Système immunitaire

3720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation est déclenchée pendant la gestation par injection, avec un risque de fausse-couche pouvant atteindre 40 %, puis la descendance subit une série de tests comportementaux dont un conditionnement de peur, pour étudier le rôle des microglies dans les troubles neurodéveloppementaux. Le porteur indique que ces tests provoquent un stress léger à modéré et prélève ensuite les structures cérébrales après mise à mort. Il conclut que les modèles in vitro ne reproduisent pas ces étapes du développement et qu'un recours à des animaux non-humains vivants est nécessaire.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux ont des causes multiples y compris environnementales. Un lien entre des épisodes inflammatoires pendant la gestation et une augmentation du risque de développer des troubles neurodeveloppementaux chez le descendant ont été démontrés. Récemment, le rôle des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans ces troubles a été mis en évidence chez la descendance mâle. Cependant, aucune donnée sur la descendance femelle, ni sur les troubles cognitifs de la descendance n'ont été générées. Ce projet se base sur un modèle d'inflammation gestationnelle couramment utilisé et maîtrisé par les porteurs du projet. L'objectif est d'étudier le rôle des microglies dans les troubles cognitifs neurodéveloppementaux chez le mâle et la femelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir le rôle des microglies dans la mise en place des troubles cognitifs à l'âge adulte des descendants mâles et femelles après inflammation gestationnelle. Cette étude permettra d'obtenir des données concrètes sur les deux sexes, ce qui n'est actuellement pas disponible mais également sur la sphère cognitive, très peu documentée à ce jour. L'approche par renouvellement des microglies permettra par ailleurs d'établir une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des troubles neurodéveloppementaux.

Procédures

Prélèvement de sang unique de quelques secondes sur animal vigile pour la présélection des femelles. Injection unique de quelques secondes durant la gestation pour la mère gestante. Tests comportementaux à la période juvénile quotidien durant en tout moins de 15 minutes afin d'évaluer les comportements émotionnels et le développement général (6 tests en juvénile), pouvant engender un léger stress chez l'animal. Tests comportementaux à l'âge adulte afin d'évaluer les capacités de mémoire et les comportements émotionnels ( 5 tests, un test par jour, espacés d'au moins un jour entre les tests, sur une période de 2 semaines– quelques minutes par test), pouvant engender un léger stress, voir modéré lors de l'apprentissage de peur conditionné chez l'animal.

Impact sur les animaux

Le modèle d'inflammation gestationnelle présente un risque de fausse-couche pouvant atteindre 40% sans impacter la survie des mères. Les mères gestantes injectées peuvent présenter une baisse de leur prise de poids sans signe majeurs de comportement de maladie. Les bébés mâles présentent généralement un poids inférieur par rapport aux contrôles. Aucune différence de poids n'est trouvée chez les femelles. Aucune mortalité après mise bas n'est documentée sur ce modèle. Les autres tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entraîner un léger stress notamment durant les deux tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules et/ou vésicules extracellulaires nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des phénotypes microgliaux au cours du développement nécessite des modèles non humains. L'étude des effets de l’inflammation maternelle ne peut se faire de manière fine chez l'homme et nécessite de fait l'utilisation d'animaux vivants. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser ces étapes du développement cérébral et la recherche bibliographique indique que la réponse inflammatoire correspondant à nos modèles n'est pas développée in vitro à ce jour. La proximité des signatures microgliales entre l'homme et l'animal permettra un transfert à l'homme à la suite de ce projet, ce qui reste notre priorité et notre objectif scientifique premier : comprendre chez l'homme le développement des microglies durant les phases développementales.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons utilisé le site Idele.fr permettant de calculer la taille des effectifs en prenant en compte le nombre de groupes, une significativité à 5%, une puissance statistique à 80% et des moyennes et écarts types fictifs basés sur nos expériences passées. Nous avons alors choisi un nombre permettant un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre de destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer sur une population cellulaire triée à partir de structures cérébrales. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques (buprénorphine à 0.1 mg/kg) les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Une anesthésie par injection intrapéritonéale de pentobarbital (Exagon 300 mg/kg, 100ul/10g de poids corporel) avec une prise en charge de la douleur préalable par utilisation de buprénorphine (0.1 mg/kg) 30 min avant sera utilisée pour réduire la douleur des animaux. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et l'accrétion de données nouvelles sur modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. De plus, les microglies de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun et permettent de conduire à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Les analyses seront conduites au cours de la période post-natale pour le comportement juvénile et à l'âge adulte pour l'évaluation comportementale et les études biologiques subséquentes.

