Système immunitaire

440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit un dispositif implanté dans l'abdomen par chirurgie, l'autre des injections locales, et toutes subissent l'application répétée de pommades irritantes provoquant psoriasis, eczéma ou dermatite, pour tester le potentiel thérapeutique de la cytokine IL-34. Le porteur décrit un épaississement de la peau accompagné de démangeaisons ou de douleur locale, et prévoit la mise à mort pour prélever peau et organes immunitaires. Il affirme que la structure et l'immunité de la peau rendent l'analyse in vivo "indispensable", les retombées pour des maladies humaines fréquentes restant annoncées à terme.

Objectifs

La cytokine IL-34, découverte en 2008, a été principalement décrite pour son implication dans la survie et la différenciation de certaines cellules immunitaires présentes dans le sang et les tissus. Plus récemment, il a également été montré qu’elle est impliquée dans la fonction de cellules régulatrices, aboutissant à une tolérance dans le contexte de la transplantation. Cette protéine a donc un grand potentiel thérapeutique dans la maitrise du rejet de greffe, mais également dans d’autres maladies autoimmunes ou inflammatoires. Celle-ci pourrait en effet offrir une alternative aux traitements donnés à ces patients pour limiter l'action du système immunitaire, dont les effets secondaires sont importants. En parallèle, il a été décrit que les cellules de Langerhans, cellules résidentes de la peau, sont dépendantes de la présence d’IL-34. Cela rend l’étude du rôle de l’IL-34 dans le compartiment cutané très intéressant, au niveau des cellules de Langerhans mais aussi d'autres cellules résidentes du derme. L’objectif principal est donc d’étudier le potentiel thérapeutique de l’IL-34 dans le traitement de pathologies inflammatoires de la peau comme le psoriasis ou l'eczéma par exemple.

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices, à court et long terme sont attendus avec ce projet. Dans le cadre du projet, l’association des résultats obtenus in vitro et in vivo permettra l’amélioration des connaissances sur les mécanismes d’action de l’IL-34, et de l’impact sur les différentes cellules cibles présentes dans le derme et l’épiderme. Mais l’objectif est surtout la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour la molécule IL-34, ici dans des modèles de pathologies cutanées. Ces résultats permettront de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour ces pathologies très fréquentes chez l’homme. De manière plus générale, la cytokine IL-34 pourrait avoir un potentiel thérapeutique dans plusieurs maladies autoimmunes ou inflammatoires. Celle-ci pourrait en effet offrir une alternative aux traitements immunosuppresseurs dont les effets secondaires sont importants chez les patients, et dont l’efficacité peut être insuffisante.

Procédures

Deux voies d’administration de la molécule thérapeutique seront comparées. 50% des animaux seront traités à l’aide de dispositifs implantables permettant une diffusion continue de la molécule thérapeutique. Le traitement via l’utilisation de ces dispositifs implique une seule chirurgie (environ 30 min) pour leur implantation au niveau de la cavité abdominale. Toutes les précautions sont prises pour limiter le stress, l’inconfort et la douleur induite par la chirurgie, avec une procédure réalisée sous anesthésie gazeuse, une analgésie pré- et post-opératoire, une prévention de l’hypothermie avec placement des animaux sur tapis chauffants, ainsi que la prévention de l’hypotension avec l’injection d’une solution saline. Les animaux sont suivis de manière journalière dans les jours suivant la chirurgie. 50% des animaux recevront le traitement sous forme d’injections locales au niveau des zones lésées de la peau, l’objectif étant d’évaluer l’efficacité locale et de limiter les potentiels effets secondaires. Ces injections seront également réalisées sous anesthésie afin de limiter le stress et garantir la sécurité des animaux, ainsi que la qualité de l’injection thérapeutique. Dans les différents protocoles, l’induction des pathologies se font par application cutanée de pommades ayant un effet irritant localement. Le protocole de psoriasis a une durée de 5 jours avec une application locale journalière. Le protocole de dermatite allergique de contact a une durée de 10 jours avec un total de 2 applications locales. Le protocole d’eczéma a une durée de 20 jours, avec un total de 12 applications locales. Toutes ces applications se feront sous anesthésie générale de courte durée afin de limiter la contention et le stress des animaux.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables modérés et de courte durée sont attendus dans les procédures décrites dans cette saisine. Ces effets sont décrits ci-dessous et seront tous pris en compte afin de limiter leur intensité et leur durée. En plus des soins pré- et post-opératoires ainsi que des traitements analgésiques prévus suite à la chirurgie, les animaux sont suivis de manière journalière dans les jours suivant la chirurgie, bien qu’aucune réduction de mobilité ou inconfort n’est attendue. La réalisation des injections au niveau de la peau ne doit pas être responsable de douleurs au niveau local, mais sera également réalisée sous anesthésie. Dans les différents modèles de pathologies cutanées décrits ici, l’induction des pathologies se font par application cutanée de pommades, ayant un effet irritant localement et spécifiques pour chaque modèle (psoriasis, dermatite allergique de contact, dermatite atopique/eczéma). Ces pommades sont appliquées de manière répétée sur une petite zone de la peau des animaux, soit au niveau d’une zone de l’abdomen, soit au niveau de l’oreille. Les effets attendus sont un épaississement de la peau de l’oreille, associé au non à des démangeaisons ou une douleur locale. Telles que décrits dans la littérature, les effets attendus sont légers avec peu d’impact sur le bien-être et le comportement des animaux traités. Une grille de suivi clinique et un suivi de poids seront réalisés afin de pouvoir repérer une éventuelle aggravation de l’état clinique des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Le but est d'obtenir le maximum d'informations sur les mécanismes d'actions et cellules cibles de la molécule thérapeutique, pour chaque animal traité, et en comparaison avec les animaux non traités. Un prélèvement de sang sera réalisé avant euthanasie afin d'analyser les cellules immunitaires et cytokines circulantes du sang. Des prélèvements d'organes seront réalisés en post-mortem afin d'analyser effets de la molécule thérapeutique sur les différents organes immunitaires (ganglions, rate) mais également au niveau de la peau traitée ou non traitée.

