Système immunitaire

8 385 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Zika par injection, certaines par voie intracrânienne sous anesthésie, puis exposées sous anesthésie à des piqûres de moustiques, et peuvent perdre jusqu'à 30 % de leur poids avec apathie et paralysie partielle. L'objectif est d'étudier le rôle de la génétique de l'hôte dans l'infection et la transmission du virus, les souris étant tuées car porteuses d'un pathogène dangereux pour l'humain. Le porteur affirme que ces phénomènes se développent au niveau de l'"organisme entier" et que la souris permet des analyses génétiques "puissantes".

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle de la composition génétique de l’individu dans sa sensibilité à l’infection par le virus Zika. En particulier, la transmission du virus de la mère au fœtus, l’apparition de troubles neurocomportementaux secondaires à l’infection et la transmission du virus Zika entre l’hôte et le moustique restent à élucider. Plus spécifiquement, ce projet prévu pour les 5 années à venir, a pour objectif de répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Quels sont les mécanismes responsables des différences de lésions cérébrales induites par l’infection par le virus Zika ? 2. Quels sont les mécanismes de transmission du virus Zika de la mère au fœtus ? 3. Quelles sont les conséquences neurocomportementales de l’infection par le virus Zika ? 4. Quelle est la variation de capacité à s’infecter (« infectabilité ») des souris en fonction de la souche de virus Zika ? 5. Quelle est la variation d’infectabilité des moustiques en fonction de la souche de virus Zika ? 6. Quelle est la variation d’infectabilité des souris en fonction de la souche de moustique ? 7. Quelle est l'influence du fond génétique des souris dans chacune des questions précédentes ? 8. Quels sont les variants génétiques de l’hôte responsables des différences de sensibilité chez la souris ?

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra de comprendre l’influence de la composition génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection et dans l’infectivité par le virus Zika. La caractérisation poussée de l’infection par le virus Zika dans des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes responsables de ces différences de sensibilité et d’infectivité. A plus long terme, ce projet permettra de faire progresser des connaissances fondamentales importantes pour comprendre le développement de la maladie et les mécanismes de transmission des maladies vectorielles. Il s'agit d'enjeux majeurs au regard du potentiel de réémergence du virus Zika au niveau mondial et des conséquences neurologiques dramatiques causées par cette infection.

Procédures

Des biopsies de queue seront effectuées sur certaines souris pour connaitre leur statut génétique, une fois au moment du sevrage pour une durée de quelques secondes. Les souris recevront une injection d’anticorps par voie intrapéritonéale une fois pour une durée de quelques secondes. La majeure partie des souris seront infectées avec le virus Zika par une injection (intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou intradermique) une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec le virus Zika par une injection intra-crâniale sous analgésie et anesthésie générale d’une durée de 15 minutes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 5 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. es tests d’évaluation du comportement non invasifs seront effectués sur certaines souris avec une durée de moins de 40 minutes et au maximum 2 fois par semaine (1 test par séance). Des repas sanguins de moustiques seront effectués sur certaines souris pour évaluer la transmission du virus entre la souris et le moustique et vice versa, sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes, au maximum 5 fois sur 7 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Le projet s'articule autour de 5 procédures de sévérité modérée. Dans la plupart des cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante pouvant atteindre 30%, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie partielle. Des souris feront l’objet de tests d’évaluation du comportement non invasifs qui pourront générer un stress limité et transitoire (quelques heures). Des souris seront anesthésiées et soumises aux repas sanguins de moustiques durant la période de virémie qui est quasiment asymptomatique. Elles seront mises à mort avant l'apparition des symptômes induits par l'infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par un pathogène dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l'organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) voire à l’interface entre deux organismes indépendants (transmission du virus entre la mère et le fœtus ou entre la souris et le moustique) et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. De plus, notre expérience sur ce virus montre que les résultats obtenus avec des cultures de cellules ne prédisent pas intégralement ce qui se passe dans un organisme entier. Les modèles animaux utilisables sont peu nombreux (primates non-humains, cobayes, hamsters et souris). Ce projet utilisera des souris car cette espèce permet de réaliser des études génétiques puissantes à l'aide de lignées génétiquement modifiées ou de lignées génétiquement très variées.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience reposera sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. L'évaluation de la charge virale dans une lignée ne requiert pas plus de 5 souris du même sexe d'après notre expérience. L’évaluation du comportement des souris requiert des nombres d’animaux un peu plus grands (10 à 12 souris du même sexe) du fait d’une variabilité intra-groupe plus importante. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Les analyses incluront des groupes d’animaux des 2 sexes sauf lorsqu'on sait déjà qu'il n'y a pas de différence dans le modèle utilisé. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure.