352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'une instillation nasale sous anesthésie et reçoivent entre dix et treize injections, pour étudier l'origine de cellules neuronales pulmonaires apparaissant lors de l'infection. Le porteur indique que l'infection peut altérer l'état corporel, la respiration et le comportement en fin d'étude. Il conclut qu'un "organisme biologique complexe" est nécessaire et que la souris est le "modèle de choix" pour ce travail.

Objectifs

La tuberculose, causée par l’infection respiratoire de la bactérie Mycobacterium tuberculosis, est la deuxième pathologie infectieuse la plus meurtrière après la COVID-19. L’apparition de bactéries résistantes aux traitements antibiotiques existants rend essentiel la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Une population de cellules neuronales dans les poumons au cours de l’infection par Mycobacterium tuberculosis a récemment été découverte. Des cellules similaires à celles identifiées dans les poumons ont été décrites dans les tumeurs de prostate. Dans ce contexte, il a été montré que ces cellules neuronales dans les tumeurs dérivent de cellules souches provenant du cerveau ; elles sont associées à une plus grande mortalité des patients. Ces cellules neuronales sont donc de potentielles cibles thérapeutiques dans le cadre du cancer. L'objectif de ce projet est d’identifier l’origine et le rôle des cellules neuronales pulmonaires lors de l’infection par Mycobacterium tuberculosis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de : (i) identifier l’origine et le rôle de cellules neuronales pulmonaires induites par Mycobacterium tuberculosis ; (ii) mieux comprendre les interactions entre le système nerveux et le système immunitaire dans le poumon ; (iii) améliorer notre compréhension de la pathologie liée à la tuberculose ; et (iv) identifier potentiellement une nouvelle cible cellulaire pour une thérapie ciblée sur l'hôte pour traiter la tuberculose.

Procédures

Les souris recevront entre 10 et 13 injections sur animaux vigiles, d’une durée inférieure à 2 minutes par injection. Cela correspond à deux injections quotidiennes sur une période de 5 jours, puis à une injection quotidienne pendant 3 jours. Une pause de 2 jours sera effectuée entre ces deux périodes. Les souris seront également anesthésiées/analgésiées une fois pendant 1h pour être infectées par voie nasale (durée d’environ 30 secondes), et une fois pendant 5 minutes pour recevoir une autre injection d’une durée d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Un stress modéré éventuel pourra être engendré par la préhension et la contention afin de procéder aux injections (durée de la contention et de l’injection inférieure à 2 minutes par injection). Une sensibilité locale au niveau de la zone des injections pourrait être observée. Les principaux effets indésirables causés aux animaux résideront dans l'inflammation causée par les bactéries et la pathologie résultant de l'infection (aux points les plus tardifs). De légères altérations de l’aspect (état corporel, pelage) peuvent être observés en fin d’étude ainsi que des légères altérations de la respiration et du comportement (posture et mobilité).

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront mises à mort à la fin des procédures pour effectuer des prélèvements.

Remplacement

Afin de mieux comprendre l’interaction entre le système nerveux et le système immunitaire, un organisme biologique complexe doit être utilisé. Des échantillons de patients infectés et de primates non-humains ont d'abord été utilisé mais pour mieux comprendre les mécanismes impliqués, le projet nécessite l’utilisation de souris vivantes.

Réduction

L'expertise dans l’utilisation de modèles animaux d’infection par Mycobacterium tuberculosis et l’expérience des années précédentes ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les approches expérimentales permettent d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés.

Raffinement

Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les infections et les injections pouvant être douloureuses seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Les souris infectées par Mycobacterium tuberculosis seront monitorées quotidiennement par des personnes compétentes. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Pour notre projet visant à déterminer l’origine et le rôle de cellules neuronales pulmonaires dans l'infection tuberculose, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques et de la variabilité de résistance à la pathologie, et ii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines. A ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature pour étudier la réponse immunitaire à l’infection par Mycobacterium tuberculosis.

358 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Celles destinées aux analyses sont tuées pour prélever la rate, la moelle osseuse et les reins, tandis que les souris gardées pour l'entretien de la lignée restent en vie. Porteuses d'une mutation reproduisant un lupus humain, elles reçoivent des prélèvements sanguins mensuels sous anesthésie et peuvent développer une insuffisance rénale, des plaies cutanées et des douleurs articulaires. Le porteur affirme devoir recourir à un "modèle entier" pour étudier la production d'auto-anticorps dans les organes lymphoïdes.

