous contention légère, pour caractériser les séquences d'anticorps équins et affiner le contrôle antidopage. Le porteur décrit des nuisances limitées à un stress de contention et une douleur brève au point de piqûre. Il répète qu'il est "indispensable" de disposer de prélèvements de chevaux sains et qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale.
Objectifs
Grâce notamment aux progrès de l’immunopathologie, des substances thérapeutiques ciblées (biothérapeuthiques) ont été développées pour le traitement de différentes pathologies (cancers et maladies inflammatoires résistantes aux traitements conventionnels). Il s’agit principalement d’anticorps monoclonaux (Monoclonal AntiBody (MAB)) produits dans des conditions particulières et caractérisés par leur spécificité d’action. Ces biothérapeuthiques sont susceptibles d’être employés dans l’objectif d’augmenter les performances des chevaux, les classant dans la catégorie des substances interdites et les rendant ainsi sujet de recherche prioritaire. Des méthodes de dépistage et de confirmation des macromolécules bio-thérapeutiques dans les matrices équines (méthodes par LC/HRMS) sont en cours de développement au sein du laboratoire. La stratégie utilisée pour ces méthodes d’analyse est de cibler les séquences peptidiques humaines qui sont différentes des séquences peptidiques équines afin d’identifier dans les échantillons biologiques la présence de macromolécules bio-thérapeutiques éventuellement administrées. En effet, les mAbs thérapeutiques, séquencés par génie génétique, sont issus de séquences murines ou humaines. Par conséquent, il est possible de différencier de manière formelle dans des matrices équines, les anticorps naturellement produits par le cheval, des mAbs thérapeutiques éventuellement administrés. Ces séquences sont majoritairement référencées dans des banques de données numériques communiquant une information sur la structure de ces molécules. Bien que les bases de données numériques telles que Uniprot ou encore RefSeq contiennent des séquences protéiques bien annotées pour les chevaux, elles résultent bien souvent de l’annotation du génome ou du transcriptome d’un unique ou d’un faible nombre d’individus. Des peptides caractéristiques des IGg humaines ont été identifiés comme tels dans nos conditions analytiques dans 10% environ des échantillons de plasma équin testés pour le moment. À la suite des travaux déjà réalisés au laboratoire, Il est donc indispensable d’analyser les deux matrices biologiques sanguines et urinaires, prélevées à partir de différents chevaux connus, n’ayant jamais été exposés à aucun produit dopant ni aucun traitement autres que vermifuges et vaccinations obligatoires en dehors des médications d’urgence éventuelles, afin de déterminer les séquences peptidiques équines endogènes.
Bénéfices attendus
Les anticorps monoclonaux (mAbs) thérapeutiques, séquencés par génie génétique, sont issus de séquences murines ou humaines. Par conséquent, il est possible de différencier de manière formelle dans des matrices équines, les anticorps naturellement produits (endogènes) par le cheval, des mAbs thérapeutiques éventuellement administrés. Ces séquences sont majoritairement référencées dans des banques de données numériques communiquant une information sur la structure de ces molécules. Bien que les bases de données numériques contiennent des séquences protéiques bien annotées pour les chevaux, elles résultent bien souvent de l’annotation du génome ou du transcriptome d’un unique ou d’un faible nombre d’individus. Il est donc indispensable d’analyser les matrices biologiques sanguines et urinaires prélevées à partir de différents chevaux connus, n’ayant jamais été exposés à aucun produit dopant ni aucun traitement autres que vermifuges et vaccinations obligatoires en dehors des médications d’urgence éventuelles, afin de déterminer les séquences peptidiques équines endogènes. Le bénéfice attendu est donc l’identification de ces séquences peptidiques endogènes ce qui permettra de sélectionner avec la sécurité requise (en accord avec les critères d'identification) les fragements pour l'identification des mAbs exogènes.
Procédures
Des prélèvements de sang (2 tubes de 10 mL, 10 secondes) et d’urine seront prélevés à chaque fois (une fois par saison, soit 4 fois par an, un an étant la durée du projet). Chaque cheval est prélevé par du personnel expérimenté. Les urines sont prélevées par mixtion spontanée. Les volumes nécessaires sont petits (centaine de mL, 15 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances sont légères : un stress peut être induit par la contention ainsi qu’une douleur légère et brève au point de piqûre. Le nombre total de prélèvements par cheval est de 4 en tout pour le projet sur 1 an (un prélèvement chaque saison). Ces prélèvements sont réalisés par du personnel expérimenté.
Devenir
Tous les animaux sont maintenus en vie à l’issue de la procédure.
Remplacement
Pour mener à bien ce projet comme expliqué dans les objectifs du projet, le cheval étant l’animal cible, il est indispensable de disposer de prélèvements équins collectés chez des chevaux sains non traités. Il n’existe pas d’alternative non animale.
Réduction
Afin d’éviter toutes procédures expérimentales injustifiées, des échanges réguliers sont entretenus avec les collègues des différents laboratoires en Europe et dans le monde. Il a donc été vérifié que cette étude n’est pas conduite par une autre équipe. Comme mentionné dans la saisine, la fréquence déjà observée de la présence potentielle de peptides « humains » est de 0,1 (10%). Sur un effectif de 50 chevaux environ tous genres confondus, cela fait donc en théorie 5 prélèvements pour lesquels un signal pourrait être détecté. Lorsqu'on réalise un calcul de puissance statistique sur la base de la fréquence de 0,1 (loi binomiale car 2 évènements, soit absence soit présence). Pour une puissance de 95%, à un risque alpha de 0,05 afin de mettre en évidence une différence de plus ou moins 0,1 (soit mettre en évidence qu’il y a en fait 0 détection), la taille de l’effectif devrait être n=165. Le nombre d’échantillons demandé est très petit mais peut être suffisant pour cette première étape de validation.
Raffinement
Les chevaux évoluent dans un environnement adapté : ils sont hébergés en boxes individuels avec possibilité de contact avec leurs voisins via des grilles. Ils sont sortis quotidiennement à la demi-journée au paddock en herbe ou en sable (en fonction de la période de l’année et de la portance des sols). Les hongres de l’étude sont également au pré en groupe pendant les deux mois d’été. Du fourrage ad libitum leur est donné ainsi qu’une ration de concentrés adaptée aux besoins de chaque individu. Des pesées et notes d’état corporel étant effectuées mensuellement sur ces chevaux pour adapter leur ration. Les prélèvements sont réalisés par du personnels familier et qualifié avec une contention légère (tenue au licol).
Choix des espèces
Le projet concerne le développement d’une méthode de détection dans des prélèvements équins. Il est donc indispensable de disposer de prélèvements équins. Des animaux adultes seront utilisés (mâles et hongres, les femelles étant prélevées dans un autre établissement utilisateur)