Système immunitaire

240 crapauds communs vont être capturés dans la nature, prélevés puis relâchés sur place, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu subit sous anesthésie locale une ponction de sang directement dans le cœur, avec deux tentatives au maximum, avant d'être surveillé au réveil puis relâché en moins d'une heure. Le porteur étudie l'effet de la pollution lumineuse nocturne sur leurs défenses immunitaires le long d'un gradient d'éclairage, et présente les retombées pour la conservation des amphibiens. Il affirme que ces traits immunitaires ne sont "pas modélisables" et qu'aucune expérience in vitro ou in silico ne peut y donner accès.

Objectifs

Dans les dernières décennies, la lumière artificielle nocturne a considérablement augmenté et est maintenant considérée comme une source de pollution. Le halo lumineux généré par les villes s’étend jusqu’à des zones naturelles pourtant éloignées de plusieurs dizaines de kilomètres des centres urbains. Du fait de l’urbanisation croissante, les zones humides, qui concentrent une part considérable de la biodiversité, se retrouvent fréquemment dans des aires urbaines et péri-urbaines exposées à la pollution lumineuse. Les amphibiens, qui sont le groupe de vertébrés le plus menacé à l’échelle mondiale, dépendent de ces zones humides en raison de leur cycle de vie complexe à l’interface entre les milieux aquatiques et terrestres. Leur rythme d’activité, principalement nocturne, les exposent particulièrement à la pollution lumineuse. Nous avons montré, à l’aide d’une approche transcriptomique, que des têtards de crapaud commun Bufo bufo soumis à de la lumière nocturne durant leur développement présentent une sous-expression de nombreux gènes liés à l’immunité innée, et une sur-expression de gènes impliqués dans l’inflammation par rapport aux animaux témoins. Or, en milieu naturel, la capacité du système immunitaire à lutter contre les agents pathogènes est une fonction cruciale pour ces espèces très sensibles aux infections virales et fongiques. Il est donc nécessaire de déterminer si les modifications transcriptomiques observées chez les têtards exposés à cette pollution se traduisent bien par des capacités immunitaires altérées à l’échelle de l’organisme. Afin de répondre à cette question, le projet proposé a pour but de caractériser fonctionnellement l’impact de la pollution lumineuse nocturne sur le phénotype immunitaire du crapaud commun. Pour cela, nous allons mesurer les capacités immunitaires et l’état de santé de différentes populations de crapauds en fonction d’un gradient de pollution lumineuse. Cela permettra de tester si la modification de l’expression des gènes liés à l’immunité a bien des conséquences fonctionnelles au niveau des capacités immunitaires des adultes, leur permettant de lutter contre les agents pathogènes. Ce type d’étude, bien que primordiale en biologie de la conservation et en éco-immunologie, est très rarement menée dans la nature compte tenu de la complexité des variables immunitaires mise en jeu. Les résultats attendus seront directement utilisables en biologie de la conservation par les gestionnaires des territoires.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de cette expérimentation seront valorisables à la fois au niveau fondamental en Eco-immunologie et à un niveau plus appliqué en Biologie de la Conservation. En effet, dans le cadre du concept de Santé Unique, comprendre les dynamiques d’interactions entre les sources de pollutions anthropiques et les espèces en milieu naturel est indispensable au contrôle des épidémies futures. Ce projet va permettre, pour la première fois, de caractériser de manière précise les réponses immunitaires chez un amphibien dans des conditions de lumière nocturne réalistes présentes sur le terrain. Nous allons utiliser une combinaison de mesure de traits immunitaires qui permettent de mieux appréhender la complexité des effecteurs (innés, acquis, cellulaires et humoraux) caractérisant la fonction immunitaire. Cette étude pionnière donnera des indications sur la pertinence et la

Procédures

Pour les 240 crapauds prélevés (nombre maximum), nous prévoyons un prélèvement sanguin par cardiocentèse après anesthésie des individus par application cutanée de la crème EMLA 5% lidocaïne + prilocaïne (voie percutanée). Le prélèvement sera réalisé en quelques minutes. Pas plus de deux tentatives ne seront réalisées chez le même individu. En comptant l’induction de l’anesthésie (environ 10 min) et le temps de réveil monitoré par un opérateur (de 5 à 30 min selon les individus), nous évaluons le temps total de la procédure à partir de la capture à un maximum de 1 heure. Après la procédure, les individus seront relâchés et ne seront donc échantillonné qu’une seule fois au cours de ce projet.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention peut induire un stress chez les crapauds, qui sera minimisé par une limitation de la durée de la contention entre 3 et 5 minutes. La prise de sang par cardiocentèse représente un effet traumatique mais modéré car se fera sous anesthésie (application locale crème EMLA, dosage standardisé).