Raffinement

Les inoculations par voie systémique et les prélèvements de sang entraînent une douleur passagère et légère qui ne justifie pas d'anesthésie ou d'analgésie. L’inoculation par voie intra-crâniale sera réalisée sous anesthésie générale et sous analgésie générale. Les repas sanguins seront effectués sur des souris anesthésiées. Les souris seront exposées aux moustiques sur un flanc, en alternant flanc gauche et flanc droit d'un repas sanguin au suivant. Après chaque repas sanguin, les souris recevront une injection de soluté de réhydratation isotonique pour compenser la perte volémique. Dans la majorité des cas, l'infection par le virus Zika se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Les animaux infectés seront toutefois surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique critique (précisée dans chaque procédure) avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire et après les repas sanguins de moustiques.

Choix des espèces

1. Nous disposons de bons modèles d'infection par le virus Zika chez la souris, y compris pour étudier la transmission entre souris et moustique (espèce compatible avec des repas sanguins répétés). 2. La souris est la seule espèce permettant de réaliser des analyses génétiques du niveau requis. 3. Des résultats antérieurs avec le virus Zika montrent la pertinence de cette espèce comme modèle animal d'infection par les flavivirus transmis par des moustiques et pour les analyses génétiques. 4. La dangerosité du virus Zika impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable dans cette espèce et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des jeunes adultes (5-6 semaines) ou adultes (6-12 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience. Nous utiliserons (détails dans les procédures 1 et 3) des souris jeunes de 1-3 semaines qui permettront d’étudier les effets de l’infection par le virus Zika sur le développement post-natal du cerveau. Nous utiliserons (détails dans la procédure 1) des fœtus entre 15 et 17 jours de développement pour étudier le syndrome congénital causé par le virus Zika.

1440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées ou une injection intraveineuse de lymphocytes, cette dernière pouvant provoquer une détresse respiratoire ou neurologique, avant d'être tuées pour prélever leur tissu adipeux brun. L'objet du projet est d'étudier le rôle de sous-populations de macrophages dans la production de chaleur par ce tissu. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal et qu'"aucune autre espèce" que la souris ne peut être utilisée.

Objectifs

Chez les mammifères deux types de tissu adipeux ont été identifiés : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun. Ces deux tissus ont des fonctions très distinctes. En effet, le tissu adipeux blanc emmagasine de l’énergie sous la forme de triglycérides. Le tissu adipeux brun est impliqué dans la génération de chaleur, un processus appelé la thermogenèse adaptative. La thermogenèse adaptative est assurée par l’intermédiaire d'une protéine mitochondriale qui permet la génération de chaleur dans les adipocytes bruns. Cette protéine mitochondriale est exprimée de manière très spécifique par les adipocytes bruns. La chaleur ainsi générée est ensuite localement libérée et diffuse dans l’organisme par la circulation sanguine. Des recherches précédentes ont démontrées un rôle essentiel du système immunitaire dans la thermogenèse adaptive. La présence de plusieurs sous-populations de macrophage ont été mises en évidence dans le tissu adipeux brun. Cependant, le rôle des différentes sous-populations de macrophages reste à déterminer. Ainsi, nous souhaitons développer des modèles génétiques permettant de cibler spécifiquement et de réduire les sous-populations de macrophages dans le tissu adipeux brun. Nous analyserons la conséquence de ces réductions de populations de macrophages sur la physiologie du tissu adipeux brun et sur la thermogenèse adaptative. Un intérêt tout particulier sera porté sur l’impact des adipocytes bruns sur le développement de la réponse immune innée et adaptative.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l'interaction entre les adipocytes thermogéniques et les cellules immunes. Nous espérons déterminer les fonctions des différentes populations de macrophages du tissu adipeux brun. En effet, ceci pourrait identifier des nouvelles cibles permettant de contrôler l'activité du tissu adipeux brun.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux seront l’une des suivantes : des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 4 jours suivies ou non de 3 autres injections la semaine suivante, ou une anesthésie suivi d'une injection intraveineuse. De plus, un prélèvement de sang sera effectué juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Des animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales répétées pendant deux semaines consecutives et une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dautres souris seront soumises à une injection intraveineuse de lymphocytes, ce qui pourrait induire des signes de détresse circulatoire (atteinte de la fonction respiratoire ou neurologique).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le tissu adipeux brun dans le but de l'analyser.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires au lieu de cellules isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre les fonctions des macrophages du tissu adipeux brun, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux brun.