Remplacement

La majorité des résultats obtenus sont issus d'études sur la structure et la fonction de l’IL-34, réalisées in vitro sur cellules de souris et humaines, et ont permis de mettre en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’IL-34. Malgré cela, ces résultats sont limités par l’absence de contexte physiologique et par la complexité du système immunitaire qui ne peut être mimé in vitro. L’utilisation de modèles pré-cliniques est donc nécessaire pour approfondir les mécanismes d’action et cibles thérapeutiques potentielles de l’IL-34, notamment dans les pathologies cutanées ayant une composante immunitaire. La peau possède une structure et une immunologie très spécifique, qui rend l’analyse in vivo indispensable.

Réduction

Un nombre total maximum de 440 animaux est prévu dans ce projet, dont la répartition est décrite ci-après. Le nombre d'animaux a été déterminé de façon à être interprétable statistiquement. Chaque protocole contient 4 groupes de 10 souris maximum, soit 40 souris par modèle. Quatre modèles seront développés, à savoir un modèle de psoriasis, un modèle de dermatite allergique de contact, avec deux agents différents, et un modèle d'eczéma (dermatite atopique). Pour chaque modèle, 2 voies d’administration seront comparées, une administration systémique par l’utilisation de dispositifs implantables permettant une diffusion continue, ou une administration via une injection locale au niveau de la zone lésée de la peau. De plus, l'efficacité du traitement en préventif et en curatif sera comparée. Pour chaque modèle, des expériences préliminaires seront d’abord effectuées sur un petit nombre d’animaux; si les effets observés ne sont pas suffisamment visibles in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des 10 souris ne sera donc pas utilisée. Dans le modèle de dermatite de contact par exemple, un seul agent sera testé en premier lieu, et si le modèle est satisfaisant, le deuxième agent ne sera pas testé. De la même manière, si une voie d’administration donne des résultats bien supérieurs à l’autre, une seule voie d’administration sera conservée afin de diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Le traitement curatif (après apparition des premiers symptômes) ne sera testé qu'avec la voie d'administration choisie dans la première phase, et seulement si les résultats préliminaires sont encourageants en préventif.

Raffinement

Des mesures sont mises en place lors de la chirurgie d’implantation des dispositifs, avec une analgésie pré- et post-opératoire et une anesthésie générale. Les souris sont placées sur un tapis chauffant pendant la chirurgie jusqu’au réveil total. Elles recevront une injection de solution saline, un baume ophtalmique sera appliqué sur leurs yeux. Une analgésie locale sera également ajoutée au moment de la chirurgie. En post-opératoire, les animaux seront suivis quotidiennement pour vérifier l’absence de perte de poids et l’état général, avec suivi quotidien de la cicatrisation. Les injections locales cutanées ainsi que les prélèvements sanguins avant euthanasie seront également effectués sous anesthésie générale. Bien qu’une atteinte de l’état général ne soit pas attendue dans ces différents protocoles, un suivi journalier du poids et de l’apparition de signes cliniques (comportement/mouvement, aspect général, évaluation du poids) sera effectué. Un tableau de score a été mis en place, afin d’agir rapidement en cas de détérioration de l’état clinique, avec mise en place d’une analgésie si besoin, ou sortie du protocole avec euthanasie le cas échéant. Dans ce cas, les animaux concernés seront euthanasiés après anesthésie générale. Les animaux provenant d'élevages agréés sont acclimatés pendant au moins une semaine avant de débuter une procédure. Les souris sont hébergées dans des cages ouvertes par groupe de 5 animaux maximum, et ont des formes d’enrichissements à leur disposition (tube, block, frisottis) afin de réduire leur stress.