Devenir

Après la capture et la prise de sang effectué sous narcose, suivie de la surveillance des individus lors de la période de réveil, tous les individus vigiles présentant un comportement actif normal seront relâchés en milieu naturel sur le lieu exact de leur capture dans un délai évalué à 1 heure. Une seule session de capture sera organisée sur chacun des sites, les individus ne seront donc capturés qu’une seule fois pour ce projet.

Remplacement

La réponse immunitaire est une fonction physiologique complexe, composée de multiples effecteurs (innés et adaptatifs, cellulaires et humoraux) qui est modulée en miroir des conditions environnementales locales. Les traits immunitaires des individus, notamment en milieu naturel, ne sont pas modélisables et leur mesure nécessite le prélèvement sanguin sur organisme vivant et sain. Aucune expérience in vitro ou in silico ne peut permettre d’accéder à ce type de données.

Réduction

La capture et l’échantillonnage réalisés sur les individus adultes ont été optimisés statistiquement, de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et prélevés dans la nature tout en obtenant des résultats significatifs. Quinze individus par site seront capturés. Cela représente le nombre minimal d’individus nous permettant d’avoir une information réaliste et exploitable sur l’état de santé des crapauds du site. Une autorisation préfectorale a été obtenue pour les sites concernés, le nombre d’individus et les prélèvements réalisés. Enfin, la quantité de sang prélevée sera utilisée dans son entièreté. Les culots de globules rouges restants des prélèvements sanguins seront conservés à -80° pour des mesures ultérieures de longueur de télomères, mesure possible chez les amphibiens qui présentent la particularité d’avoir des globules rouges nucléés. Cette mesure permettra une évaluation du stress environnemental.

Raffinement

Le bien-être et la minimisation du stress infligé aux animaux est une condition sine qua non de cet échantillonnage en milieu naturel et fera l’objet de toute notre vigilance et notre adaptation à chaque individu échantillonné. Les crapauds seront délicatement prélevés sur le terrain à la main avec port de gants à usage unique. Chaque individu sera essuyé délicatement avant pesée nous permettant

Choix des espèces

Les amphibiens sont un taxa très menacé mondialement. En dehors des chiroptères, les amphibiens contiennent la plus grande proportion d’espèces nocturnes (93%) susceptibles d’être affectés par la pollution lumineuse. Le crapaud commun, espèce sentinelle, est présent dans les zones péri-urbaines et urbaines régulièrement soumise à la pollution nocturne. Ainsi, dans son environnement naturel, cette espèce est soumise à des éclairements bien supérieurs aux éclairements de la photopériode naturelle, pouvant affecter sa physiologie et son comportement. Le choix de cette espèce est donc particulièrement adapté à l’étude des effets de la pollution lumineuse. De plus, la pollution lumineuse semble avoir d’importants effets sur le système immunitaire de cette espèce, la fonction physiologique de défense des individus en milieu naturel. Ce taxa étant particulièrement sensible aux épidémies bactériennes et fongiques, les résultats obtenus seront susceptibles d’avoir une grande portée de conservation et pour la gestion des territoires. Nous avons choisi de travailler sur les adultes car ce stade est particulièrement impacté par la pollution lumineuse nocturne, notamment au moment de la reproduction (sortie de l’hiver – début du printemps) où ils doivent se déplacer pour rejoindre les sites de ponte. De plus, des perturbations physiologiques à ce stade auraient directement des impacts sur le succès reproducteur des individus, et donc sur les dynamiques des populations. Enfin, le système immunitaire des individus adultes étant complètement développé, les résultats obtenus seront plus généralisables qu’à des stades plus juvéniles.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour dans le nez, sous anesthésie, un condensat de fumée de cigarette pendant huit semaines, puis une bactérie ou un champignon respiratoires, avant d'être tuées pour prélever leur sang et leurs poumons. Le porteur décrit une perte de poids initiale et des troubles respiratoires possibles, et indique que l'infection bactérienne rend les souris fébriles sans les tuer. Il étudie ainsi les mécanismes de la bronchopneumopathie chronique obstructive et affirme nécessaire de prendre en compte l'"organisme en entier" après des travaux in vitro.

Objectifs

La Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) est une maladie inflammatoire chronique des bronches, se caractérisant par un rétrécissement progressif et une obstruction permanente des voies aériennes dont le facteur de risque principal est la fumée de cigarette. Nous savons maintenant que la progression et la sévérité de la BPCO est accentuée suite à des exacerbations provoquées essentiellement par des infections respiratoires. Malheureusement, les mécanismes qui gouvernent la pathogenèse des exacerbations de BPCO sont encore obscurs à ce jour et les thérapies demeurent inefficaces. Cela est dû à une mauvaise compréhension des mécanismes sous-jacents de la genèse de la maladie. Dans ce projet, nous nous intéressons aux pathogènes fréquemment isolés au cours de l’exacerbation des BPCO, la bactérie Haemophilus influenzae et le champignon Aspergillus fumigatus. Ce projet vise à déterminer les mécanismes impliqués dans l’inflammation pulmonaire causée par la cigarette et les pathogènes grâce à des modèles murins.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre d’en apprendre davantage sur les mécanismes impliqués dans l’inflammation chronique au cours de la BPCO et notamment dans l’exacerbation de BPCO par Haemophilus influenzae et/ou Aspergillus fumigatus. Une première expérience sur modèle murin avec Aspergillus fumigatus nous a permis d’identifier des médiateurs inflammatoires clés impliqués dans le recrutement de cellules immunitaires dans l’exacerbation de BPCO médiée par le champignon Aspergillus fumigatus et nous souhaiterions étudier plus en détail les mécanismes permettant cette augmentation d’inflammation. Nous utilisons des souris sauvages et une lignée de souris génétiquement modifiée permettant d’invalider des enzymes du neutrophile car ce sont des enzymes qui vont dégrader le tissu pulmonaire et conduire à une perte des fonctions respiratoires.