Réduction

Pour les élevages nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. De plus, nous utiliserons les souris mâles et femelles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement l’aspect des sites d’injections. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et la déplétion spécifique des différentes populations de macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée.

2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie provoquant un infarctus par ligature définitive d'une artère coronaire, un quart d'entre elles ayant en plus la rate retirée, avec des injections de vésicules extracellulaires et des échographies sous anesthésie. L'objectif est de comprendre le rôle de ces vésicules dans la réparation du cœur après infarctus, les applications thérapeutiques restant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que ces phénomènes complexes ne peuvent être recréés in vitro et que le modèle murin est "absolument nécessaire et indispensable".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires et l’infarctus du myocarde en particulier sont l'une des premières causes de mortalité dans le monde. La compréhension des mécanismes impliqués dans cette maladie est nécessaire pour le développement de thérapies visant à améliorer la survie après infarctus et constitue ainsi un enjeu médical et sociétal majeur. La mort du tissu cardiaque infarci déclenche une réponse inflammatoire qui est essentielle pour la réparation cardiaque. Cette réponse inflammatoire repose sur la communication efficace entre les cellules inflammatoires et les cellules cardiaques. Lors d’un infarctus, les cellules cardiaques libèrent des fragments de leur membrane, les vésicules extracellulaires (VE). Ces VE exercent leur activité biologique par le transfert de leur contenu (protéines et acides nucléiques) vers des cellules cibles, ce qui en fait de véritables messagers intercellulaires. La composition de ces VE cardiaques ainsi que leur rôle dans la réponse inflammatoire et la réparation cardiaque est inconnu. Le but de notre projet est de définir les mécanismes moléculaires qui contrôlent cette communication intercellulaire par les VE cardiaques, leur rôle dans la réparation cardiaque après infarctus du myocarde. Divers modèles de souris génétiquement modifiées nous permettront d’analyser spécifiquement le rôle de ces VE. Les animaux subiront un infarctus du myocarde. L’analyse consistera à caracteriser la composition des VE cardiaques ainsi que leur rôle dans la réponse inflammatoire, la fonction et le remodelage du coeur après infarctus.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de définir les mécanismes de communication cellulaire qui controllent la réparation cardiaque lors de l’infarctus du myocarde. La caractérisation de ces mécanismes clés est essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à favoriser la réparation du coeur infarci et ainsi favoriser la survie.

Procédures

Chaque animal va subir une procédure chirurgicale de 20 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde expérimental est réalisé par ligature permanente de l’artère coronaire antérieure gauche. Un tiers de ces animaux seront injectés avec des VE purifiées (injection intracardiaque ou intraveineuse) afin d'évaluer le rôle des VE dans la réparation cardiaque. Un quart des animaux de ce projet sera préalablement splénectomisé. La splénectomie est une procedure chirurgicale de 10 minutes. Pour chacune de ces procédures, trois injections sous-cutanées d’analgésiques (50 µL, durée inférieure à 5 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents jours après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Per-opératoire Inconfort au point d'injection. Douleur post-opératoire adequatement soulagée par des analgésiques. Post-opératoire L'etat de santé des souris sera suivi quotidiennement pour les 5 premiers jours puis de manière hebdomadaire par la suite. Toute dégradation de l'etat de santé (ex: douleur refractaire au tratiement antalgique, infections, insuffisance cardiaque) sera minutieusement evalué en rapport à une grille de points limites. Les traitements adéquats seront mis en place tant que les limites ne sont pas atteintes. Dès qu'une de ces limites est atteinte, les animaux concernés seront mis à mort immédiatement.