Objectifs

Ce projet repose sur l'étude d'une mutation décrite chez une patiente atteinte d'un lupus érythémateux systémique. Un modèle murin reproduisant cette mutation a été récemment créé sur fond C57BL/6J, et décrit dans la littérature. Cette souris présente une survie réduite, une autoimmunité avec une augmentation des lymphocytes B et une production d’auto-anticorps (notamment des anticorps anti-nucléaires). Nous souhaitons étudier en détail le phénotype des lymphocytes B à l’origine de la production des autoanticorps pathogènes. Ce projet n'a pas fait l’objet d'une évaluation par d'autres instances mais repose sur une question scientifique non résolue à ce jour et dont les réponses pourraient bénéficier aux patients.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de mieux comprendre comment cette mutation génétique peut conduire à une perte de contrôle de la production d’autoanticorps dans une maladie autoimmune sévère telle que le lupus. Les TLR sont des récepteurs de l’immunité qui ont été impliqués dans la maladie lupique dans la littérature, mais les mécanismes de leur implication sont encore mal connus. Ainsi ces résultats pourraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients, à moyen/long terme.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins mensuels, sous anesthésie. Des prélèvements (rate, moelle osseuse, reins) seront effectués sur les animaux en fin de procédure après mise à mort. La protéinurie sera mesurée sur un prélèvement d'urine toutes les semaines, pour l'évaluation des points limites.

Impact sur les animaux

Les souris étudiées dans ce projet développent une maladie proche du lupus humain, qui peut causer une perte d'appétit et donc une perte de poids, une insuffissance rénale matérialisée par une augmentation de la protéinurie mesurable à l'aide de bandelettes urinaire. De plus, les animaux peuvent développer une adénopathie associée à une dermite, entrainant une dépilation et le développement de plaies. Le lupus peut également se matérialiser par des douleurs articulaires induisant des difficultés de déplacement et une mise à l'écart du/des individus, un dos voussé. Les prélèvements sanguins peuvent potentiellement générer une anémie (paleur des muqueuses), une respiration plus rapide ainsi qu'une plaie éventuelle au site de prélèvement. Les nuisances liées aux anesthésies répétées sont inhérentes à toute anesthésie (l'anesthésie est cependant ici de courte durée pour un prélèvement sanguin). L'utilisation de l'isoflurane pour l'anesthésie présente un aspect aversif pour la souris, cependant l'anesthésie génère un stress moins important que de réaliser le prélèvement sur un animal vigile.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle entier afin d'étudier les réponses immunes et la production d'autoanticorps qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été décidée. La pertinence des résultats sera évaluée à l'aide de tests statistiques multiparamétriques de type Anova nécessitant l'analyse de groupes de 10 souris minimum pour chaque question posée. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d'optimiser l'utilisation des différentes portées, nous utiliserons les mâles et les femelles de chaque portée générée.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés dans une animalerie à statut sanitaire propre permettant déviter une infection. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, décrite pour chaque procédure, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites spécifiques.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'autoimmunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations auront un âge de 3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 8 mois (âge moyen pour lequel les points limites apparaissent).

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans le coussinet adipeux mammaire sous anesthésie, puis des injections répétées trois fois par semaine pendant un mois d'un pro-médicament expérimental activé par les espèces réactives de l'oxygène. Le porteur ne détaille guère les nuisances liées à la croissance tumorale au-delà de la mention des greffes, et prévoit des points limites précoces. Il affirme qu'il est "absolument nécessaire" d'utiliser un modèle in vivo, le système immunitaire étant selon lui impossible à reconstituer in vitro.

Objectifs

Le mode d'action de la majorité des agents chimiothérapeutiques, qui ont été cliniquement approuvés pour le traitement de cancers hématologiques, reposent sur un ciblage rapide des cellules en croissance. Cependant, en dehors des cellules cancéreuses, certains types de cellules non malignes présentent également une telle propriété. Par conséquent, bien que de grands progrès aient été réalisés dans ce domaine au cours des dernières décennies, la spécificité des chimiothérapies est encore faible. Ce problème peut être approché en utilisant des médicaments anti-tumoraux ciblés. Cependant, les cancers qui dépendent d’un seul récepteur ou enzyme sont rares. Un ciblage plus robuste peut être potentiellement atteint par l’activation de pro-médicaments dans le microenvironnement spécifique du cancer. Il a été démontré que la majorité des cellules cancéreuses surproduisent les ROS (espèces réactives de l’oxygène) alors que dans les cas des cellules non-malignes, leur concentration est extrêmement faible. Étant donné que la production élevée de ROS semble être une caractéristique générale du cancer,, les pro-médicaments activés par les ROS sont potentiellement applicables pour le traitement de nombreux types de cancer différents. Nous nous intéressons particulièrement à un pro-médicament, dérivé du N-alkylaminoferrocene. Cette molécule induit une mortalité cellulaire via la perturbation des lysosomes, l’augmentation de la production de ROS, l’arrêt du cycle cellulaire en phase G0/G1 et d'autres mécanismes. Le traitement avec cette molécule chez la souris greffée nous permettra de confirmer l’effet anti-tumoral constaté in vitro. L’analyse des tumeurs (microenvironnement) après traitement nous informera sur la capacité de cette molécule de stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses et donc à rétablir une immunosurveillance défaillante caractéristique des tumeurs.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à une diminution de la croissance tumorale après traitement avec le médicament testé en association aux traitements conventionnels anti-tumoraux comparée aux traitements conventionnels seuls. Cela permettra de proposer de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux aux patients par la suite.