Procédures

Instillation intranasale de solution saline (souris contrôles) ou de fumée de cigarette en solution (souris cigarettes et Cigarettes+pathogènes) 1 fois/jour, 5 jours/semaine et pendant 8 semaines. Instillation intranasale de solution saline (souris contrôles et souris cigarettes) ou de pathogènes (souris pathogènes et Cigarettes+pathogènes) additionné de solution saline ou de fumée de cigarette en solution : cette instillation aura lieu 4 semaines après le début de l’expérimentation et 24h avant la mise à mort des animaux, à la place de l’instillation effectuée les autres jours, afin de ne réaliser qu’une anesthésie et une instillation ces 2 jours. Toutes les instillations se feront après anesthésie (1 à 3min en fonction de la vérification de l’immobilité et absence de réflexe de retrait de la patte arrière des animaux en appuyant sur celle-ci). L’instillation intranasale dure moins de 2 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont une perte de poids au démarrage de l’exposition mais le poids devrait se stabiliser au cours des semaines, un stress notamment lié à l’anesthésie et qui ne devrait pas durer après l’exposition, possibilité de troubles respiratoires après exposition aux pathogènes ou à la fumée de cigarette en solution ou la combinaison exposition aux pathogènes et à la fumée de cigarette en solution. Concernant l’infection intranasale bactérienne, elle rend les souris fébriles indépendamment de leurs génotypes 24h post-challenge sans engendrer de mortalité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les prélèvements sanguins et pulmonaires.

Remplacement

Afin de mener à bien ces investigations, des études in vitro ont été menées en amont. Il s’agit à présent de prendre en considération l’organisme en entier pour un cadre plus complexe et réel. De plus, la souris est un modèle éprouvé et fiable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour ne garder que le nombre nécessaire aux analyses statistiques. L’utilisation de 8 souris (4 mâles et 4 femelles = ratio équivalent) par groupe permettra d’obtenir des résultats statistiquement significatifs à cause des variabilités de réponse qui peuvent exister entre souris et pouvoir regarder les biais sexuels éventuels (4 mâles et 4 femelles/groupe). Lors de notre précédente expérimentation, l’utilisation de 8 souris par groupe a permis d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe, dans des conditions d’hébergement optimisées pour assurer leur confort (enrichissement, soins et suivi post-instillation). Une anesthésie générale sera réalisée avant toute instillation pour limiter tout risque de douleur et d’angoisse pouvant résulter de l’intervention. Les animaux seront observés 2 fois par jour et pesés 2 fois par semaine pour suivre leur prise de poids. Les expérimentateurs sont formés aux gestes impliquant un contact avec l’animal et à l’observation des signes cliniques fondamentaux. La connaissance des modèles animaux a permis de définir des points limites précis.

Choix des espèces

La souris est utilisée dans cette procédure plutôt que la drosophile car il s’agit d’un modèle proche de l’Homme et qui est adapté pour étudier la réponse inflammatoire ou immunitaire avec des mécanismes similaires à ceux présents chez l’Homme. La souris peut être modifiée génétiquement pour définir l’importance relative du gène d’intérêt en condition physiologique ou physiopathologique Les souris utilisées auront entre 8-10 semaines, soit environ 25-30 grs, afin d'utiliser des animaux à maturation pulmonaire.

94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie des injections d'infliximab agrégé ou non à la base de la queue, subissent des biopsies de peau et des prises de sang, puis sont tuées au dioxyde de carbone pour prélever leurs ganglions et organes lymphoïdes. Le porteur décrit une douleur au point d'injection et un état inflammatoire de type fébrile qu'il juge transitoire, sans perte de poids attendue. Il veut suivre le trajet des agrégats d'anticorps dans l'"organisme entier" et affirme que les cultures de cellules ne suffisent pas à trancher.