Devenir

Toutes les procédures de ce projet sont terminales et par consequent, les souris sont mises à mort.

Remplacement

Pour respecter le principe des 3R, nous avons évalué nos hypothèses in vitro avec des cultures de cellules cardiaques et de macrophages autant que possible avant de l’étudier dans un modèle murin. Cependant, ces modèles murins sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes, que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires, mais également tissulaires qui sont mises en jeu au cours des phénomènes de réparation tissulaire consécutifs à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la complétion de ce projet a été calculé au plus juste ajusté par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Le nombre d'animaux est ainsi calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait pour détecter un changement de 20% de la fraction d'éjection ventriculaire gauche par échocardiographie. Ces tests déterminent un nombre de 15 souris par groupe. Pour deux groupes, en supposant quelques problèmes de traitement des tissus et la mortalité inhérente à la procédure, nous estimons une taille de groupe de 15 animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses échocardiographiques, anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et cellules cardiaques.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux seront élevés en cages enrichies avec maisonnettes, batônnets en bois et coton et avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Après la procédure chirurgicale, les animaux sont placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie antalgique sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 48 heures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs confirmés pendant les 5 premiers jours post-opératoires, puis par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Pour l’infarctus du myocarde et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante thermorégulée dès l’induction de l’anesthésie.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettront de comprendre le rôle des VE cardiaques dans le remodelage cardiaque après infarctus du myocarde. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 10 à 15 semaines, chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent cinq injections intraveineuses et sont soumises à quatre tests comportementaux non précisés, pour étudier le rôle des lymphocytes B. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et ne décrit qu'un stress bref lié aux injections et aux contentions. Il justifie le recours à la souris par la disponibilité de lignées transgéniques reproduisant la maladie.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle des lymphocytes B dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la MA.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections par voie intraveineuse (5 injections espacées de deux semaines) et des tests comportementaux (au nombre de 4). Chaque injection intra-veineuse durera au maximum une minute (préhension + immobilisation + injection).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effets indésirables sur les animaux car les animaux développeront une maladie modérée. Dans ce modèle bien caractérisé, les souris développent une maladie grave à l'age de 12 mois et donc bien après la période de leur utilisation dans notre étude. Tous les animaux seront mis à mort à l'age de six mois maximum. En revanche, les animaux pourront développer des effets indésirables au cours des injections et des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indisérables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront immobilisés pour être injectés par voix intra-veineuse ou lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Nous avons alors établi des points limites afin de limiter au maximum ces éffets indésirables.

Devenir

AMENDEMENT: Les animaux que nous utilisons développent spontanément une maladie grave à l'age de 12 mois. Tous les animaux seront donc utilisés et mis à mort au plus tard à l'age de 6 mois.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle des cellules B dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 semaines seront utilisées.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la patte puis des injections de chimiothérapie, pour distinguer le rôle de deux types de cellules immunitaires dans la réponse au cisplatine. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité et l'alimentation, provoquer une perte de poids et des nécroses cutanées. Il affirme que la complexité du cancer ne peut pas être appréhendée in vitro et renvoie les retombées pour les patients au long terme.