Procédures

Les animaux seront soumis à une greffe dans dans les coussinets adipeux mammaires (animal sous anesthésie générale) une fois (durée 15 minutes) puis à des injections intra-peritonéales (anesthésie locale), 3 fois par semaine pendant 1 mois (durée

Impact sur les animaux

Greffes de tumeurs en sous-cutané.

Devenir

Pour chaque procédure, les animaux seront euthanasiés à la fin pour analyses.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo. Nous avons choisi le modèle souris car notre projet s'applique à étudier l'implication du système immunitaire dans la lutte anti cancéreuse chez le mammifère. La souris est le mammifère le plus utilisé en expérimentation animale car suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, facile à manipuler et suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Ceci a été confirmé par des calculs de puissance (puissance à de 80% et risque alpha à 5%). Pour cette expérience, on peut attendre une réduction de 20% de la taille de la tumeur dans les groupes traités par rapport au contrôle, avec une déviation standard d’environ 17%. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux témoins. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale seront des tests longitudinaux de suivi individuel permettant d'augmenter la puissance et de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, au moins une fois par semaine et avant euthanasie lors de l’expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation (évaluation des experssions faciales), et examen clinique. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : De par sa petite taille, la souris est un animal facile à manipuler et il est possible d’en héberger un nombre relativement important. C’est aussi un animal suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales. La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte (6-9 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).

400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux incisions dans le dos permettent de glisser sous la peau un biomatériau à base d'acide polylactique, dont on veut évaluer la biocompatibilité en vue d'applications de régénération osseuse dentaire chez l'humain. Le porteur indique une inflammation de la zone opérée, une possible désunion de la plaie et un risque d'infection inférieur à 10 %, et précise que les prélèvements de peau ne sont faits qu'après la mise à mort. Il affirme qu'il "n'existe pas d'alternative" ni de méthode in silico pour vérifier la biocompatibilité dans un organisme vivant.

Objectifs

La pose d'un implant dentaire est généralement entravée par un volume osseux limité au niveau de l'os de la machoire. Afin d'augmenter ce volume osseux et assurer la pose efficace de l'implant, la greffe osseuse , technique de référence, est utilisée. Cependant cette technique présente des inconvénients. La nécessité de procéder à deux actes chirurgicaux (prélèvement et greffe), la faible quantité d'os disponible lors du prélèvement ainsi que les suites post-opératoires et les complications potentielles nous pousse à l'innovation et au développement de nouvelles techniques de régénération osseuse moins invasives. La régénération osseuse guidée (ROG) utilise des matériaux sous forme de membranes qui ont pour rôle de séparer le défaut osseux à régénérer des tissus mous périphériques (peau, muqueuse et muscle). Ces membranes barrières vont donc empêcher la colonisation du défaut osseux par ces tissus indésirables et favoriser la prolifération et la migration des cellules d'origine osseuse dans le défaut osseux. De nombreuses membranes sont actuellement commercialisées, mais leur manque de propriétés régénératrices, leur manque de tenue mécanique ainsi que leur résorption rapide pousse la recherche à dévelloper de nouvelles générations de membranes afin d'améliorer leurs propriétés. Ce projet de recherche vise (1) à étudier la compatibilité et (2) à évaluer la dégradation de nouvelles membranes fabriquées au laboratoire. Les études in vitro préalablements effectuées ont permis de sélectionner des membranes avec un potentiel thérapeutique important (dégradation, régénératrice et antimicrobien). Leur innocuité a été évaluée, mais les études in vitro ne peuvent modéliser la complexité des systèmes physiologiques mis en place lors de la réponse inflammatoire et lors de la cicatrisation in vivo. Le recours a un modèle animal est donc un préalable préclinique essentiel pour envisager une plausible application en clinique humaine. Pour ce projet, nous choisissons de travailler avec le rat, car l'enssemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font de cet animal, le modèle préférentiel pour mener à bien cette étude. Nous étudierons la biocompatibilité et la résorption de différentes membranes fabriquées à partir de polymères secondairement fonctionnalisées. Ces membranes seront implantées sous la peau dans le dos des animaux.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet à court terme sont : (1) la vérification de la bonne tolérance biologique et tissulaire (absence de réaction inflammatoire exacerbée et absence de fibrose cicatricielle au contact des membranes, (2) le développement de biomatériaux à dégradation tissulaire contrôlée pour une utilisation en ROG. Les bénéfices attendus à long terme sont de pouvoir proposer en clinique chez l’homme, des dispositifs médicaux innovants doués de propriétés cicatrisantes, ossifiantes, antibactériennes et biomécaniques améliorées par rapport aux dispositifs médicaux actuellement disponibles sur le marché dans le but de répondre à des impératifs cliniques élargis et adaptées à des situations pathologiques spécifiques (médecine régénératrice personnalisée). La réalisation de ce projet d’expérimentation animale sur le rat permettrait de confirmer la pertinence de la stratégie thérapeutique de vouloir améliorer les propriétés de membranes actuellement commercialisées destinées à la ROG.