Objectifs

Lorsque les patients sont traités avec des anticorps thérapeutiques, ces derniers peuvent s’associer pour former des agrégats pouvant produire des effets secondaires délétères pour les patients. Notre équipe étudie la façon dont les agrégats d’anticorps sont perçus par notre système immunitaire. Nous avons déjà montré qu’ils peuvent activer différents types de cellules immunitaires humaines en culture. Toutefois, ces données in vitro ne nous permettent pas d’évaluer la prise en charge des agrégats par les différentes cellules au sein de l’organisme entier, ni d’étudier le transport des formes agrégées d’anticorps depuis le site d’injection vers les organes où se développe la réponse immunitaire. Pour cette raison, un modèle d’étude animal est nécessaire, afin de disposer de données concernant la dynamique de prise en charge des agrégats dans l’organisme entier, et d’identifier les cellules immunitaires activées au niveau des organes lymphoïdes, où ont lieu les interactions entre cellules immunitaires. Cette étude sera menée chez la souris et est dimensionnée pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, en garantissant la possibilité de dégager des conclusions robustes. Les aspects de raffinement des procédures de maintien et manipulation des animaux ont été également optimisés.

Bénéfices attendus

L’immunogénicité des anticorps thérapeutiques est suivie par la mesure de différents paramètres chez les patients en cours de traitement, cependant l’effet particulier des agrégats d’anticorps ne peut être distingué lors de ce suivi. Afin de prédire et d’évaluer la réponse immunitaire due spécifiquement aux agrégats, ces études doivent être complétées par un modèle intégré, permettant de suivre la migration des cellules immunitaires prenant en charge les agrégats au site d’injection, leur activation, ainsi que leurs interactions avec un environnement cellulaire complexe au sein de l’organisme. C’est en cela que le modèle animal est pertinent. Ce projet permettra d’apporter des réponses précises quant à la prise en charge des agrégats d’anticorps au site de l’injection, de suivre les populations cellulaires permettant leur migration vers les organes lymphoïdes, et d’étudier de manière approfondie les populations de cellules recrutées dans ces organes. A notre connaissance, une telle étude n’a jamais été réalisée. Elle apportera des éléments scientifiques nouveaux quant au rôle des agrégats dans l’immunisation contre les anticorps thérapeutiques et la mobilisation des cellules immunitaires impliquées. Ces données sont importantes pour comprendre comment les patients s’immunisent contre leur traitement et quelle est la contribution des agrégats protéiques dans ce processus.

Procédures

Il s’agit d’administrer un anticorps thérapeutique sous forme agrégée ou non à différents groupes de souris, afin d’analyser les réponses cellulaires induites, ainsi que le cheminement des agrégats dans les organes lymphoïdes. Pour cela les souris seront sous anesthésie gazeuse et l’anticorps sera administré sous forme agrégée ou non, par voie sous cutanée à la base de la queue. Pour 3 groupes, les souris seront euthanasiées par inhalation de dioxyde de carbone 2h, 4h et 24 heures après l’injection, puis des biopsies de la peau seront réalisées au site d’injection, pour en extraire les cellules cutanées pour analyse. Les ganglions lymphatiques inguinaux seront également prélevés pour également y analyser les populations de cellules. Pour 3 autres groupes, des prélèvements sanguins seront effectués à 3 temps (J7, J14 et J28), afin de réaliser des dosages dans le sang. Pour limiter l’anxiété et la douleur, les animaux seront prélevés sous anesthésie gazeuse. Puis les souris seront euthanasiées au 28ème jour, par inhalation de dioxyde de carbone, et les organes lymphoïdes seront prélevés pour analyser les populations de cellules immunitaires qui s’y trouvent.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration des différents produits, la viscosité des préparations va probablement engendrer une douleur au point d’injection et un état général inflammatoire des animaux (fièvre), comme lors d’une vaccination. Cet état devrait être transitoire cependant, et nous n’anticipons pas de perte de poids ou de dégradation de l’état général des animaux. L’effet de ces injections répétées sera la mise en place d’une réponse immunitaire chez l’animal, sans dégradation de l’état général attendue. Pour limiter le stress des souris lors des immunisations et des prélèvements sanguins, elles seront anesthésiées par inhalation gazeuse.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélèvements de tissus et analyses post-mortem.

Remplacement

Chez les patients en cours de traitement, l’immunogénicité des anticorps thérapeutiques est suivie par la mesure de différents paramètres cependant l’effet particulier des agrégats d’anticorps ne peut être distingué lors de ce suivi. Il faut donc prévoir des modèles alternatifs permettant l’étude de l’impact des agrégats d’anticorps dans l’immunogénicité globale. On peut ainsi utiliser des cellules en culture issues de donneurs sains ou de patients. Mais ces études doivent être complétées par un modèle intégré, permettant de suivre au sein d’un organisme entier la migration des cellules immunitaires prenant en charge les agrégats au site d’injection, leur activation, ainsi que leurs interactions avec un environnement cellulaire complexe au sein des organes lymphoïdes. Ce type d’étude ne peut être directement réalisé chez l’homme, c’est pourquoi le modèle animal reste encore pertinent, et en particulier la souris.