Objectifs

Si l’impact des chimiothérapies sur les cellules tumorales est connu, les conséquences d’un tel traitement sur les cellules du système immunitaire restent cependant à découvrir. Nos données préliminaires montrent qu’une chimiothérapie peut attirer le système immunitaire dans la tumeur permettant ainsi une meilleure efficacité du traitement contre le cancer. Ce projet consiste à étudier le rôle de 2 types de cellules immunitaires dans la réponse à une chimiothérapie afin de discriminer leur importance individuelle. Pour cela, deux types de souris génétiquement modifiées, ne possédant pas l’une ou l’autre des cellules d’intérêt seront comparées à des souris ayant les deux types de cellules et l’on observera l’efficacité de la chimiothérapie sur la croissance tumorale dans ces différentes souris ainsi que l’évolution du système immunitaire au sein de la tumeur. Cela nous permettra de comprendre l’importance de nos deux cellules immunitaires d’intérêt dans l’efficacité de la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Une augmentation de la réponse immunitaire au sein même de la tumeur via l'augmentation de la présence du système immunitaire pourrait avoir d'importants impacts dans le ralentissement de la croissance tumorale. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 10 jours plus tard, au maximum 3 injections Intrapéritonéale (IP) de 1 minute, réparties sur une semaine et certaines souris auront également 2 Intra veineuse (IV), de 1 minute chacune environ, espacée de 3 jours, la première injection IV ayant lieu le même jour que la première injection IP.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis au maximum à 2 injections IV de 1 minute, 1 injection sous-cutanée de 1 minute et 3 injections IP de 1 minute, sous anesthésie, répartie sur plusieurs jours. Les administrations IV et SC ne sont pas connues pour être particulièrement douloureuses. L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. En réalisant des injections en sous-cutané, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections SC (cellules tumorales) et IP (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Saines, elles reçoivent trois injections destinées à produire des anticorps contre des peptides liés à la spermatogenèse, avec prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des lésions ou des ulcérations cutanées et les prélèvements des saignements et des hématomes. Il décrit la souris comme le "meilleur modèle" pour induire l'immunisation et rattache le projet à une étude internationale sur les effets du COVID sur la fertilité.

Objectifs

L’auto-immunité est la conséquence d’un système immunitaire qui s’emballe et dépasse son rôle de défense contre les agents extérieurs pour s’attaquer aux propres cellules de l'organisme. Les agents extérieurs peuvent être des bactéries, champignons, virus. Ainsi l'épidémie de COVID-19 a incité les scientifiques, et en particulier les immunologistes, à étudier l'impact de l'infection par le SARS-CoV-2 sur la population humaine mondiale. La principale préoccupation est de savoir si l'infection peut déclencher une maladie auto-immune. Les anticorps formés contre le SARS-CoV-2 se lieraient aux protéines des tissus humains, entraînant une réactivité auto-immune. La présente étude porte sur l'appareil reproducteur. Les tissus du système reproducteur sont très vulnérables aux infections virales, de plus les ovaires et les testicules expriment des récepteurs qui servent également a la voie par laquelle le virus pénètre dans les cellules. Par ailleurs, plusieurs études ont indiqué que les patients atteints de COVID-19 produisent des auto-anticorps et qu'une partie d'entre eux développent des troubles auto-immuns; à cet égard, une altération de la spermatogenèse a été signalée dans des études menées sur des patients atteints de COVID-19. Notre première analyse a permis d'identifier 4 sequences (peptides) communes liées à la spermatogenèse et la protéine Spike du SARS-CoV-2. Nous avons également découvert que des patients masculins et féminins affectés par le COVID-19 développaient des anticorps contre 2 des 4 peptides sélectionnés liés à la spermatogenèse, soulignant l'apparition de nouveaux troubles de la fertilité dans la population. Le but de ce projet est la production d'anticorps anti-peptides sur des souris saines afin de vérifier l'impact sur la fertilité

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur la population en général. Cette étude nous permettra de produire des anticorps qui seront utilisés dans un projet plus vaste afin de comprendre leur rôle.

Procédures

Trois injections et les prélèvement sanguins sont réalisées sur animal anesthésié. Temps : injections : 1 minute/souris Prélèvement sanguin : 2 minutes/souris

Impact sur les animaux

Les souris peuvent développer des lésions cutanées ou des ulcérations au niveau de la peau ou du muscle. Le prélèvement de sang peut provoquer des saignements excessifs et des hémorragies sous-cutanées.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la prodédure pour prélèvement.