Procédures

Les animaux seront sousmis à une seule procédure chirurgicale consistant à réaliser 2 incisions dans le dos, une de chaque côté de 1,5 - 2 cm afin de glisser sous la peau un biomatériau. La durée de la procédure chirurgicale n'excédera pas 5 minutes. Les analyses thermique seront pratiquées sur des animaux anesthésiés. Les prélèvements tissulaires (peau) ne seront réalisés qu'après la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues d'après la littérature occasionnées lors de cette procédure sont : une inflammation aigüe et subaigüe de la région opérée suite au décollement sous-cutanée et la mise place du biomatériau, une désunion des berges de la plaie et un risque d'infection de la plaie cutanée (

Devenir

A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront anesthésiés puis mis à mort afin de pouvoir procéder au prélèvements tissulaires et biologiques sans souffrance.

Remplacement

Les études in vitro permettent d'évaluer la cytotoxicité et la réponse inflammatoire induites par les biomatériaux. Pour une utilisation en clinique humaine la biocompatibilité d’un dispositif médical (DM) candidat doit être vérifiée par une implantation dans un organisme vivant. A ce jour il n’existe pas d’alternative ni de méthode in silico permettant de répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Nous utiliserons au minimum 6 rats et au maximun 10 rats par lot, nombre calculé pour permettre d'obtenir des résultats scientifiques probants et staristiquement significatifs. Dans l'optique d'une réduction maximale du nombre d'animaux à inclure, des analyses intermédiaires à 6 et 8 animaux/lot seront réalisées avant d'augmenter le nombre d'individus le cas échéant afin d'obtenir la puissance statistique nécessaire (Stratégie go - no go).

Raffinement

A leur arrivée à l'animalerie les rats subiront une phase d'acclimatation de 14 jours aux conditions d'hébergement du laboratoire. Les animaux seront hébergés dans des cages plastiques adaptées à la taille des animaux (surface : 800 cm2 et hauteur : 18 cm) dans un environnement monitoré (20-24 °C ; cycle 12h lumière - 12h obscurité) avec un nombre de 2 à 3 animaux par cage (en respectant une surface minimum de 250 cm2 par animal). La nourriture et l'eau seront mis à disposition ad libitum et la litière sera changée régulièrement. Les cages seront enrichies de tubes en carton avec lesquels les animaux construiront un nid et du sizzle-dry kraft. Après la procédure chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages individuelles jusqu'au retrait des fils (dépose des sutures prévues à 7 jours post-opératoires pour les lots concernés). Une analgésie préventive par injection de buprénorphine (0.05 mg/kg, en sous-cutanée dans la région abdominale) en post-opératoire immédiat (avant réveil des animaux) sera pratiquée et poursuivie pendant 72h à la demande en fonction du obtenus à partir d'une grille d'évaluation de la souffrance et du Bien-être animal reconnue (Morton et Griffiths, 1985). Une surveillance clinique biquotidienne au minimum durant les 4 premiers jours post-opératoires sera mise en place. A partir du 5ème jour, une surveillance uni-quotidienne pourra être envisagée si le score clinique le permet (score inférieur ou égal à 3), dans le cas contraire une surveillance biquotidienne sera maintenue jusqu'à l'obtention d'un score inférieur ou égal à 3. En cas d'atteinte d'un niveau défini de points limites, la mise à mort de l'animal sera anticipée. Après la dépose des fils, les animaux seront réunis par 2 ou 3 par cage jusqu'à la fin de l'expérimentation afin de garantir leur bien être et leur vie sociale.