Réduction

Notre protocole a été conçu pour minimiser le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la possibilité de dégager des conclusions robustes de nos travaux, pour les deux axes du projet : 1) Etude des réponses immunitaires chez des souris immunisées par l’infliximab agrégé ou non Sur la base des travaux antérieurs réalisés sur l’animal dans notre laboratoire, nous avons calculé que ces expériences nécessiteront 8 animaux par groupe afin de pouvoir réaliser des tests statistiques adaptés aux groupes de petits effectifs. Donc au total en nombre d’animaux est restreint à 40 animaux. Cette première procédure constitue une étude pilote de manière à vérifier que les souris sont capables de monter une réponse immunitaire contre l’infliximab et/ou les agrégats. Autrement dit elle est un pré-requis avant d’initier le second volet du travail. 2) Etude de la prise en charge et du transport des agrégats d’anticorps thérapeutiques par les sous-populations de DC La réalisation de l’ensemble de cette procédure, tenant compte des groupes de souris nécessitera 54 souris en tout. En effet, comme expliqué pour la première procédure nous avons calculé que 8 souris par groupe (traitées par infliximab non agrégé et agrégé) seront nécessaires afin de garantir l’interprétation des résultats et la possibilité de générer des conclusions statistiquement étayées.

Raffinement

Les souris seront hébergées selon les règles en vigueur en termes de densité de population et surveillées quotidiennement. Leur entretien sera réalisé par la même personne. Le temps de manipulation des souris sera minimisé afin de limiter le stress. Il sera réalisé par le même manipulateur, tout au long des protocoles. Les manipulations susceptibles d’induire de la douleur chez les animaux (injections et prélèvements sanguins) seront réalisées sous anesthésie gazeuse et une attention particulière de l’état général des souris sera apportée, pour déceler un comportement anormal. Une souris dont le comportement se modifie (prostration, poils mal entretenus et/ou hérissés) sera surveillée de façon accrue. Toute souris ayant perdu 20 % de son poids depuis le début du protocole ou 10% en 24h sera ainsi retirée du protocole. Les souris blessées au cours d’éventuelles bagarres seront isolées et les plaies désinfectées. Si les plaies perdurent, la souris sera retirée du protocole et euthanasiée. Le jour du sacrifice, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées.

Choix des espèces

Les expériences réalisées étudient la mobilisation des cellules du système immunitaire suite à l’immunisation par un anticorps thérapeutique natif ou agrégé. Classiquement ce type d’expérience se fait chez la souris car les mécanismes immunitaires sont comparables à ceux observés chez l’homme, et que de nombreux outils d’analyse sont disponibles pour suivre les cellules immunitaires et leurs réponses. C’est également le principal modèle animal utilisé dans la littérature pour les études d’immunogénicité chez le petit animal. Les souris utilisées pour ce type d’étude auront 7 semaines, et commenceront le protocole après deux semaines d’adaptation à leur nouvelle animalerie, afin d’atteindre le poids de 20g.

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'ablation chirurgicale du ménisque du genou, l'autre une injection de monoïodoacétate dans l'articulation pour provoquer une arthrose, puis toutes marchent sur un tapis tous les quinze jours pendant quatre-vingt-dix jours afin de mesurer leur douleur. Le porteur précise qu'aucun traitement anti-inflammatoire n'est possible, l'objectif étant justement d'induire l'inflammation, avant la mise à mort pour prélever les articulations. Il teste un complément à base de peptides de collagène marin et de polyphénols, et présente le recours à la souris par ses "faibles coûts" et sa facilité de manipulation.

Objectifs

Les peptides de collagène marin ainsi que les extraits poly-phénoliques de pépins de raisin et d’olive possèdent des bénéfices démontrés et décrits dans la littérature sur l’arthrose. Le but de cette étude est d’évaluer l’effet d’un ingrédient Santé d’origine naturelle, associant peptides de collagène et polyphénols, pour les sujets sportifs et âgés susceptibles de développer une arthrose.

Bénéfices attendus

Trouver un traitement efficace à la diminution du développement de l’arthrose.

Procédures

Dans ce projet, nous évaluerons l’impact de l’association de nutraceutiques, peptides de collagènes et polyphénol, dans la progression de l’arthrose. Les souris recevront dans l'eau de boisson le traitement durant les 90 jours de l'étude. Un modèle d’arthrose post-traumatique, en ôtant le ménisque interne, sera réalisé sur des souris jeunes et âgées. Cette interventions sous anesthésie nécessite 20min par animaux. Un modèle d’arthrose par dégradation des cellules de l’articulation (les chondrocytes) sera également réalisé par injection de monoïodoacétate au niveau de l’articulation choisie du genou. Cette injection necessite la contention de l'animal pendant 1min. Afin d’évaluer les douleurs engendrées par les 2 modèles, les souris seront amenées à se déplacer librement sur un tapis de marche tous les 15 jours durant les 90 jours de l'étude. A la fin de l'étude, un prélevement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

Dans ces modèles murins d’arthrose, le geste chirurgical peut entrainer dans les jours suivants des difficultés chez les souris à se déplacer. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs seront disposés au-dessus des cages. La prise hydrique est évaluée journalièrement. Des mangeoires et igloos seront disposés au fond de la cage.