Remplacement

Le projet actuel constitue la phase finale d'une large étude internationale à grande échelle qui a commencé par une analyse visant l'identification de peptides partageant des séquences similaires avec la protéine Spike du SARS-CoV-2 et les protéines liées à la spermatogenèse. Ensuite, nous avons démontré la réactivité des anticorps des sérums des patients COVID-19 envers lesdites protéines/peptides liées à la spermatogenèse par des tests in vitro (sérums collectés de divers centres cliniques internationaux). L'objectif du projet actuel est à présent de produire des anticorps contre les peptides caractérisés et de pouvoir étudier leur effet sur un organisme complexe. Cela nécessite d’induire une réponse immunitaire contre ces peptides, ce qui ne peut être généré que chez ou à partir d'animaux vivants et de prélèvements de tissus à la fin del la procédure.

Réduction

Le nombre d'animaux employés est basé sur les travaux rapportés dans la littérature. Il a été établi pour nous permettre d’obtenir des anticorps en quantité suffisante pour poursuivre vos travaux.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un groupe social et dans des cages enrichies (matériaux de nidation, tubes). L'expérience est arrêtée lorsque l'analyse de sang confirme la présence d'anticorps. Nous avons établi des points-limites nous permettent de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme, et leurs systèmes physiologiques schématisent les observations faites chez l'homme. Aujourd'hui, la souris représente le meilleur modèle pour induire l'immunisation. Des souris âgées de 6 à 8 semaines seront recrutées. À cet âge, les souris sont considérées comme des adultes et leur système immunitaire est pleinement développé.

Pour savoir si des cellules stromales issues du tissu adipeux peuvent traiter la sclérodermie systémique, 154 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, des poumons, de la rate et de la peau. Elles reçoivent des injections dans le derme cinq jours par semaine pendant quatre ou six semaines, soit jusqu'à trente, et une seule injection de ces cellules dans la veine de la queue. La bléomycine ou l'acide hypochloreux injectés peuvent provoquer des démangeaisons, parfois des plaies ou des irritations de la peau, et les souris développent une fibrose de la peau et des poumons. Le porteur affirme que cette fibrose pulmonaire n'entraîne "pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires", ne mentionne aucun point limite, et prévoit seulement que des sédatifs ou des antidouleurs "pourront" être donnés si des signes de souffrance apparaissent.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines ou pendant 6 semaines et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs).

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)

Remplacement

Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades.

Raffinement

Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes

52 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticorps humains anti-contactine 1, des prélèvements de sang et d'urine et un isolement de quatre heures pour la collecte d'urine, avant prélèvement des reins et des nerfs, pour reproduire une maladie rénale auto-immune. Le porteur indique que les injections peuvent déclencher une atteinte rénale ou neurologique mimant la maladie humaine. Il justifie le choix du hamster par le fait qu'il exprime la contactine dans le rein, à la différence des souris, rats, lapins et cobayes testés, et qu'il est plus facile à élever que le porc.