Choix des espèces

Les études fonctionnelles réalisées in vitro à partir de cellules humaines mettent en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’IL-34 mais sont limitées par l’absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire qui ne peut-être mimé in vitro. L’utilisation de modèles pré-cliniques est donc nécessaire pour valider ces résultats, pour approfondir les connaissances sur les cellules cibles et mécanismes d’action, et pour obtenir des informations sur le potentiel thérapeutique de l’IL-34. De plus, le compartiment cutané possède une structure et une immunologie très spécifiques, qui rend l’analyse in vivo indispensable. Plusieurs modèles de souris sont utilisés pour différentes pathologies cutanées, et les mécanismes immunitaires sont bien mis en évidence dans la littérature, ce qui permet à ce projet de s’appuyer sur des publications déjà existantes représentant de manière fiable les pathologies humaines. Les fonctions de l’IL-34 de souris sont également bien décrites et sont représentatives des effets observés sur cellules humaines. La souris est donc l’espère la plus pertinente pour faire la preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de l’IL-34 dans des pathologies cutanées. Pour ce projet, les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes de 10 à 12 semaines, afin d’éviter la phase de croissance et d’avoir un poids stabilisé au démarrage de l’expérimentation, permettant un meilleur suivi clinique, mais aussi un poids suffisant pour limiter le risque de complications chirurgicales liées à l’implantation des dispositifs au niveau de la cavité abdominale.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans le sinus veineux situé derrière l'œil sous anesthésie, puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang par la joue sur deux à trois semaines, pour comparer des anticorps produits à partir de microalgues à des anticorps classiques. Le porteur présente l'enjeu comme économique, réduire le coût de production des anticorps, et annonce le bénéfice pour les patients à terme. Il affirme qu'après vérification in vitro il était "nécessaire" d'étudier ces anticorps dans un organisme au système immunitaire mature.

Objectifs

L’industrie pharmaceutique mise de plus en plus sur les anticorps thérapeutiques pour satisfaire les besoins de santé, encore nombreux. Cependant, l’industrie française a pris du retard dans ce domaine. Malgré une consommation importante de médicaments par la population française, seuls trois anticorps thérapeutiques sont produits en France (omalizumab, canakinumab, sécukinumab). Avec la prévalence croissante des maladies chroniques comme les cancers, les maladies autoimmunes et infectieuses telles que la COVID-19, le besoin en médicaments de type anticorps s’accroit considérablement. Ces médicaments sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Le coût de production de ces anticorps est très élevé. En conséquence, il devient indispensable de développer des systèmes alternatifs de production d’anticorps qui permettent de décroître leurs coûts de production et ainsi de les rendre plus accessibles. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels dirigés contre des virus comme le virus de l’Hépatite B ou le virus de Marburg. Nous produisons actuellement des bio-similaires d’anticorps anti-cancéreux. L'objectif du projet est donc de comparer la pharmacocinétique de ces anticorps produits à partir de microalgues par rapport aux anticorps génériques.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude, si ils valident le système alternatif de production d'Ac à partir de microalgues va permettre de diminuer considérablement leur coût de production et ainsi les rendre plus accessibles.

Procédures

Chaque souris recevra à J0 une injection intraveineuse unique via le sinus rétro-orbitale de 5 mg/kg d’anticorps dans un volume total de 200µl de PBS. Cette injection sera pratiquée sous anesthésie générale. Chaque souris aura des prélèvements sanguins, un total de 9 sur 2 à 3 semaines. Prélèvements de sang via les veines submandibulaires. L’ensemble des prélèvements sera effectué sous anesthésie générale à l’isoflurane 2.5% après une induction à l’isoflurane 5% dans l’air. Le volume de chaque prélèvement sera de 50µl récupéré dans des capillaires calibrés. Après chaque ponction une pommade antiseptique cicatrisante sera appliquée (Biseptine Cica gel).

Impact sur les animaux

Les gestes expérimentaux sur les animaux se limitent à une injection intraveineuse et des prélèvements sanguins qui ne devraient pas induire de nuisances ou effets indésirables particuliers compte tenu des mesures préventives prises et des précautions apportées à leur mise en oeuvre.

Devenir

Tous les animaux de l'étude seront mis à mort.

Remplacement

Les anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma ou son immunogénicité. Après vérification in-vitro de ces différentes interactions anticorps récepteurs il était nécessaire d’étudier leur comportement dans un organisme vivant avec un système immunitaire mature et fonctionnel.