Devenir

Une mise à mort sera effectuée afin de prélevé les tissus arthrosiques (articulation du genou) chez les souris

Remplacement

Dans un premier temps, une validation objective de l’efficacité biologique sera réalisée sur les différentes formulations de cette association entre peptides de collagène et extraits poly-phénoliques. Pour cela, la toxicité des produits développés seront déterminées in vitro par l’évaluation de leur cytotoxicité sur des chondrocytes (cellules du cartilage présentes dans les articulations), fibroblastes (cellules de la membrane synoviales de l’articulation) et macrophages (cellules de la membrane synoviale de l’articulation, mais également cellules immunitaires recrutées sur les sites inflammatoires dont les articulations arthrosiques). Les études in vivo complémentaires permettront de valider l’efficacité du produit choisi in vitro (seuls ou en association).

Réduction

Nous limitons la répétition inutile des expériences grâce à un échange permanant entre les membres de l’équipe. Nous essayons d’effectuer le maximum d’analyses réalisables sur les mêmes animaux sans altérer la qualité de l’expérience et le bien-être des animaux. Chaque animal sera son propre contrôle. L’arthrose induite sera effectuée sur une seule patte et les résultats seront comparées avec la patte saine, ce qui permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaire pour l’étude. Enfin, tous les protocoles expérimentaux sont, une fois validés, mis à disposition de l’ensemble des membres de l’équipe. Le nombre d’animaux utilisé correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Les groupes d’animaux constitués de 6 individus permettront une étude statistique

Raffinement

En dehors de la visite quotidienne habituelle des animaux, les souris seront surveillées quotidiennement pendant 15 jours suite à l’intervention au niveau de l’articulation et puis 1 fois /semaine . Dans ces modèles murins d’arthrose, le geste chirurgical peut entrainer dans les jours suivants des difficultés chez les souris à se déplacer. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs seront disposés au-dessus des cages. La prise hydrique est évaluée journalièrement. Des igloos et des croquettes seront disposés au fond de la cage pour l’enrichissement et pour faciliter la prise alimentaire. Il n’y a pas de possibilité de réaliser un traitement anti-inflammatoire car le but du modèle est d’induire une inflammation.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc.) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Souris adultes car l’arthrose se développent majoritairement chez l’adulte : - Souris âgées de 8 à 10 semaines, afin de mimer l’adulte jeune sportif - Souris âgées de 12 à 18 mois, afin de mimer la personne âgée Ces deux populations, adulte jeune sportif et personnes âgées, sont celles les plus susceptibles de développer une arthrose.

298 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie coupant la circulation d'un rein pendant vingt-cinq minutes pour provoquer une insuffisance rénale aiguë, suivie d'échographies et de mesures de pression artérielle, avant d'être tué à un à vingt-huit jours pour prélever ses organes. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur au site opératoire et une perte de 10 à 15 % du poids, prises en charge par des antalgiques. L'objectif déclaré est de tester si le blocage d'une molécule inflammatoire, l'interleukine-3, limite les atteintes cardiaques et rénales, le porteur jugeant le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

Notre étude vise à évaluer l’implication d'une molécule inflammatoire dans l’insuffisance rénale aiguë. Nous travaillons sur un modèle murin chez qui nous induisons une insuffisance rénale aiguë via une chirurgie visant à couper la circulation sanguine dans le rein pendant 25 minutes, on parle d'un modèle d'ischémie reperfusion rénale. Nous allons analyser chez des animaux contrôles et des animaux ne possédant pas notre molécule inflammatoire d'intérêt les conséquences de l'ischémie reperfusion rénale au niveau du rein, du cœur mais également au niveau immunitaire. L'objectif de cette étude est d'évaluer si l'inhibition de cette molécule inflammatoire est en mesure de réduire les conséquences cardio-rénales induites par une insuffisance rénale aiguë.

Bénéfices attendus

Nous étudions le syndrome cardio-rénal, soit la survenue d'une atteinte cardiaque aiguë en conséquence d'une atteinte rénale aiguë initiale ainsi que les conséquences immunitaires dans ces organes (cœur et reins). Notre étude s'intéresse plus particulièrement au rôle d'une molécule produite lors d'une inflammation. Il est rapporté dans la littérature que cette molécule inflammatoire est associée à une surmortalité dans différentes maladies telles que dans les infections graves. L’inhibition de cette molécule est désormais une potentielle cible thérapeutique. Mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'insuffisance rénale pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.