Choix des espèces

Le modèle d’implantation sous-cutanée est considéré comme une référence pour évaluer la réponse biologique (inflammation, cicatrisation et remodelage) vis-à-vis d’un biomatériau. Différentes espèces animales peuvent être utilisées mais le rat reste l’espèce de référence de par sa taille (en comparaison de la souris) favorisant une acte opératoire reproductible et rapide. Le rat immunocompétent est choisi car il permettra d’apporter une réponse vis-à-vis de la réaction immunitaire induite par l’implantations des membranes en PLA fonctionnalisées. Plusieurs souches de rats ont été utilisées dans la littérature, notamment les rats Sprague-Dawley et Wistar. L’animalerie dispose de l’agrément pour l’espèce et la souche choisie (Wistar). Les animaux utilisés dans cette étude sont des rats adultes âgés de 8 à 12 semaines pesant entre 200-300g. Des rats juvéniles ne seront pas adaptés pour l’implantations des différentes membranes (1cm x 1cm). Généralement, des rats âgés de 8 à 12 semaines sont habituellement utilisés dans la littérature.

4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. Le porteur reconnaît que l'infection peut causer des douleurs et qu'une tumeur à croissance rapide peut obstruer l'urètre. Il décrit ces travaux comme visant une "meilleure compréhension" des mécanismes immunitaires et affirme le recours à l'animal "absolument nécessaire", faute d'alternative.

Objectifs

Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.

Bénéfices attendus

Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.

Procédures

les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.

Impact sur les animaux

Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).

Réduction

Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.

Raffinement

Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).

Choix des espèces

Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des plaies cutanées par découpe à l'emporte-pièce ou par compression à l'aimant, pour étudier le rôle d'une "protéine X" dans la cicatrisation et la fonction vasculaire. Le porteur indique qu'aucun anti-inflammatoire ne sera administré pendant la cicatrisation "car cela pourrait modifier les résultats", une douleur modérée pouvant persister plusieurs jours. Il décrit le passage par l'animal comme "indispensable" pour observer ces mécanismes dans un "organisme entier".

Objectifs

Des candidats médicaments sont en cours de développement pour traiter certains défauts de cicatrisation tels que les plaies des grands brûlés, les opacités cornéennes ou les conséquences déletères d'un infarctus au niveau cardiaque ou d'une infection au niveau hépatique ou pulmonaire. Toutes ces pathologies peuvent s'avérer mortelles ou très invalidantes et représentent un coût sociétal très important. Pour le moment, les candidats médicaments se fixent principalement sur la Protéine Y bien caractérisée mais aussi sur une protéine très semblable, appelée Protéine X, dont les fonctions sont mal connues. Pour mieux anticiper les effets secondaires des candidats médicaments et déterminer s'il faut les améliorer pour qu'ils ne reconnaissent que la Protéine X ou la Protéine Y, il est crucial de mieux comprendre les rôles précis de la Protéine X chez les mammifères. La peau et les vaisseaux sanguins seront investigués en analysant particulièrement le rôle de la Protéine X dans la cicatrisation de la peau ainsi que dans la capacité des vaisseaux sanguins à répondre aux agents qui régulent la pression artérielle ou à laisser passer des molécules dans les tissus.

Bénéfices attendus

Les expériences ne nécessitant pas de recours aux animaux ont déjà été réalisées. Ceci a permis d'identifier des mécanismes d'action possibles pour la Protéine X. L'étape suivante consiste à vérifier ce qui se passe dans un organisme entier et à confirmer les données préliminaires déjà obtenues concernant l’effet de l’absence de la Protéine X sur l’organisation de la peau normale et cicatricielle ainsi que sur la fonction des vaisseaux sanguins. Ces éléments seront étudiés indépendamment puis conjointement dans un modèle de plaie où l’apport en oxygène et nutriments est déficient (type escarre). A plus long terme, les informations collectées lors de ces expériences serviront à mieux comprendre les fonctions de la Protéine X dans la peau et à évaluer s’il est plutôt bénéfique ou délétère que les candidats médicaments reconnaissent à la fois la Protéine X et la Protéine Y. Par exemple, s'il s'avère que la Protéine X est nécessaire à la fonction vasculaire, il faudra développer des candidats médicaments qui n'affectent que la Protéine Y. Les résultats obtenus seront ainsi très importants pour optimiser leurs propriétés.