Réduction

Au-delà de l’utilisation du nombre minimum d’animaux pour obtenir une modélisation correcte de la pharmacocinétique de chaque anticorps, cette étude à terme permettra de remplacer les milieux de culture riches en sérum de veaux foetal par de l’eau de mer pour la production de ces anticorps. Le problème éthique majeur du sérum de veau foetal vient du fait qu’il provient du sang de foetus de vache, prélevé au moment de l'abattage de vaches gestantes. Le foetus est retiré du ventre de sa mère, et la totalité de son sang est prélevé par ponction cardiaque, le plus souvent sans anesthésie afin de garantir la qualité de l’échantillon. Ce nouveau mode de production permettra donc à court et à long terme moins d’utilisation de sérum de veaux foetal et donc d’animaux donneurs.

Raffinement

L’injection intraveineuse ainsi que les différents prélèvements seront pratiqués sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de limiter le nombre de prélèvement sur chaque souris tout en garantissant un suivi sérologique optimal pour l’étude pharmacocinétique, les 16 souris seront divisées en 4 groupe de 4. De cette façon le nombre de prélèvements par individu sera divisé par 4, de plus les prélèvements seront alternés coté droit et gauche de la mandibule. L’innocuité de ces anticorps devant être totale, des points limites extrêmement précoces basés sur le mouse grimace scale et le poids seront appliqués :

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle qui permet d'évaluer après modélisation le profil pharmacocinétique d'un anticorps monoclonal. La demi vie d'un anticorps et sa bio distribution au sein des différents tissus d'un organisme vivant sont dûs à un récepteur aux Fc des immunoglobulines G, le FcRn. Chez la souris il est totalement fonctionnel pour les IgG humaines ce qui permet d'évaluer la demi vie et la courbe de distribution par dosage cinétique des concentrations résiduelles dans le sang (volume périphérique) d'un anticorps choisi. Ces anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma. Cette étude chez la souris permettra donc d'évaluer ces modifications potentielles. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines pour que leur système immunitaire soit mature. Elles arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et seront acclimatées pendant 7 jours période nécessaire au développement d'un microbiote dépendant de notre animalerie.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucune ne restant vivante à la fin. Génétiquement modifiées, elles subissent un prélèvement de queue au sevrage, une injection déclenchant un lupus, puis des prélèvements sanguins mensuels, la maladie provoquant une inflammation pulmonaire, une perte de poids, une alopécie et des atteintes articulaires handicapantes. Le porteur indique que 90 animaux sont d'abord utilisés comme reproducteurs pendant un an avant d'être tués, les autres étant tués en fin de procédure pour prélever poumons, rate et reins. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme entier", ce qui justifierait selon lui le recours aux souris.

Objectifs

Le lupus systémique est le prototype de la maladie auto-immune non spécifique d’organes. Elle est parmi les plus fréquentes des maladies rares avec une prévalence variant en fonction des pays entre 15 à 50 cas pour 100000 habitants. Les manifestations cliniques sont nombreuses incluant fréquemment des atteintes cutanées, articulaires, hématologiques ou rénales. De plus, bien que souvent sous-évaluées, les manifestations pulmonaires sont retrouvées dans 30 à 50% des cas suivant les études. Certaines formes de ces atteintes pulmonaires comme l’hémorragie intra-alvéolaire se grèvent d’une mortalité supérieure à 50% incitant à mieux comprendre la physiopathologie, étant donné l’urgence thérapeutique qu’elle constitue. D’autres atteintes notamment rénales peuvent se compliquer dans 25 % des cas d’une insuffisance rénale terminale. La pathologie est caractérisée par la présence d’auto-anticorps anti-ADN. Ces complexes anticorps/ADN forment des agrégats qui participent au développement et au maintien d’une inflammation chronique qui engendre des dégâts tissulaires. Le rôle du récepteur Fc néonatal (FcRn), dans la physiopathologie des maladies auto-immunes est étudié depuis de nombreuses années. Les principales fonctions du FcRn sont associées à la biologie des IgG et de l’albumine. Le FcRn est un récepteur de recyclage et de transfert des IgG et de l’albumine, permettant leur maintien dans la circulation sanguine mais aussi leur transport au travers des barrières épithéliales. Le rôle de FcRn dans le routage des complexes immuns a permis de suggérer son implication dans la physiopathologie de différents types de maladies auto-immunes dont le lupus. Par ailleurs, l’inflammation déclenchée par ces complexes immuns entraine une activation des cellules immunitaires et notamment de certaines populations de lymphocytes T spécialisées dans la production rapide de cytokines comme les lymphocytes T innés (e.g. les cellules NKT et les cellules MAIT). Ces cellules sont ainsi impliquées dans différentes maladies auto-immunes et notamment dans le lupus systémique. Par exemple, plusieurs études ont montré un défaut de NKT chez des patients lupiques ou dans des modèles expérimentaux. L’objectif de ce projet de recherche est de caractériser l’implication de la protéine FcRn et des lymphocytes T innés, dans la physiopathologie du lupus afin de permettre de développer de nouveaux axes de traitements ciblant ces cellules.