Procédures

Les animaux de la série 1 sont soumis à 2 procédures : - procédure chirurgicale d'ischémie reperfusion rénale sous anesthésie (35 minutes) avec une mise à mort des animaux à j1, j3 j7 ou J28 -procédure chirurgicale d'ischémie reperfusion rénale sous anesthésie (35 minutes) combiné à une échocardiographie sous anesthésie avant chirurgie et au moment de l’euthanasie de l’animal (2 fois 10 min) et à une mesure de la pression artérielle sur animal vigile chaque jour pendant une semaine avant la chirurgie pour habituer l’animal, puis au moment de l’euthanasie de l’animal (6 fois 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales s'accompagnent de douleur au niveau du site opératoire. Un traitement antalgique pré- et post-opératoire systématique sera administré pour diminuer les douleurs liées à la chirurgie. La potentielle persistance de la douleur au-delà de 24h sera systématiquement recherchée et traitée. La perte de poids est une complication attendue suite à la chirurgie, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporel et régresse quelques jours après. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle et n'excède pas 48 heures au-delà des différentes procédures. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie et n’induit pas de nuisance spécifique. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress à l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure préalablement à la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures aux différents temps de l'étude (j1, j3, j7, j28) en concervant tous les organes que nous avons à analyser.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.

Réduction

Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisé. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.

Raffinement

Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus aisée conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux lors des procédures expérimentales, les mesures suivantes seront prises : Administration systématique d'antalgique par voie intra péritonéale à h8 post-chirurgie pour tous les animaux, surveillance 2 fois/jour pendant les 3 premiers jours après chirurgie et administration à h24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire mise à mort si le traitement est sans effet au-delà puis surveillances chaque jour par le personnel de l'animalerie pendant toute la durée du protocole.

Choix des espèces

Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle d’ischémie-reperfusion rénale comporte de nombreuses similitudes par rapport à une insuffisance rénale aiguë chez l’Homme. Par ailleurs, son potentiel génétique permet d’analyser l’effet d’une absence/surexpression d’un gène cible. Nous disposons de tous les outils permettant une exploration physiopathologique complète. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4-8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale après IRr et de grader des paramètres physiologiques normaux. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole, car les femelles présentent une protection relative à l’insuffisance rénale induite par ischémie reperfusion rénale liée aux œstrogènes Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme.

610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage d'un ver intestinal puis par un parasite de la malaria, subissent des prélèvements sanguins trois fois par semaine, puis une ponction cardiaque suivie de la mort par dislocation cervicale. Le porteur décrit une infection le plus souvent asymptomatique et une anémie transitoire liée à une souche de plasmodium "non létale", et tue toute souris dont l'état se dégrade. Il présente la souris comme le "modèle de choix", ces interactions à trois partenaires ne pouvant selon lui être reproduites in vitro, l'étude portant d'abord sur la capacité d'adaptation du ver.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’adaptation à la coïnfection entre un nématode intestinal et un des agents de la malaria murine, en termes de la capacité à réguler la réponse immunitaire de l’hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et en effet on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection peut entrainer des dynamiques très différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, un des paramètres clé déterminant la dynamique de la coïnfection est la capacité des nématodes intestinaux à moduler la réponse immunitaire de l’hôte. Cette capacité d’immunomodulation a pour objectif de favoriser la persistance des vers au sein de l’hôte. Cependant, un hôte dont la réponse immunitaire est sous exprimée devient également plus susceptible à l’infection par d’autres pathogènes. La question que nous souhaitons aborder ici est donc la suivante : Y a-t-il un potentiel d’adaptation du nématode aux conditions de coïnfection qui limite le niveau d’immunosuppression de l’hôte ?

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le potentiel d’adaptation d’un nématode intestinal à la coïnfection avec plasmodium en termes de sa capacité à immunomoduler l’hôte. Ces deux parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la manipulation de la réponse immunitaire par le nématode pourrait jouer dans le risque encouru par ces populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : gavage (200 µl d’eau de boisson à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Nous attendons peu d’effets indésirables sur les animaux. Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté et ceci basé sur de centaines de souris infectées au cours de ces 10 dernières années. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris (p.ex. état de prostration) elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Nous avons déjà effectué des infections de C57BL/6JRj avec cette souche de plasmodium et avons pu constater qu’aucune mortalité n’intervient. Le seul symptôme observable associé à l’infection par Plasmodium yoelii 17X NL est une diminution du nombre de globules rouges (anémie). Cette diminution est cependant transitoire (elle se produit entre les jours 14 et 22 post-infection) et après J26 les valeurs reviennent à la normale. Le gavage est réalisé en quelques secondes, à l’aide s’une sonde souris, et ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau (200 µl). Les injections i.p. sont réalisées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Comme pour le gavage, chaque individu ne reçoit qu’une seule injection. Les micro prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont aussi réalisés après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Les prélèvements de fèces sont effectués en isolant les souris (afin de pouvoir identifier l’appartenance de l’échantillon à chaque individu). Cependant, les souris ne sont isolées que pendant 1 heures, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer l’adaptation d’une espèce de nématode intestinal à la coïnfection par plasmodium en termes d’immunosuppression de l’hôte. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans cette expérience a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 5 souris par passage pour chaque groupe expérimental, et 15 souris tests dont l’objectif est de vérifier si les paramètres mesurés ont dévié par rapport à la génération initiale. Le nombre de 15 souris est le plus petit possible car 5 souris sont mises à mort pour chaque jour de prélèvement. Afin de réduire ultérieurement le nombre total de souris, nous avons décidé de ne répéter l’expérience qu’une fois. Par ailleurs cette répétition ne concerne que les souris tests et non pas les souris utilisées pour les passages. Au total, avec les répétitions, 610 souris seront nécessaire sur une période de 3 ans.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans cette expérience. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (minimum 5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Lors des prélèvements de fèces, les animaux ne sont isolés que pendant 1 heure, ce qui représente 1% du temps hebdomadaire passé en isolement. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Les injections et prélèvements de sang sont effectués après application d’un anesthésiant local pour éviter toute douleur. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