Objectifs

La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune du système nerveux. Plusieurs cibles de ces anticorps dirigés contre soi ont été découvertes, parmi lesquelles des protéines présentes sur les neurones comme la contactine 1. La survenue concomitante chez certains patients d’une PIDC et d'une maladie auto-immune du rein (GEM : glomérulopathie extramembraneuse), dont l’évolution clinique est variable et peut aller jusqu’à la perte totale de la fonction rénale, est connue de longue date. Ces deux maladies concomitantes ont souvent été décrites mais leur lien n'a jamais été établi dans la bibliographie. Ainsi, la contactine 1 a été identifiée dans des petits amas de vaisseaux sanguins participant à la filtration rénale, puis la présence simultanée des anticorps anti-contactine dans le nerf et dans le rein a été mise en évidence. L’objectif principal de ce projet est de confirmer dans un modèle hamster l'implication des anticorps anti-contactine 1 dans cette maladie rénale via la reproduction de la maladie chez le Hamster mais aussi, à analyser les dysfonctionnements aux niveaux clinique et tissulaire provoqués par les anticorps anti-contactine humains afin de mieux connaitre cette maladie pour pouvoir ensuite adapter le diagnostic et les traitements de cette maladie chez l'homme.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de confirmer l'implication des anticorps anti-contactine et leur lien avec le développement d’une atteinte rénale induisant des modifications biochimiques et histologiques. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la glomérulopathie extramembraneuse ainsi que dans le développement de tests de dépistage et d’évaluation de la maladie si le rôle pathogène des anticorps est confirmé et si leur concentration a une valeur pronostique.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans deux procédures distinctes de sévérité modérée qui se dérouleront en plusieurs étapes et sur une durée de 11 jours pour la première procédure et 11 semaines pour la seconde. Concernant la première procédure, une injection d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux aura lieu au tout début de l'expérimentation. Des prélèvements sanguin et urinaire auront lieu 3 fois sur la durée des 11 jours d'expérimentation afin de suivre la fonction rénale des animaux. Concernant la seconde procédure, 4 injections d'anticorps sont prévu sur une durée totale d'expérimentation de 11 semaines. Des prélèvements sanguins et urinaires seront réalisés en moyenne deux fois par semaine. Pour les prélèvement urinaires, les animaux seront isolés en moyenne deux fois par semaines pendant 4 heures afin de prélever leurs urines, cela pouvant provoquer du stress et de l'angoisse chez les animaux. Les animaux seront systématiquement anesthésiés avant chaque intervention afin de diminuer leur angoisse et leurs stress. Les injections et prélèvements réalisés ne dureront pas plus de 10 min. Au bout des 11 jours pour la première procédure ou 11 semaines pour la seconde, ou si les animaux montrent des signes de souffrance, les reins et nerfs seront prélevés dans le but d'étudier l'impact que les anticorps ont eu sur les hamsters. Ces prélèvement seront réalisés sous anesthésie et juste avant l'euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Ppour les prélèvements sanguins les animaux seront anesthésiés donc ils auront un leger stress du à l'injection IP d'anesthésique. Pour les Hamsters ayant reçu des injections d'anticorps anti-contactine1, des nuisances liées à l'apparition d'une maladie rénale et/ou neurologique qui mime la pathologie humaine, peuvent apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps anti-contactine1.

Remplacement

L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection des anticorps anti-contactine1 humains induit chez le Hamster des altérations neurologiques et de la fonction des reins similaires à celles observées chez l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif.

Réduction

52 animaux seront utilisés pendant 1 an pour cette étude. Le modèle hamster visant à recréer une maladie auto-immune rénale avec des injections d’anti-contactine1 étant unique, il est difficile de prévoir le juste nombre d’animaux nécessaire à cette étude. Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois à travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence statistiquement significative entre les groupes en cas de comparaison. Ainsi, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 4 pour l'étude préliminaire visant à visant à confirmer que les immunoglobulines humaines contenant l’anticorps anti-contactine pourront se fixer sur les reins des hamsters et induire des dépôts immuns. Il y a deux groupe d'animaux pour cette analyse soit 8 animaux. Concernant la seconde partie de l'étude, si l'étude préliminaire est concluante, 4 animaux par groupe seront nécessaires, avec également deux groupes d'animaux, afin de déterminer les doses adéquate d'anticorps à injecter aux animaux. Enfin, 36 animaux seront nécessaire pour l'étude principale qui vise à induire la maladie cliniquement et à évaluer l’atteinte rénale. Les 36 animaux seront réparties dans 3 groupes de 12 animaux qui recevront des injections d'anticorps issues de patients ayant des pathologies nephrotiques et/ou neurologiques différentes.

Raffinement

Nous attachons une importance majeure sur les conditions d’hébergement et la qualité de vie des animaux. C’est pourquoi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Pour les phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un antidouleur sera administré à l’animal. Dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs.

Choix des espèces

Nous avons préalablement recherché in vitro la contactine dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries souris, rats, lapins et cochons d’Inde mais aucun d’entre eux n’exprime la contactine dans le rein. Seul le Hamster et le porc expriment cette protéine dans leur reins. Notre choix s'est ensuite porté sur le modèle Hamster car plus facile à élever. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 10-14 semaines, pour des raisons techniques (poids entre 100-120g), permettant des groupes homogènes.