Bénéfices attendus

Les stratégies de recherches visant à identifier des cibles thérapeutiques de l’immunité adaptative tout particulièrement humorale ont montré une certaine efficacité dans l’amélioration de la prise en charge des malades lupiques. Cependant leurs indications restent limitées pour l’instant, les formes les plus graves de la maladie comme les atteintes neurologiques, pulmonaires et rénales reposant toujours sur des thérapeutiques non ciblées exposant à des effets secondaires non négligeables. Explorer de manière plus poussée le rôle de l’immunité innée, notamment des lymphocytes T innés pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques s’intégrant aux stratégies actuelles de manières non exclusives. Avec ce projet il s’agira 1) de comprendre l’homéostasie de ces cellules en situation physiologique et pathologique 2) d’identifier les interactions entre ces cellules et les cellules clés de la physiopathologie du lupus comme le lymphocyte B 3) d’analyser la nature de leur participation au cours des différentes atteintes d’organes et 4) d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques pouvant permettre de moduler leur action.

Procédures

Toutes les hypothèses, issues de la littérature, seront évaluées, au préalable, sur des modèles in vitro (culture cellulaire) et ex vivo (cellules issues de donneurs de sang humains et de patients atteints de lupus). Seuls les paramètres d’intérêts seront sélectionnés afin d’être testés in vivo chez la souris. En effet, il n’existe pas de modèles in vitro ou ex vivo capables de reproduire la complexité d’une réponse immunitaire d’un organisme vivant. Les animaux transgéniques devront être génotypés au moment du sevrage (3 semaines après la naissance). Pour cela un prélèvement d’un 1 mm de queue sera réalisé sous anesthésie générale (anesthésie gazeuze). Ce protocole dure moins de 3 minutes en tenant compte du temps d’anesthésie, du prélèvement (instantané) et du réveil de l’animal et ne sera pas renouvellé. Afin de reproduire le développement d’un lupus chez l’Homme, les souris adultes (8 semaines minimum) recevront 1 injection unique de 500µL par voie intrapéritonéale. Ce protocole dure moins de 1 minute en tenant compte de la contention de l’animal et de l’injection et une seule injection par animal sera réalisée. Des prélèvements sanguins seront réalisés 1 fois par mois à partir de J15 après l’injection (donc les animaux auront entre 1 et 7 prélèvements sanguins (pour les animaux conservés jusqu’à J180) afin de suivre les paramètres inflammatoires et l’apparitions des anticorps auto-immuns marquant le développement de la pathologie. 100 µL de sang seront prélevés en prélèvement submandibulaire en utilisant des lancettes et le sang sera collecté dans des tubes héparinés. Cette procédure dure quelques secondes. Les souris seront toujours anesthésiées avant de procéder au prélèvement sanguin. Tout au long des expériences, les souris seront soigneusement surveillées quotidiennement pour détecter les changements physiques ou comportementaux. Ainsi, le poids et les comportements, seront relevés de façon journalière les 1ers jours après l’injection puis 3 fois par semaine entre 15 jours et 180 jours après l’injection.

Impact sur les animaux

Notre modèle de lupus est induit par une injection intrapéritonéale ce qui provoque un stress et une douleur au point d’injection (piqûre). Quelques semaines après l’injection, l’inflammation pulmonaire peut entrainer des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal et provoquer des troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité. A plus long terme (plusieurs mois) les souris développent des symptômes inflammatoires variés pouvant prendre différentes formes. Les plus courantes étant une alopécie derrière la tête et sur le dos et l’apparition de problèmes articulaires, notamment au niveau des extrémités (pattes), pouvant être handicapant pour l’animal. Une diminution de l’activité des souris peut ainsi être observée.

Devenir

Les animaux utilisés pour l’entretien des lignées transgéniques seront réutilisés, en tant qu’animal reproducteur, pendant 1 an. Ces animaux seront ensuite euthanasiés et d’autres animaux plus jeunes seront mis en accouplement. Tous les autres animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les poumons, la rate et les reins pour analyser les réponses immunitaires se développant dans ces organes. Il ne restera donc pas d’animaux vivants en fin de procédure.