Procédures

Il n'est pas prévu de prélèvements sur animaux vigiles. Cependant, une injection de colorant (Bleu EVANS) est programmée sur certains animaux pour identifier des "fuites" éventuelles au niveau des vaisseaux sanguins. Une série d'animaux sera également soumise à des plaies réalisées soit à l'aide de "punchs" et ciseaux fins (6 mm de diamètre; 1 seule induction de plaies) soit par application de 2 aimants de 8 mm de diamètre pendant 3 fois 3h à 24h d'intervalle (plaies de compression). Les autres interventions auxquelles seront soumis les animaux sont non invasives et indolores.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en Protéine X sont viables, fertiles et ne semblent pas présenter de phénotype dommageable, en conditions normales, susceptible d’induire de la souffrance ou d’affecter leur comportement. La procédure visant à évaluer la fonctionnalité vasculaire utilise des techniques non invasives et indolores (laser doppler) réalisées sous anesthésie générale pour diminuer le stress des animaux. L’injection de bleu EVANS dans la veine caudale en fin de procédure peut cependant induire un stress momentané. L’induction des plaies d’excision et de compression peut aussi causer douleur et stress chez l’animal. Elles sont réalisées sous isoflurane pour diminuer ces effets et un produit analgésique sera administré avant l'induction des plaies d'excision. Une douleur modérée peut persister après l'induction de la plaie pendant quelques jours. Il n’est pas prévu d’administrer de produit anti-inflammatoire pendant l’induction des plaies ou pendant la cicatrisation car cela pourrait modifier les résultats de notre étude. L’apparition d’autres effets indésirables (perte de poids, mobilité réduite, comportement anormal etc) sera surveillée tous les 2 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures car des prélèvements seront réalisés pour étudier la peau et ses différents composants cellulaires.

Remplacement

Les modèles in vitro (protéines recombinantes) et cellulaires ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées qui nécessitent des systèmes intégrés multi-cellulaires et multi-organes. Il n’existe par exemple pas de modèle de peau reconstruite intégrant toutes les composantes cellulaires nécessaires aux études de physiologie vasculaire ou de cicatrisation. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures de fonctionnalité vasculaire, il est possible de tester deux agents vaso-dilatateurs différents sur les mêmes animaux à 7 jours d’intervalle minimum. Les mêmes animaux peuvent donc être utilisés pour ces deux mesures qui sont également couplées à chaque fois à au moins une autre mesure non invasive (réponse à la pression ou perfusion cutanée). Avant la mise à mort des animaux en fin de procédure, il est également prévu de faire une injection de bleu EVANS qui permettra de mettre en évidence une augmentation éventuelle de perméabilité vasculaire au niveau de la peau. Dans les études de cicatrisation, deux plaies sont réalisées sur le même animal pour diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Les 5 temps de mise à mort ont été soigneusement sélectionnés en fonction de la connaissance actuelle des modèles pour couvrir toutes les phases de la cicatrisation et évaluer précisément le rôle de la Protéine X dans chacune de ces phases.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée (au moins trois fois par semaine). Des points limites (perte de poids supérieure à 20% du poids maximal atteint par la souris, état de prostration de l’animal, plaies infectées) ont été définis qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal. Les animaux utilisés pour l’étude de fonctionnalité vasculaire ne subiront pas plus de deux anesthésies générales chacun. Le nombre de souris par cage sera compris entre 3 et 5, suivant la taille de la cage et en accord avec la réglementation en vigueur. Après induction des plaies ou en cas de comportement agressif d’un animal, les animaux seront isolés dans des cages individuelles pour éviter le risque de sur-blessure. Ces cages possèdent des séparations transparentes pour permettre aux animaux de continuer à communiquer et diminuer le stress lié à l’isolement. Les cages seront également enrichies avec des boules d’ouate, des bâtonnets de bois, du carton etc. Les plaies seront protégées par des pansements pour éviter les risques d'infection. Tous les changements de pansements (et les photographies permettant de suivre la fermeture des plaies) seront réalisés sous anesthésie gazeuse sur table chauffante.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du tissu d'intérêt (peau) très semblable au tissu humain et les étapes clés du processus de cicatrisation sont conservées (phase inflammatoire et vasculaire, phase de réparation, phase de remodelage). Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 8-16 semaines pour rester cohérent avec les expériences préliminaires qui ont été réalisées.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées comme donneuses de moelle osseuse et 720 transférées vers un autre protocole de tests comportementaux. Rendues obèses par un régime gras pendant 18 semaines, elles reçoivent du busulfan induisant une myélodysplasie, une greffe de moelle et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle de la protéine DNase1L3 dans le syndrome métabolique et la dépression liés à l'obésité. Le porteur décrit la perte de poids et l'anémie post-busulfan comme "transitoires". Les 720 survivantes prolongeront l'expérimentation dans une animalerie dédiée aux tests d'anxiété et de dépression, sous une autre autorisation.