33 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres expériences. Ils subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter veineux central, destiné à faciliter les prélèvements et injections d'études ultérieures de pharmacocinétique, de toxicité ou d'efficacité menées en prestation pour d'autres chercheurs. Le porteur reconnaît un risque de perte importante de sang pendant l'opération mais affirme que les lapins supportent "très bien" le cathéter et le gilet, sans douleur attendue. Il justifie le recours au lapin par sa taille commode pour poser le matériel et présente le remplacement comme difficile, l'effectif pouvant augmenter selon la "demande d'industriels".

Objectifs

Un cathéter veineux central (CVC) est un tube mince et flexible, introduit dans une veine de la base du cou (jugulaire) ou du thorax (sous clavière) jusqu’à atteindre la veine cave supérieure. Ce dispositif, couramment mis en place chez l’homme en clinique, peut permettre l’injection de traitements par voie intra-veineuse (IV), la perfusion de sang ou de plaquettes, le prélèvement d’échantillons sanguins ou encore la mise en place d’une nutrition parentérale (injection d’éléments nutritifs par voie IV). Le but de ce projet est d’offrir les mêmes possibilités à notre modèle animal qu’est le lapin dans le cadre de prestations ou collaborations avec d’autres chercheurs. 33 lapins cathétérisés sont prévus pour l’année 2023.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un CVC apporte plusieurs avantages : -réduction du nombre d’injections et de piqûres d’aiguille ; -atténuation de l’endolorissement/sensation de brûlure parfois causés par un traitement IV administré par une perfusion standard périphérique ; -accroissement du confort et réduction de l’anxiété chez les lapins nécessitant un traitement IV ou des prélèvements sanguins à répétition.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 20min sous anesthésie et analgésie pour la pose d’un cathéter veineux central.

Impact sur les animaux

La nuisance la plus importante est lié à l’opération chirurgical en elle-même. Durant cette dernière, les animaux sont susceptibles de perdre une quantité importante de sang pouvant entrainer une mauvaise récupération post-opératoire. Cependant, tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur des animaux (anesthésie + analgésie pré et post-opératoire). D’après notre expérience, les animaux supportent très bien le cathéter ainsi que le gilet. Aucune douleur n’est attendue.

Devenir

Au terme de la procédure, tous les animaux seront utilisés pour des expériences nécessitant des prélèvements ou des injections qui seront facilités par le cathéter limitant ainsi les effets néfastes pour les animaux.

Remplacement

Différents types d’étude seront réalisés chez les lapins cathétérisés : analyse pharmacocinétique d’un nouveau composé, tests de toxicité, évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies. L’ensemble de ces utilisations met en jeu l’organisme dans son entièreté et rend le remplacement du modèle animal difficile.

Réduction

Dans un objectif de Réduction, le nombre d’animaux choisi correspond au minimum de lapins qui nous est habituellement commandé sur une année. Cependant il est possible que ce chiffre varie à la hausse (demande d’industriels). Dans le cas d’une demande plus importante, une nouvelle demande d’autorisation de projet sera rédigée. Le nombre de lapins sera de 33 sur 1 an.

Raffinement

Dans un objectif de Raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Le design du gilet utilisé pour le maintien du cathéter permet la libre circulation de l’animal dans sa cage sans risque d’arrachement. Les conditions d’hébergement ont également été optimisées par l’enrichissement du milieu. Enfin, l’utilisation de l’analgésique buprénorphine a été mise en place pour réduire la douleur liée à l’opération.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle de choix pour les essais impliquant des actes chirurgicaux. Sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters. De plus, le lapin est en certains points (notamment immunitaire), plus proche de l’homme que la souris, notamment pour les études s’intéressant aux infections bactériennes. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont souvent nécessaires. Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.