Remplacement

Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme entier pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Cependant, nous utilisons au laboratoire, des systèmes de culture in vitro (hybridomes de cellules immunitaires), pour étudier certains paramètres avant de réaliser des expériences in vivo. De plus, nous avons développé des modèles d’analyses des cellules humaines issues de donneurs sains ou de patients atteints par de lupus systémique. En effet en parallèle de cette étude réalisée chez l’animal, nous avons développé une étude clinique dont l’objectif est de caractériser les lymphocytes T innés de patients atteints de lupus et hospitalisés dans le service de Médecine interne du CHU. Ces modèles nous permettent d’analyser et d’affiner certaines hypothèses avant de les tester in vivo chez la souris. Ils permettent également de confirmer chez l’Homme, les résultats obtenus chez la souris.

Réduction

Tout d’abord, nous tenons à souligner que les expériences in vitro et ex vivo avec des cellules humaines, limiteront le nombre d’hypothèses et donc le nombre de souris à utiliser. De plus, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Lors de nos expérimentations, nous comparerons les souris traitées aux souris non traitées, en utilisant des tests statistiques. Nous souhaitons une puissance de test de 90% de détecter une différence à un niveau de significativité de 5%. Pour chaque condition, 12 souris ayant reçu l’injection induisant le lupus et 12 souris ayant reçu l’injection d’huile minérale seront nécessaires. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …). L’objectif initial est de tester 4 lignées de souris transgéniques comparées à 2 lignées consanguines contrôles. Le nombre total de souris est ainsi estimé à 768 pour l’ensemble de ce projet d’équipe planifié sur 5 ans. Cet objectif sera évalué au cours de l’avancement des expériences et de la validation des hypothèses et pourra être revu à baisse. En effet, si certains génotypes s’avèrent ne pas être pertinents in vitro et/ou ex vivo par rapport à la maladie lupique, alors les expériences in vivo ne seront pas réalisées. Ainsi, nous avons actuellement une étude clinique analysant la fréquence et les fonctions des cellules MAIT chez des patients atteint de lupus. Si aucun impact de la pathologie sur les cellules MAIT n’est observé alors les expériences sur les souris CAST et CAST-MR1-/- ne seront pas réalisées. De plus, les analyses en cinétique seront réalisées au fur et à mesure des résultats. Ainsi, les expériences des temps les plus précoces (J15 et J30) seront réalisés dans un premiers temps et si nous n’observons pas de différences entre les différentes lignées de souris alors les temps tardifs (J90 et J180) ne seront pas réalisés.

Raffinement

Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée par toujours les mêmes expérimentateurs afin d’habituer les animaux et de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. De plus, une pesée régulière des animaux sera effectuée. Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi des points limites et les animaux présentant un de ces critères seront euthanasiées.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous utiliserons des souris consanguines. Nous avons choisi la souris, car elle offre les avantages suivants : - La souris est l’espèce la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires limitant de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. - Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. - Notre laboratoire dispose de différentes lignées de souris transgéniques adaptées à l’analyse du rôle du FcRn et des lymphocytes T innés. De plus, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 à 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant. Les animaux utilisés pour le maintien des lignées seront mis en reproduction à partir de l’âge de 7 semaines et jusqu’à 1 an.

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont colonisées par gavage avec des souches d'Escherichia coli, soumises à un régime gras pendant plusieurs semaines à plusieurs mois et à des tests répétés de tolérance au glucose, certaines souches pathogènes pouvant entraîner une perte de poids déclenchant leur mise à mort. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"irremplaçable" pour ces bactéries et reconnaît ne pas avoir prévu d'analyse statistique préalable du nombre d'animaux. Toutes les souris sont tuées pour disséquer leurs tissus, un effectif de 3 360 justifié par la recherche d'un "seuil statistiquement valable".

Objectifs

Comprendre : i) les altérations du métabolisme du glucose et du microbiote intestinal induites par les infections à E. coli; ii) le rôle de l'inflammation intestinale dans les phénomene du point i); iii) comoprendre les mécanismes moléculaires selon lesquels les maladies métaboliques type obésité et diabète de type 2 predisposent aux infections.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge des patients métaboliques et qui souffrent des maladies infectieuses à E. coli

Procédures

9 procédures : voir point 4. Durée de la procédure 1 de colonisation ~5 seconds, le temps du gavage; pour la procédure 2 high-fat diet courte durée, 4 semaines; pour la procédure 3 high-fat diet longue durée, ~3 mois; pour la procédure 4 IPITT 1 heure; pour la procédure 5 IPGTT 2 heures; pour la procédure 6 OGTT 2 heures; pour la procédure 7 IPPTT 2 heures; pour la procédure 8 injection de MCC950, ~5 seconds, le temps de l'injection; pour la procédure 9 de la NFS, durée de ~15 seconds, le temps du prélevement du sang.

Impact sur les animaux

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites.

Devenir

Les souris resterons en vie à la fin de chaque procédure. Les souris seront mises à mort à la fin de chaque protocole complet indiqué en 3.4.10. La mise a mort est nécessaire afin de permettre la dissection des tissus pour réaliser les analyses moléculaires et identifier les facteurs moléculaires à la base des phénotypes observés.