Objectifs

Nous avons observé que la déficience en DNase1L3 rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité. Un de nos objectif courant est de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires de la DNase1L3 dans le contexte de l’obésité. De plus, l’obésité induit des troubles neuropsychiatriques comme la dépression. Un deuxième objectif de notre travail est d’évaluer l’impact de la déficience en DNase1L3 sur la survenue des syndromes neuropsychiatrique induits pas l’obésité. Tous les concepts, incluant l’état de l’art, le rationnel de notre étude ainsi que sa méthodologie sont décrits dans la section suivante.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence le rôle de la DNase1L3 dans la régulation de l’inflammation chronique induite par l’obésité ainsi que ces mécanismes d’actions. De plus, il nous permettra de déterminer si une dérégulation de la DNase1L3 peut contribuer aux troubles neuropsychiatriques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité qui est à l’origine du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques.

Procédures

Les souris sont soumises à un régime riche normal et riche en graisse durant 18 semaines. Une myélodysplasie est induite par le Busulfan durant 4 jours. Une reconstitution des souris myélodysplasique est faite par transfer de cellules de moelle osseuses . La reconstitution se fait par une seule injection et a lieu en 1 mois. Des prises de sang retroorbitaires sont effectué toutes les six semaines. Un test de tolérance au glucose par injection i.p de glucose et prise de sang a la base de la queue est effectué toutes les 6 semaines aussi.

Impact sur les animaux

1. Placer les animaux sur un régime riche dans le temps imparti pour l’expérimentation augmente leur poids d’une manière considérable sans causer une altération significative de l’état général de l’animal. 2. La génération de souris chimérique nécessite l’induction d’une myélodysplasie par un traitement aux Busulfan. Ce traitement induit une perte de poids

Devenir

Procédure 1 : 288 animaux sont inclus dans cette procédure. 48 animaux sont utilisés en tant que donneur de moelle osseuse et sont euthanasiés par dislocation cervicale a l’issue de cette procédure. Le prélèvement de la moelle osseuse ne peut être effectue que sur des animaux morts. Le reste des animaux (240), constituent les animaux chimériques receveur de moelle osseuse qui seront gardés en vie et donc inclus dans les procédures qui suivent. Procédure 2. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un régime normal (360) et un régime riche en graisse (360). Tous les animaux de cette procédure sont gardés en vie en passent dans la procédure 3. Procédure 3. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à des prises de sang. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie en passent dans la procédure 4. Procédure 4. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un test de tolérance au glucose. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie et transférés dans l’animalerie NutriNeuro ou ils seront soumis à des tests comportementaux. Une autre DAP a été soumise pour cela.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologiques observés chez l'homme, peut apporter la preuve du rôle de la DNase1L3 dans le développements d’un syndrome métabolique et dans la régulation des troubles neuropsychiatriques qui découlent de l’inflammation induite par l’obésité. De plus les études comportementales afin d’évaluer le développent de l’anxiété et des états dépressifs ne peuvent être réalisé que sur des animaux vivants. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro ou ex vivo, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité de la régulation des états mentaux par les processus inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Afin de réduire le nombre d’animaux nous avons également optimisé leur utilisation. En effet sur les mêmes animaux nous allons à la fois évaluer la survenue du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques. Cela nous permet de réduire l’utilisation des animaux d’un facteur deux.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bienêtre (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang retro-orbitaires sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort de cette procédure. De plus, les prises de sang réalisées à l’extrémité de la queue incluent une anesthésie locale pour réduire la douleur qui peut être induite par cette procédure.

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Les souris déficientes pour la DNase1L3, DNase1, TLR9 et IFNAR sont uniquement disponibles dans cette espèce et sur ce fond génétique. De plus, elles sont très sensibles aux régimes alimentaires pour l'induction de l’obésité (Surwit et al., Diabetes, 1988). Comme l’Homme, elles développent une obésité, un diabète de type II, une stéatose hépatique et des troubles neuropsychiatriques (dépression et anxiété) un fois exposées à un régime riche en graisse, alors qu’avec une alimentation standard, elles restent minces et ne développent pas de problèmes métaboliques ni de troubles neuropsychiatriques. En plus des souris congénique B6/SJL (pep boy, CD45.1) seront utilisées pour réaliser des chimères de moelle osseuse. Leur utilisation est necessaire afin d'évaluer l'efficacité de nos greffes qui est rendu possible par l'analyse de l'expression du variant de la molécule CD45. Les souris seront nourries dès l’âge de 12 semaines par HFD. L’exposition des souris C57BL/6 de cet age à un régime HFD ad libidum conduit à une obésité et au développent du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques assez proche de ceux se développant chez l’homme. Les premières manifestations apparaissent environ 6 semaines après l’introduction du régime HFD mais l’hyperglycémie, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique ainsi que les troubles neuropsychiatriques sont observées vers 18 semaines post régime HFD (Surwit et al. ; Diabetes, 1988).