Remplacement

Pas adaptable dans ce cas car si les études avec des cellules ont permis d’identifier et caractériser les dommages à l'ADN provoqués par les génotoxines, le recours à l’animal est irremplaçable pour ce type d'étude avec des souches bactériennnes. En effet, aucun modèle cellulaire ne permet de récapituler les processus de la colonisation intestinale bactérienne, de la translocation, c’est-à-dire la diffusion des bactéries vers les autres organes, ni d’évaluer, au niveau de l’individu, le rôle de la colonisation par des bactéries produisant des génotoxines sur la santé.

Réduction

Le chiffre de 3360 souris nous permettra d’atteindre un seuil statistiquement valable et donc de pouvoir interpréter les résultats obtenus. Cela permettra donc de ne pas répéter les expérimentations tout en respectant la réduction du nombre d’animaux employés (règle de 3 R). En ce qui concerne les points limites (critères d'interruption) pour le raffinement des protocoles, l’inhibition pharmacologique de l’inflammasome intestinal NLRP3 et les procédures de colonisation n’ont pas été rapportées pour induire de douleur chez l’animal et sont bien tolérées sauf avec certaines souches pathogènes. Pour ces souches spécifiquement, le temps d’expérimentation sera réduit afin de minimiser la mortalité. Une perte (non attendue) du poids initial supérieure à 20% ainsi que des éventuels états de prostration ou isolement nous conduiront à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Nous envisageons d’utiliser de souris mâles, dont la littérature montre une vaste gamme de données sur le microbiote intestinal.

Raffinement

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites. Nous ne prévoyons pas une étude statistique à l’avance (analyse de puissance) car nous n’avons pas un pourcentage précis de modulation de variables que l’on va analyser.

Choix des espèces

Le microbiote intestinal chez la souris est désormais bien connu et sa structure ressemble à celle du microbiote intestinal chez l’homme. Pour cela, la translation des résultats obtenus chez la souris vers l’homme pourrait être faite rapidement (Serino et al., Acta Diabetol. 2013). Nous utiliserons des souris de 12 semaines d’âge au moment de la colonisation avec les souches bactériennes d’intérêt. Cette âge tient compte du temps d’acclimatation des souris en zootechnie (2 semaines), de l’éventuel protocole antibiotique (2 semaines) avant colonisation et du traitement par régime gras 60%HFD (4 semaines ou 3 mois, selon le protocole). Dans ce dernier cas les souris arriveront à l’âge de 6 semaines. Cette âge permet une réponse optimale des souris au régime gras diabétogène/obésogène pour l’induction des maladies métaboliques. Dans les autres cas sans régime gras les souris arriveront en zootechnie à l’âge de 10 semaines.

1000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité expédiés vers d'autres laboratoires après l'opération et les autres tués. Chaque animal subit l'ablation de la rate sous anesthésie, une chirurgie que le porteur associe à des risques de douleur, de saignement, de mauvaise cicatrisation et d'infection. Ce prestataire produit ainsi 100 rats et 100 souris par an sans rate, destinés aux projets de ses clients. Il reconnaît qu'"aucune approche statistique" n'a fixé les effectifs et présente l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain.

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires et l'immunologie. Ce projet a pour but de fournir des rongeurs sans la rate donc déficient pour la production de globules rouges, la cicatrisation, la coagulation et dans l’immunité en vue de leur utilisation dans les études expérimentales de nos clients. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année pour nos clients sur nos animaux : 100 rats et 100 souris par an.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Chaque animal subira une ablation de la rate sous anesthésie d'une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie et celle en post-opératoire, le risque de saignement continu, de mauvaise cicatrisation et un risque infectieux (baisse du système immunitaire).

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés. Les autres animaux seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans les études expérimentales.

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce entre rat et souris est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet. Puis, 5-6 jours après l'opération, les animaux lui seront envoyés après un examen vérifiant la bonne récupération des animaux de la chirurgie.

3840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales sous la peau, puis des vecteurs viraux AAV et des anticorps, avec des prélèvements de sang répétés, pour tester une stratégie censée stimuler une réponse immunitaire contre la tumeur. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent former des métastases "causant de la souffrance animale" et une perte de poids importante. Il affirme que "seuls les modèles animaux" permettent de tester cette approche et envisage une production des vecteurs pour l'humain.

Objectifs

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succés des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénificiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. Alors que les mécanismes de résistance primaires et secondaires ont été identifiés au cours des dernières années, il est devenu évident que pour les tumeurs faiblement immunogènes et/ou avec un faible infiltrat immunitaire, de nouvelles stratégies ont besoin d'être développées afin de stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Dans ce contexte, les vecteurs viraux ciblant les cellules tumorales et/ou immunitaires semble être un outil idéal. L'objectif du projet est de développer une approche basée sur l'utilisation de vecteurs viraux de type AAV afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales et/ou les cellules suppressives du microenvironnement tumorale afin de stimuler les réponses immunitaires dirigées contre la tumeur. Ces AAV ont montré des résultats intéressants in vitro avec l'induction d'une mort cellulaire et d'une inflammation qui nous semble favorable à l'induction des réponses immunitaires in vivo. Nous pensons que l'injection intratumorale entrainera l'induction d'une réponse immunitaire, ce qui entrainera une diminution de la croissance tumorale, voire un rejet. Avec cette approche, nous introduisons une capacité lytique des cellules tumorales par les différents AAV, qui n'est normalement pas présente naturellement dans les AAV.

Bénéfices attendus

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succés des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénificiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. De nouvelles thérapies innovantes ont donc besoin d'être mise en place. Pour ce faire, nous attendons que l'injection intra-tumorale des AAV codants pour les différentes morts cellulaires immunogéniques (pyroptose et nécroptose) induise un rejet de la croissance tumorale avec l'induction d'une réponse immunitaire permettant l'augmentation de la survie des animaux traités. De plus, l'utilisation de nos vecteurs codants pour les protéines inductrices de mort cellulaire immunogénique seule mais aussi en combinaison de différentes cytokines apporte des effets à long terme chez nos animaux avec la mise en place d'une réponse immunitaire de longue durée permettant le contrôle voire le rejet à long terme des différents modèles tumoraux. L'association avec des immunothérapies connues permettrait d'amplifier ces phénomènes et donc d'obtenir un meilleur contrôle de la croissance tumoral (médié par le système immunitaire). Les vecteurs AAV possèdent de nombreux avantages et ont déjà été approuvés en clinique en Europe et aux états-unis. Il est donc envisageable de produire ces vecteurs pour une utilisation chez l'homme si nos stratégies se montrent convaincantes.

Procédures

Injections de cellules tumorales : injection en sous-cutanée sur le flanc, sur animal anesthésié. Les souris seront injectées deux fois maximum pour les protocoles de vaccination et une seule injection pour les autres protocoles. Chaque injection dure moins de 10 secondes. Prélèvement de sang sur animal anesthésié. Les souris seront prélevées maximum 3 fois à une semaine d'intervalle entre les prélévements et en phase terminale. Les prélevements de sang durent moins de 10 secondes. Injections pour l'administration d'anticorps thérapeutiques : injection en intrapéritonéale (IP) sur animal vigile. Ces injections IP seront répétées 4 fois maximum avec un intervalle d'injection de 2 jours entre les administrations. Les injections durent moins der 10 secondes.

Impact sur les animaux

Il est possible que l'injection en sous-cutanée sois mal réalisée et entraine une injection de cellules tumorales dans des tissus non souhaités. Cependant, ce problème est contrebalancé par l'expérience que nous avons dans le laboratoire sur ce type d'injection. Une fois injectées, les cellules tumorales peuvent former des tumeurs secondaires (métastases) dans différents tissus causant de la souffrance animale. Pour limiter cet ecueil, le nombre des cellules tumorales à injecter est bien documenter dans littérature limitant de ce fait ce phénomène. Les modèles tumoraux peuvent induire aussi une perte de poids importante et un mauvais état global de l'animal. De plus, l'injection d'AAV codant pour des formes de mort inflammatoires pourrait induire une inflammation systèmique si les différents AAV vont transduire différents organes ou tissus de l'animal. Cependant nous limitons cet effet secondaire par une injection intratumorale avec un volume d'injection limité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever le sang et des organes pour analyse.Aucun animal ne peut donc être replacé, adopté ou réutilisé.

Remplacement

Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration qui existe entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique ne peut se faire que chez l’animal. Dans ce cadre la souris est utilisée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée pour optimiser les protocoles expérimentaux et s’assurer de la non-obtention de résultats déjà publiés. Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, des étapes de sélection in vitro des meilleurs candidats sera effectuée afin de réduire drastiquement le nombre d'animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée qui peut être limitée en se basant sur une grille d’observation visant à définir des points limites à partir desquels l’expérience sera arrêtée immédiatement. Si les animaux présentent des signes de douleur, un anti-douleur sera utilisé. Un enrichissement est également apporté par des abris de cellulose et des carrés de coton vierge.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris permet aussi l’utilisation de modèle transgénique, des modèles de Knock-Out qui peuvent être intéressant dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le cancer. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (animaux âgés entre 6 et 8 semaines au début de protocole) afin que le système immunitaire soit mature au moment de l’inoculation de la tumeur et de l’injection intra-tumorale des différents AAV.